Procédures modérées
Microévolution du bacille de la peste dans le vecteur puce : dynamiques et conséquences fonctionnelles
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Exposés une heure au contact de puces, des souriceaux de deux à cinq jours sont utilisés pour nourrir les colonies d'insectes. 5 104 souris vont être utilisées, 2 760 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 2 344 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur indique qu'au-delà d'un millier de puces l'alimentation simultanée provoque une perte de sang importante, une perte de conscience puis un décès rapide, et qualifie la phase consciente de brève. L'objet du projet est de savoir si le bacille de la peste mute dans la puce, où et quand, et la description des procédures tient en une phrase, sans dire combien de souriceaux sont exposés à ces effectifs de puces.
Objectifs
Le bacille de la peste, responsable de la maladie du même nom transmise par les puces, connaît des phénomènes de microévolution, révélés par des signatures génétiques partiellement documentée. Toutefois, on ignore encore si ces microévolutions surviennent dans le vecteur. Si c’est le cas, on ne sait ni où ni quand elles apparaissent, ni quelles fonctions elles remplissent dans la colonisation de la puce. Ce projet vise à lever ces inconnues en identifiant ces signatures moléculaires, en les localisant de façon spatio-temporelle chez la puce, puis en évaluant leur impact sur la capacité du bacille à produire une infection transmissible chez l’insecte. En améliorant notre compréhension des mécanismes d’adaptation du bacille dans son vecteur, cette recherche contribuera à évaluer le risque d’émergence épidémique et à concevoir de nouvelles stratégies de lutte.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des connaissances inédites sur les mécanismes d’adaptation de Y. pestis à ses vecteurs, en identifiant les mutations associées à la persistance et à la transmission. Ces données permettront d’évaluer plus finement le risque d’émergence épidémique et de cibler de nouvelles stratégies de lutte. Les bénéfices attendus sont en santé publique, animale, comme en recherche fondamentale.
Procédures
Les animaux seront exposés une seule fois au contract de puces pendant une durée d'heure.
Impact sur les animaux
L’exposition aux puces peut entraîner deux types de nuisance. D’une part, les piqûres elles-mêmes, atténuées par les propriétés analgésiques et anti-inflammatoires de leur salive. D’autre part, la perte sanguine liée à l’alimentation des insectes. Lors d’expositions avec un nombre limité de puces, la quantité de sang prélevée demeure faible et n’entraîne pas d’effet physiologique observable dans nos conditions. A l’inverse, lors du nourrissage de colonies établies sur souriceaux, l’alimentation simultanée d’un très grand nombre de puces provoque une perte de sang importante, conduisant rapidement à une perte de conscience puis au décès très rapide. Dans ce contexte, la phase consciente est brève et la perception nociceptive potentielle reste transitoire.
Devenir
Quel que soit la procédure, les animaux ne seront pas maintenus en vie après leur utilisation. Leur prise en charge en fin de protocole est strictement encadrée et conforme aux exigences sanitaires et réglementaires en vigueur, afin d’éviter tout risque de contamination croisée et de garantir la sécurité des installations expérimentales.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun modèle in vitro capable de reproduire le cycle biologique complet des puces ni leurs interactions physiologiques avec un hôte. Les puces sont des insectes hématophages stricts, et la prise de repas sanguin constitue un déclencheur physiologique essentiel à leur développement, leur reproduction et leur ponte. Ce processus dépend non seulement de la disponibilité du sang, mais aussi de signaux sensoriels et hormonaux issus du contact avec un hôte vivant. L’utilisation de systèmes artificiels de nourrissage, comme des membranes synthétiques, reste inadaptée à notre contexte expérimental. Ces dispositifs ne permettent ni une alimentation efficace ni une reproduction stable chez les espèces ciblées ici. Ils exposent également les puces à des anticoagulants et à des contaminations bactériennes ou fongiques, nécessitant l’ajout d’antimicrobiens qui altèrent leur physiologie et compromettent la validité des données. Enfin, il n’existe actuellement ni lignée cellulaire, ni modèle substitutif permettant de reconstituer ex vivo les interactions complexes entre la puce et son hôte.
Réduction
L’utilisation de souriceaux permet de nourrir un grand nombre de puces tout en mobilisant un nombre réduit d’animaux. Un seul souriceau remplace le volume sanguin fourni par 4 à 5 souris adultes dans un système artificiel équivalent, ce qui contribue significativement à la réduction du nombre total d’animaux utilisés. Notre stratégie expérimentale a également été conçue pour limiter le recours aux animaux, tout en maintenant la robustesse scientifique du modèle. Nous avons aussi choisi de travailler avec une souche de puce dont le cycle biologique permet un nourrissage bihebdomadaire, contrairement à d’autres espèces qui nécessitent un nourrissage tous les deux jours à minima. Ce choix permet de réduire sensiblement le nombre de souriceaux requis. Par ailleurs, notre expérience montre qu’il est possible d’interrompre un nourrissage une fois par mois sans compromettre la survie des colonies, ce qui permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés pour leur maintien. Pour l’étude sur l’émergence de nouveaux variants, nous avons choisi un nourrissage tous les deux jours. Ce rythme est plus fréquent que le bihebdomadaire habituel, mais reste inférieur au quotidien. Il maximise les chances de détection d’un événement évolutif sans pour autant mobiliser davantage d’animaux qu’un nourrissage quotidien, qui ne nous apporterait pas d’information supplémentaire utile. Enfin, nous regroupons autant que possible plusieurs tests en présence d’une condition témoin.
Raffinement
Plusieurs mesures ont été intégrées pour minimiser la contrainte associée aux nourrissages. Les souriceaux seront exposés sans contention, pendant une durée limitée à une heure. Ce choix contribue au raffinement en réduisant stress et douleur. Les stades utilisés (2 à 5 jours) correspondent à une période de développement où la perception nociceptive est présente, mais encore partiellement intégrée, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Des observations seront menées pendant et après l’exposition afin de détecter tout signe de souffrance (vocalisation, évitement, apathie). Enfin, les puces injectant naturellement des molécules salivaires aux propriétés analgésiques et anti-inflammatoires, cette particularité constitue une forme de raffinement biologique supplémentaire. Des points limites adaptés ont été définis pour chaque procédure afin de permettre l’identification précoce de signes de souffrance justifiant l’interruption de l’expérimentation et l’euthanasie immédiate de l’animal.
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris (Mus musculus), qui constitue un hôte naturel ou compatible pour de nombreuses espèces de puces ciblées par le projet. Elle est couramment utilisée pour le nourrissage de puces en contexte expérimental. Son statut d’espèce modèle, sa physiologie bien connue, et sa compatibilité avec les besoins alimentaires des puces en font un choix scientifiquement pertinent et largement validé pour ce type de protocole. Souriceaux âgés de 2 à 5 jours. Il s’agit du stade privilégié pour les nourrissages expérimentaux. A ce stade, les souriceaux sont glabres, leur peau est fine, et leur système nerveux est encore en développement. Bien que la perception nociceptive soit présente dès la naissance, son intégration centrale est partielle, ce qui limite la réponse comportementale complexe. Lorsqu’ils sont exposés à un grand nombre de puces (>1000), l’exsanguination entraîne une perte rapide de conscience suivi du décès rapide. La perception nociceptive potentielle est intense mais très transitoire, et ne s’accompagne d’aucun signe comportemental prolongé. Par ailleurs, l’utilisation de souriceaux permet de réduire significativement le nombre total d’animaux utilisés: un seul individu alimente les puces alors qu’il faudrait 4 à 5 souris adultes nécessaires pour obtenir un volume sanguin équivalent lors d’un nourrissage artificiel. La faible pilosité des souriceaux permet également de limiter les risques de fuite des insectes, ce qui sécurise la procédure. Ces animaux seront exposés sans contention, pendant une durée maximale d’une heure, ce qui réduit le stress. Ce stade est également optimal pour les puces, en raison de la vascularisation cutanée. Leur utilisation répond donc à la fois aux objectifs scientifiques et au principe de raffinement.
Impact de la fibrose sur la régénération musculaire et sur des stratégies thérapeutiques innovantes chez la souris dystrophique MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
1 284 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles et leurs organes. Une partie reçoit une injection de myotoxine dans le muscle de la patte, une autre une greffe musculaire de trente minutes sous anesthésie, une autre encore des injections ou un gavage jusqu'à deux fois par jour pendant treize semaines. Certaines sont immunodéficientes, donc exposées aux infections, et la mesure finale de contractilité du muscle se fait sans réveil. Cette modification du projet augmente l'effectif pour tester de nouvelles molécules antifibrotiques, et le porteur affirme que thérapie cellulaire, thérapie génique, régénération et fibrose ne peuvent s'étudier qu'in vivo, sans autre argument.
Objectifs
Nous nous intéressons aux dystrophies musculaires, un groupe de maladies génétiques qui touchent le muscle squelettique. Elles sont caractérisées par une faiblesse musculaire, une dégénérescence progressive des muscles du corps. Dans certains types de dystrophies musculaires, comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne (incidence 1 sur 3500 naissances de garçons), la dystrophie musculaire oculo-pharyngée (1 sur 100000) ou la dystrophie musculaire des ceintures (prévalence entre 1 et 3 personnes sur 125000) entre autres, l’apparition de tissu cicatriciel (appelé fibrose) dans les muscles est également observée. Le processus fibrotique représente une réponse progressive qui aboutit, suite à la production excessive de tissu cicatriciel remplaçant le tissu, à une dysfonction de l’organe et à dans certains cas peut amener à la mort de l’individu. Dans le muscle squelettique (comme dans nombreux autres tissus), le processus qui amène l’apparition de tissu cicatriciel reste un processus très peu connu et son impact sur la régénération musculaire et son influence sur certaines des thérapies innovantes utilisées dans des essais cliniques dans le cadre des dystrophies musculaires, reste mal compris. Ce projet consiste à 1) étudier l'impact de la fibrose musculaire sur la régénération musculaire; 2) étudier comment la fibrose musculaire peut influencer certaines approches thérapeutiques comme la thérapie génique et la thérapie cellulaire; 3) tester des approches thérapeutiques visés à diminuer la fibrose et améliorer la fonction musculaire dans des modèles de dystrophie musculaire. Le projet nécessite une modification avec augmentation du nombre d'animaux afin d'étudier de nouvelles approches thérapeutiques anti-fibrotiques chez la souris dystroophique.
Bénéfices attendus
Ce projet aidera à comprendre comment la présence de tissu cicatriciel (fibrose musculaire) au sein du muscle squelettique est capable de modifier la régénération du muscle. Également, il permettra de comprendre comment la fibrose peut influencer l’efficacité de certaines stratégies thérapeutiques, comme la thérapie cellulaire par transfert de myoblastes et la thérapie génique, qui représentent des thérapies envisageables pour des maladies génétiques comme les dystrophies musculaires. Enfin, il permettra de tester des approches thérapeutiques visés à diminuer la fibrose et améliorer la fonction musculaire dans des modèles de dystrophie musculaire.
Procédures
Différents groupes d’animaux seront soumis à différentes procédures. Un lot d'animaux sera soumis à l'injection d'une toxine musculaire sous anesthésie. Il s'agit d'une intervention de très courte durée (l'injection de la toxine elle-même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes); Un lot d'animaux sera soumis à l’injection de molécules thérapeutiques ou de cellules (sous anesthésie/analgésie). Il s'agit également d'une intervention de très courte durée (l'injection elle-même ne dure que quelques secondes et la manipulation de la souris ne demande que quelques minutes); Un lot d'animaux sera soumis alternativement pour une durée de traitement estimé à environ 13 semaines à :i) l’injection d’une molécule thérapeutique (maximum deux fois par jour, sur animaux vigils) ; ii) le gavage d’une molécule thérapeutique (maximum deux fois par jour sur animaux vigils) ;iii) l’administration d’un molécule thérapeutique dans la nourriture (animaux vigils); iv) l’injection de molécules thérapeutiques sous anesthésie. Les manipulations des souris dans ces interventions sont de très courte durée (moins qu’une minute) ; Un lot d'animaux sera soumis à une greffe musculaire, une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale et analgésie d’une durée de 30 minutes ; Un lot d'animaux sera soumis à une mesure in situ de la contractilité du muscle squelettique (durée de 15 minutes) qui est un acte sans réveil effectuée sous anesthésie et analgésie. Cet acte est suivi de l’euthanasie (réalisée sous anesthésie et analgésie) des tous les animaux afin de permettre le prélèvement des organes d’intérêt.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés présentent une fibrose musculaire à partir de 2 mois (selon le modèle utilisé) sans signe clinique associés. Certains animaux seront également immunodéficients et sont donc plus sensibles aux infections. Dans notre projet, nous injectons des cellules ou des molécules à effet thérapeutique chez la souris. Pour certaines souris cela sera après avoir effectué un dommage musculaire du muscle tibialis anterior. D’autre animaux auront une greffe musculaire. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection, l'animal pourrait alors ressentir une douleur locale au niveau du site d'injection. Certains animaux auront un traitement en systémique. L'effet indésirable qui peut se produire sur les animaux est une inflammation/infection de la peau au site d’injection ou un des effets secondaires liés à la molécule administrée. Lors des anesthésies effectuées pour l'ensemble des gestes techniques, les risques/contraintes peuvent être les suivants : effets sur les variables physiologiques affectant le maintien de l'homéostasie pendant l'anesthésie (hypothermie, hypotension, hypoxie)
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure. L’analyse des muscles injectés et des autres organes (foie, etc) est indispensable pour ce projet. L'euthanasie de l’ensemble des animaux est donc requise.
Remplacement
La thérapie cellulaire, génique, la régénération musculaire et la fibrose sont des processus qui peuvent être investigués exclusivement in vivo et pour le quel un remplacement in vitro en respect de la règle de 3R n’est pas encore possible.
Réduction
Chaque groupe sera constitué de 8-20 animaux pour obtenir des résultats statistiques. Dans le respect de la règle des 3R, une première série d’ expériences sera réalisée sur 5-12 souris. Le nombre sera incrémenté exclusivement si besoin. En outre, afin de réduire le nombre de souris utilisées (dans le respect de la règle des 3R) pour chaque souris, quand possible, les deux muscles Tibialis Anterior (gauche et droite) seront injectés. Au maximum un total de 1284 souris seront utilisées dans ce projet. Afin de comparer les groupes de sujets, nous réaliserons une analyse statistique.
Raffinement
Pour le raffinent, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons ou tunnel en carton ou carré de coton compacté. Suite à la procédure chirurgicale, qui est réalisé sous anesthésie/analgésie, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience afin de déceler des signes de douleur. Pour l’injection de vecteurs AAV- virus adéno-associés- en intramusculaire, pour l’injection de la myotoxine et l’injection de cellules, les souris sont anesthésiées. Les critères tels que l’activité générale, la prise de nourriture et d’eau, la perte de poids, des plaies au site d’injection, une croissance excessive des dents seront évalués régulièrement. Les animaux qui montrent un signe quelconque de détérioration de leur santé seront euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est le modèle le plus commun utilisé dans des études de régénération musculaire et de compréhension des mécanismes physiopathologique du muscle squelettique, ainsi que dans des études pour évaluer la participation des myoblastes humains à la régénération musculaire et de thérapie génique. Nous utiliserons de souris présentant de la fibrose musculaire pour pouvoir étudier l’effet de la fibrose sur la régénération musculaire, la thérapie cellulaire et génique et tester des approches thérapeutiques visés à diminuer la fibrose et améliorer la fonction musculaire dans des modèles de dystrophie musculaire. Nous utiliserons des souris d’âge adulte (2 mois et plus): puisque c’est à partir de cet âge qu’elles présentent de la fibrose au niveau musculaire.
Evaluation de l’efficacité, de l’innocuité, et de la durabilité de nouvelles méthodes et dispositifs d’assistance cardiaque mécanique par des méthodes de chirugie standard et mini-invasives – 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Moutons : 200
Bovins : 100
L'enjeu déclaré est la validation réglementaire de dispositifs d'assistance cardiaque mécanique avant leur pose chez des patients. 200 moutons, 100 bovins et 50 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour nécropsie et examen histopathologique du site d'implantation. Chaque animal subit une, parfois deux interventions chirurgicales pouvant durer plusieurs heures, jusqu'à douze examens d'imagerie sur six mois, des jeûnes de douze à seize heures avant chaque anesthésie et des prélèvements sanguins pouvant aller jusqu'à un par jour. Le porteur qualifie l'expérimentation sur "organisme entier" d'"incontournable" et la présente comme une "obligation règlementaire", tout en précisant qu'aucune approche statistique n'a servi à fixer l'effectif.
Objectifs
Les dispositifs d'assistance cardiaque mécaniques permettent de suppléer aux défaillances cardiaque et/ou respiratoire en assurant le débit circulatoire nécessaire et l’oxygénation. Ces appareils peuvent temporairement ou de façon plus durable aider le coeur dans son rôle de pompe dans le cas des insuffisances cardiaques sévères par exemple. Ces dispositifs sont de différents types, il peut par exemple s'agir d'un dispositif externe d'Oxygénation par Membrane Extracorporelle (ECMO), d'une prothèse ventriculaire implantable, d'un ballonnet implantable au niveau de l'aorte, ou d'un coeur artificiel total. Les dispositifs d'assistance ventriculaire gauche sont particulièrement intéressants pour les patients en attente d'une greffe du cœur. En raison de la forte demande de cœurs par rapport au nombre de cœurs disponibles pour un don, un dispositif d'assistance ventriculaire gauche peut véritablement sauver des vies. Ils peuvent également servir en attendant que la fonction cardiaque se rétablisse (assistance à la réadaptation) ou en tant que traitement à long terme à l’intention des patients d’insuffisance cardiaque en phase terminale et qui ne sont pas candidats à une greffe. Tous les dispositifs d'assistance cardiaque implantables nécessitent un système d'alimentation et de transmission de l'energie pour pouvoir fonctionner. Ce projet de recherche a pour objectif le développement et l'évaluation de l'efficacité et de la sécurité de nouveaux dispositifs et techniques d'assistance cardiaque mécanique pour le traitement de l'insuffisance cardiaque. Ce projet se déroulera dans 2 Etablissements Utilisateurs EU 1/2 et EU 2/2.
Bénéfices attendus
L'avantage escompté et les bénéfices attendus sont une amélioration de la prise en charge des patients, une amélioration de la durabilité et de l’efficacité des implants pour éviter leur rejet, et ainsi les ré opérations parfois multiples des patients, pour réduire les temps de cicatrisation et le traumatisme tissulaire , corollaires de ces interventions et qui handicapent les patients, ainsi que l'occurrence d'effets indésirables comme les infections grâce au recours à des méthodes d'implantation mini-invasives. Un autre avantage important des techniques mini-invasives est de permettre une récupération plus rapide des patients.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Des prélèvements sanguins de faible volume à des fins de biologie médicale sur animaux vigiles ou légèrement sédatés, pour tous les animaux du projet. Les fréquences maximales des prélèvements pouvant être d’un prélèvement par jour sur une courte période de quelques jours à une semaine ou d’un prélèvement par semaine jusqu’à 6 mois. - Des préparations à l’anesthésie pour les examens d'imagerie et d'implantation chirurgicale qui consistent en la pose d'un cathéter et en l'injection des produits utilisés pour la prémédication et l'anesthésie. Durée de moins de dix minutes. - Préalablement aux anesthésies générales, les animaux seront mis à jeun pour une durée de 12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins. - Le nombre maximal d’examens d’imagerie par animal pourra aller jusqu’à 12 sur une période de 6 mois. - Des procédures chirurgicales d'implantation de dispositif cardio-vasculaire avec ou sans procédure chirurgicale de création de modèle lésionnel préalable. Chaque animal du projet ne subira qu'une seule chirurgie d'implantation de dispositif associée ou non à une chirurgie de création de modèle antérieur soit une seule et parfois deux interventions chirurgicales par animal dont une mini-invasive pour la création de modèle lésionnel. Comme pour les interventions chez l'Homme, les interventions chirurgicales et les examens d'imagerie sont toujours réalisés sous anesthésie générale (évitant tous stress et douleur pour les animaux) et pourront durer jusqu'à plusieurs heures en cas d’intervention chirurgicale complexe pour tous les animaux du projet. Dans ce projet, les actes d'imagerie pourront être réalisés dans les EU 1/2 et 2/2. Les actes chirurgicaux d'implantation de dispositif et/ou d'évaluation de technique chirurgicale avec ou sans réveil seront réalisés dans l'EU 1/2. Le suivi clinique et fonctionnel des animaux après les procédures chirurgicales pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2. Pour les études chroniques, les évaluations finales avec euthanasie pourront être réalisées dans les EU 1/2 et 2/2.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont exactement les mêmes que ceux attendus sur un futur patient humain : - La faim ,lors de la mise à jeun (12 heures pour les porcs, 12 à 16 heures pour les ovins/bovins) de l’animal préalablement à l’anesthésie, - Le stress physique induit par la contention/manipulation/pose de cathéter au moment de la préparation de l’anesthésie, - En fonction des besoins et préalablement à la procédure d'évaluation du dispositif, l'induction d'une lésion à la faveur d'une intervention chirurgicale mini-invasive de type lésion vasculaire, création d'un defect tissulaire, ligature ou occlusion de vaisseaux par exemple - La douleur en phase postopératoire : jusqu'à plusieurs jours en fonction de l’invasivité de la technique, pour ces derniers points, des mesures de raffinement sont mises systématiquement en place pour minimiser ces effets (comme par exemple le recours systématique à l'anesthésie générale, l'usage systématique de traitements anti-inflammatoires et anti-douleur opiacés, la protection des plaies, la mise en place d'un suivi clinique quotidien des animaux).
Devenir
Pour toutes les procédures du projet, la nécessité de collecter des données scientifiques se fera au niveau clinique, au niveau biologique (hématologie et biochimie par exemple), au niveau fonctionnel (données issues des examens d'imagerie, scanners, IRM par exemple), par l'interrogation des dispositifs, et enfin au niveau tissulaire par la réalisation d'une évaluation nécropsique et d'une évaluation histopathologique après euthanasie des animaux qui déterminera la tolérance locale et générale ainsi que l’altération du dispositif (durabilité). La bonne réalisation de ce suivi règlementaire garantit donc une évaluation complète et des dispositifs testés dans le projet.
Remplacement
La validation des dispositifs médicaux implantables et des méthodes techniques innovantes dans ce projet requiert la vérification de la sécurité et de l’efficacité des implants. Le recours à l’animal vivant pour évaluer les différentes versions de prototypes afin de reproduire fidèlement les contextes clinique, fonctionnel, anatomique et tissulaire qui seront visés par les applications chez les patients est indispensable. En effet leur utilisation in fine chez les patients représente des procédures à haut risque létal et il est donc indispensable d’avoir recours à l’expérimentation animale au préalable afin de vérifier le bon fonctionnement des dispositifs et des méthodes d’implantation, leur innocuité et leur durabilité. L’expérimentation sur l’organisme entier, et donc sur animal vivant est incontournable, c’est une obligation règlementaire dans le cadre de l’évaluation des dispositifs médicaux implantables.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué prospectivement et réduit au minimum nécessaire pour répondre aux besoins et objectifs scientifiques du projet, aucune approche statistique n'a été réalisée. Pour réduire le nombre d’animaux, des sélections par méthodes d’imagerie non invasives sont mises en place (IRM, Scanner, Echographie, RX …), permettant par exemple une reconstruction 3D des structures d’intérêt. Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour s’assurer de la pertinence de cette estimation.
Raffinement
Les modèles animaux suivront exactement le cheminement d’un futur patient avec les mêmes exigences et techniques médicales mises en oeuvre pour la réalisation des interventions (personnel hautement qualifié, plateau technique opératoire et d’imagerie de pointe). L’ensemble des procédures est conçu pour réduire au maximum le stress, l’angoisse et les contraintes sur les animaux comme le recours systématique à l’anesthésie générale durant les interventions d’imagerie et les procédures chirurgicales. La localisation de la plateforme d'imagerie sur le site même des animaleries permet de réaliser ces examens sur place, réduisant ainsi le recours aux transports pour les animaux et le stress associé. Les paramètres vitaux sont enregistrés et contrôlés par des techniciens spécialisés en anesthésie afin d’adapter les perfusions, l’assistance respiratoire et les dosages d’anesthésiques et d’antalgiques. Un suivi de la température est réalisé pendant toute la procédure d'implantation chirurgicale et des dispositifs de maintien de la normothermie tels que le système de couverture de réchauffement Bair Hugger© ou des tapis chauffants sont utilisés. Les protocoles de réanimation sont standardisés et réalisés par des vétérinaires chirurgiens spécialisés. Pendant et après ces procédures, des protocoles de prises en charge de la douleur sont systématiquement appliqués (anti-inflammatoires non stéroïdiens et/ou opioïdes). Les animaux sont hébergés systématiquement en groupe sociaux ou individuellement pour les besoins de l'étude, ils ont accès à un enrichissement environnemental multimodal (social, alimentaire, manipulatoire et physique) et dans des conditions environnementales d'hébergement contrôlées et maîtrisées (température et ventilation). Des points limites stricts et spécifiques sont appliqués tout au long du projet. Les transports d'animaux réalisés entre les 2 EU (35 km) seront réalisés à l'aide de véhicules de types camionnettes fermées, autorisés par la Direction Départementale de la Protection des Populations, ventilés, climatisés et spécialement équipés pour le transport des animaux vivants (dispositifs d'abreuvement, tapis et revêtements antidérapants, suivi et enregistrement des températures lors des trajets, système de surveillance vidéo des animaux). Les personnels en charge sont formés et titulaires du certificat de convoyeur (CCTROV).Un bilan intermédiaire en cours de projet sera effectué pour évaluer les dommages réellement subis par les animaux.
Choix des espèces
Les dispositifs testés dans ce projet doivent l’être sur une anatomie semblable à celle de l’Homme avec les mêmes dimensions. Les modèles utilisés ont fait l'objet d'études similaires et sont considérés comme appropriés à cette fin. - Le système cardio-vasculaire du mouton, du bovin, et du porc reproduisent fidèlement la physiologie cardiaque humaine et le processus de cicatrisation du coeur et des vaisseaux est similaire à celui observé chez l'homme. - La taille relative de ces modèles animaux permet une visualisation à l'aide d'équipements de chirurgie interventionnelle et d'imagerie standards chez l'Homme. - L'ovin est le modèle pertinent pour l'évaluation de la durabilité des dispositifs chez l'Homme. - Le modèle porcin est pertinent pour l'évaluation de la thrombogénicité des dispositifs ainsi que pour évaluer les systèmes d'ancrage des dispositifs. - Le modèle veau est pertinent pour sa taille et son fort développement thoracique. - L'ovin, le bovin et le porcin possèdent des cavités thoracique et abdominales qui permettent d'implanter les dispositifs d'assistance ainsi que les systèmes de transfert d'énergie associés. Les animaux utilisés pourront être des juvéniles ou adultes. L’objectif scientifique est d’avoir une anatomie de taille ou une situation clinique comparable à celle observée chez l’Homme.
Anticorps anti-TNF alpha et anticorps anti-IL6 pour le traitement curatif de l’arthropathie hémophilique dans un modèle murin d’hémophilie B
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Une aiguille est enfoncée dans le genou droit de souris hémophiles pour y provoquer un saignement, geste répété quinze jours plus tard sur la même articulation. 29 souris vont être utilisées ainsi, 24 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 un niveau léger, toutes tuées à l'issue. Le porteur écrit n'attendre aucune douleur après le réveil, et prévoit pourtant de poser nourriture et eau gélifiées au sol pour éviter aux souris de se redresser sur les pattes arrière compte tenu des douleurs du genou. La mise à mort est justifiée par le prélèvement d'un millilitre de sang, volume qu'il juge incompatible avec le maintien en vie de l'animal.
Objectifs
L’hémophilie est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur VIII (FVIII) de la coagulation pour l’hémophilie A et le facteur IX (FIX) pour l’hémophilie B. La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FVIII ou FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. Les saignements articulaires répétés, peuvent conduire à une atteinte articulaire handicapante appelée arthropathie hémophilique. Il s’agit d’une complication grave, de la maladie. La présence anormale du sang dans la cavité articulaire conduit à une inflammation et à terme à la destruction progressive de l’articulation. L’arthropathie hémophilique partage certaines caractéristiques avec d’autres maladies articulaires telles que la polyarthrite rhumatoïde. Comme dans le stade précoce de l’arthropathie hémophilique, chez les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, il existe une inflammation articulaire. Le pilier du traitement de l'hémophilie est la substitution du facteur de coagulation manquant, afin de prévenir les saignements récurrents responsables de l'arthropathie. Cependant, aucun traitement actuellement disponible ne cible spécifiquement l’inflammation articulaire, pour la faire régresser afin de bloquer la progression de l’arthropathie hémophilique, alors que les anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6 largement utilisés dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde entant que médicament de première intention pourrait être potentiellement efficace. Il s’agit de médicaments visant à contrôler l’inflammation. Il a été montré que les anti-TNF alpha étaient efficaces chez 60 à 70 % des patients avec polyarthrite rhumatoïde et les anti-IL6 ont montré une efficacité chez 55% des patients avec la polyarthrite rhumatoïde qui ont eu une rémission. Nous avons fait l’hypothèse que le ces anticorps pourrait réduire l’inflammation de la synovite comme traitement curatif chez les hémophiles et empêcher l’évolution de cette arthropathie handicapante, comme il fait dans la polyarthrite rhumatoïde. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité curative des anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6 pour traiter la synovite de l’arthropathie hémophilique et de bloquer ainsi l’évolution de l’atteinte articulaire chez les souris hémophiles B
Bénéfices attendus
La comparaison entre le traitement habituel par concentré de facteur de coagulation et les anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6, va permettre d’évaluer l’efficacité potentielle de ces médicaments dans le contexte d’arthropathie hémophilique, médicament couramment utilisée dans la polyarthrite rhumatoïde dont les dégâts articulaires sont similaires à ceux causés par l’hémophilie. Si les résultats de l’étude montrent une efficacité suffisante de ces anticorps dans l’arthropathie hémophilique, une étude clinique pourra alors être proposée pour évaluer l’efficacité de ces anticorps chez des patients hémophiles.
Procédures
Les souris seront séparées en 3 groupes : Groupe 1 : recevant un traitement par FIX pour traiter et prévenir les saignements tel qu’il est recommandé actuellement pour les patients hémophiles sévères Groupe 2 : recevant un traitement par FIX en association avec l’anticorps anti-TNF alpha avec l’objectif de contrôler voire faire régresser l’inflammation articulaire Groupe 3 : recevant un traitement par FIX en association avec l’anticorps anti-IL6 avec l’objectif de contrôler voire faire régresser l’inflammation articulaire Nous induirons un saignement articulaire responsable d’arthropathie chez des souris hémophiles B par ponction articulaire, réalisée sous anesthésie générale et médicament anti-douleur, selon la technique déjà publiée par notre groupe. Une mesure quotidienne du diamètre des genoux, sur 15 jours, étudiera la variation du diamètre qui sera exprimée en pourcentage par rapport à la valeur avant ponction. Le 15ème, une 2eme ponction sera réalisée sur le même genou (droit) afin de mimer des saignements articulaires à répétition qui caractérisent la maladie, le genou contrôle ne subira aucune ponction articulaire. Un traitement par FIX à demi-vie allongée tous les 4 jours sera administré chez toutes les souris et sera poursuivi pendant 15 jours. Les souris du groupe 2 et 3 recevront pendant 15 jours un traitement combiné associant l’anticorps anti-TNF alpha ou anti-IL6 2 fois/semaine le même jour que la prophylaxie par FIX afin de limiter le risque d’hématome post-injection. Ensuite, un prélèvement sanguin sera réalisé pour la mesure des marqueurs inflammatoires (IL6 et TNF alpha). Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress sont effectués sous anesthésie générale et administration d’un médicament anti-douleur. Les souris bénéficieront d’un enrichissement adapté améliorant leur bien-être et compte tenu des douleurs du genou, les conditions d’alimentation seront adaptées afin de leur éviter le redressement sur des pattes arrières avec nourriture et eau gélifiée au sol. Les souris seront mises à mort et les pattes arrière seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche d’une inflammation articulaire. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. deux ponctions articulaires : 2-3 min 2. Un prélèvement sanguin : 1 min 3. La mesure du genou siège d’arthropathie : 30 sec 4. des injections: groupe 1 : 2 min, groupe 2 et 3 : 3-7 min 5. Un prélèvement sanguin de 1mL et mise à mort : 3-5 min
Impact sur les animaux
Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane. • Après le réveil suite à l’induction de l’arthropathie et de l’injection, l’expérience de notre groupe ne nous fait attendre aucune douleur. Une possible gêne locomotrice peut être attendue, en cas d’apparition, de l’eau et de la nourriture seront mis à disposition dans la cage, au sol, pour éviter la station debout aux souris et le redressement sur les pattes arrière pour chercher leur nourriture. Les anticorps anti-TNF alpha et anti-IL6 peuvent augmenter le risque d’infection. Les règles d’asepsie seront attentivement appliquées afin de réduire ce risque (tonte, désinfection cutanée avant ponctions, essuyage par compresse stérile, gants stériles) et surveillance clinique quotidienne.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude sur les dégâts articulaires handicapants induits par l’hémophilie et son traitement. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisé dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesures et d’études sur le même animal. Les mesures biologiques réalisées sur une souris vivante sont corrélées aux mesures histologiques de cette même souris et chaque souris constitue son propre contrôle pour l‘étude de l’articulation du genou droit.
Raffinement
Application des points limites strcits et spécifiques du projet pour préserver le bien-être de l’animal avec en outre l'utilisation de l'analgésie et de l'anesthésie. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges, de l’eau gélifiée et de la nourriture dans la cage en cas de problèmes locomoteurs. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Evaluation de l’impact de deux molécules immuno-modulatrices sur le développement du Syndrome de Leigh chez la souris MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Dès qu'une souris atteint trois points sur la grille de score clinique, elle est mise à mort. 160 souris porteuses d'une mutation mitochondriale vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvements post-mortem. Elles reçoivent deux immunosuppresseurs dans leur nourriture à partir du sevrage, avec pesée, température rectale et notation clinique au moins trois fois par semaine, et passent trois séances de dix minutes sur rotarod à quarante jours, alors que le porteur situe le début des difficultés à se mouvoir vers quatre semaines. L'objectif déclaré est de vérifier si deux molécules déjà testées sur un autre modèle murin du syndrome de Leigh agissent aussi sur celui-ci, donc de généraliser un résultat publié à un second gène.
Objectifs
Il n'existe aucun traitement disponible pour la plupart des maladies mitochondriales, maladies génétique du métabolisme entraînant un handicap grave et une mort prématurée. Le syndrome de Leigh en est une des formes plus graves. Il est causé par des mutations dans de nombreux gènes différents affectant la fonction des mitochondries, les centrales énergétiques de nos cellules. Cliniquement, cette maladie affecte généralement le cerveau et les muscles. Une étude récente a rapporté un effet positif de deux médicaments agissant sur l'inhibition du système immunitaire chez un modèle de souris développant un syndrome de Leigh suite à l'inactivation d'un gène mitochondrial particulier. Le but de notre projet est de tester ces deux molécules sur un deuxième modèle de souris du syndrome de Leigh, impliquant un autre gène, afin de déterminer si ces deux traitements peuvent être généralisable à tous les patients atteints par cette maladie.
Bénéfices attendus
Le projet vise à étudier l'implication du système immunitaire en tant que mécanisme principal à l'origine du syndrome de Leigh et la possibilté d'approches thérapeutiques le ciblant . Si les résultats sont solides et montrent des améliorations significatives, cela devrait permettre le développement de traitements cliniques pour le syndrome de Leigh et potentiellement pour d’autres maladies mitochondriales.
Procédures
Traitement pharmacologique: administration de deux molécules thérapeutiques dans la nourriture, de l'âge de 21 jours jusqu'à la mise à mort de l'animal basée sur l'observation de signes cliniques. Basé sur une publication sur un modèle similaire, le traitement pourrait s'étendre sur 6 mois. Test de coordination motrice: les souris seront placées sur une machine (rotarod) permettant de vérifier leur capacité à coordonner les mouvements de leurs pattes. Il y aura une phase d'entrainement à l'âge de 30 jours, puis une phase de mesure à 40 jours. Basé sur des publications scientifiques, les souris restent en moyenne 10 minutes sur le rotarod, par mesure. Trois mesures seront effectuées, espacées de 15 minutes de récupération.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées sur ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (vers 4 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir, et enfin des difficultés respiratoires peu avant le décès (à 7-8 semaines). Les traitements pharmacologiques en question ont été déjà appliqués dans des études scientifiques publiés qui ne semblent pas attribuer effets indésirables spécifiques.
Devenir
Tous les animaux prévus sur ce projet seront mis à mort en fin de protocole expérimental en vue de prélèvements post-mortem
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle en absence d’autre modèles cellulaires qui permettent d’étudier la réponse du système nerveux à des immunotraitements in vivo. De plus, les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.
Réduction
Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique et les effectifs ont été calculés à l'aide d'un logiciel. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les analyses cliniques, pathologiques et moléculaires.
Raffinement
Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien-être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Pour limiter l’inconfort lié aux procédures, les manipulations seront réalisées par des personnes compétentes et expérimentées. Le bien-être des animaux fera l’objet d’un contrôle quotidien par le personnel de l'établissement utilisateur et du laboratoire. De plus, dans le cadre du protocole expérimental, à partir du début du traitement à lâge de 3 semaines, le poids corporel, la température rectale, la consommation alimentaire, l’état clinique seront évalués en aveugle au moins trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Une pesée supplémentaire sera effectuée le dimanche à partir de l’âge de 6 semaines. Un score sera attribué aux signes cliniques. Dès que les souris obtiendront un score de 3 points, elles seront mises à mort (point limite).
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de ses gènes est très similaire à celle de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, cela permettra de tester l'efficacité de molécules thérapeutiques sur le syndrome de Leigh à l'échelle d'un organisme par des observations concrètes sur la survie et l'évolution pondérale. Le début du traitement commencera dès le sevrage des animaux à 21 jours car les molécules testées étant dans la nourriture, il faut que les souris puissent se nourrir seules. Le traitement continuera jusqu'au moment de la décision d'euthanasier les souris, basée sur notre grille de score, car le critère principal d'efficacité du traitement pharmacologique est la survenue plus tardive des signes cliniques pathologiques.
Caractérisation des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le développement de l’ostéopathie induite par le méthotrexate (MTX) et efficacité des modalités thérapeutiques : évaluation des conséquences osseuses chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Ovariectomisées chez le fournisseur avant même le début du projet, les souris reçoivent ensuite une injection sous-cutanée hebdomadaire de méthotrexate, un groupe passant à une injection par jour cinq jours sur sept, et certaines portent une minipompe implantée. 90 souris vont être utilisées, 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 10 un niveau modéré, toutes tuées pour analyser la microarchitecture de leurs os. Le projet cherche à comprendre les atteintes osseuses provoquées par ce médicament, largement prescrit contre les rhumatismes, et à proposer un traitement. Le porteur affirme n'attendre aucune toxicité hépatique, rénale ou osseuse à la dose employée, et répartit les 90 souris en six groupes de 10 ou 20 sans expliquer ce qui fait varier les effectifs.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de préciser les mécanismes impliqués dans le développement des problèmes osseux liés au méthotrexate (MTX). En effet, les premiers cas ont été décrits dans le cadre des leucémies aigues chez des enfants, dans les années 70. Le méthotrexate a par la suite été largement et reste largement utilisé dans un grand nombre de rhumatismes (avec des doses de traitements moins importantes). Pourtant, il existe aussi des problèmes osseux à des doses faibles.
Bénéfices attendus
Les cas rapportés de problèmes osseux liés au Méthotrexate se multiplient ces dernières années. Ce traitement est fréquemment utilisé dans un grand nombre de rhumatismes. Ce travail a pour but d’avancer dans la compréhension afin de mieux identifier les sujets ou situations à risque, mais surtout de proposer un traitement adapté.
Procédures
Les animaux bénéficieront d'une ovariectomie en amont du projet auprès du fournisseur. Concernant les interventions, les animaux seront soumis à la réalisation hebdomadaire d'une injection sous-cutanée réalisée dans des conditions d'analgésie et d'anesthésie adaptées. Un groupe sera soumis à une injection journalière sous cutanée 5 jours sur 7 réalisée dans des conditions d'analgésie et d'anesthésie adaptées. Les injections seront de faible volume et rapide.
Impact sur les animaux
Pas de toxicité attendue du méthotrexate à cette dose que ce soit au niveau du foie, des reins ou osseux. Stress et douleurs lors des procédures (pose de minipompe et injections sous-cutanées) pris en charge par analgésie et anesthésie.
Devenir
Mise à mort de l'ensembles des 90 animaux pour analyse de la microarchitecture osseuse
Remplacement
Dans une optique de remplacement, ce projet s’associe à des travaux expérimentaux in vitro sur des cellules osseuses qui ne permettent pas d'englober l'ensemble des métabolismes mis en jeu car limité à un type cellulaire (contre 3 types de cellules osseuses fonctionnant conjointement dans un os). Par ailleurs, l'analyse osseuse sur animal vivant (comme par scanner) ne permet pas d'obtenir les informations recherchées, les anomalies étant d’ordre microarchitecturale.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit dans ce projet par l’utilisation de modèles icellulaires. La cohorte constituée de 90 souris sera répartie en 6 groupes expérimentaux (10 animaux/groupe ou 20 animaux/groupe). La taille de l’échantillonnage de chaque groupe a été définie à partir d’un test statistique. Le caractère variable entre les groupes entre 10 et 20 individus est basé sur les observations cliniques retrouvant une amélioration à l'arrêt du traitement par méthotrexate.
Raffinement
L'équipe appliquera un ensemble de démarches pour réduire au maximum le stress et la souffrance des souris utilisées dans ce projet. Les animaux bénéficieront d'une prise en charge par analgésie et anesthésie adaptée à la situation tout au long du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies avec jouets et tunnel. De plus, tout au long de la durée du protocole, les animaux suivront un contrôle quotidien avec questionnaire effectué par les chercheurs via un registre journalier et individuel. L'enrichissement sera modifié dans le groupe de souris bénéficiant de minipompes pour éviter tout frottemente et donc douleur sur la plaie (retrait du plastique et mise de carton ou coton). Le questionnaire fait ressortir les signes visibles de douleur et d’inconfort chez le rongeur. En cas d'atteinte des points limites décrits dans chacune des procédures, nous procèderons à la sortie de la souris du protocole.
Choix des espèces
La souris est le modèle répondant parfaitement à la problématique pour évaluer le tissu osseux sur ces deux versants. L'équipe a fréquemment utilisé ce type de souris permettant d’utiliser des protocoles de mise à mort bien connus. Le fait de cibler un sexe féminin exclusif répond à la problématique de la pathologie d'intérêt touchant de façon préférentielle (environ 80% des cas) des femmes. Enfin, l'utilisation de souris ovariectomisées de 12 semaines est aussi basée sur la description clinique des patients atteints (90% des femmes atteintes sont ménopausées)
Diffusion extravasculaire du variant facteur IX Padua et son rôle potentiel hémostatique dans un modèle murin d’hémophilie B
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Génétiquement privées de facteur IX, les souris de ce projet ne saignent pas spontanément mais risquent l'hémorragie au moindre traumatisme. 21 vont être utilisées, 16 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 un niveau léger. Chacune reçoit une injection quotidienne de facteur IX pendant cinq jours, puis une plaie vasculaire est pratiquée à une patte arrière sous anesthésie et les caillots formés sont comptés pendant quinze minutes. Toutes sont tuées, la mise à mort étant justifiée par le prélèvement d'un millilitre de sang total, volume que le porteur juge incompatible avec le maintien en vie.
Objectifs
L’hémophilie B est une maladie hémorragique héréditaire rare liée à déficit en facteur IX (FIX). La sévérité de l’hémophilie est définie par les taux de FVIII ou FIX plasmatiques. La forme sévère, où le taux du FIX est indétectable dans le sang, est caractérisée par des saignements spontanés surtout au niveau articulaire. La prise en charge recommandée est le traitement prophylactique par concentrés de FIX afin de réduire voire éviter les saignements spontanés. Cette prophylaxie peut être également effectuée par la thérapie génique qui permet au patient de produire son propre FIX. Le FIX est une petite protéine qui peut diffuser à l’extérieur des vaisseaux et en cas d’apport régulier de FIX (comme lors d’une prophylaxie au long cours) et y former un réservoir extravasculaire autour des vaisseaux. L’objectif de ce projet est d’évaluer le comportement extravasculaire d’un variant du FIX appelé FIX-Padua chez les souris hémophiles B, ce variant est utilisé pour la thérapie génique de l’hémophilie B chez l’homme.
Bénéfices attendus
Au travers de la comparaison des groupes de souris recevant un traitement par FIX-WT ou FIX-Padua, ce projet pourrait améliorer la compréhension des mécanismes extravasculaires du FIX, en particulier du variant Padua, et clarifier son potentiel à former des réservoirs tissulaires. Il permettra d’évaluer si cette accumulation extravasculaire contribue à une hémostase durable, même en l’absence de FIX plasmatique détectable. Ces résultats pourraient guider l’optimisation des stratégies de thérapie génique pour l’hémophilie B, en améliorant l’efficacité clinique et le phénotype hémorragique en réduisant les saignements sévères, notamment au niveau des articulations et des muscles.
Procédures
Les souris seront séparées en 2 groupes : Groupe 1 : traitement prophylactique par FIX naturel (FIX-WT) Groupe 2 : traitement prophylactique par le variant FIX-Padua Un traitement quotidien par FIX (naturel ou variant Padua) 100 UI/kg sera injecté chez toutes les souris et sera poursuivi pendant 5 jours. Ensuite, l’activité coagulante du FIX extravasculaire sera évaluée 7 jours après la dernière injection de FIX, en l’absence de tout résidu du FIX dans le sang. Pour cette évaluation, le nombre de caillots sanguins formés seront comptés pendant 15 minutes à partir d’une plaie vasculaire au niveau d’une patte arrière. Un prélèvement sanguin sera réalisé pour la mesure de FIX qui doit être indétectable. Tous les actes qui peuvent engendrer une douleur ou un stress seront effectués sous anesthésie générale et sous médicament anti-douleur. Les souris bénéficieront d’un enrichissement adapté améliorant leur bien-être. Les souris seront mises à mort et les pattes arrière et des organes seront disséquées pour l’étude histologique à la recherche du FIX extravasculaire. Les animaux seront soumis, sous anesthésie générale, à 1. Une plaie vasculaire : 2-3 min 2. Observation de formation de caillots sanguins : 15 min 3. Un prélèvement sanguin : 1 min 4. Une injection: 2 min 5. Un prélèvement sanguin de 1mL et mise à mort: 3-5 min
Impact sur les animaux
Au cours du projet, tous les gestes sont réalisés sous anesthésie à l’isoflurane. Le modèle de souris hémophile KO ne présente pas de saignement spontané mais un risque d’hémorragie en cas de blessure.
Devenir
La mise à mort est justifiée par la nécessité de prélèvement de 1mL de sang total, non compatible avec le maintien en vie de l'animal
Remplacement
La nécessité d’un modèle animal est justifiée par le besoin d’un modèle vivant, dynamique et doté d’un système vasculaire et locomoteur pour cette étude l’étude de la diffusion du FIX dans les tissus dont les articulations. La mise au point des techniques in vitro est réalisée au maximum avant l’utilisation des souris ce qui nous permet de conserver le modèle de souris hémophile, modèle éprouvé et fiable pour notre étude.
Réduction
En accord avec l’expérience acquise par le groupe, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre la validité statistique des résultats. De plus, les tests développés au laboratoire nous permettent d’effectuer un maximum de mesures et d’études sur le même animal.
Raffinement
Application de points limites stricts et spécifiques du projet pour préserver le bien-être de l’animal. Quand cela est possible, les souris sont maintenues en groupe par fratrie avec l’utilisation de biberon à longues tiges. Tous gestes traumatiques ou stressants seront réalisés sous anesthésies et analgésie.
Choix des espèces
La souris représente la seule espèce animale, après le chien hémophile, à permettre la mesure de l’activité des médicaments de l’hémophilie et d’étudier la destruction articulaire induite par la maladie. Il est important de préciser que la souris hémophile, paradoxalement à la forme humaine de cette maladie, n’est pas victime de saignement spontané et les saignements sont provoqués que par des traumatismes. Pour cette étude, nous allons utiliser des souris matures. Il est important de travailler avec des jeunes adultes dont la croissance est finie. Les souris très jeunes sont à éviter car leur croissance articulaire n’est pas encore terminée et les souris très âgées sont également à éviter en raison de la modification possible de la coagulation avec l’âge et par conséquent la tendance hémorragique.
Mesure de l’impact d’additifs alimentaires sur les performances zootechniques, le métabolisme, l’écosystème ruminal et le statut immunitaire chez la vache laitière en fonction de la teneur en protéine de la ration
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
Recevant successivement tous les traitements testés dans un dispositif en carré latin, sept vaches laitières en lactation sont réutilisées d'une période à l'autre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit jusqu'à trois prélèvements de contenu ruminal par sonde naso-œsophagienne, dix-huit prélèvements de fèces au rectum, dix-huit prélèvements d'urine obtenus par palpation sous la vulve et sept prises de sang, tous sur animal vigile. Le porteur reconnaît que la palpation répétée peut provoquer rougeur et sensibilité, et que la contention laisse les vaches inconfortables. L'essai mesure l'effet d'additifs alimentaires sur la production laitière, et chaque animal rejoint ensuite son aire d'élevage.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact d’additifs alimentaires sur les performances zootechniques de la vache laitière (quantité et qualité de lait produit) et de comprendre le mode d’action de ces additifs afin de fournir des recommandations d’utilisation sur le terrain (dose, type d’alimentation, statut physiologique de l’animal…). Afin de comprendre les modes d’actions, plusieurs leviers physiologiques seront étudiés : la modulation de l’écosystème ruminal, le métabolisme (digestibilité et bilan azoté) et le statut immunitaire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont : - évaluer les effets des additifs sur les performances de production laitière en quantité et en qualité, - comprendre le mode d’action des additifs et leurs effets sur l’écosystème ruminal, - évaluer les effets des additifs sur la digestibilité, - évaluer l’effet des additifs sur le statut immunitaire. L’évaluation de l’effet des additifs permettra ainsi de définir les meilleures stratégies alimentaires et d’identifier les axes d’amélioration pour 1) améliorer les bien-être des animaux, 2) augmenter les gains économiques des éleveurs, 3) réduire l’empreinte environnementale et 4) réduire l’utilisation des antibiotiques et à terme développer des modèles digestifs in vitro pour réduire et remplacer complétement ou partiellement l’utilisation des animaux ex expérimentation animale.
Procédures
Le prélèvement de contenu ruminal : le prélèvement sera effectué au maximum 1 fois/mois/animal (3 prélèvements maximum). La durée de l’intervention est de 5 minutes. Le prélèvement sera réalisé par sonde une heure avant le repas du matin. Les prélèvements de fèces : 6 prélèvements/vache/période (18 prélèvements maximum). La durée de l’intervention est de 2 à 5 minutes. Les prélèvements d’urine: 6 prélèvements/vache/période (18 prélèvements maximum). La durée de l’intervention est de 5 à 10 minutes. Les prélèvements de sang : 2 prélèvements/vache/période (6 prélèvements maximum), et un dernier prélèvement à la fin de l’essai sera réalisé sur chaque vache (1 prélèvements au maximum/vache). Soit un total de 7 prélèvements durant l’essai. La durée de l’intervention est de 2 à 5 mn. Tous les prélèvements seront réalisés sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les risques de lésions de l’œsophage sont extrêmement faibles car nous utilisons du matériel médical (Sonde naso-œsophagienne en PVC silicone pour poulain, Alcyon) suffisamment souple pour ne pas léser un organe élastique tel que l’œsophage. La cavité buccale, le pharynx et l'œsophage possède un épithélium malpighien soit un épithélium pavimenteux pluristratifié résistant l’abrasion. Néanmoins, même si le risque est très faible, il faudra vérifier que les animaux mangent bien après le prélèvement. Un contrôle visuel de ration distribuée sera effectué pour chaque vache. Ensuite à la fin de la journée, la quantité restante sera pesée pour évaluer les quantités ingérées. Une chute brusque et prolongée de l’ingestion (15-20%) déclenchera l’intervention d’un vétérinaire. Même si toutes les précautions seront prises pour atténuer les effets indésirables sur les animaux, il se peut que les animaux soient dans un état d'inconfort lors de leurs contentions pour les prélèvements de liquide ruminal ou du sang. La zone de prélèvement sanguin est pressée pendant 1 à 2 mn pour éviter l’apparition des hématomes. Néanmoins un petit gonflement de la zone piquée peut apparaitre. Après les prélèvements, les vaches restent sous contrôle. Les prélèvements urinaires se feront par palpation de la zone sous la vulve et peuvent engendrer selon la durée, une rougeur et une sensibilité à la touche de la zone concernée. Les prélèvements fécaux se feront directement au rectum en utilisant des gants humidifiés. Même si le geste est rapide, il se peut que les animaux soient dans un état d’inconfort.
Devenir
L’animal est ensuite libéré et rejoint son aire d’élevage
Remplacement
Une méthode alternative in vitro permettra de remplacer la méthode traditionnelle dite in sacco qui consiste à placer des sachets contenant 5 g d’aliment chacun dans le rumen des vaches à travers les canules. La méthode in vitro donnera une indication sur la dégradabilité des matières premières composant la ration. Elle permet aussi d’étudier l’écosystème ruminal. La conservation du liquide ruminal par cryopréservation permettra de remplacer les vaches donneuses de liquide ruminal. Pour cette procédure, nous ne pouvons remplacer complètement l’animal, mais on substitue une partie du protocole in vivo en in vitro.
Réduction
Les essais seront menés en un design expérimental en carré-latin. Ainsi, toutes les vaches recevront les différents traitements successivement. D’après des études statistiques, un minimum de 6 vaches (2 vaches par groupe et par période) et une (témoin) sont nécessaires à l’obtention de résultats interprétables. Cet effectif est en accord avec les études récentes portant sur les performances zootechniques des vaches ayant reçu un additif alimentaire à base de levure
Raffinement
Les prélèvements d’échantillons de fèces et d’urine se feront au même moment pour réduire au maximum la manipulation et la contention des animaux. Les animaux seront surveillés en permanence pour contrôler leur comportement et chaque risque de souffrance ou détresse. Les prélèvements fécaux directement au rectum et d’urine à des heures bien précises viennent remplacer l’utilisation des cages métaboliques considérées comme la méthode de référence pour mesurer la digestibilité et les bilans azotés. Au lieu de suivre l’ingestion journalière qui nécessite parfois une manipulation des animaux, des échantillons de rations distribuées et des échantillons fécaux seront analysés pour leurs compositions chimiques. Ensuite, des marqueurs type cendres insolubles dans l’acide seront utilisés pour estimer la digestibilité. Pour les prélèvements urinaires, par rapport à la méthode utilisée qui consiste à stimuler la zone sous la vulve par palpation, des gants humidifiés seront utilisés. La palpation ne sera pas en continue avec des petits temps de repos (Palpation-repos-palpation-repos…) jusqu’à la miction. En ce qui concerne le prélèvement de liquide ruminal, un système de lève tête sera utilisé pour bien positionner la tête de l’animal et faciliter l’entrée de la sonde à travers l’œsophage. Cette technique permettra de réduire le temps de manipulation. Des critères physiologiques comme la production laitière, l’état de la mamelle, l’ingestion, le poids et la note d’état corporel serviront comme critères de prise de décision. Des critères d’évaluation allant de 0 à 3 pour chaque critère seront établis avec 0 (état normal) et 3 (changement très important par rapport à la normale). Dans le cas d’un changement important, le recours à l’avis d’un vétérinaire sera pris en compte. Les prélèvements seront réalisés par du personnel qualifié et habitué aux gestes, à l’aide d’un cornadis adapté à la contention de bovins adultes et auquel les vaches sont habituées.
Choix des espèces
En ruminant, la vache est le modèle animal le plus utilisé pour comprendre le mode d’actions de produits et leurs effets sur les paramètres zootechnique, l’immunité et l’environnement. Pour répondre aux objectifs du projet, l’utilisation de l’animal est obligatoire. La mise en place de protocoles in vitro nécessite l’utilisation d’inoculum (contenu ruminal par exemple) provenant de l’animal dans le but d’alimenter les systèmes in vitro. Pour ces raisons, l’utilisation de bovins adultes est obligatoire. Dans ce projet, les animaux seront tous des animaux adultes en phase de lactation
Evaluation de la réponse inflammatoire suite à l’injection d’un vecteur délivrant de l’ARN dans un modèle de souris – MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections intraveineuses d'un vecteur lentiviral porteur d'ARN, à trois semaines d'intervalle, et sept prélèvements sanguins destinés à doser les cytokines. Le projet mesure la réaction inflammatoire au vecteur avant son usage chez l'humain, pour le compte d'une société qui a repoussé le démarrage de deux ans, le temps d'une restructuration et de ses levées de fonds. Le porteur énumère les méthodes disponibles sans animaux, cellules immunitaires en culture, organes sur puce, organoïdes, biobanques de tissus humains et simulation, avant de conclure qu'aucune ne permet d'évaluer une cascade inflammatoire dans un organisme entier.
Objectifs
L’étude de la réponse inflammatoire dans un modèle de souris est essentielle pour évaluer la sécurité, l’efficacité et la faisabilité de l’utilisation d’un produit à visée thérapeutique. Elle contribue à orienter son développement, optimiser les protocoles d’administration, et à garantir la sécurité de ce type de thérapie. Ce projet a donc pour objectif d’évaluer la réponse inflammatoire pouvant survenir après l’injection d’un vecteur non intégratif pouvant délivrer de l’ARN chez l’animal. C’est un requis pour l’utilisation future de ce vecteur in vivo, et notamment chez l’Homme à des fins thérapeutiques. L’injection intra veineuse sera testée, avec un rappel d’injection 3 semaines plus tard. Les analyses consisteront en un dosage de la sécrétion de cytokines dans le sang. MODIFICATION: ce projet démarre 2 années plus tard que prévu, en raison d'une restructuration de la société, priorisation des projets et finalisation des levées de fonds; d'où la demande de prolongation de la durée sur 4 ans au total. Par ailleurs, nous souhaitons rajouter un prélèvement sanguin avant l'injection des vecteurs, afin d'obtenir le niveau basal d'expression des cytokines.
Bénéfices attendus
Cette étude de la réponse inflammatoire chez l’animal va permettre : - d’évaluer la sécurité du produit en évaluant la réaction du système immunitaire; - d’identifier les caractéristiques du produit pouvant provoquer une réponse inflammatoire; - de prédire les réponses immunitaires humaines possibles.
Procédures
Les animaux recevront 2 injections par voie intraveineuse (durée 2-3 minutes). On réalisera 6 - MODIFICATION: 7 - prélèvements sanguins (durée 2-3 minutes)
Impact sur les animaux
Dans le cadre d’une étude de la réponse inflammatoire, l’administration in vivo d’un produit peut entrainer des effets indésirables, notamment des réactions allergiques, des effets toxiques…. L’administration in vivo du vecteur de transfert d’ARN par voie intraveineuse peut entrainer un stress ou une douleur chez l'animal, Par ailleurs, ces souris subiront des prélèvements sanguins pouvant également induire un stress.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue des procédures expérimentales. Etant donné que ces souris seront injectées avec un vecteur lentiviral, on ne pourra pas les ré-utiliser. Les animaux seront ainsi euthanasiés en fin de procédure expérimentale, pour ne pas les maintenir en vie inutilement.
Remplacement
Le Remplacement du modèle animal pour une étude de de la réponse inflammatoire peut se faire selon l'utilisation : - de modèles in vitro, avec des cellules du système immunitaires; - d’organes sur puce qui permettent de créer des modèles miniatures d’organes ou tissus humains; - de modèles bio-informatiques et de simulation; - de biobanques de tissus humains; - des organoïdes, version miniature et simplifiée d'un organe fabriqué in vitro et qui présente une anatomie et une fonction proches de la physiologie. La fonctionnalité du vecteur de transfert prévu pour cette étude est ainsi validée sur des modèles cellulaires in vitro en amont. Cependant, aucun de ces outils ne pourra générer l’ensemble des données attendues sur la réponse inflammatoire induite par l’injection d’un vecteur viral dans un modèle d’organisme physiologique entier. La réponse inflammatoire étant la somme d’une cascade de réponses physiologiques, elle est impossible à évaluer de façon exhaustive sans le modèle animal et doit donc s’étudier in vivo.
Réduction
La Réduction du nombre d’animaux lors de la mise en place d’une étude implique une réflexion sur la planification expérimentale pour laquelle la conception de l’étude vise à réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant des résultats statistiquement significatifs. Le design associé à ce projet prend en considération les objectifs fixés correspondant au minimum requis pour une étude statistique. Nous utiliserons ainsi 8 souris par groupe (sauf pour le groupe controle où un effectif de 4 souris sera suffisant), cet effectif constituant un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction du nombre d'animaux, en comparant les animaux ayant eu un vecteur non-intégratif, un vecteur intégratif ou le véhicule. Des études similaires antérieures ont notamment permis de réduire le nombre d’animaux tout en garantissant des données interprétables et statistiquement utilisables. Le nombre de contrôles peut ainsi être limité à 4 souris. Par ailleurs, 4 femelles et 4 males permettront d’évaluer la réponse inflammatoire potentielle après injection des vecteurs lentiviraux. Nous ne nous attendons notamment pas à un dimorphisme sexuel dans cette réponse.
Raffinement
Le Raffinement implique la mise en place de procédures assurant: - l’amélioration du bien-être des animaux pour minimiser la douleur et la détresse éventuelles des animaux participant à l’étude; - une surveillance non-invasive pour collecter les données sur le bien-être des animaux; - la présence de produits d’enrichissements dans les lieux d’hébergement des animaux. En particulier, nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation et les sites d'injection. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites le cas échéant pouvant entrainer l’euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. Lors des prélèvements sanguins, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Le cas échéant, des soins locaux par spray d'un antiseptique seront attribués. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires
Choix des espèces
La souris est l’un des modèles animaux les plus couramment utilisés dans ce type d’étude pour les raisons suivantes : - Similitudes génétiques, anatomiques et physiologiques avec l’Homme - Disponibillité et coûts - Simplicité de manipulation - variété de souches permettant de simuler des conditions pathologiques spécifiques si nécessaire Les souris qui seront utilisées auront entre 10 et 14 semaines, - MODIFICATION: entre 9 et 14 semaines, s’assurant ainsi de leur maturité et de leur taille adulte. Cela facilite la manipulation, la collecte d’échantillons et la réalisation des expériences à suivre.
Evaluation de l’efficacité de schémas thérapeutiques innovants humanisés reposant sur des combinaisons d’antibiotiques chez le rat infecté
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Jusqu'à 72 heures de perfusion continue par cathéter vasculaire, neuf prélèvements sanguins et deux heures d'anesthésie chirurgicale pour poser le dispositif : 706 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par une pyélonéphrite ou une péritonite, provoquée par administration ou par chirurgie, avec perte de poids attendue, prostration possible et isolement jusqu'à 72 heures. Tous sont tués pour compter les bactéries dans leur rein ou leur rate, le projet servant à caler des schémas posologiques de combinaisons d'antibiotiques avant l'essai clinique. Le porteur a retenu une lignée non consanguine parce que sa variabilité génétique reflète mieux, selon lui, la diversité des réponses humaines aux antibiotiques.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques constitue un problème de santé majeur. Un certain nombre d’options thérapeutiques sont toutefois apparues ces dernières années dans le traitement des infections sévères à entérobactéries résistantes, mais des résistances apparaissent. L'étude de nouvelles associations d’antibiotiques ainsi que l’optimisation des posologies sont donc nécessaires afin d’améliorer le traitement de ces infections sévères. Ce projet consiste à évaluer de nouvelles posologies chez des rats infectés soit par une pyélonéphrite, soit par une peritonite après perfusion continue de combinaisons d'antibiotiques permettant de reproduire des concentrations humaines chez l'animal.
Bénéfices attendus
Cette étude in vivo permettra d’évaluer de nouveaux schémas posologiques de ces combinaisons d’antibiotiques qui serviront de base solide pour décider quelles associations et quels schémas posologiques méritent d’être testés en essais cliniques chez l’humain. Cela représente une étape indispensable pour réduire les risques et optimiser la sécurité des patients lors des phases suivantes. À long terme, ce projet pourrait jouer un rôle clé dans la lutte contre les infections graves causées par des bactéries multi-résistantes. En proposant des stratégies thérapeutiques innovantes et validées, nous pourrons améliorer durablement la prise en charge clinique des patients, réduire la morbidité et la mortalité liées à ces infections, et répondre ainsi à un enjeu majeur de santé publique mondiale.
Procédures
Tous les animaux auront une anesthésie. Pour une partie des animaux, l'anesthésie durera 15 minutes pendant lesquelles l'infection sera provoquée par administration. Pour une autre, l'anesthésie durera 30 minutes au cours desquelles l'infection sera provoquée lors d'une chirurgie. Pour le reste des animaux, l'anesthésie durera environ 2 heures au cours desquelles l'infection sera provoquée et des cathéthers vasculaires seront placés lors d'une chirurgie. Les cathéters permettront la perfusion d'antibiotique et les prélèvements sanguins répétés. Sur ces animaux un tiers aura une perfusion de 24 heures au cours desquelles 3 prélèvements sanguins seront faits. Un tiers aura une perfusion de 48 heures au cours de laquelle 6 prélèvements sanguins seront faits. Un tiers aura une perfusion de 72 heures au cours de laquelle 9 prélèvements de sang seront faits.
Impact sur les animaux
Chirurgie : inconfort transitoire au réveil - une perte de poids attendue due à l'infection. Une prostration ou une perte de mobilité à 24 heures post-infection peut survenir. Isolement de l'animal pendant 72 heures maximum, Implantation de cathéters à demeure : gêne légère pendant la durée de la perfusion intraveineuse et pendant les prélèvements.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et détermination de la concentration bactérienne dans le rein ou la rate.
Remplacement
Dans ce projet, nous commencerons par tester différentes combinaisons de traitements in vitro afin de sélectionner celles qui sont les plus efficaces, comparées aux traitements classiques utilisés seuls ou en association. Cependant, avant d’envisager leur utilisation chez l’humain, il est essentiel de valider ces nouvelles approches chez des animaux infectés, pour vérifier qu’elles fonctionnent bien dans un organisme vivant. À notre connaissance, aucun autre modèle in vitro ou sur ordinateur ne permet aujourd’hui de mener ce type d’étude, qui apporte des informations sur les variations individuelles dans la manière dont les médicaments agissent et sont éliminés.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé pour pouvoir observer une différence claire dans la quantité de bactéries entre les groupes traités et non traités.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant 10 jours. Les procédures d'infection et les technqiues chirurgicales seront réalisées sous des conditions aseptiques et thermorégulées sous anesthésie générale et sous converture antalgique. Des points limites gradés et bien identifiés ont été établies afin d'obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations, ce qui permettra d'agir sans délai. Le système de perfusion utilisé au cours de cette procédure est un système commercial, validé, sécurisé et robuste, il permet une perfusion continue et de réaliser des prélèvements sanguins sans toucher l'animal ce qui réduit le stress.
Choix des espèces
Nous utiliserons des rats agés de 8 semaines ayant atteint la maturité physiologique, modèle couramment utilisé pour l'étude des médicaments. Nous avons choisi une lignée non consanguine qui présente une certaine variabilité génétique entre les individus ce qui permet de mieux refléter la diversité génétique dans les concentrations d'antibiotiques et la réponse aux antibiotiques observée dans la population humaine. De plus, leurs paramètres physiologiques, métaboliques et anatomiques sont bien connus, cela permet une interprétation fiable de des données chez le rat et donc une extrapolation des résultats à l'homme plus robuste.
Régulation de la réponse immunitaire anti-tumorale par des bactéries du tube digestif et prévention de la rechute par l’utilisation de virus ciblant spécifiquement les bactéries.
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour vérifier qu'une bactérie intestinale, Bacteroides fragilis, affaiblit la réponse immunitaire contre le cancer, puis l'éliminer par des virus qui l'infectent, 2 072 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever peau, tube digestif, foie et organes immunitaires. Elles reçoivent des injections de cellules cancéreuses ou immunitaires dans la veine de la queue sur animal éveillé, une irradiation détruisant leur système immunitaire, puis jusqu'à cinq gavages de bactéries ou de bactériophages sur 28 jours. Aucun analgésique n'est prévu, le porteur indiquant avoir fixé des critères assez précoces pour tuer l'animal avant que la douleur ne justifie un traitement.
Objectifs
Ce projet repose sur des données publiées ayant montré que la composition du microbiote digestif des patients ayant reçu une greffe de moelle pour le traitement d’un cancer du sang était associée à une augmentation du risque de rechute chez les patients dont le tube digestif était colonisé par une bactérie commensale, c’est-à-dire naturellement présente dans notre organisme, appelée Bacteroides Fragilis. Les objectifs de ce projet sont : (1) de confirmer que cette bactérie diminue la réponse immunitaire anti cancéreuse dans des modèles de souris porteuses de tumeur ou ayant reçu une greffe de moelle pour le traitement d’un cancer du sang, (2) et de montrer qu’il est possible d’utiliser un traitement sûr et spécifique pour éliminer la bactérie du microbiote digestif en administrant par voie orale un cocktail de virus, les bactériophages, qui infectent uniquement les bactéries mais qui sont sans effet sur les mammifères. Actuellement, ce type d’approche est déjà utilisé chez l’humain pour le traitement d’infections bactériennes résistantes aux antibiotiques, en utilisant des bactériophages capables de détruire les bactéries pathogènes, provoquant des maladies pour l’humain, et leur sécurité a déjà été établie.
Bénéfices attendus
Ce projet démontrera le lien entre certaines bactéries intestinales et la diminution de l’immunité anticancéreuse, ainsi que la preuve de concept qu’une thérapie par les bactériophages peut restaurer cette immunité et réduire les rechutes après une greffe de moelle osseuse ou traitement anticancéreux. En montrant pour la première fois que des bactériophages permettent de moduler très spécifiquement le microbiote pour renforcer la réponse antitumorale, il fournira le rationnel nécessaire au lancement d’essais cliniques chez l’humain. Cette approche répond à un besoin non couvert, les antibiotiques ou autres traitements anti-infectieux n’agissant pas à l’échelle d’une seule espèce microbienne et pouvant altérer l’immunité. Le bénéfice direct sera la mise en place des premiers essais cliniques utilisant des bactériophages ciblés pour réduire le risque de rechute après la greffe de cellules, conformément au brevet européen déposé sur cette indication.
Procédures
Le projet consiste à déterminer s’il existe des mécanismes d’interactions entre certaines espèces de bactéries commensales et la réponse immunitaire anti-tumorale afin de cibler et diminuer les risques de rechutes dans les cancers du sang. Pour cela, nous utiliserons plusieurs modèles expérimentaux consistant tous en l’injection de cellules (cancéreuses ou immunitaires) par voie intraveineuse (veine de la queue, durée d’environ 2 min comprenant la contention sur souris éveillée). Pour l’un des modèles, une injection sous cutanée (zone dorsale, durée moins d’une minute sur souris éveillée) de cellules cancéreuses sera réalisée. En amont des injections par voie intraveineuse, et en fonction du modèle expérimental, les souris subiront une irradiation permettant l’élimination du système immunitaire et donc cela permettra la prise de greffe des cellules à l’origine de toutes les cellules du sang (hématopoïétique). Une fois les modèles expérimentaux de cancer établis, les souris recevront par gavage oral sans anesthésie des solutions de bactéries commensales et/ou de virus dirigé contre ces bactéries (de un à cinq fois maximum sur 28 jours selon la procédure d’une durée d’environ 3min). De plus les fèces de ces souris seront récupérés afin d’étudier les micro-organismes présents. L’ensemble des procédures aura une durée d’environ 28 jours, à la suite desquelles les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur.
Impact sur les animaux
Trois procédures sont susceptibles d’être associées à des effets indésirables chez la souris : - l’injection de tumeur, par voie intraveineuse ou sous cutanée, en induisant une croissance tumorale, peut être source d’inconfort ou de douleur chez la souris. - l'apparition de la maladie de l'hôte contre le greffon peut entrainer une douleur chez la souris - enfin, la procédure de gavage utilisée pour la colonisation microbienne du tube digestif peut s’accompagner d’un stress temporaire pour l’animal. Dans de rares cas, une lésion du tube digestif pourrait être observée.
Devenir
Euthanasie des animaux pour permettre la récupération des différents organes associés au système immunitaire et les organes cibles de la maladie (peau, tube digestif et foie) et leur analyse en post-mortem
Remplacement
L’objectif du projet est de déterminer les mécanismes d’interactions entre certaines espèces de Bactéroïdes et la réponse immunitaire antitumorale afin de pouvoir les moduler et ainsi diminuer les risques de rechute. Les modèles cellules ne peuvent mimer l’ensemble des phénomènes mis en jeu dans un organisme vivant entier.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisés. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel de l’animalerie. Pendant les expérimentations, les animaux seront évalués tous les jours selon une grille d’évaluation comprenant différents aspects cliniques. Cette surveillance étroite permettra de détecter rapidement toute anomalie et de prendre les mesures nécessaires pour assurer le confort et la santé des animaux. Aucune utilisation d’analgésique n’est prévue car nous avons défini des critères suffisamment précoces qui conduiront à l'euthanasie de l'animal avant que la douleur ressentie ne nécessite une prise en charge avec un anti-douleur. Par ailleurs, dès qu’un affaiblissement d’une souris est observé, de la nourriture sera ajoutée dans la cage pour faciliter sa prise alimentaire. En cas de souffrance, la souris sera euthanasiée.
Choix des espèces
L’espèce animal choisie dans ce projet est la souris. Ces dernières ont une génétique et une physiologie (organes, tissus) très comparables avec l’Homme, ce qui permet de mieux comprendre les processus biologiques et les maladies chez l’humain. Et, le comportement de ce mammifère est bien connu, de ce fait, l’évaluation du bien-être ainsi que de la douleur liée à l’expérimentation peuvent être effectuées aisément (perte et aspect du poils, posture, comportement et isolement) permettant une prise en charge adaptée et rapide. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux de 8 à 10 semaines au début de la procédure. Ce stade de développement correspond à des jeunes adultes chez l’humain.
Identification de nouvelles stratégies thérapeutiques combinatoires afin d’améliorer les effets anti-tumoraux de la radiothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
3 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, une irradiation de dix minutes en état vigile, puis trois injections de médicament, avec pour nuisances attendues la perte d'appétit, la perte de poids et la prostration liées à la tumeur. L'objectif déclaré est d'augmenter l'efficacité de la radiothérapie en déclenchant le "cannibalisme cellulaire", un mécanisme déjà criblé in vitro sur tous les modèles tumoraux retenus. Le porteur affirme malgré ce criblage qu'il est "maintenant indispensable" de tester ces molécules sur l'animal, seul un organisme "vivant, entier" permettant selon lui d'étudier l'immunité antitumorale.
Objectifs
L'objectif du projet est de développer des nouvelles approches thérapeutiques pour augmenter l’efficacité de la radiothérapie en favorisant le déclenchement de la destruction des cellules tumorales par des cellules immunitaire.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet nous permettra d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques combinant la radiothérapie à un inducteur du cannibalisme cellulaire. Il nous permettra d’identifier les processus et acteurs impliqués dans la régression tumorale.
Procédures
Les animaux auront une injection de cellules tumorales sous anesthésie générale (durée 1 minute). Il auront ensuite une irradiation vigile, durée 10 minutes. Enfin, ils recevront 3 injections de médicament, sous anesthésie locale, durée 1 minute.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées aux symptômes tumoraux après greffe de tumeur : perte d'appétit, perte de poids et prostration des animaux. Des nuisances transitoires légères sont attendues (stress et douleur), liées au rasage du flanc droit de la souris, et aux injections.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés pour caractériser et définir la réponse immunitaire associée à la régression tumorale induite par les traitements.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier l’immunité anti tumorale dans sa globalité avec toutes les interactions nécessaires (système immunitaire, voies hormonales, médiateurs physiologiques). Cet environnement est impossible à reproduire dans toute sa complexité et sa régulation in vitro ou ex vivo (un de nos objectifs étant de comprendre les mécanismes immunitaires mis en place contre les cellules entotiques). Etant donné que la détection du cannibalisme cellulaire et de la sénescence dans des cancers du sein semble prédire in vitro la réponse clinique des patients aux traitements neo-adjuvants (article actuellement soumis et en évaluation à Nature) il est maintenant indispensable de tester l'effet anti-tumoral de ces modulateurs in vivo sur des modèles murins .
Réduction
Tous les modèles des tumeurs solides qui seront utilisés dans ce projet sont déjà criblés et validés in vitro pour leur grand potentiel d’induire le cannibalisme cellulaire en réponse à la radiothérapie et en combinaison avec les molécules radio-sensibilisantes. Les nombres d'animaux par lots ont été déterminés par calcul de puissance. Des tests statistiques non paramétriques seront utilisés pour les comparaisons entre groupe témoin et les groupes traités (analyses des résultats).
Raffinement
Les animaux seront pesés une fois par semaine et examinés quotidiennement pour observer leur comportement.Les injections de cellules tumorales seront réalisées sous anesthésie générale. Les injections seront réalisées après anesthésie locale. En cas de douleur, les animaux recevront un antalgique. En cas de perte d'appétit ou d'amaigrissement, les animaux auront un aliment adapté, appétent, plus riche et plus préhensile. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Les lignées de souris ont été choisies pour leur capacité à développer rapidement et efficacement des tumeurs murines ou à partir de cellules humaines, et pour l’homogénéité et donc la fiabilité des résultats que l’on peut générer avec ce modèle (souris congéniques, avec recul important sur les données antérieures). Ces modèles font partie des modèles les plus utilisés dans la recherche en cancérologie Nous allons utiliser des animaux à maturité sexuelle. Age 8-12 semaines. Nous étudions le système immunitaire adulte. Nous savons que les animaux trop jeunes n’ont pas atteint une maturité immunologique; de plus les animaux trop vieux ont un système immunitaire moins performant.