Procédures modérées

Opérés une journée pour l'implantation d'électrodes chroniques, puis une seconde journée pour que leurs neurones à ocytocine soient transfectés par un virus, 12 ouistitis subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut rester cinq ans dans le projet, avec des sessions d'enregistrement de une à trois heures, jusqu'à cinq fois par semaine, et des examens d'IRM et de TEP sous anesthésie générale. L'objet déclaré est de comprendre comment le cerveau des primates encode les échanges vocaux entre congénères et ce que l'ocytocine y modifie. Le porteur justifie le choix du marmoset par sa petite taille et ses "capacités cognitives inférieures" à celles du macaque, présente l'imagerie comme un raffinement qui permet d'envisager un placement en sanctuaire, et prévoit six individus réutilisés dans un autre protocole pour six désimplantés et mis en retraite.

Objectifs

Pour les primates, humains compris, les signaux acoustiques sont essentiels pour communiquer. Grâce à leurs capacités cognitives, ils sont capables d’ajuster leur production vocale selon le contexte social, mais on ne sait pas encore comment les neurones encodent les vocalisations des congénères et produisent une réponse appropriée. Ce projet permettra d’enregistrer les neurones et d’étudier les vocalisations de singes marmoset dans différents contextes sociaux, dans des conditions semi-naturelles, les animaux se déplaçant librement dans la colonie. En parallèle, les neurones à ocytocine, neurohormone impliquée dans les comportement sociaux et espoir thérapeutique, seront stimulés pour comprendre son influence sur la communication acoustique des primates. Cette approche multidisciplinaire et multisite (un établissement pour l'hébergement, le comportement et l'electrophysiologie, un autre établissement pour la neuroimagerie) permettra de mieux cerner le rôle de l'ocytocine et d’en savoir plus sur le fonctionnement du cerveau des primates lors de conversations naturelles dans différents contextes sociaux.

Bénéfices attendus

Le projet produira plusieurs résultats significatifs. Sur le plan scientifique, il révélera comment le cerveau encode la communication accoustique, c'est à dire les échanges vocaux entre individus, ainsi que les liens affiliatifs entre eux. Cela apportera une nouvelle perspective au domaine, où les bases neurales de la perception et de la production vocales sont étudiées ensemble dans le cadre d'une interaction sociale naturelle : les conversations. De plus, il montrera le rôle du neuropeptide ocytocine (OT) dans ce processus. Cela est crucial car ce sera la première preuve causale que l'OT endogène module le comportement social des primates, et, indépendamment, la communication acoustique. Ainsi ce projet avancera nos connaissances sur les bases neurales et chimiques de l'affiliation entre individus.

Procédures

Les animaux seront d'abord habitués à l'environnement et aux expérimentateurs du laboratoire (1 à 3 mois). Ils seront notamment entrainés à coopérer afin que les expériences se déroulent sans stress. Ensuite, des examens de neuroimagerie nous permettrons d'identifier les structures cérébrales d'intérêts (une demi journée par examen). Les animaux seront implantés avec des électrodes chroniques (chirurgie d'une journée), et leurs neurones à ocytocine seront transfectés pour pouvoir les activer ou les inhiber sur commande (chirurgie d'une journée). Enfin, nous enregistreront conjointement l'activité cérébrale et les vocalisations des sujets lors de leur comportements naturels avec leurs partenaires, directement dans la pièce d'hébergement (sessions de 1 à 3h, entre 1 et 5 fois par semaine, pendant la durée du projet). Il s'agit d'une seule procédure modérée, chaque animal participera à ce projet pendant une durée maximale de 5 ans. L'hébergement, l'entrainement, les chirurgies, les expériences comportementales et neurophysiologiques auront toutes lieu dans l'EU 1/2. Seuls les examens de neuroimagerie, IRM et TEP, seront réalisés dans l'EU 2/2.

Impact sur les animaux

1. Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale, destinée à l'implantation d'électrodes et l'injection de virus AAV. La chirurgie suscitera un inconfort post-opératoire passager (quelques jours), maitrisé par l'administration d'analgésique. Par ailleurs, une légère perte de poids et une réduction de la mobilité sont possibles selon le temps pris par l'individu pour s'adapter à son implant (quelques jours). 2. Pour les tests comportementaux, ceux-ci auront lieu directement dans la cage d'habitat ou la cage d'expérimentation (enregistrement passif de l'animal libre). Cette cage d'expérimentation sera placée soit devant la cage d'habitat ou une autre cage, face à un autre individu. L'impossibilité d'interaction tactile et la nature prosociale des marmosets préviendront l'apparition de stress fort, mais une anxiété légère est possible. De plus, la pose de l'équipement d'enregistrement (neurologger + veste avec micro et ecg) nécessite une manipulation à la main par les expérimentateurs, ce qui peut également être stressant. Ce stress et cette anxiété seront graduellement réduits avec l'habituation des individus à ces situation (quelques semaines). 3. Les animaux seront aussi soumis à des examens d'IRM, de TEP (Tomographie à émission de positon), pour lesquels ils seront mis sous anesthésie générale, ce qui provoquera un léger stress lors de l'induction ainsi qu'un inconfort (quelques heures) au réveil. 4. La désimplantation ne laisse pas de séquelle (hormis une cicatrice), la peau et l’os se cicatrisent. Comme toutes les procédures chirurgicales, elle peut comporter des risques d’infection, ou plus rarement encore, entraîner des crises d’épilepsie. Dans l’éventualité où une infection ou des crises d’épilepsie se produiraient, une médication appropriée d’antibiotiques ou d’antiépileptiques serait administrée à l’animal, sous l’avis de notre vétérinaire. De même que pour l'implantation, toute douleur post opératoire sera traitée par analgésique (quelques jours).

Devenir

A la fin de la procédure, les singes seront réutilisés dans un autre protocole ou bien désimplanteés et replacés pour une mise en retraite. Cette décision sera prise par la Structure du Bien être Animal au cas par cas et avec l'accord des responsables et du vétérinaire référant.

Remplacement

Les modèles in silico du cerveau ne sont pas encore assez évolués pour simuler le comportement spontané de primates. Il est donc nécessaire d'utiliser un modèle animal. Le choix d'un modèle primate est justifié par les questions spécifiques du projet qui s'intéressent justement à la différence des effets de l'ocytocine chez le rongeur et chez le primate, ainsi qu'aux bases neurales de la communication acoustique du primate. L'OT module-t-elle le comportement social et l'activité cérébrale chez les primates comme elle le fait chez les rongeurs ? Comment les circuits cérébraux spécifiques aux primates (ACC) encodent-ils la communication acoustique ? Comment le contexte social riche et spécifique des primates influence-t-il la production vocale ? Pouvons-nous infecter et manipuler les neurones de primates en utilisant des AAV périphériques ? Nous avons sélectionné le marmoset, pour remplacer le modèle classique qu'est le macaque, en raison de sa plus petite taille, de ses capacités cognitives inférieures ainsi que par sa proximité phylogénétique plus lointaine et surtout du fait de son riche comportement acoustique et pro social.

Réduction

La principale réduction du nombre d'animaux vient des technologies utilisées, les électrodes choisies pour ce projet ont de nombreux contacts et sont implantées de manière chronique et ont une longue durée de vie, ce qui permet d'enregistrer beaucoup de neurones en peu de temps, et d'utiliser un même singe pour toutes les étapes du projet. Ainsi une grande quantité de données sera extraite de chaque session et de chaque singe impliqué, ce qui au final réduit le nombre de session et d'animaux nécessaires. Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations (n =12 selon le calcul de puissance).

Raffinement

Plusieurs éléments de raffinement sont mis en oeuvre : Recours à l’imagerie (IRM et TEP), qui se substitue pour la plupart des animaux à l’histologie post-mortem et permet d’envisager leur replacement en sanctuaire à l'issue des expériences. Durant chaque transport, les animaux seront sédatés à la kétamine. Entrainement des singes via du renforcement positif, ce qui permet de les manipuler sans contention. De plus, l'intégralité des expériences seront conduites en conditions semi-éthologiques, c’est-à-dire en conditions expérimentales où les animaux sont libres de leurs mouvements et peuvent se déplacer et interagir avec des objets ou des congénères. La différence entre conditions purement éthologiques et semi-éthologiques est que ces dernières n’adviennent pas en milieu naturel. Ces conditions sont rendues possibles grâce à notre laboratoire d’enregistrement sans fil où les animaux pourront se déplacer librement et se comporter d’une manière naturelle. Surtout, ces enregistrements se déroulent directement dans ou à côté de la cage d'hébergement, à l'intérieur de la salle de stabulation, ce qui enlève le stress d'une sortie de cage prolongée. Ces conditions expérimentales dans lesquelles les animaux sont testés constituent un élément de raffinement important. De plus l'hébergement des marmosets se fera dans de grandes cages (1.7 voir 3.4m^3 pour deux animaux) ce qui est supérieur, relativement à leur taille, à ce qu'on les macaques en laboratoire. Tous les actes chirugicaux seront fait sous anésthésie et avec un traitement analgésique. Enfin, un traitement humain des animaux sera assuré par des points limites liés à la douleur éventuelle suite à la chirurgie ou un inconfort lié à un stress chronique.

Choix des espèces

Les aires de la communication acoustique et de l'affiliation ne sont pas équivalentes entre les rongeurs et les primates. Ces derniers ont en effet développé un cortex cingulaire antérieur qui leur est unique, en terme de connectivité et de type de neurones. Par ailleurs, les primates ont une cognition sociale bien plus élaborée et complexe que celle des autres modèles. Dans l'optique de transférer les connaissances acquises par le présent projet à l'humain, et notament à des patients, il est donc crucial de réaliser ces expériences sur un primate non humain. Enfin, un des objectifs du projet est de tester si l'on peut manipuler le comportement social des primates via le système ocytocinergique, comme on a pu le faire chez le rongeur. Il est donc obligatoire d'utiliser un primate non humain pour répondre à cette question. Les animaux utilisés seront adultes. Ce stade permet de documenter les bases neuronales d’un sujet normal adulte et sain, présentant un système de communication et d'affiliation dévelopés.

Les dix juments ne sont pas tuées à l'issue, le porteur prévoyant de les réutiliser dans d'autres procédures après un temps de repos. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, à raison de six prélèvements par an au maximum. Chaque prélèvement d'ovocytes par ponction transvaginale dure moins de trente minutes, sous sédation et analgésie sur animal vigile, et il est précédé de cinq à six examens gynécologiques espacés de douze à quarante-huit heures. La finalité est commerciale, mettre sur le marché français des embryons équins produits par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, la filière équine étant décrite comme ayant un "besoin" continu d'amélioration génétique.

Objectifs

La filière équine a un besoin continu d'amélioration génétique. Le développement de l’ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection) pour les équidés en France va faciliter des croisements et la reproduction de juments ou téalons qui jusqu'ici n'étaient pas fertiles et aussi faciliter la production d'embryon destinés à l'implantation sur des juments porteuses. A l’heure actuelle, il n’y a pas encore de laboratoire qui puisse assurer la production et la commercialisation d’embryons équins par technique ICSI sur des ovocytes équins en France. Tous les ovocytes récoltés des chevaux/ poneys en France sont prélevés sur des juments vivantes puis envoyés à l’étranger pour la production des embryons post-ICSI

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la validation d’une technique in vitro d’ICSI pour la mise à disposition d’embryons équins sur le marché français.

Procédures

Les interventions sont équivalentes à celles que subiraient les juments à qui on prélèvera des ovocytes avant de réaliser une fécondation in vitro. Elles consistent en des examens gynécologiques répétés plusieurs jours de suite, ainsi que des prélèvements ovariens par ponction transvaginale. Les examens gynécologiques durent moins de 5 minutes et sont au nombre de 5 à 6 avant chaque prélèvement, espacés de 12 à 48 heures. Ils sont plus fréquents à l’approche du prélèvement. Le prélèvement dure moins de 30 minutes. Un maximum de 6 prélèvements par an est prévu.

Impact sur les animaux

Les nuisances de ces interventions sont un légère douleur locale liée à l'examen gynécologique. Les ponctions ovocytaires sont une douleur passagère liée à l'introduction d'un aiguille par voie intra abdominale.

Devenir

Les juments sont temporairement utilisées dans ce projet, qui prévoit des pratiques de médecine vétérinaire classique, sans impact sur leur santé. Elles pourront alors être réutilisées pour d'autres procédures après un temps de repos.

Remplacement

La technique d'ICSI est connue dans plusieurs espèces animales et publiée. Le laboratoire connaît bien la façon de traiter les cellules et les cultiver. En revanche, il pour la mise au point précise de la technique, il est nécessaire de réaliser quelques essais avec des ovocytes prélevés sur juments vivantes en bonne santé pour valider et standardiser les techniques.

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre nécessaire à réaliser des prélèvements d'ovocytes jusqu'à ce que la technique soit validée et standardisée. On ne peut pas en revanche trop réduire le nombre de juments pour éviter de trop solliciter un nombre trop réduit de juments.

Raffinement

Un programme d'enrichissement sera mis en place. Ce dernier comprendra des enrichissements structuraux (congénère dans le box adjacent pour un contact visuel, olfactif et sonore permanent, une pierre à sel laissée à disposition), une litière confortable et épaisse de paille pour le repos en décubitus, un jouet (ballon), des friandises (carottes, bonbons) distribués quotidiennement par les soigneurs, de la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress. Les juments, issues d’un troupeau à visée pédagogique, seront déjà acclimatées à leur environnement (lieu de vie, pré et boxe, personnel, congénères) depuis plusieurs mois et ont déjà bénéficié d’une période d’habitation (training aux actes techniques et manipulations) avant le début du projet. Ce programme d’habituation est associé à du renforcement positif (ex : distribution de récompenses) ce qui permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations. Les animaux seront suivis individuellement et trois fois par jour tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur. Un examen échographique de contrôle des ovaires et de l’utérus sera effectué à 24h post-aspiration. Le personnel soignant veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal. Les temps de repos accordés aux juments entre les prélèvements respecteront les recommandations éthiques en vigueur au sein de l’établissement utilisateur. Les prélèvements seront réalisés sous sédation et analgésie. Un traitement analgésique post-opératoire sera également mis en place. Les prélèvements ovocytaires seront réalisés sur animal vigile et sédaté, car l'anesthésie générale engendre un stress et un risque plus important pour l'animal que la procédure elle-même. Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge et hospitalisé en clinique spécialisée, selon les recommandations du vétérinaire. L’arrêt du protocole sera envisagé si l’animal ne répond pas au traitement ou si son état se dégrade (sous la responsabilité du vétérinaire).

Choix des espèces

L’objectif est de pouvoir produire des embryons équins in vitro ; il est indispensable d'avoir recours à l’espèce animale cible. Des juments adultes, sexuellement matures (> 3 ans) seront utilisés dans ce projet. Les juments de plus de 15 ans à fertilité potentiellement diminuée, ne seront pas utilisées afin de limiter les échecs de la récolte ovocytaire.

Incision d'un centimètre à l'abdomen ou au crâne sous guidage stéréotaxique, injection de cellules tumorales, suture par clips retirés sept à quatorze jours plus tard sous une nouvelle anesthésie : 696 souris passent par cette chirurgie. 796 souris en tout vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une centaine d'entre elles développant spontanément des tumeurs mammaires vers vingt-quatre semaines. Il s'agit de faire exprimer aux cellules cancéreuses un antigène synthétique, un drapeau artificiel que des anticorps ou des macrophages génétiquement modifiés viendraient reconnaître, sur des protocoles pouvant durer huit mois. Le porteur écrit que l'isolement des animaux sera évité, puis qu'un isolement temporaire pourrait être envisagé si les clips de suture provoquent des comportements agressifs entre souris.

Objectifs

Ce projet vise à développer une nouvelle approche d’immunothérapie contre le cancer, capable de s’attaquer à un grand nombre de tumeurs solides, en contournant l’une des principales limites actuelles : la variabilité des antigènes tumoraux d’un patient à l’autre, voire au sein d’une même tumeur. Notre idée repose sur l’introduction dans les cellules cancéreuses d’un antigène synthétique, une sorte de « drapeau » artificiel qui signale la cellule cancéreuse au système immunitaire. Ce marquage pourrait ensuite être reconnu par des traitements immunothérapeutiques spécialement conçus pour cibler cet antigène. Le projet se structure autour de trois axes complémentaires : 1. Création de modèles de tumeurs exprimant l’antigène synthétique Nous développerons des lignées de cellules tumorales murines, notamment de cancer du sein et de tumeurs cérébrales (gliomes), modifiées pour exprimer cet antigène à leur surface. Ces lignées seront ensuite utilisées dans des souris avec un système immunitaire fonctionnel, afin d’étudier si le système immunitaire est capable de reconnaître et de détruire les cellules cancéreuses ainsi marquées. 2. Utilisation de vecteurs viraux pour délivrer l’antigène dans les tumeurs Nous utiliserons des petits virus à ADN non pathogènes, déjà bien connus pour leur sécurité, pour introduire le gène de l’antigène synthétique directement dans les cellules tumorales. Ces virus seront conçus pour cibler uniquement les cellules cancéreuses, grâce à des systèmes de régulation activés spécifiquement dans l’environnement tumoral. L’objectif est de garantir une expression du marqueur uniquement dans la tumeur, sans affecter les tissus sains. 3. Développement de traitements ciblés contre cet antigène Enfin, nous concevrons deux types d’immunothérapies ciblant spécifiquement cet antigène : des anticorps thérapeutiques, et des macrophages génétiquement modifiés (CAR-M). Ces cellules modifiées seront capables de reconnaître, attaquer et éliminer les cellules cancéreuses marquées, tout en stimulant une réponse immunitaire plus large contre la tumeur.

Bénéfices attendus

Ce projet représente une avancée majeure dans le développement d’une nouvelle immunothérapie capable de cibler spécifiquement les tumeurs solides du sein et du cerveau, en combinant l’utilisation d’un antigène synthétique, de vecteurs viraux adaptés et de traitements innovants tels que les anticorps thérapeutiques et les macrophages génétiquement modifiés (CAR-M). À court terme, il permettra de surmonter les limites des thérapies actuelles en offrant une méthode plus efficace et sécurisée pour éliminer les cellules tumorales, tout en limitant les effets sur les tissus sains. À plus long terme, cette approche pourrait être étendue à d’autres types de cancers solides, élargissant ainsi son impact thérapeutique. Par ailleurs, le projet vise à établir un protocole robuste pour l’intégration de cette stratégie dans les traitements cellulaires de nouvelle génération, améliorant la précision et la sécurité des immunothérapies. Enfin, si les résultats précliniques sont prometteurs, ce travail ouvrira la voie à une première application clinique, offrant une nouvelle option aux patients souffrant de tumeurs résistantes et contribuant ainsi à améliorer significativement leur prise en charge.

Procédures

Le projet se déroulera en 5 parties dont plusieurs étapes sont communes. Une partie des animaux (696 souris) sera pesée (1 min) puis recevra une injection d'anti-douleur (30 sec) avant d'être anesthésiée par voie gazeuse (durée anesthésie : 20 min). Sous anesthésie, une incision de 1 cm maximum sera réalisée au niveau de l'abdomen (348 animaux) ou du crâne à l'aide d'un appareil de guidage spécifique (348 animaux) (durée : 1 min). Des cellules tumorales seront alors injectées au niveau du site (1min) et une suture sera réalisée au moyen de clips (1 min). Les clips seront retirés après cicatrisation (7 à 14 jours) sous anesthésie gazeuse (durée : 5 min). Pour les modèles cérébraux (348 animaux), un système de canule de traitement sera mis en place afin de limiter de multiples interventions chirurgicales pour le traitement des tumeurs. Le poids des souris sera évalué 2 fois par semaine (1 min) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine au moyen d'un pied à coulisse (348 animaux ; 2 min) ou par imagerie sous anesthésie (348 animaux ; durée anesthésie : 20 min). Pour l'imagerie, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus sous anesthésie à l’aide d’un masque. Ils recevront ensuite l’injection d’une molécule permettant la réalisation de l’imagerie (durée : 30 sec). Dans les parties 1 et 2, 32 animaux recevront un traitement dans leur eau de boisson. Dans les parties 3, 4 et 5, une semaine après l'injection des cellules tumorales, 536 animaux recevront 1 à 2 injections de petits virus à ADN non pathogènes ou d’immunothérapies espacées de 4/5 jours (durée : 1 à 6 min) au niveau de la tumeur ou par voie générale. Pour 250 souris, cette injection se fera sous anesthésie gazeuse (durée 20 min). En parallèle, nous utiliserons dans la partie 5, des animaux (100 souris) développant spontanément des tumeurs au niveau mammaire à 24 sem. d'âge environ. Le poids des souris sera évalué 2 fois /semaine (1 min) et la croissance des tumeurs sera mesurée 2 fois par semaine avec un pied à coulisse (2 min). Ces animaux recevront 1 à 2 injections de petits virus à ADN non pathogènes ou d’immunothérapies espacées de 5 jours (durée : 1 à 6 minutes) au niveau de la tumeur. Les animaux seront surveillés quotidiennement selon des critères précis. Au moindre signe de souffrance, les animaux seront mis à mort selon la méthode réglementaire définie (durée max des procédures : 8mois).

Impact sur les animaux

Les procédures que nous prévoyons de réaliser pourraient être à l’origine d’un stress lié à la manipulation. De plus, le développement de tumeurs sur l’abdomen de l’animal ou au niveau de la zone subventriculaire du cerveau des animaux pourrait être à l’origine d’une faible gêne de la mobilité ou encore une potentielle perte de poids de l’animal. L’étape initiale d’injection des cellules nécessitant une anesthésie gazeuse, les animaux pourraient souffrir de stress au cours de cette manipulation qui serait de quelques minutes (2 ou 3 minutes jusqu’à l’anesthésie complète). Les pesées et mesures de masse tumorale pourront également conduire à un stress léger de courte durée (1 minute) répété deux fois par semaine. Malgré les précautions prises, l’utilisation de clips pour la suture des animaux après injection des cellules cancéreuses pourrait provoquer un inconfort ou des comportements agressifs inter-individuels jusqu’à la cicatrisation complète (5 à 7 jours). Dans ce cas, un isolement temporaire pourrait être envisagé après avis de la structure de Bien-être des Animaux et en accord avec les recommandations ministérielles. Les cellules injectées conduisant à la croissance tumorale et potentiellement à la dissémination de métastases, cette dernière pourrait avoir un effet sur le comportement des animaux qui sera étroitement surveillé.

Devenir

À l’issue des procédures expérimentales prévues dans ce projet, tous les animaux seront mis à mort selon les normes éthiques en vigueur, afin de limiter toute souffrance inutile et de permettre la récupération des tissus pour analyses scientifiques. La mise à mort interviendra soit à la fin du protocole expérimental planifié, soit de manière anticipée si des signes cliniques de souffrance, de détresse ou de dégradation de l’état général sont observés.

Remplacement

Dans un modèle cellulaire, nous avons développé l’antigène synthétique et confirmé son adressage à la membrane plasmique des cellules cancéreuses mammaires et de gliome par différentes techniques. Nous avons également établi des lignées cellulaires stables exprimant l’antigène synthétique, ainsi que des lignées à expression qui peut être induite. Ces cellules ont été cultivées dans des conditions avec très peu d’oxygène et l’expression de l’antigène a été vérifiée à l’aide des mêmes techniques. Par ailleurs, des co-cultures ont été réalisées entre les cellules cancéreuses exprimant l’antigène synthétique et les macrophages CAR évaluant ainsi leur capacité à reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. Ces résultats confirment la pertinence de poursuivre par des études dans un modèle animal, essentielles pour valider nos hypothèses dans un environnement biologique plus complexe et pour développer de nouvelles stratégies d’immunothérapie.

Réduction

Nous avons mis en œuvre plusieurs stratégies pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant des résultats robustes et statistiquement significatifs. Tout d’abord, des expérimentations préliminaires dans des cellules ont permis de sélectionner l’antigène synthétique optimal et les conditions optimales pour l’efficacité des immunothérapies (macrophages CAR et anticorps thérapeutiques). Ces études incluent le développement et l’analyse de lignées cellulaires stables ou pouvant être induites ainsi que des co-cultures pour valider les interactions immunitaires. Ensuite, les calculs de puissance statistique ont été réalisés pour minimiser le nombre de souris nécessaires par groupe tout en assurant une détection fiable des différences biologiques. Enfin, des techniques avancées comme la cytométrie en flux et l’imagerie par bioluminescence seront utilisées pour maximiser les données obtenues à partir de chaque animal, réduisant ainsi le besoin d’augmenter les cohortes. Ces approches permettent de réduire au strict minimum le nombre d’animaux respectant ainsi le principe des 3R, sans altérer la robustesse de nos résultats.

Raffinement

Afin de minimiser la souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage dans un environnement enrichi (maison, carré de coton, copeaux de cartons...) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). L’isolement d’animaux sera évité. Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Afin de prévenir le stress des animaux lié à la manipulation par l’expérimentateur, les souris seront préalablement habituées à la présence de l’expérimentateur et à leur manipulation par l’humain. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés et analgésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance lié au score observé sur la grille d’évaluation de la douleur, un traitement analgésique sera envisagé jusqu’à disparition des signes de souffrance. Des points limites à ne pas dépasser ont été définis préalablement au projet et l’atteinte de l’un d’entre eux ou l’inefficacité du traitement analgésique conduirait à la mise à mort immédiate des animaux selon la méthode définie. Ces points limites comportent notamment toute blessure de la tumeur mais aussi toute atteinte aux libertés fondamentales de l’animal (telles que la gêne au déplacement, à la posture, à l’expression d’un comportement normal ou la présence de souffrance et/ou de détresse chez l’animal) Le poids des souris sera évalué deux fois par semaine. Une perte de poids de plus de 15% constatée et maintenue sur plus de 72h conduira à la mise à mort de l’animal. La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines, car à cet âge leur système immunitaire est pleinement développé. Cela est essentiel pour notre projet, qui étudie des traitements agissant via le système immunitaire pour éliminer les cellules cancéreuses. Le choix de la souris comme espèce repose sur plusieurs raisons : ● Tout d’abord, les cellules cancéreuses utilisées dans notre étude proviennent de souris. Il est donc logique et scientifiquement cohérent d’utiliser un modèle murin pour garantir une compatibilité biologique. ● Par ailleurs, la souris est l’un des modèles les plus utilisés en recherche sur le cancer, car elle présente de nombreuses similitudes avec l’humain en ce qui concerne le développement des tumeurs et la réponse immunitaire.

3 598 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent des cellules tumorales qui forment des tumeurs du poumon, jusqu'à quatre injections de bactéries, jusqu'à six injections d'anticorps et, pour les porteuses de tumeurs, une à deux séances d'imagerie sous anesthésie par semaine pendant trois à cinq mois. Le porteur indique que les bactéries peuvent provoquer une douleur modérée et une difficulté à se mouvoir et à s'alimenter, et que les tumeurs peuvent entraîner douleur, perte de poids et réduction de la mobilité, les souris atteignant un point limite étant alors tuées. Le but est de savoir si ces bactéries font apparaître dans les tumeurs des amas de cellules immunitaires qui renforceraient les immunothérapies, et le porteur qualifie la souris de "modèle nécessaire et indispensable" pour les étudier.

Objectifs

Les immunothérapies, notamment les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ou ICI), ont révolutionné le traitement de plusieurs cancers solides, dont le cancer du poumon. Cependant, seuls jusqu'à 40 pour cent des patients atteints d'un cancer du poumon obtiennent une réponse après traitement par ces immunothérapies. Des recherches récentes ont montré que la présence, dans les tumeurs, de petits groupements de cellules immunitaires appelés "structures lymphoïdes tertiaires" (ou TLS) est liée à une meilleure réponse à ces traitements. Ces structures se forment en cas d’inflammation et disparaissent une fois l’inflammation résolue. Il a été récemment montré qu’une molécule, issue de certaines bactéries, pouvait provoquer l’induction de TLS dans les poumons de souris. Ce projet vise donc à tester si certaines bactéries peuvent, elles aussi, induire la formation de ces structures, et si cela améliore l’efficacité des immunothérapies dans des modèles murins de cancer. Nous chercherons aussi à comprendre les mécanismes impliqués dans la formation et la maturation des TLS, dans l’objectif, à long terme, de développer de nouvelles stratégies pour renforcer l’efficacité des traitements chez les patients atteints de cancer.

Bénéfices attendus

En France, le cancer du poumon touche plus de 50 000 personnes chaque année et est responsable de près de 33 000 décès. Il représente également un coût économique majeur estimé à plus d’un milliard d’euros par an pour le système de santé. Malgré les avancées en immunothérapie, notamment avec les inhibiteurs des points de contrôle immunitaire (ICI), seulement environ 40 pour cent des patients atteints d’un cancer du poumon répondent favorablement à ces traitements. Ce projet vise à renforcer l’efficacité des immunothérapies. Il reposera sur un modèle de cancer du poumon chez la souris, dans lequel des bactéries seront administrées soit à titre préventif (comme une vaccination), soit à titre curatif (après l’apparition de la tumeur). L’objectif est d’évaluer leur capacité à induire des structures immunitaires dans les tumeurs, appelées structures lymphoïdes tertiaires (TLS), et à améliorer la survie des souris. Le projet permettra de déterminer : 1) si ces bactéries améliorent la survie des souris et induisent la formation de TLS ; 2) si l’effet thérapeutique de ces bactéries est dû à la formation des TLS ; 3) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’effet thérapeutique de ces bactéries 4) les mécanismes immunitaires à l’origine de l’induction et de la maturation de TLS. Les résultats de ce projet pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques chez les patients atteints de cancer, soit en utilisant directement ces bactéries comme traitement, soit en développant de nouvelles molécules capables de stimuler la formation de TLS dans les tumeurs. Cette approche pourrait s’appliquer non seulement au cancer du poumon, mais aussi à d’autres types de cancers dans lesquels la présence de TLS est associée à un meilleur pronostic

Procédures

Les animaux seront soumis à : des injections pour administrer les cellules tumorales (animal vigil ou anésthésié, 1 à 2 fois, 1 minute), des injections pour administrer les bactéries (animal vigil, 1 à 4 fois, 1 minute), un suivi par imagerie (animal anesthésié, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois, 15 minutes) avec injection au préalable de produit de contraste (animal vigil, 1 à 2 fois par semaines pour 3 à 5 mois maximum, 1 minute) pour les animaux avec tumeurs, une injection d'une substance qui agit sur le système nerveux (animal vigil, 2 fois, 1 minute) ainsi qu'une injection d’anticorps dans certains cas (animal vigile, jusqu’à 6 fois au maximum, à raison de 2 fois par semaine pendant 3 semaines au maximum, 1 minute).

Impact sur les animaux

Les manipulations des animaux pourront induire un stress. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les injections répétées peuvent induire un risque de péritonite. L’injection de bactéries pourra engendrer une réponse inflammatoire générant une douleur modérée à l’animal associée à une difficulté de se mouvoir et s’alimenter. L’injection de cellules tumorales pourrait engendrer une gêne à se mouvoir. L'imagerie in vivo sera effectuée sous anesthésie et pourra engendrer une baisse de la thermorégulation. Ces administrations et anesthésies pourront également engendrer une gêne respiratoire transitoire. L'induction de tumeur pourra induire une douleur modérée, une perte de poids ainsi qu'une réduction de la mobilité.

Devenir

Les souris injectées avec des cellules tumorales développeront des tumeurs pulmonaires. Dès l’apparition de signes cliniques indiquant l’atteinte d’un point limite défini, elles seront euthanasiées afin de prévenir toute souffrance inutile. Les autres animaux seront euthanasiés à des temps définis expérimentalement pour permettre le prélèvement d’organes. Ces échantillons seront utilisés pour analyser la réponse immunitaire induite, notamment l’organisation locale du système immunitaire suite à l’injection de bactéries ou en réponse à la présence de cellules tumorales.

Remplacement

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du BCG (Bacillus Calmette-Guérin), une souche atténuée de Mycobactérium Bovis, et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo.

Réduction

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. En effet, il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires du système immunitaire impliqués dans l’effet thérapeutique du traitement et dans la formation des TLS. Ainsi, les modèles souris sont considérés comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumeur. Les éventuelles voies d’interactions entre les cellules immunitaires seront testées tout d’abord in vitro puis in vivo Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé par un calcul de puissance statistique et réduit au strict nécessaire pour atteindre les objectifs sans compromettre la validité des résultats. En raison de la variabilité de la croissance tumorale entre les souris, 7 souris par groupe seront utilisées dans les expériences suivant l’effet des traitements sur la survie et la progression tumorale (jusqu’à atteinte d'un point limite ou au maximum 3 mois après la dernière injection de cellules tumorales). Pour étudier la présence et le stade de maturation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS), 3 souris par groupe seront utilisées à chaque point temporel. Afin d’établir les cinétiques d’induction et de maturation des TLS, 5 souris par time point seront nécessaires. Les analyses par cytométrie nécessiteront quant à elles 7 souris par groupe et par point temporel. Les écarts attendus entre les groupes devraient garantir une puissance statistique suffisante malgré la taille restreinte des groupes. Pour les expériences nécessitant des souris survivantes, 20 animaux seront inclus initialement pour assurer un nombre suffisant de survivantes, qui seront ensuite soit réinjectées avec des cellules tumorales, soit euthanasiées pour récupérer les cellules immunitaires. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé par imagerie, permettant des mesures répétées sur un même animal. Chaque expérience sera répétée au moins 2 fois afin d’assurer la reproductibilité des résultats, conformément aux bonnes pratiques expérimentales. Au total, 3 598 animaux seront utilisés dans ce projet

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des portoirs ventilés dans un environnement A2 et ne seront expérimentés qu'après une semaine minimum de stabulation. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (hébergement individuel limité à la fin des expériences s’il ne reste qu’une seule souris survivante dans la cage) en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec 2 des enrichissements ci-après : 6 à 10 bâtonnets de coton, 1 à 2 rouleau en carton ou 1 à 2 maisonnette. La taille des cages est variable, permettant d’héberger jusqu’à 12 souris, tout en respectant la densité réglementaire. Dans les situations nécessitant un hébergement individuel de l’animal (dernier animal dans la cage), il bénéficiera d’un enrichissement en plus et il sera vérifié par le responsable du Bien-Être Animal de l'animalerie pour valider son hébergement individuel. Les conditions de températures et d'hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie). Tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. L'évolution tumorale sera suivie et mesurée. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les animaux seront vérifiés quotidiennement. Ils seront également pesés au minimum deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de la procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie).

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle est un outil précieux pour étudier les structures lymphoïdes tertiaires (TLS), car leur système immunitaire fonctionne de manière similaire à celui des humains, en particulier pour les réponses immunitaires innée et adaptative. Malgré quelques différences, la souris reste un modèle pertinent pour comprendre comment se forment les TLS et comment les cellules immunitaires interagissent avec les cellules cancéreuses dans le microenvironnement tumoral. Le modèle de cancer que nous utiliserons a déjà permis d’observer des TLS chez la souris. De plus, il existe de nombreux outils expérimentaux adaptés à ce modèle, comme des anticorps spécifiques ou des cellules tumorales modifiées permettant le suivie de la croissance tumorale par imagerie, ce qui facilite les analyses. Enfin, plusieurs protocoles déjà validés chez les souris commerciales femelles non génétiquement modifiées permettent de mener les expériences efficacement, sans augmenter le nombre d’animaux, ce qui est essentiel dans une démarche préclinique responsable. Les animaux seront reçus à l'âge de 7 ou 11 semaines puis mis en stabulation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire mature. Les animaux seront identifiés par un code couleur et le nombre de points fait aux feutres sur la base de la queue de l'animal.

Pour tester une molécule anti-inflammatoire à longue action destinée à de futurs médicaments vétérinaires pour chats, 32 chats adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis tous gardés en vie et déclarés réutilisés. Sous anesthésie générale d'environ une heure, une solution de kaolin leur est injectée en huit points sous la peau de la plante d'une patte arrière, ce qui provoque une inflammation et une boiterie d'environ cinq jours, que le porteur qualifie de "modèle totalement réversible". S'y ajoutent jusqu'à trois injections du produit espacées de trois semaines, des prises de sang à la jugulaire, un hébergement individuel pendant la boiterie et des passages en laisse et harnais sur une plateforme de force. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de recourir à l'animal" et précise que le traitement d'une douleur détectée se décide "en accord avec le Donneur d'Ordre".

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité d'un produit testé en le comparant avec un contrôle positif (la référence) et un contrôle négatif (le véhicule du produit test à administrer ou du sérum physiologique). Les propriétés recherchées du produit testé sont des propriétés anti-inflammatoire et analgésique évaluées via un modèle boiterie chez le chat.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité du produit testé en le comparant aux contrôles positif et négatif. De démontrer les propriétés anti inflammatoires et analgésiques du produit test . Ce projet est nécessaire pour trouver de nouveaux principes actifs pour de futurs médicaments vétérinaires destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations sous-cutanées quelques soit le groupe, pour le produit test, le contrôle négatif et le contrôle positif. Durée, par administration, inférieure à la minute. Au total un maximum de 3 administrations par produit espacées de 3 semaines de récupération entre les administrations pourront être réalisées. La réalisation de la boiterie sera induite par administration d'une solution de kaolin en 8 points d'injections par voie sous-cutanée en face plantaire d'un membre postérieur sous anesthésie générale. La durée d'administration est inférieure à 5 minutes. La durée de l'anesthésie générale est d'environ 1h. Durée de la boiterie induite : environ 5 jours, il s'agit d'un modèle totalement réversible. Les prélèvements sanguins seront réalisés avant chaque administration du produit test, contrôle négatif ou positif puis toutes les 3 semaines jusqu'à la fin de l'étude. Tout prélèvement de sang sera fait selon les bonnes pratiques vétérinaires et conformément à la réglementation en vigueur. La durée d'un prélèvement sanguin est inférieur à la minute. Enfin les animaux seront tenus en laisse et harnais et passeront à la marche sur un système de balance (force plate). Les animaux auront eu un entrainement au préalable de l'étude. Cela a pour but d'évaluer la force du membre présentant la boiterie pour pouvoir évaluer l'efficacité du médicament testé. Durée d'un passage : inférieur à 1 minute. Plusieurs passages ( maximum 5) sont réalisés par temps afin d'obtenir une moyenne fiable d'interprétation.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont ceux liés à l'induction d'une boiterie et d'une inflammation du membre postérieur administré avec la solution de kaolin, à la contention lors des prélèvements sanguins, le risque d'hématome lors des prélèvements au niveau des veines jugulaires et au risque anesthésique de toute intervention sous anesthésie générale. Des réactions inflammatoires (gonflement, rougeurs par exemple) peuvent également être observées au niveau des sites d'injections des éléments tests.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de chaque procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux, il est indispensable de recourir à l’animal. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité d'un produit test sur le modèle boiterie chez le chat. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés.

Réduction

32 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront répartis en 4 groupes de 8 animaux. 2 groupes auront les éléments contrôle positif et contrôle négatif puis deux groupes auront l' élément test à deux doses différentes. C'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables et en tenant compte de la variabilité inter individuelle. Une justification du nombre d'animaux est demandée pour éviter tout double emploi. Des phases préliminaires, comme des études pilotes, ont été réalisées dans le but de déterminer le nombre d'animaux nécessaires pour cette étude. Pas de test statistique réalisé en amont.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux continueront une phase d'entraînement à la marche en ligne dans le corridor de Force Plate. Cette phase sert à familiariser les animaux avec le dispositif experimental. Les animaux seront hébergés par groupe de 2 à 4. Puis ils seront hébergés en condition individuelle tout au long de la présence de la boiterie. Cet hébergement en individuel est nécessaire pour mettre l'animal dans de bonnes conditions pour la phase de réveil et pour faciliter l'observation des animaux ainsi que de garantir leur tranquilité tout au long de la phase active du modèle boiterie. En effet, pour les chats, le calme et le repos est plus apprécié lors d'évènements pouvant occasionner une gêne ou une diminution de la capacité motrice que les nombreuses intéractions sociales avec des congénères. Ils garderont un contact visuel, auditif et olfactif pendant la période d'hébergement individuel. De l'enrichissement (exemple: plateformes à différentes hauteurs, tunnels, balle, corde et griffoirs) sera présent autant que possible dans les boxes. Les tablettes dans les hébergements seront remontées aussi longtemps que la présence de boiterie pour l'animal au niveau du membre induit. En cas de détection d'une souffrance ou de douleur , le vétérinaire sera immédiatement prévenu et procèdera à un examen clinique de l'animal concerné afin d'établir un diagnostic et mettre en place un traitement adapté en accord avec le Donneur d'Ordre. Des anesthésiques ou analgésiques pourront être utilisés si necessaire. Toute intervention sur l'animal sera effectuée par une personne habilitée et expérimentée afin de réduire au minimum le stress.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible pour ce projet. Chats adultes entre 1 à 9 ans. Ce stade de développement permettra de viser la majorité du stade cible de ce médicament.

500 rats vont être utilisés, dix au maximum par groupe, soit une cinquantaine de groupes d'étude, tous tués et autopsiés à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection de cellules cancéreuses, humaines ou de rongeur, puis des traitements répétés jusqu'à quatorze semaines après l'injection, avec un prélèvement de sang par semaine sur animal vigile et une ponction de liquide synovial sous anesthésie en fin d'étude. Les produits testés ne sont pas nommés et leur fréquence d'administration reste à définir selon les médicaments de chaque étude, les effets indésirables attendus devant être "abordés avec le client" avant toute mise en œuvre. Les bénéfices annoncés, mieux comprendre les mécanismes d'action et accélérer le développement de médicaments, sont renvoyés au court et au long terme, face à des tumeurs implantées et une mise à mort systématique.

Objectifs

L'objectif du projet est d’évaluer la croissance de tumeur et la réponse à des traitements anticancéreux potentiels en injectant des cellules cancéreuse chez le rat. Les cancers sont des pathologies particulièrement invalidantes dont les traitements ont de lourds effets secondaires et nécessitent d’être constamment améliorés. Les modèles de cancer réalisés chez le rongeur par injection de cellules cancéreuses humaines ou de rongeurs offrent des mesures robustes et reproductibles sur la base de modèles parfaitement décrits, calibrés et admis par la communauté scientifique. L’injection de cellules cancéreuses chez le rongeur permet de mimer différents types de cancers grâce au choix des cellules cancéreuses et à l’endroit où elles sont injectées, et ainsi de tester différents composés pouvant potentiellement réduire ou détruire les tumeurs. Le suivi de l’évolution de la tumeur, de la survie et de l’état général des animaux permettra d’identifier de nouveaux candidats médicaments et d’améliorer la compréhension des mécanismes de résistance au cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices escomptés de ce projet de recherche se déclinent à court et long termes. A court terme, ce projet permettra d'obtenir des informations cruciales sur (1) les mécanismes impliqués dans le traitement de différents types de cancers ; (2) la tolérance ou la potentielle toxicité des médicaments testés ; (3) l’efficacité de nouveaux candidats médicament. À plus long terme, ce projet contribuera de manière significative au développement de nouveaux traitements en oncologie. Les données obtenues seront en effet essentielles pour : (1) Affiner la compréhension des mécanismes d'action des nouveaux médicaments ; (2) Guider la sélection des molécules les plus prometteuses pour les essais cliniques ; (3) Optimiser les stratégies des traitements pour une meilleure prise en charge des patients. En fournissant une base solide de connaissances précliniques, avec notamment le suivi de l’évolution des tumeurs, de la survie et de l’état général des animaux, ce projet accélérera potentiellement le processus de développement de médicaments innovants, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques aux patients atteint de cancers.

Procédures

La procédure comporte une injection de cellules cancéreuses : durée de l'opération en fonction du type d’injection 1 minute à 15-30 minutes. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et avec une gestion appropriée de la douleur pré et post-opératoire. Des radiographies pourront être prises au moment de la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et la procédure durera 5 à 10 minutes. Les traitements à tester seront appliqués avant et/ou après l’injection de cellules cancéreuses et répétés tout au long de la durée de l’étude, 14 semaines maximum après l’injection. Chaque administration dure 1 à 2 min. La fréquence d’administration des traitements sera définie selon le mode d’administration ainsi que selon les médicaments utilisés pour chaque étude. Une analyse du sang ou des urines pourra aussi être réalisée au cours de l’étude pour rechercher des marqueurs liés au développement de cancers. Les prélèvements de sang pourront être effectués sur l’animal sans anesthésie et dureront moins de 5 min par animal. Une période minimum d’une semaine de récupération sera nécessaire à l’animal avant de procéder à un nouveau prélèvement, avec au maximum 1 prélèvement par semaine pendant l’étude. Un prélèvement de liquide synovial pourra être réalisé sous anesthésie, à la fin de l’étude uniquement.

Impact sur les animaux

Une observation quotidienne de l’état général des animaux, ainsi qu’une évaluation détaillée 2 fois par semaine du comportement, du poids, seront réalisées tout au long de l’étude afin d’identifier au plus vite une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par les manipulations effectuées. Des nuisances liées au modèle et à l’induction du modèle et au développement de cancer sont attendus dans ce protocole. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour estimer un éventuel traumatisme et une inflammation au niveau des sites d’injections des cellules cancéreuses. Des nuisances liées aux médicaments à tester peuvent être rencontrés, tels qu’une perte de poids, un comportement anormal de l’animal, ou une réaction pendant l’administration. Les effets indésirables susceptibles d’être observés seront abordés avec le client avant toute mise en œuvre du projet. Ils seront anticipés au plus juste en fonction des informations obtenues au cours de protocoles préalablement réalisés et appuyés d’une veille bibliographique inhérente aux médicaments à administrer.

Devenir

A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés et autopsiés. Les organes d'intérêts seront prélevés. Les prélèvements sanguins, urinaires et de liquide synovial seront utilisés pour mesurer la concentration du médicament testé, évaluer sa toxicité ou la réponse de l’animal suite au traitement. Les organes pourront également être utilisés pour mesurer la concentration du médicament, ou regarder la structure des organes par histologie ou imagerie.

Remplacement

De manière générale, les médicaments que nous évaluons in vivo ont fait l’objet d’études préalables réalisées sans animaux, mais le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer de potentielles interactions avec l’organisme. En effet, les tests in vitro actuels permettent de prévoir le devenir des médicaments testés, mais ne renseignent pas sur leurs effets sur l’ensemble d’un organisme. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres liés à un individu dans sa globalité. Le cancer étant une pathologie complexe, il n'existe à ce jour aucune méthode alternative à l'expérimentation animale pour évaluer l'influence de différentes cellules dans le développement de tumeurs.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum afin d’avoir des résultats exploitables, permettant de conclure de manière certaine, tout en évitant la réalisation d’une deuxième étude pour confirmer les résultats obtenus au cours du présent projet. 10 animaux par groupe au maximum sont prévus afin d’assurer un nombre minimum d’animaux nécessaire pour une analyse pertinente et une comparaison statistique fiable pour l’évaluation des composés à testés, tout en prenant en compte le bien-être animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat, n'induisant pas de stress. Nous mettrons en place des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents traitements pour éviter toute souffrance inutile et prolongée : les conditions d’hébergement seront optimisées (litière, enrichissement, facilité d’accès à l’alimentation), nous utiliserons des traitements anti-douleurs dès l’apparition de premiers signes cliniques. Un suivi quotidien des animaux sera effectué avec prise de poids 2 fois par semaine et observations de caractéristiques spécifiques au modèle. Les animaux seront maintenus un minimum de temps en situation d’inconfort lors de leur manipulation (ex : au moment de leur pesée et mesure de la tumeur, ou au moment des prélèvements sanguins). Tout animal ayant atteint un ou plusieurs points limites (repérés le plus précocement possible grâce au suivi clinique et à l’appui des grilles du bien-être animal adaptées) sera euthanasié.

Choix des espèces

Le rat a été choisi pour ce projet car ce mammifère présente des caractéristiques physiopathologiques et réponses tissulaires proches de celles observées chez l'homme. Ces rongeurs, étant fréquemment utilisés à des fins de recherche, permettent de transposer assez facilement les résultats à l'homme, par simples approches/méthodes statistiques. Par ailleurs, leur taille permet d’obtenir un volume suffisant de sang parfaitement analysables. Enfin, les données obtenues chez ces animaux permettent de calculer facilement les doses administrables à l’homme prévues dans le cadre de premiers essais cliniques nécessaires au développement de nouveaux agents thérapeutiques.

L'anticorps testé est développé par l'équipe depuis une dizaine d'années et vient d'entrer en essai clinique pour d'autres pathologies, l'enjeu étant ici d'étendre ses indications au cancer du côlon. 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever tumeurs et foie. Chaque animal reçoit une injection unique de cellules cancéreuses sous la peau sous anesthésie, puis pour certains deux injections d'anticorps par semaine pendant quatre semaines sur animal vigile, avant un prélèvement de sang terminal, la croissance de la tumeur pouvant provoquer une ulcération de la peau et une déshydratation. Le porteur écrit que la validation de l'approche exige un "modèle physiologique complet sur animal entier", après des essais déjà menés sur lignées cellulaires et sur tissus de patients.

Objectifs

Le cancer du côlon est la 2ème cause de mortalité attribuable au cancer dans le monde et est en augmentation depuis 20 ans. De nouveaux types de traitement faisant appel à des anticorps ciblant le système immunitaire se sont montrés efficaces dans d’autres types de cancers mais n’ont pas encore fait leur preuve pour le côlon. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du côlon. Nous avons montré dans le cancer du foie que notre anticorps pouvait réduire la taille des tumeurs, influencer le système immunitaire et améliorer les thérapies ciblant ce dernier à la fois chez l’homme et la souris. L’objectif de notre projet est d’étendre nos recherches au cancer du côlon afin d’évaluer l’efficacité de notre anticorps dans ces cancers.

Bénéfices attendus

Le cancer du côlon est un grave problème de santé public. Il est très fréquent et ses formes les plus graves se soignent très mal. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements plus efficaces. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies ciblant le système immunitaire et ainsi la survie très nombreux malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologies.

Procédures

Une partie des animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant 4 semaines par injection réalisée sur animaux vigiles qui prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux peut entraîner un stress physique modéré. L’injection de cellules tumorales en sous-cutané, ainsi que les injections intrapéritonéales répétées d’anticorps, induisent une douleur légère et transitoire liée à la piqûre de l’aiguille. Au cours de l’expérience, la croissance tumorale peut occasionner une gêne plus ou moins importante, selon la taille de la tumeur et sa localisation (ventrale, dorsale ou latérale). Dans certains cas, une ulcération cutanée peut apparaître au niveau du site d’implantation des cellules tumorales. De même une déshydratation peut survenir secondairement à la pathologie tumorale.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foie) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons prévu de procéder à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite en parallèle une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble pour le rongement et des tunnels en kraft pour le refuge. Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans des cages sur portoir ventilé. Les injections de cellules tumorales en sous-cutané seront réalisées sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane, afin de limiter la douleur et le stress liés à la procédure. Les autres procédures potentiellement invasives ou stressantes seront également effectuées sous anesthésie et/ou analgésie, lorsque cela est nécessaire. Une période d’acclimatation de 14 jours sera respectée avant le début des procédures. Durant cette période, les souris seront laissées sans manipulation pendant les 2 à 3 premiers jours, puis progressivement habituées à la contention au cours de la deuxième semaine. Cette familiarisation permet de diminuer le stress lors des injections répétées et des mesures de suivi (taille tumorale, température corporelle). Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre immédiatement les procédures et de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance excessive

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront âgés au minimum de 8 semaines (adultes) afin qu’ils présentent un système immunitaire mature. De plus il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

Soumises la nuit à six séries de sons de trente minutes espacées de trois heures, soit trois heures de stress sonore, certaines souris sont utilisées comme modèle de fibromyalgie. D'autres reçoivent jusqu'à dix injections d'une molécule qui déclenche la migraine chez les patients migraineux, avec application de filaments fins ou de jets d'air sur la face ou la patte toutes les trente minutes pendant quatre heures les jours d'injection. D'autres encore boivent pendant une semaine une eau contenant une molécule qui irrite l'intestin, et une partie subit une chirurgie de quarante-cinq minutes sans réveil. 672 souris en tout, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort à la fin parce que les protocoles se terminent par un prélèvement d'organes.

Objectifs

Parmi les douleurs chroniques, la migraine qui affecte environ 15% de la population générale, est sur-représentée dans certaines autres maladies douloureuses chroniques. Ainsi, environ 20% des patients souffrant de douleurs viscérales au niveau des intestins sont également migraineux. Cette proportion atteint jusqu’à 45 à 80% des patients fibromyalgiques (douleurs musculaires diffuses), selon les études. Malgré ces observations cliniques, le(s) mécanisme(s) pouvant expliquer la présence de la migraine dans d’autres maladies douloureuses est(sont) encore peu connu(s). Ainsi, le but de notre projet est de mieux comprendre si un mécanisme commun entre les douleurs viscérales, la fibromyalgie et la migraine pourrait exister. Parmi les mécanismes sous-tendant ce type de douleur chronique, une activation trop importante des neurones pourrait être à l’origine de la sensibilité exacerbée de ces patients. Des cellules particulières appelées les cellules satellites gliales, entourant les neurones, semblent jouer un rôle clef dans la régulation de l’activité des neurones. Le but de notre projet est donc de caractériser le rôle des cellules satellites gliales entre différents modèles de douleur chronique, que sont la fibromyalgie, la douleur viscérale et la migraine à la fois chez les mâles et les femelles. Pour cela, nous évaluerons l'expression de plusieurs marqueurs spécifiques d’activation des cellules satellites gliales dans (i) un modèle de douleur, mimant la fibromyalgie, induite par le stress sonore, (ii) un modèle de migraine induite par des injections répétées d’une molécule qui provoque des migraine chez les patients migraineux et (iii) un modèle de douleur viscérale induite par l'administration orale d’une molécule induisant une inflammation du côlon.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes qui expliqueraient pourquoi la migraine est plus fréquente chez des patients souffrant déjà d’autres douleurs (douleurs viscérales inflammatoires et fibromyalgie), notamment le rôle de cellules particulières, appelées les cellules satellites gliales qui entourent les neurones. A plus long terme, comprendre ces mécanismes permettrait de tester de nouvelles molécules pharmacologiques pour cibler plus spécifiquement les patients présentant la présence de la migraine et d’une autre maladie douloureuse viscérale ou de fibromyalgie.

Procédures

Les interventions seront : Injections d’une molécule : chaque injection dure moins d’une minute (au total 10 injections sur plusieurs semaines). Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : les jours d’injection pendant 4h toutes les 30 minutes ; cette mesure se fait par l'application de filaments fins sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. Les animaux peuvent être sous anesthésie gazeuse pour réaliser une chirurgie : elle a lieu une fois et elle sera sans réveil. La chirurgie dure environ 45 min. Stress induit par un son : série de sons pendant 30min, répétés toutes les 3 heures, soit 6 fois au cours de la nuit, ce qui représente un total de 3 heures de stress sonore.

Impact sur les animaux

Nous utilisons un modèle de migraine qui provoque une douleur modérée chez l’animal. Cette douleur est ressentie après les injections, mais n’empêche pas les mouvements de l’animal. Elles seront réalisées sur des souris en contention modérée. Mesure de la sensibilité cutanée : cette mesure se fait par l'application de filaments fins ou de jets d'air sur la peau de l'animal au niveau de la face ou de la patte qui entraine une douleur modérée. Le modèle de douleur viscérale est induit par l’administration d’une molécule dans l’eau de boisson sur une semaine. La répétition d’un son entraine un stress chez l’animal. Une douleur légère est provoquée par les injections de molécules qui durent moins d'une minute. Cette molécule induit une irritation de l’intestin et la douleur provoquée est modérée. Les animaux seront sous anesthésie pour réaliser une chirurgie : le début de cette anesthésie peut induire un stress transitoire de l’animal qui dure moins de 2 minutes.

Devenir

Les procédures ne permettent pas de réutiliser les animaux. En effet, elles se terminent par des techniques qui nécessitent le prélèvement d’organes : les animaux seront donc mis à mort à la fin des procédures.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux est défini à partir de notre expérience et des tests statistiques donnant le nombre nécessaire pour la discrimination des effets. Ainsi pour toutes les procédures, nous aurons 12 animaux (6 males et 6 femelles) par groupe. Une fois les animaux mis à mort, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela limitera le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La nuisance identifiée sur le bien-être des animaux est la douleur et le stress engendrés dans le cadre des différents modèles. Concernant la douleur générée par l’application des stimulations mécaniques (à l'aide de filaments en plastique ou de jet d'air), nous limitons les stimulations en durée et en intensité au minimum et l’animal a toujours la possibilité d’échapper à la stimulation puisqu’il est libre de ses mouvements. Les stimulations mécaniques ne dépassent pas les points limites fixés. Pour améliorer le bien-être des animaux, les cages sont enrichies à l'aide de rouleaux permettant aux animaux de se cacher ainsi que de papier de nidification, chose importante pour la souris. Une des procédures nécessite une chirurgie qui se fera sous anesthésie gazeuse par une personne expérimentée.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans la migraine, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez le rat. Les animaux seront âgés de 8-12 semaines pour la comparaison avec les autres données de la littérature : les souris sont considérées comme de jeunes adultes. Ce stade de développement a été choisi car c’est chez le jeune adulte que le plus souvent la maladie migraineuse débute chez l’être humain. Les animaux génétiquement modifiés seront âgés de moins d’une semaine (injection virus) à 12-14 semaines (expérience d’imagerie calcique).