Procédures modérées

Sept prélèvements de sang en soixante-douze heures sur chaque animal, dont quatre dans les vingt-quatre premières heures : 24 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur foie. Le porteur prévoit une douleur aiguë transitoire à la queue et une déshydratation dès la huitième heure, compensée par une injection de sérum physiologique. Les souris sont génétiquement modifiées pour ne plus exprimer, dans le foie seulement, la protéine que vise l'anticorps testé. Le bénéfice attendu se limite à optimiser un anticorps dont l'effet sur le cancer du foie et la fibrose hépatique est déjà démontré, en vue d'une application future chez des patients.

Objectifs

L'objectif du projet est d’étudier la manière dont un traitement (ici un anticorps spécifique d’une protéine d’intérêt) se répartit et est éliminé par le corps dans un nouveau modèle de souris récemment établi, un modèle qui n’exprime plus cette protéine d’intérêt au niveau du foie seulement. Cela permettra de déterminer dans quelle mesure notre protéine d’intérêt au niveau du foie contribue à la distribution et élimination du médicament dans le corps. Nous avons déjà pu montrer que notre anticorps conduisait à une inhibition de la croissance du cancer du foie et du processus de fibrose hépatique. Cette étude permettra de mieux comprendre le fonctionnement de notre anticorps thérapeutique permettant ainsi une optimisation de notre traitement chez les patients dans le cas de différentes maladies du foie telles que, la cholangite sclérosante primitive (CSP), la stéatohépatite associée à un dysfonctionnement métabolique (MASH) et le cancer du foie (CCA, HCC).

Bénéfices attendus

Ces données nous aideront à mieux comprendre le fonctionnement de notre traitement et à l’améliorer pour soigner les maladies du foie, comme la cholangite sclérosante primitive (CSP), la stéatohépatite liée à un trouble métabolique (MASH) et le cancer du foie.

Procédures

Un prélèvement sur animal anesthésié d'une durée de 1 minutes environs sera réalisé puis l’injection d’une molécule thérapeutique sur animal vigile d'une durée inférieure à 1 minutes suivi de 4 prélèvements de sang sur 24h sur animal vigile d'une durée de 1 minutes environs et enfin 2 autres prélèvements à 48h et 72h sur animal anesthésié d'une durée de 1 minutes.

Impact sur les animaux

Un stress lors de la manipulation des souris pour réaliser le traitement et les différents prélèvements sanguins risque d’être observé. Une douleur aigue transitoire suite aux prélèvements de sang au niveau de la queue sera observé. Lors des prélèvements, après le point 8h une déshydratation de l’animal risque d’être observée suite aux différents prélèvements en moins de 24h qui sera compensée par une injection de sérum physiologique.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Les modèles cellulaire 2D ou 3D ne permettent pas de récapituler les mécanismes de répartition et d’élimination en détail d’un médicament par le corps. Nos précédentes expériences in vivo ne permettent pas de comprendre complétement le fonctionnement de notre traitement ciblant une protéine d’intérêt. C’est pourquoi un nouveau modèle de souris a été développé pour une validation et une meilleure compréhension de notre traitement dans le cas de maladies du foie afin de pouvoir l’optimiser avant de passer à l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques seront appliquées lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement. Avant le début de l’expérience une période d’acclimatation de 2 semaines sera réalisée à l’arrivée des souris en zone d’hébergement (déplacement des souris de la zone de reproduction à la zone d’hébergement). Au cours de la période d’acclimatations de 14 jours, les souris seront laissées 7 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié à l’injection et aux prélèvements.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme et ont contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons. De plus le modèle de souris que nous utilisons est génétiquement modifiée pour ne pas exprimer notre cible thérapeutique au niveau du foie afin de compléter nos études sur cette cible. À présent, ce modèle n’est donc disponible que dans la souris. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte). Ce choix se réfère également à nos précédentes expériences réalisées au sein du laboratoire pour l’étude des maladies hépatiques (la stéatohépatite liée à un trouble métabolique, cholangite sclérosante primitive et cancer du foie).

Une chirurgie stéréotaxique de trente minutes sous anesthésie permet d'injecter directement dans le cerveau un composé pharmacologique ou un virus, suivie de cinq jours de surveillance postopératoire. 540 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour l'analyse histologique de leurs tissus. Le projet mesure la distribution de ces composés dans le système nerveux central, au stade préclinique du développement de traitements contre les maladies neurodégénératives. Le porteur écrit ne pas savoir quels composés ni quels virus seront testés, ni quels effets secondaires ils pourraient provoquer, la toxicité n'étant vérifiée qu'in vitro au préalable.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives résultent de la dégénérescence progressive des neurones, entraînant une altération chronique du fonctionnement du système nerveux. Fortement invalidantes, elles affectent aussi bien la motricité que les fonctions cognitives. Pour être efficace, un médicament doit atteindre sa cible neuronale afin d’agir et de ralentir les processus neurodégénératifs. Cependant, il doit soit traverser la barrière hématoencéphalique (barrière sang/cerveau), soit être directement administré dans l’environnement neuronal. Cette seconde approche est particulièrement adaptée aux petites molécules (les peptides, les nucléotides) ou aux virus. L’objectif de cette étude est d’analyser la distribution de composés pharmacologiques dans le système nerveux de rongeurs après une injection intracérébrale.

Bénéfices attendus

Le projet s’inscrit dans la phase préclinique du développement de composés pharmacologiques destinés au traitement des maladies neurodégénératives. Cette étape vise à évaluer la distribution, l’efficacité et la sécurité des composés testés avant leur passage en essais cliniques. Elle comprend l’étude de la biodisponibilité, de la pharmacocinétique (durée de vie du composé dans l’organisme) et de l’impact biologique des molécules administrées, notamment par injection intracérébrale chez des modèles animaux. En cas de résultats concluants, le développement des composés pharmacologiques pourra se poursuivre vers des phases cliniques, avec pour objectif d’optimiser leur formulation, de valider leur efficacité chez l’humain et d’assurer leur innocuité. Ces travaux pourraient ainsi ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques contre les maladies neurodégénératives, contribuant à l’amélioration des traitements existants et à l’augmentation des options disponibles pour les patients.

Procédures

L'ensemble des animaux de ce projet subiront la procédure décrite: une chirurgie (1 fois, 30 minutes maximum), sous anesthésie générale, une analgésie systémique et une analgésie locale. Leur état clinique sera surveillé pendant cinq jours postopératoire pour détecter un effet indésirable ou des signes de souffrance. En fin de procédure, les animaux seront mis à mort.

Impact sur les animaux

Les injections intra-péritonéales et sous-cutanées pour induire l’analgésie et l'anesthésie peuvent engendrer un stress lors de l’acte. La chirurgie stéréotaxique (sous anesthésie) peut causer de la souffrance post-opératoire. Nous ne savons pas quels composés ou virus seront testés ni leurs potentiels effets secondaires. Cependant la toxicité des composés est systématiquement testée in vitro avant son utilisation sur les animaux.

Devenir

Ce projet incluant une analyse histologique, tous les animaux seront mis à mort pour permettre la collecte de tissus.

Remplacement

Le profil de distribution tissulaire des candidats-médicaments ou virus dépend de plusieurs facteurs, tels que la diffusion au sein du liquide céphalorachidien, sa capture par différents types cellulaires et son élimination. Ces variables impliquent l'interaction de plusieurs types cellulaires. Ce degré de complexité ne peut être atteint qu’avec un modèle animal.

Réduction

Le nombre d'animaux (n par groupe) a été déterminé pour assurer l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les études publiées dans la littérature scientifique suggèrent qu'un nombre de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ainsi, pour ce projet, nous travaillerons avec n=12 souris par groupe. Les analyses incluent des mesures de pharmacodistribution, des mesures d'expression de gènes et/ou de protéines.

Raffinement

Le raffinement sera basé sur : (i) la présence d’objets d'enrichissement (papiers pour nids, tunnels en carton), (ii) des approches d'analgésie lorsque nécessaire, (iii) et le contrôle strict des paramètres physiologiques des animaux (poids, température corporelle). Les animaux seront hébergés par quatre au maximum, avec un accès ad libitum à l'eau et à la nourriture. La souffrance des animaux sera limitée au maximum grâce à la recherche quotidienne de signes indicateurs de souffrance. Le projet a défini des points limites : si l’un de ces points est atteint, le responsable de l’étude sera informé et l’animal sera mis à mort. Si des signes de souffrance sont détectés, le responsable de l’étude sera également informé, et un analgésique sera administré. Dans le cas où le traitement analgésique se révélerait inefficace, l’animal sera mis à mort. Pour les interventions chirurgicales, une anesthésie gazeuse est utilisée afin de faciliter un réveil rapide et contrôlé. Pour la mise à mort, une surdose d’un mélange d'anésthésique est administrée, permettant d’induire une anesthésie profonde avant le décès. Durant la chirurgie et la période de réveil l'animal est placé sur un tapis chauffant. Un gel ophtalmique est appliqué avant l'opération pour éviter le dessèchement des yeux. En phase post-opératoire, ou en cas de signe de souffrance, de la nourriture ramollie ou du gel nutritif est déposé dans la cage.

Choix des espèces

Les souris possèdent un système nerveux complexe, qui présente des similitudes avec le système nerveux humain. Ce sont donc des modèles appropriés permettant l'étude de la distribution des candidats-médicaments dans le système nerveux central. Les animaux seront agés de 12 semaines ce qui correspond à un stade de dévelopement adulte.

10 poulets de chair reçoivent à 15 jours, sous anesthésie générale, deux capteurs de température, l'un dans la cavité abdominale, l'autre sous la peau, et les descendants gardés en élevage sont exposés pendant cinq jours à des vagues de chaleur entre 25 et 32 °C, dix jours avant leur mise à mort. 260 poules et poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue : 30 futures reproductrices et 32 descendants dès l'éclosion, après une prise de sang, les autres en fin d'élevage. Il s'agit de savoir si une "programmation thermique embryonnaire" des œufs de futures reproductrices rend leur descendance plus résistante à la chaleur, dans des élevages en plein air de poulets à croissance lente, à l'aide d'indicateurs comportementaux que le porteur ne détaille pas. Sous la chaleur, il cite comme possibles une hausse de la température corporelle, une perte d'appétit, de l'agitation ou de l'apathie, des tentatives d'échappement et du picage. Les carcasses pourront être "valorisées commercialement", sauf celles des 10 poulets porteurs de capteurs, indique-t-il.

Objectifs

Le projet vise à évaluer, l’impact de la « programmation thermique embryonnaire » appliquée sur des œufs embryonnés de futures reproductrices, sur leur descendance, des poulets de chair produits terminaux, exposés à des vagues de chaleur. Cette étude sera conduite sur une race à croissance lente adaptée aux conditions d'élevage en plein air, qui devrait être plus sensible aux vagues de chaleur potentielles. La capacité de la progéniture de ces femelles reproductrices soumises ou non à un traitement thermique à résister aux défis de la chaleur sera évaluée à l'aide d'indicateurs physiologiques et comportementaux qui ont été validés comme mesures de la robustesse ou de la résilience dans des environnements fluctuants et sous-optimaux.

Bénéfices attendus

L’objectif général du projet est de proposer des stratégies de programmation thermique afin de renforcer la robustesse des animaux et leur capacité d’adaptation à des vagues de chaleur. L’intérêt scientifique de ce projet réside en premier lieu dans l’approche expérimentale réalisée sur les œufs de futures reproductrices qui est relativement peu étudiée. La connaissance de l’impact d’une programmation thermique d’œufs de futures reproductrices et la transmission potentielle à sa descendance d’une meilleure capacité à s’adapter à des vagues de chaleur n’a jamais été étudié, à notre connaissance, sous l’angle complémentaire des performances zootechniques et des biomarqueurs en lien avec la robustesse, la santé et le bien-être de la progéniture.

Procédures

Une prise de sang sera réalisée à l’éclosion sur 30 femelles futures reproductrices et 32 descendants. Ces animaux sont ensuite mis à mort pour des prélèvements de tissus. Une prise de sang sera également réalisées sur les femelles avant leur entrée en ponte (1 seule prise de sang) et sur les descendants avant, pendant et après le coup de chaleur (3 prises de sang sur les mêmes individus pour suivre leur réponse aux vagues de chaleur et leur capacité d’adaptation / récupération). La pose de capteurs internes de suivi de température sera réalisée par voie chirurgicale sur des poulets à l’âge de 15 jours (2 capteurs/poulet, l’un en intrapéritonéale et l’autre en sous cutané). Les animaux seront sous anesthésie générale dont de délai prévisionnel est de 30 min, le délai de chirurgie est estimé entre 15 et 20 min par poulet. L’application de vagues de chaleur sur tous les descendants débutera 10 jours avant la mise à mort pour une durée de 5 jours. Les fluctuations oscilleront entre 32°C pendant 6h en journée et 25°C durant 6h la nuit. Ces deux plages de température sont séparées de 6h durant lesquelles la température augmente ou diminue graduellement.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut provoquer de la douleur et de l’inconfort en cas d’insuffisance d’action de l’anesthésie. Cette dernière peut provoquer une dépression respiratoire, même si le risque est limité avec une anesthésie gazeuse. Dans nos conditions, l’apparition de complications post-opératoires est peu probable mais reste possible (risques d’infection, de rejet du capteur, ou de réponse inflammatoire excessive). La contention lors des prises de sang engendre du stress pour l’animal, une légère douleur au niveau du site de prélèvement et un éventuel hématome. L’exposition aux vagues de chaleur peut engendrer des conséquences physiologiques potentielles (augmentation de la température corporelle, déséquilibre hydro-électrolytique, réduction de l’appétit, etc.) ainsi que des conséquences comportementales (agitation, apathie, ou comportements visant à éviter la chaleur comme regroupement en zones fraîches ou tentatives d’échappement). L’élevage des animaux au sol en groupe peut entraîner des comportements agressifs, voire de picage, qui peuvent être exacerbés lors d’épisodes de chaleur.

Devenir

Suite aux prélèvements de sang à l’éclosion, les animaux seront mis à mort pour des prélèvements de tissus d’intérêt métabolique. A la fin de la procédure de chirurgie, les animaux seront replacés dans leur parquet d'origine avec leurs congénères jusqu'à la fin de l'élevage du lot. Tous les autres animaux inclus dans le protocole seront mis à mort en fin d’élevage de la bande. Les carcasses de ces animaux pourront être valorisées commercialement à l’exception de celles des 10 animaux qui auront porté les capteurs de température.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ou in vitro n'est capable de reproduire l'effet de la programmation thermique chez l'espère cible, le poulet de chair, et son impact durant toute la durée de vie de l'animal (physiologie, comportement, performances, etc..).

Réduction

Au niveau du volet des reproductrices, 15 femelles par traitement (N=30) seront prélevés (sang + tissus) à l’éclosion pour évaluer l’impact de la programmation thermique sur la physiologie de l’animal à l’état initial. De nouveaux prélèvements de sang seront réalisés avant l’entrée en ponte des femelles (N=15 par groupe) pour évaluer le statut physiologique et métabolique des femelles. Le nombre d’animaux expérimentaux choisi est nécessaire et suffisant pour pouvoir tirer des conclusions significatives en tenant compte de nos expériences précédentes en intégrant la variabilité interindividuelle attendue en termes de poids, composition corporelle, statut métabolique et robustesse. Nous avons volontairement choisi une puissance statistique, car en absence de challenge type conditions d'élevage dégradées ou coup de chaleur plus tard dans la vie, nous nous attendons à avoir des effets de faible amplitude mais variés. Sur la base des travaux antérieurs réalisés, les marqueurs sanguins de stress oxydatifs sont les plus variables. L’unité statistique pour les dosages de biomarqueurs sera l’animal.

Raffinement

Dès l’éclosion, les descendants seront élevés au sol sur copeaux, avec accès à l’eau et à l’aliment ad libitum, dans un bâtiment à environnement contrôlé (température, ventilation, lumière). Ce mode d’élevage favorise les interactions sociales. Les animaux seront visités au moins deux fois par jour (week-ends et jours fériés inclus). En cas de signes de détresse ou de maladie (cf grille d’atteinte des points limites), un isolement en infirmerie ou une euthanasie pourra être envisagé. L’environnement sera enrichi avec des rubans colorés à picorer et un perchoir. Lors du coup de chaleur, les pipettes seront vidangées trois fois par jour pour garantir une eau fraîche. En période de forte chaleur, une attention particulière sera portée à la baisse effective des températures pour assurer des phases de récupération. Raffinement des prises de sang : elles seront réalisées par deux opérateurs expérimentés, avec une contention calme et précise. Une garde sur l’aiguille limitera les risques de pénétration excessive et de lésions cérébrales. Raffinement de la chirurgie : une prémédication sera administrée 15 min avant l’anesthésie gazeuse (bréchet). Chaque animal sera endormi individuellement. Une antibioprophylaxie débutera la veille de l’intervention et se poursuivra pendant 3 jours post-opératoires. En cas de signes de douleur (prostration, anorexie…), une dose d'antalgique pourra être donnée. Les animaux seront isolés durant 5 jours post-opératoires en infirmerie, avec suivi individuel selon une grille dédiée à l’évaluation post-chirurgicale. Cette procédure a été testée avec succès dans un essai précédent chez des poulets à croissance lente : aucune mortalité, réintégration au parquet d’origine après traitement, et croissance équivalente aux témoins.

Choix des espèces

Le poulet de chair a été choisi comme modèle car c’est l’espèce agronomique cible du projet. Les œufs embryonnés seront mis en incubation au couvoir de l’établissement expérimentateur. Après éclosion, les animaux seront mis en place dans le bâtiment d’élevage et élevés jusqu’à 30 semaines pour la partie « reproducteurs », et jusqu’à environ 75 jours pour la descendance. L’évaluation de l’intérêt d’une programmation thermique embryonnaire lors de l’incubation se fera tout au long de la durée d’élevage des animaux sur les 2 générations (reproductrices et descendants). La mise en place de capteurs de température interne sera faite sur les descendants. L’opération se fera sur des animaux de 15 jours afin qu’il puisse supporter l’acte de chirurgie et permettre de suivre les paramètres du capteur tout au long de la vie de l’animal. Par ailleurs, l’épisode artificiel de forte chaleur sera appliqué en fin d’élevage, 10 jours avant mise à mort, âge où les animaux sont les plus sensibles aux variations/pics température. Il convient donc de suivre les critères zootechniques, comportementaux et sanitaires pendant toute la durée de l’élevage. Les poulets seront élevés de leur jour d’éclosion jusqu’à l’âge classique de mise à mort pour un élevage d’animaux labels (75 jours max).

Cinq à sept minutes d'incision de la peau et des tissus sous-cutanés jusqu'à la trachée, une injection de molécule fibrosante, deux points de suture : 424 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever poumons et sang. Le porteur annonce des difficultés respiratoires, une perte de poids et une mortalité liée à la fibrose entre le septième et le quatorzième jour, qu'il chiffre à moins de 10 % des effectifs. Le projet cherche à comprendre le lien entre l'altération du gène ZCCHC8 et la fibrose pulmonaire idiopathique, faute d'échantillons humains disponibles en quantité. Des organoïdes sont déjà utilisés en parallèle, mais le porteur conclut que la souris reste un animal "incontournable" pour modéliser la réponse d'un organe entier.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique, ou FPI, est une maladie des poumons qui rend la respiration de plus en plus difficile. "Idiopathique" veut dire que l'on ne connait pas précisément l'origine de cette maladie. Parfois, cette maladie se retrouve dans certaines familles. Aujourd’hui, il n’existe pas de médicament qui peut guérir cette maladie, sauf si on remplace les poumons par une greffe. La FPI débute lorsque certaines cellules des poumons, appelées "pneumocytes de type 2", ne fonctionnent pas bien. Cela peut être à cause de l’âge, de l’environnement ou d’un problème dans les gènes. Chez certaines personnes, un gène qui s’appelle ZCCHC8 est altéré, et cela pourrait être une des raisons pour lesquelles elles ont une fibrose pulmonaire. Nous ne comprenons pas bien le lien entre l'altération de ce gène et la fibrose pulmonaire. Comme il est très difficile d’avoir des échantillons de poumons de personnes malades pour les étudier, nous utilisons des souris spéciales qui ont le même problème que les patients dans leurs gènes. Cela nous aide à mieux comprendre comment la maladie se développe et, peut-être un jour, à trouver un traitement. L’objectif de cette recherche est donc de comprendre ce qui se passe dans les poumons quand le gène ZCCHC8 ne fonctionne pas bien.

Bénéfices attendus

Cette étude, réalisée d’une façon fiable et appropriée dans nos modèles murins, assurera une meilleure connaissance des mécanismes de la fibrose pulmonaire chez l’Homme.

Procédures

En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose au niveau de la trachée après incision de la peau et des tissus sous cutanés. Après incision, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées après anesthésie profonde, après quoi des prélèvements serons réalisés.

Impact sur les animaux

L'induction de la fibrose pulmonaire chez les souris peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général avec perte de poids. Dans le modèle de fibrose, il existe un risque de mortalité liée au développement de la fibrose à partir du 7ème jour, et jusqu'au 14ème jour après injection. Cette mortalité est en général < 10% des effectifs. Une fréquence respiratoire anormalement élevée ainsi qu’une gêne respiratoire sont des conséquences possibles de la fibrose. Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est également possible. Une altération de l'état général avec perte de poids est possible.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement sanguin et des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes immunitaires impliqués dans la fibrose pulmonaire.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la réponse d’un organe entier dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire. En outre, la bonne compréhension des mécanismes cellulaires au sein des poumons est strictement dépendante de l’étude du recrutement des cellules issues d’autres tissus/organes via la circulation sanguine notamment. Ces affirmations se basent sur des discussions avec des confrères, des conférences en pneumologie/immunologie et une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2000-2023. Il faut noter que des méthodes alternatives comme les organoïdes (culture cellulaire en laboratoire) sont déjà utilisées dans notre projet mais ne nous permettent pas encore de répondre à l’ensemble de nos questions notamment parce que ce modèle n’intègre qu’un nombre restreint de sous-types cellulaires pulmonaires et ne peuvent pas reproduire le dynamisme du recrutement des cellules extrapulmonaires (c'est à dire l'arrivée de cellules non pulmonaires dans le poumon).

Réduction

Le nombre a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les animaux seront anesthésiés lors des procédures expérimentales. Des antalgiques seront donnés en pré et post opératoire. Pour l'ensemble des souris, l'enrichissement consistera en la mise en place de coton et d’un tunnel de change dans les cages, et à partir de J7, d'une nourriture gélifiée facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. En plus de la surveillance visuelle effectuée quotidiennement par les animaliers, les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique après le réveil et jusqu’au moment de l'euthanasie. Les souris seront euthanasiée. Cette surveillance clinique sera effectuée quotidiennement par l'expérimentateur. Elle se base sur une grille de points limites évaluant l’apparence de l’animal (yeux, poils, oreilles, posture...), son comportement (motricité, apathie (activité réduite), posture de repli, détresse respiratoire, hypothermie...), la diminution du poids et la cicatrisation. La fréquence de surveillance clinique des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En cas d'atteinte des points limites, une euthanasie sera effectuée par une méthode réglementaire.

Choix des espèces

Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature et reproduisent des aspects cliniques clés de la fibrose pulmonaire humaine. Les souris offrent également la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés et d’étudier spécifiquement le rôle d’un gène donné dans le poumon. Enfin, le modèle murin permet la mise en place de modèles pré-cliniques incontournable pour le développement précoce de thérapies innovantes. Actuellement, pour la fibrose pulmonaire, il n’existe pas de stratégie alternative pour modéliser la réponse d’un organe dans le contexte d’un organisme entier. La souris est donc un animal incontournable pour apporter des réponses à des enjeux de santé humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte, entre 11 et 13 mois (étude du phénotype pulmonaire à l’état basal) et 7 et 16 semaines (modèle « bléomycine »). La fibrose pulmonaire est une pathologie évoluant en fonction de l'age de l'individu nécessitant une fourchette d'age large pour les animaux utilisés au cours de ce projet.

Pour savoir si les poissons qui descendent la rivière sont attirés vers la turbine la plus meurtrière d'un barrage hydroélectrique, 260 individus vont être capturés et marqués, dont 65 salmonidés et 195 poissons d'autres espèces, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie une opération d'une à trois minutes pour implanter un émetteur acoustique, refermée par une suture au fil résorbable. Les atteintes annoncées vont du stress de capture à une inflammation ou une gêne locale pouvant durer plusieurs semaines. Tous sont remis à l'eau en moins d'une heure, une fois leur nage redevenue active, sauf ceux qui atteignent les points limites définis pour la phase de réveil, alors mis à mort.

Objectifs

L’objectif de l’étude est d’établir un état des lieux du comportement des poissons lors de la phase de dévalaison à l’approche d'un barrage et plus spécifiquement un des groupes hydroélectriques, plus mortel. Ce suivi sera réalisé par l’utilisation de la télémétrie acoustique. Ce suivi comportemental permettra de définir le délai d’approche des individus en fonction de l’espèce, les voies de passage utilisées par les individus, le délai de franchissement en fonction de la voie de passage, les zones de concentration éventuelles afin de définir des zones potentielles d’ouvertures d’exutoires, les détections à l’aval de l’ouvrage à la suite de la dévalaison afin d’obtenir un indice de survie. Le projet est étalé sur 3 années afin d’observer la saisonnalité des déplacements piscicoles (reproduction, alimentation, hivernage) mais également pour prendre en compte les variations interannuelles de l’hydrologie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont d’ordres écologiques. Le projet permettra d’évaluer si les poissons sont attirés préférentiellement vers le groupe hydroélectrique étudié, présentant un indice de mortalité plus élevé que les 4 autres turbines. Le cas échéant, les données obtenues permettront d’orienter vers des solutions visant à réduire l’impact de cette turbine. Diverses solutions sont envisagées, du design d’une voie de passage alternative jusqu’au remplacement de la turbine par un modèle moins impactant. Le projet permettra également d’en apprendre plus sur l’écologie des espèces étudiées. En effet, les déplacements migratoires des poissons sur cette partie du cours d'eau sont peu documentés et la première année met en évidence des déplacements importants des poissons vers l’amont et vers l’aval.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d'un maximum de 3 minutes.

Impact sur les animaux

Voici la liste des nuisances ou effets indésirables sur les animaux : stress lié à la capture et à la manipulation, effets de l’anesthésiant, effets post-opératoire (inflammation liée à l’implantation ou gêne locale pouvant aller jusqu’à quelques semaines), altération temporaire du comportement (lié au stress, à l’implantation, à l’anesthésie pouvant aller jusqu’à quelques heures).

Devenir

Les animaux sont replacés dans leur milieu naturel à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’objectif du projet étant d’évaluer les voies de passage des poissons au niveau d’un barrage, il est indispensable d’observer les comportements individuels de déplacement en milieu naturel. Le remplacement n’est pas envisageable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques tout en garantissant la puissance statistique. Un minimum de 35 individus détectés par espèces ou groupes d’espèce est nécessaire pour mener des analyses robustes. Les espèces ou groupes d'espèces sélectionnées sont le barbeau fluviatile, le gardon, les autres cyprins (rotengle, chevaine, brème commune)et les salmonidés (Truite fario, truite lacustre). Pour espérer détecter 35 individus par groupe d’espèces, soit 140 poissons, il faut tenir compte du taux de détection en dévalaison, du taux de survie post marquage et du taux de rétention du tag. Cela donne 372 poissons à marquer sur l’ensemble du projet. Etant donné que 112 poissons ont déjà été marqués pour ce projet, il reste 260 poissons à marquer sur la durée restante du projet (372-112 = 260). Cet objectif est bien sûr à réévaluer en fonction des captures réalisées. Si certains effectifs de poissons ne sont pas atteints, les effectifs restants pourront être reportés sur d’autres espèces.

Raffinement

Les opérations d'implantation sont réalisées sous anesthésie et ont la durée la plus courte possible, entre 1 à 3 minute pour l’implantation d’un tag. Pour les opérations de 3 minutes, une recirculation d’eau avec une légère sédation est installée pour le poisson. Le poids de l'émetteur ne dépasse pas 2% du poids de l'individu. Les émetteurs sont de trois classes différentes. Le choix de l’émetteur se fait en fonction du poids du poisson à marquer. Les tags sont tous encapsulés dans des matériaux biocompatibles. Concernant le marquage, les solutions d'anesthésiant sont changées tous les 20 individus. Les poissons sont manipulés à l'aide d'épuisette en maille en silicone pour éviter l'abrasion provoquée par les mailles classiques en nylon. Les points de suture sont réalisés avec du fil monofilament résorbable. Le fil monofilament endommage moins les tissus et empêche une infiltration d’eau par capillarité. Le matériel est désinfecté avant chaque session de marquage. Les lames de scalpel sont stériles. Les opérateurs portent des gants stériles. Les poissons sont anesthésiés un par un. Un pansement de povidone iodée est appliqué sur la cicatrice du poisson, ayant un effet antiseptique dans les heures suivant le marquage. Lors des stabulations pré et post marquage, les poissons sont placés dans des volumes d'eau adaptés aux espèces, une pompe à air à grande capacité permet de maintenir un taux d'oxygène adapté et une limitation à l'exposition à la lumière est prévue. La température est également contrôlée pour éviter le stress thermique. Afin de limiter le stress, les poissons sont relâchés le plus rapidement possible (

Choix des espèces

Les espèces ont été choisies en fonction des espèces dévalantes répertoriés dans le rapport du suivi quinquennal de la passe à poissons du barrage étudié ainsi que les espèces les plus susceptibles d’être impactées par les turbines du barrage lors de la dévalaison, et les plus abondantes dans le milieu local ont été retenues). Par ailleurs, elles ont été validées par le Comité de Pilotage du projet. Les stades de développement étudiés seront les stades adultes ou juvéniles (dans la mesure où le poids de l’émetteur a un poids inférieur à 2% de celui de l'individu).

Un infarctus du myocarde est provoqué chirurgicalement chez chaque souris, en moins de vingt minutes, puis suivi de sept injections quotidiennes et de deux échocardiographies sous anesthésie. 384 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente comme effets indésirables principaux l'inconfort de la préhension et une douleur légère au point d'injection, avant de décrire l'insuffisance cardiaque provoquée par l'opération, avec fatigue à l'effort, œdèmes et détresse respiratoire possible. Toutes sont tuées pour prélever le cœur et le sang, afin de mesurer l'effet d'un anticorps censé freiner la fibrose cardiaque.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie qui se traduit par l’incapacité du coeur à assurer son rôle de pompe. Elle affecte plus d’un million de personne en France. La cause majeure de l’insuffisance cardiaque est l’infarctus du myocarde. Ce dernièr est caractérisé par une modification structurelle du tissu cardiaque résultant le développement de la fibrose. Ces modifications mèneront à l’augmentation de la rigidité du muscle cardiaque ce qui augmente le risque d’insuffisance cardiaque. Actuellement, il n’existe aucun traitement qui inhibe la fibrose et améliore la prise en charge des patients, d’où la nécessité de comprendre ses mécanismes et de limiter son développement par des traitements ciblés. L’objectif de ce projet est de produire un anticorps qui inhibe un facteur de croissance impliqué dans le développement de la fibrose cardiaque. En effet, l’expression de ce facteur de croissance diminue au cours du développement, et est très faible (voir meme absente) dans le coeur adulte mais augmente en réponse à un stress notamment en cas d’infarctus du myocarde. De même, ce facteur de croissance a été identifié dans la circulation sanguine, avec un pic de sécrétion dans le 2-4 jours après l’infarctus. Cet anticorps sera testé in vivo et nous validerons son action dans un modèle prè-clinique d’infarctus du myocarde. Ces résultats seront considérés comme un programme de développement pré-clinique pouvant soutenir le passage ultérieur chez l’humain.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer le bénéfice d'une approche thérapeutique qui pourrait empecher le développement de la fibrose cardiaque. A terme, ceci conduira à développer un nouveau anticorps pour lutter contre le développement de l’insuffisance cardiaque, une pathologie qui touchent des millions de patients et qui impacte fortement leur qualité de vie au quotidien.

Procédures

Dans le cadre de ce projet de recherche, nous allons : Dans un premier temps, réaliser une échocardiographie sous anesthésie générale sur tous les animaux afin de mesurer la fonction cardiaque de base, cet examen dure environ 10 min. Dans un second temps, induire un infarctus du myocardique. Cette intervention est unique, réalisée une seule fois sur chaque souris modèle et dure moins de 20 minutes. Les souris seront injectées quotidiennement et pendant 7 jours, cette injection dure environ 5 secondes. 7 jours après la chirurgie, réaliser une deuxième échocardiographie pour mesurer la fonction cardiaque post chirurgie et post traitement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont liés à l’expérimentation, principalement l’inconfort lié à la préhension des animaux et la douleur légère de courte durée au point d’injection. Il y a également les effets indésirables liés à la chirurgie comme l’insuffisance cardiaque. En effet, la chirurgie est une source de douleur pour les animaux et l’insuffisance cardiaque engendrée par l’opération est également une source de souffrance pour la souris et se traduit généralement par une fatigue à l’effort, des Œdèmes et peux aller jusqu’à une détresse respiratoire.

Devenir

A l’issue des différents gestes techniques réalisés sur le même animal, tous les animaux seront mis à mort dans le but de prélever le coeur et le sang. Ceci nous permettera d’étudier l’efficacité de l’anticorps à l’aide de différentes techniques d'analyse.

Remplacement

L’anticorps neutralisant à étudier fait l’objet de tests préliminaires in vitro qui permettent de démontrer son pouvoir neutralisant, d’évaluer sa puissance d’action et sa capacité à réduire l'activation des cellules impliquées dans la fibrose cardique. Notre projet nécessite d'utiliser ensuite un modèle in vivo pour valider ces effets, et ceci en raison d’une approche physiopathologique du système cardiovasculaire intégrée sur animal entier. La réalisation de ce projet constitue une des étapes précliniques indispensables avant l’application chez l’homme de ces approches thérapeutiques.

Réduction

les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés

Raffinement

Le suivi quotidien des animaux par un personnel qualifié et la mise en place de points limites stricts et adaptés au projet permettront d’identifier et de limiter toute souffrance et douleur, d’abord par l’injection des antalgiques et par une mise à mort anticipée selon les méthodes réglementaires, si nécessaire.

Choix des espèces

La recherche clinique sur l’infarctus du myocarde chez l’humain est limitée pour des raisons éthiques, c’est pourquoi le recours aux modèles animaux est devenu indispensable pour élucider les mécanismes mis en jeu. La souris est un modèle de choix, la structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. Les mêmes populations cellulaires sont présentes. Des souris jeunes adultes (agées de 8 à 10 semaines) car leur système cardiovasculaire est bien developpé.

Sensibilisés chaque semaine puis exposés quotidiennement pendant quarante-cinq jours à un produit qui provoque l'asthme, ou traités deux fois par un composé fibrosant, 4 800 souris et 4 800 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les atteintes annoncées vont de la difficulté à respirer aux crachats de sang, en passant par la toux, la perte de poids et les œdèmes liés aux injections répétées. Chaque animal est ensuite tué pour prélèvement d'organes, après une mesure de fonction respiratoire qui immobilise les rats jusqu'à vingt-quatre heures. Le porteur annonce vingt candidats médicaments testés par an pendant cinq ans, sans nommer ni le produit sensibilisant, ni le composé fibrosant, ni les molécules évaluées.

Objectifs

Les maladies respiratoires chroniques sont des maladies qui affectent les voies aériennes (trachée, bronches) et les poumons. Parmi les plus courantes, on retrouve l'asthme, la BPCO (bronchopneumopathie chronique obstructive) le cancer du poumon, les infections virales (grippe, COVID-19) la mucoviscidose, les maladies pulmonaires professionnelles (ex mésothéliome). L’asthme (population jeune) et la BPCO (population âgée), représentent un problème de santé publique majeur en France et dans le monde entier. Ce sont des maladies « civilisationnelles ». L’asthme sévère (10% des asthmes) qui limite fortement l’activité physique malgré un traitement bien conduit, n’a toujours pas de solution thérapeutique réellement efficace. Selon les dernières estimations, la BPCO sera la 4ème cause de mortalité en France en 2030. Aucun traitement curatif n’est disponible à ce jour. L’objectif de notre projet est de mettre en place des modèles expérimentaux de pathologies pulmonaires chez les rongeurs, afin de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques et des approches technologiques innovants. Les pathologies pulmonaires sont des maladies complexes, qui ne peuvent être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et leur système immunitaire. Pour l'instant, il n'est pas possible de prouver l'efficacité des médicaments en utilisant seulement des methodes alternatives à l'expérimentation animale.

Bénéfices attendus

Le but de notre étude est de quantifier l’effet de candidats médicaments par des traitements aigues ou chroniques, afin de valider de nouvelles stratégies thérapeutiques et des approches technologiques innovants pour les pathologies pulmonaires, notamment l’asthme et la fibrose pulmonaire. Nous estimons de tester 20 candidats médicaments par an, donc 100 médicaments pourront être testés sur 5 ans. Cela permettra, à moyen ou long terme, d’identifier de nouveaux médicaments plus satisfaisants pour soigner les patients touchés par ces graves pathologies.

Procédures

Pour le modèle d’asthme chronique, les animaux seront traités par une combinaison de 2 produits sensibilisant, 1 fois par semaine pendant 3 semaines. Ensuite, les animaux seront soumis à une administration pulmonaire quotidienne d’un produit sensibilisant pendant 30 minutes/jour et cela pendant 45 jours. Dans le même temps, les animaux seront traités (3 fois par semaine pendant 6 semaines) avec le candidat médicament. Un prélèvement de sang sera realisé 1 fois par semaine, pour un total de 7 prélévements. La durée de chaque prélèvement de sang sera de 5 minutes. Lors du premier et du dernier jour de traitement avec le candidat médicament, la fonction respiratoire sera analysée à l’aide d'appareils spécifiques (chez la souris pendant 60 minutes; chez le rat pendant 24 heures maximum), puis l’animal sera mis à mort. Pour le modèle de fibrose pulmonaire, la fonction pulmonaire sera analysée, lors du premier et du dernier jour de traitement avec le candidat médicament, à l’aide d'appareils spécifiques (chez la souris pendant 60 minutes; chez le rat pendant 24 heures maximum). La pathologie respiratoire sera induite par 2 administrations d'un produit chimique connu pour induire la fibrose chez l'homme et les animaux. Ensuite à partir du septième jour après la dernière administration du produit fibrosant, les animaux seront traités avec les candidats médicament 1 fois par jour pendant 21 jours. Pendant ce temps, 5 prélèvements de sang seront réalisés. La durée de chaque prélèvement de sang sera de 5 minutes. Par la suite, les animaux seront mis à mort. Pour le modèle de toxicologie, les produits à tester seront administrés par voie pulmonaire pendant 30 minutes pendant 1 jour, 3 jours ou 9 jours, ensuite les animaux seront mis à mort. Deux prélèvements de sang seront effectués pour chaque groupe expérimental. La durée de chaque prélèvement de sang sera de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront sujets aux nuisances typiques des pathologies pulmonaires : réponse inflammatoire étendue, un dépôt de collagène et un épaississement des muscles lisses des voies respiratoires similaires aux pathologies observées chez l’Homme. D’autres nuisances probables seront la difficulté à respirer, des « crachats » de sang, une toux, des éternuements, la perte de poids, de l’inconfort ou une irritation de la gorge dû aux gavages et des problèmes d’irritation ou d’inflammation aux niveaux des yeux/joues à cause des prélèvements de sang et enfin du stress et de la douleur liée à la pathologie. Les animaux pourraient développer des œdèmes à cause des administrations sous-cutanée, intrapéritonéal, intramusculaire et prélèvement de sang submandibulaire. Ils pourront aussi développer l’addition des mauvais signes clinique, tel que : poil hérissé, vibrisse en touffe, léthargie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement/analyses d’organes.

Remplacement

Bien que nous menions en parallèle des études sur des cellules humaines épithéliales de l’appareil respiratoire en co-culture avec des fibroblastes, l’asthme et la fibrose pulmonaire sont des pathologies complexes, qui ne peuvent être étudiée de façon complète que sur des animaux entiers avec leur physiologie et leur système immunitaire complet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été défini comme le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés. Ainsi, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires, étant donné la variabilité interindividuelle. Le nombre de lots est déterminé en fonction du nombre des doses à tester pour chaque molécule

Raffinement

Tous les efforts seront mis en place afin de minimiser la douleur, l'angoisse et la souffrance animale. Les cages sont de type à ventilation individuelle en surpression et sont rangées sur portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés 5-6 par cage (souris) ou 2-3 par cage (rats), en fonction de leur poids corporel et ainsi permettre aux animaux de pouvoir interagir et entretenir des liens sociaux avec leurs congénères, tout en gardant un espace suffisant. Des morceaux de coton, des igloos et des bâtonnets en bois seront intégrés dans les cages d'hébergement. Pendant la manipulation pour l’induction de la pathologie pulmonaire, les animaux sont maintenus sur des tapis chauffants en condition d’anesthésie gazeuse. Ensuite après l’anesthésie et pendant la phase expérimentale, les animaux recevront quotidiennement un complément alimentaire hypercalorique et des graines de tournesol stériles, en plus de la nourriture standard pour rongeurs, afin de limiter la perte de poids. Des points limites ont été mis en place et seront appliqués.

Choix des espèces

Des modèles animaux d'asthme ont été développés chez la souris et le rat, car ils partagent de nombreuses caractéristiques de l'asthme allergique humain. Les principaux symptômes de l'asthme, tels que l'hyperréactivité et l'inflammation des voies respiratoires, peuvent être reproduits plus facilement chez le rat que chez la souris. De plus, la taille des rats permet de collecter de plus grandes quantités d'échantillons. Pour ces raisons, les modèles d'asthme chez le rat gagnent en importance. La reconnaissance du potentiel d'un produit chimique spécifique à induire une fibrose pulmonaire chez l'homme a conduit à son utilisation dans des modèles expérimentaux. Depuis quarante ans, elle constitue le modèle le plus fréquemment utilisé pour la fibrose pulmonaire expérimentale. Elle a été utilisée chez de nombreux animaux, notamment la souris, le rat, le cobaye, le hamster, le lapin, le chien et les primates, mais rats et souris sont les plus fréquemment utilisées. Le stade de développement utilisé sera animaux adultes, à partir de 8 semaines d'âge. En effet, les pathologies étudiées sont présentes principalement chez les adultes.