Procédures modérées

Vingt-huit des 32 macaques à longue queue seront tués pour prélever leurs yeux et vérifier l'intégration de la thérapie génique, les quatre autres restant en vie. Tous sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sur une période pouvant atteindre six mois. Chaque animal subit jusqu'à sept batteries d'examens oculaires de cinquante minutes, une injection dans chaque œil, huit prélèvements de sang et sept ponctions d'humeur vitrée sous anesthésie générale, chaque anesthésie étant précédée d'un jeûne de seize heures, avec des contentions répétées pendant les sept jours suivant l'injection. Le porteur justifie le recours au primate par l'absence de fovéa chez les rongeurs, les chiens et les porcs, cette zone centrale de la rétine n'existant que chez les simiens, l'être humain compris.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à développer une nouvelle approche pour traiter certaines maladies des yeux qui provoquent une perte de vision, comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), la rétinopathie diabétique et la rétinopathie du prématuré. Ces maladies sont causées par une croissance anormale des vaisseaux sanguins dans la rétine, pouvant entraîner des saignements, des cicatrices et une perte de vision irréversible. Actuellement, les traitements existants, comme les injections répétées dans l’œil, permettent de ralentir la progression de la maladie, mais ils sont contraignants et ne suffisent pas toujours à stopper la dégradation de la vision. Notre recherche propose une nouvelle solution : une thérapie génique qui permettrait aux cellules de l’œil de produire elles-mêmes un traitement capable de bloquer cette croissance anormale des vaisseaux. En utilisant un vecteur viral spécifique (AAV), nous espérons cibler précisément certaines cellules de la rétine afin de prolonger l’effet du traitement et réduire le besoin d’injections répétées. Ce projet pourrait améliorer la qualité de vie des patients en leur offrant une solution plus efficace et durable, tout en réduisant les contraintes liées aux traitements actuels. Ces travaux permettront aussi d’en apprendre davantage sur ces maladies et d’optimiser les futures thérapies géniques pour la vision.

Bénéfices attendus

A terme, le bénéfice de ce projet fera progresser les connaissances scientifiques concernant l'étude et l'identification de nouveaux outils de thérapie géniques ciblant le traitement de maladies touchant le système visuel et plus spécifiquement la dégénérescence maculaire liée à l'âge. À long terme, les découvertes apportées par ce projet serviront au développement de thérapies géniques efficaces permettant de guérir des maladies de la vision.

Procédures

Les interventions prévues seront les suivantes : (1) Jusqu’à 7 batteries d’examens oculaires (environ 50 minutes par animal), comprenant une tomographie en cohérence optique, un examen du fond d’œil, un examen à la lampe à fente et une angiographie. Ces examens seront réalisés le mois précédant les interventions, le jour des interventions, puis à raison d’une séance mensuelle (maximum 6 mois). (2) Injections intraoculaires (une injection unique par œil, d’une durée d’environ 5 minutes). (3) Jusqu’à 8 prélèvements sanguins réalisés sous anesthésie générale (durée d’environ 5 minutes chacun), espacés de 15 jours à 1 mois. (4) Jusqu’à 7 prélèvements d’humeur vitrée sous anesthésie (environ 5 minutes chacun), réalisés le jour des injections puis à raison d’un prélèvement mensuel. (5) Chirurgie terminale sous anesthésie profonde, destinée au prélèvement des yeux.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont le jeûne de moins de 16h nécessaire la veille des anesthésies, un stress provoqué par la réalisation de certains gestes techniques tels que la capture de l’animal, les contentions répétées (pendant 7 jours post injection), potentiellement une légère perte de poids consécutive aux injections et le maintien en infirmerie les jours suivant les injections. Une légère douleur liée à la réalisation des gestes techniques (Injection intravitréenne des AAVs sous anesthésie générale) et des peut être observée également. Les injections et induction de la croissance des vaisseaux, bien que réalisées sous anesthésie générale et couverture analgésique, peuvent engendrer un très léger inconfort au niveau de la zone d’injection.

Devenir

A l’issue de la procédure, 28 des 32 animaux seront mis à mort pour prélèvements et analyses de tissus oculaires afin de vérifier la bonne intégration de la thérapie génique. Les 4 animaux non inclus dans l'étude seront gardés en vie.

Remplacement

Les maladies rétiniennes de type dégénérescence maculaire liée à l'âge ou rétinopathies affecte les cellules de la rétine et plus particulièrement la fovéa. Les outils de thérapie génique ciblant ces cellules, l'utilisation de modèle animaux tels que les rongeurs n'est pas possible car ils ne possèdent pas de fovéa. De plus, l'efficacité des vecteurs viraux qui seront utilisés ont été testés et validé au préalable in vitro sur des explants rétiniens humain. La technique proposée dans ce projet aura pour objectif la validation d'une preuve de concept visant à être évaluée à plus long terme dans des études cliniques chez l'Homme. Ce passage à la clinique nécéssite donc cette phase sur modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour ce projet a été réduit à son maximum afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Trente deux macaques seront ainsi utilisés sur 5 ans. Ce nombre d'animaux à été déterminé sur la base d'études similaire réalisées chez le PNH.

Raffinement

Pour chaque procédure réalisée, les interventions seront réalisées sous anesthésie générale complétée par des compléments analgésiques et anti-inflammatoires. Les méthodes expérimentales ont été pensées et choisies pour éviter toute souffrance des animaux et des points limites ont été établis afin de soustraire l’animal à la souffrance en cas d’effets indésirables. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans des animaleries respectant les standards prévus par la réglementation et dans un environnement adapté et enrichi (enrichissements structurels, jouets, litière pour fourrager, socialisation).

Choix des espèces

Les maladies de la vision humaine pour lesquelles le bénéfice du développement de thérapie génique est le plus porteur concerne les maladies altérants les photorécepteurs de la fovea, partie centrale de la rétine. Cette région de l’oeil contient les cônes nécessaires à la vision des couleurs et n’est pas présente chez le rongeur, les chiens ou les porcs invalidant par conséquent leur utilisation pour ce type d'étude. Le primate non-humain a ainsi été choisi car la fovéa n’est présente que chez les simiens (homme inclus). Le modèle PNH choisi et accessible est le macaque cynomolgus. Cette espèce est l’une des espèces de PNH la plus utilisée en recherche pour ce type d’étude. En effet, le macaque cynomolgus présente une structure anatomique de la rétine similaire à celle de l'Homme avec la présence de la fovéa. Ce projet sera réalisé avec des animaux adultes âgés à minima de plus de 3 ans de manière à ce que les structures oculaires soient développées.

Les souris utilisées portent une altération génétique censée reproduire la myopathie de Duchenne, mais le porteur précise que le modèle n'en présente qu'une forme légère, avec une espérance de vie intacte et une locomotion spontanée normale, quand les patients meurent vers 25 ans. 106 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit 53 administrations du composé testé, seize pesées, quatre mesures de composition corporelle, trois prélèvements de sang et deux mesures de force musculaire sous anesthésie. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever les muscles des pattes, le cœur et le diaphragme, au bénéfice d'un client dont le porteur espère qu'il portera la molécule jusqu'au marché.

Objectifs

La myopathie de Duchenne est une maladie d'origine génétique induisant une dégénérescence progressive de l’ensemble des muscles de l’organisme. Elle est liée à une anomalie génétique, responsable de la production d’une protéine impliquée dans le soutien de la fibre musculaire. Chez les patients atteints de cette maladie, qui sont à 99,5% des hommes, les fibres qui constituent les muscles squelettiques et cardiaque se détériorent à chaque contraction et finissent par se détruire. Des cellules souches musculaires tentent de régénérer le tissu musculaire lésé, mais ce processus est vite débordé et la dégénérescence finit par l’emporter. Les patients atteints de la maladie de Duchenne présentent ainsi une espérance de vie très réduite, de l'ordre de 25 ans, du fait notamment de complications cardiaques et respiratoires. La recherche est ainsi très active concernant cette maladie et plusieurs pistes visant à mise au point d’un traitement curatif sont actuellement à l’étude. Néanmoins, à aujourd'hui, il n'existe aucun traitement curatif sur le marché. En revanche, les patients sont le plus souvent traités à l'aide d'anti-inflammatoires afin de réduire l'inflammation musculaire et alléger quelque peu les symptômes de la maladie. Le présent projet vise à étudier les effets d'un composé X en développement sur les symptômes musculaires liés à la myopathie de Duchenne en association ou non avec ces anti-inflammatoires. Le modèle employé est un modèle de mutation génétique spontanée qui présente des symptômes proches de la maladie de Duchenne chez l'humain, bien que les symptômes soient moins prononcés. Le projet devra permettre de montrer l'impact d'un traitement chronique du candidat médicament sur les capacités musculaires du modèle de maladie de Duchenne, dans le cadre d'une administration seule ou en co-traitement avec des anti-inflammatoires.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé visant à traiter les conséquences musculaires de la maladie de Duchenne chez l'humain. Alors que plusieurs molécules ont été testées ces vingt dernières années, il n'existe toujours aucun médicament curatif de la maladie de Duchenne. Il s'agit donc d'une pathologie présentant un besoin médical très important sur le plan thérapeutique. Si l'issue du projet s'avère favorable, le développement dans lequel s'engage notre client pourrait aboutir à la mise sur le marché d'une nouvelle molécule pour le traitement de la maladie de Duchenne.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1) Manipulations par les expérimentateurs pour des mesures de poids corporel (16 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 1 minute); 2) Analyse non invasive de composition corporelle (4 mesures; durée de la mesure: 2 minutes); 3) Administration de traitements (53 administrations; durée : 1 minute); 4) Mesures in vivo de la force musculaire sous anesthésie avec réveil (2 mesures au cours de l'étude; durée de la mesure : 20 minutes), 5) Prélèvements sanguins (3 prélèvements, durée du prélèvement : 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les mesures de poids corporel et autres manipulations ainsi que les mesures de composition corporelle, les prélèvements sanguins et les administrations des traitements pourront être source de stress du fait d'une entrave aux mouvements de courte durée. Les injections pour réaliser les traitements seront source de douleurs légères et transitoires. Les mesures de force musculaire in vivo nécessiteront une anesthésie avec réveil qui peut être source de stress. Enfin, les animaux pourront subir des troubles digestifs mineurs du fait des traitements chronique par les anti-inflammatoires.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les muscles des pattes, le coeur et le diaphragme pour des analyses fonctionnelles (mesures de force musculaire) et histologiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il est nécessaire de tester, suite à une première série d'études menées sur cultures cellulaires, le composé sur organisme entier afin de vérifier que les effets observés dans ces premières étapes se traduisent effectivement en un bénéfice dans le cadre de la pathologie. Par ailleurs, l'étude sur animal reste une étape règlementaire incontournable pour la constitution d'un dossier de demande de premières études sur l'homme (passage aux études cliniques).

Réduction

Le nombre de 12 animaux par groupes utilisés a été rationalisé de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés en tenant compte de l'hétérogénéité du modèle mdx. Le groupe contrôle du modèle, constitué de souris sauvages, a été réduit à 10 animaux compte tenu de la moindre variabilité dans les paramètres étudiés. Enfin, compte tenu que la maladie de Duchenne touche à 99,5% des garçons, l'étude sera limitée au seul genre mâle.

Raffinement

Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum le stress et l’inconfort des animaux sans compromettre les objectifs de l’étude. Les traitements seront administrés par des expérimentateurs rodés à ce type de pratique. Les animaux seront hébergés en cages collectives (2/3 souris par cage) et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos, de matériels de nidification et de briquettes en bois spécialement conçues pour le rongeur. Les procédures de mesure de la force des muscles de la patte arrière seront réalisée chez la souris anesthésié. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Ces actions incluent, entre autres, une surveillance renforcée et l'emploi d'analgésiques en cas de douleur avérée. Il est a noter qu'une étude préalable de toxicité a été réalisée afin de déterminer la dose de composé X employée dans le présent projet : aucun effet toxique n’a été observé, même à des doses 10 fois supérieures à la dose qui sera ici employée. Enfin, pendant la seconde semaine d'habituation les animaux seront habitués par 2 fois (pendant 2 minutes) aux tubes de contention nécessaire à la mesure de composition corporelle et aux prélèvements sanguins.

Choix des espèces

La modèle génétiquement altéré que nous emploieront est classiquement utilisé pour étudier les mécanismes physiopathologiques de la dystrophie de Duchenne et pour tester des candidats médicaments au stade préclinique visant à traiter cette pathologie. Le modèle récapitule de nombreux symptômes de la pathologie de Duchenne, bien qu'il n'exhibe qu'une forme relativement légère de la maladie comparativement à l'humain (espérance de vie non réduite et locomotion spontannée non affectée par la mutation). Ces souris présentent une diminution de leur force musculaire comparativement aux souris sauvages dès 5 semaines d'âge. Elles présentent également une hypertrophie musculaire, mais cette dernière ne compense pas la perte de force. Cette hypertrophie persiste jusqu'à la fin de vie des animaux (leur durée de vie n'est pas affectée par la mutation) mais reste néanmoins légère et n'entraine aucune perturbation de l'activité locomotrice spontanée des souris mutantes comparativement aux souris sauvages. Les souris seront reçues à 5 semaines d'âge. Cet âge a été déterminé en fonction de la cinétique des défaut musculaires observés chez ce modèle. En effet, à partir de 12 semaines, le modèle commence à présenter une hypertrophie musculaire progressive. Bien que la force musculaire des souris génétiquement altérées reste inférieure à celle des souris sauvages à tout âge, et compte tenu de la durée du traitement, nous souhaitons que les souris ne présentent pas une hypertrophie musculaire trop marquée en fin d'étude.

Une fausse route pendant le gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et une perte de 20 % du poids déclenche la même issue. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Elles sont gavées une fois par jour pendant trois mois au maximum, subissent des prélèvements de sang derrière l'œil, des courses sur tapis roulant, un maintien en équilibre sur une roue en rotation, une heure trente d'IRM et vingt minutes d'échocardiographie. Le porteur affirme que le test chez la souris est un "requis obligatoire" avant le passage à l'homme, pour cinq composés déjà commercialisés dans d'autres indications.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.

24 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leur moelle osseuse. Le nombre vient d'un calcul que le porteur détaille : environ trente mégacaryocytes observables par souris, cent nécessaires par condition, six conditions, donc quatre souris chacune. Elles reçoivent une chimiothérapie qui fait chuter leurs plaquettes, puis une injection de Romiplostim et un prélèvement de sang sous anesthésie. Le porteur décrit la thrombopénie induite comme sans impact sur le bien-être des animaux non-humains en l'absence de saignement, tandis que le bénéfice clinique annoncé, faire progresser la prise en charge des patients sous chimiothérapie, reste renvoyé à plus tard.

Objectifs

Chaque année, en France, environ 370 000 personnes atteintes de cancer reçoivent un traitement de chimiothérapie. Ce traitement provoque fréquemment une forte baisse de la numération plaquettaire, appelée thrombopénie, exposant les patients à des saignements. Ces thrombopénies peuvent avoir des conséquences très graves, notamment des retards dans le traitement du cancer. Les plaquettes sont produites dans la moelle osseuse par les mégacaryocytes. Ce processus est sous l’influence d’une hormone, la thrombopoïétine (TPO). Un médicament prometteur, le Romiplostim, qui imite l'action de la TPO, pourrait aider à traiter la thrombopénie induite par la chimiothérapie. Cependant, la moelle osseuse des patients n’étant pas facilement accessible, on ne connait pas encore son impact réel sur les mégacaryocytes dans la moelle osseuse. L’objectif de cette étude est une analyse quantitative et qualitative de l’état fonctionnel des mégacaryocytes (MK) de la moelle après traitement au Romiplostim, notamment en évaluant l'impact du Romiplostim sur la morphologie des MKs ex vivo à J+8. Pour se faire il sera utilisé 1) un modèle préclinique murin déjà validé par le laboratoire, 2) des souris génétiquement modifiées, sans phénotype dommageable, possédant des mégacaryocytes fluorescents et 3) une approche d'imagerie de pointe, permettant d’imager en temps réel le comportement des mégacaryocytes dans leur environnement natif.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle de la PodoPZ des mégacaryocytes. La PodoPZ est une structure présente sur tout le pourtour du mégacaryocyte qui joue un rôle majeur dans la production et la libération des plaquettes dans le sang. Sur le plan clinique, l’impact du Romiplostim en tant qu’analogue de la thrombopoïétine permettra de faire avancer les traitements de restauration de la numération plaquettaire chez les patients sous chimiothérapie. Une thrombopénie est un réel frein au traitement des cancers puisque la seule prise en charge actuelle est de décaler le traitement de chimiothérapie, nuisant ainsi à l’efficacité du traitement anti cancéreux.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 injections et un prélèvement. Une injection sur animal vigile avec une durée de moins d’une minute et une sur animal anesthésié avec une durée de 2-3 minutes. Le prélèvement sanguin s’effectue sur animal anesthésié et dure moins d’une minute. La durée totale de l’anesthésie est d’environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sur les animaux sont: - Le stress lié à la préhension et contention de l’animal (léger)- La douleur liée aux injections et prélèvements (léger) - La thrombopénie induite par le traitement (léger) - La baisse, éventuelle, du système immunitaire (léger). Concernant le Romiplostim, il n’est pas attendu d’effets indésirables ; au contraire ce dernier devrait améliorer les effets liés au traitement, notamment pour la thrombopénie. La durée de la procédure n’excédant pas 8 jours, il n’est pas attendu d’altération de l’aspect et du comportement des animaux (état corporel, pelage, mobilité, respiration, etc).

Devenir

Les analyses par imagerie auront lieues sur les moelles osseuses des souris, ex vivo. Tous les animaux du projet seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d’organes.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre la capacité des mégacaryocyrtes à franchir une barrière vasculaire dans des conditions où le microenvironnement est fortement perturbé par une chimiothérapie. En effet, le franchissement de la barrière vasculaire met en œuvre, simultanément, des interactions entre les mégacaryocytes, les vaisseaux et la circulation sanguine. Des expériences préliminaires réalisées in vitro sur des mégacaryocytes, indiquent que ces cellules ne franchissent pas naturellement une membrane poreuse. Afin de répondre à nos questions, nous devons travailler sur le fonctionnement du système hématopoïétique (création des cellules sanguines) dans sa globalité ; en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. C’est pourquoi, il n’est pas possible de remplacer l’utilisation d’un organisme vivant, en l’occurrence des rongeurs, par une autre méthode.

Réduction

Nous savons par expérience qu'il nous est possible d'observer en moyenne 30 mégacaryocytes par souris en imagerie. Afin d’effectuer des tests statistiques cohérents, nous devons obtenir environ 100 mégacaryocytes par condition. Il nous faut donc 4 souris par condition, qui sont au nombre de 6, ce qui fait un total de 24 souris.

Raffinement

Les animaux étant habitués à la manipulation, le stress engendré lors de la préhension (pince au-niveau de la peau du cou ou tunnel) et de la contention est moins présent. Pour les injections, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane, selon la procédure en vigueur et un anesthésique local ainsi qu’un onguent ophtalmique seront utilisés. Les prélèvements de sang seront réalisés sous anesthésie, ce qui limitera le stress lié à la contention. En ce qui concerne la thrombopénie induite par le traitement, en l’absence de saignement, cette dernière est non impactante pour le bien-être animal. Toutefois, nous anticipons tout risque potentiel de saignement, notamment en cas de bagarre, par un enrichissement supplémentaire (tunnel) et un suivi, rigoureux, des animaux sera effectué deux fois par jour. Cela permettra de détecter au plus tôt tout comportement agressif au sein d’une cage. Pour ce qui est du risque lié à la baisse du système immunitaire induite par le traitement, celui-ci est minime ; toutefois les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé qui permettra d’éviter le développement d’une infection. De plus, des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués le cas échéant.

Choix des espèces

Pour ce qui est du choix de l'espèce, la souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir des mégacaryocytes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptées à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Par ailleurs la souris est un mammifère qui, par expérience, supporte bien les traitements de CIT (limités à quelques jours et à une seule injection), et présente une thrombopénie proche de celle des patients humains dans les conditions de chimiothérapies. C'est également un animal indiqué pour le suivi des traitements pharmacologiques, qui dans notre cas est le Romiplostim. En ce qui concerne le stade de développement des souris : les souris adultes (8–18 semaines, 25–30 g) constituent le modèle le plus adapté car leur système hématopoïétique est pleinement mature, stable et comparable à celui de l’adulte humain, ce qui permet une interprétation pertinente des résultats.

Un gavage oro-gastrique quotidien pendant quatre semaines et jusqu'à quatre prises de sang sous-mandibulaires attendent chaque souris de ce projet. 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer l'effet de produits alimentaires d'origine végétale sur l'expression des gènes et le microbiote intestinal. Le porteur reconnaît que la répétition du gavage peut provoquer des irritations ou des lésions de l'œsophage, et annonce que les prises de sang seront évitées si des tests préalables sur cellules ne montrent aucune modification des hormones de satiété. 576 souris sont tuées à l'issue pour prélever foie, iléon et cæcum, les 144 restantes sont "relâchées de l'étude" et réutilisées dans un autre protocole.

Objectifs

L’objectif du projet est de tester l’effet de différents produits et denrées alimentaires issus de différentes plantes sur l’expression génique (approche nutrigénomique) et sur le microbiote intestinal (effet prébiotique) chez un modèle murin.

Bénéfices attendus

Un bénéfice majeur du projet sera la mise en évidence des modification dand l'expression de gènes impliqués dans des voies métaboliques clés (prolifération cellulaire, immunité, métabolisme), ce qui permettra d'estimer la valeur fonctionnelle du produit alimentaire testé. Un autre bénéfice très important sera la mise en évidence des changements dans la composition du microbiote intestinal, ce qui nous permettra d'évaluer l'effet prébiotique de l'aliment. Nous attendons aussi une confirmation des résultats obtenus in vitro sur les changements dans les dosage des hormones suite à l'ingestion des différents produits, ce qui s'associera aux effets métaboliques observés par les analyses sur l'expression des gènes.

Procédures

Chaque animal fera l’objet d’un gavage oro-gastrique quotidien, d’une durée inférieure à 5 minutes. Les prélèvements sanguins seront effectués chez des animaux vigiles, au niveau sous-mandibulaire et sous anesthésie locale, pour une durée inférieure à 5 minutes par individu. Le nombre total de prélèvements par animal ne dépassera pas quatre.

Impact sur les animaux

La contention nécessaire aux prélèvements sanguins (moins de 5 minutes par session) ou aux gavages (également inférieurs à 5 minutes) engendre un certain inconfort et du stress chez les animaux, mais elle est indispensable pour recueillir des réponses individuelles. Bien que le gavage oro-gastrique ne soit pas douloureux en soi, sa répétition peut causer des irritations ou des lésions œsophagiennes, notamment lorsque le protocole impose une administration quotidienne pendant une période de quatre semaines.

Devenir

A la fin de la procédure, un total de 576 animaux seront euthanasiés afin de récupérer le fois, iléon et caecum. Les 144 animaux restants seront relâchés de l’étude et réutilisés dans un autre protocole.

Remplacement

Les prélèvements de sang seront réalisés sur les animaux uniquement après que des expériences préalables aient été faites in vitro. Nous allons réaliser d’abord les expériences sur des cellules entéroendocrines avec des digestats des différents produits issus des differents produis alimentaires testés obtenus par digestion in vitro. Si aucune modification n’est constatée in vitro, nous allons conclure que le produit ne change pas le taux des hormones de satiété et nous n’allons pas réaliser les prélèvements de sang, évitant ainsi une procédure invasive. Si nous constatons une modification du niveau des hormones suite au contact avec les digestats de différents produits alimentaires testés, nous allons réaliser des prises de sang chez les souris pour doser ces hormones dans le plasma et si les résultats obtenus par les méthodes in vitro montrent une corrélation significative avec les dosages Luminex, nous allons remplacer complètement les dosages dans le serum par les dosages issus de la digestion in vitro, pour toutes nos futures analyses de ce type.

Réduction

Des études in vitro au laboratoire seront préalablement réalisées afin de sélectionner les produits alimentaires susceptibles d’induire un effet fonctionnel, ce qui permet de réduire le nombre de groupe par étude et donc le nombre d’animaux. Le principe de réduction se traduira aussi dans l’utilisation d’un nombre réduit à 6 animaux par groupe. Les analyses statistiques exigent un minimum de 5 individus et nous rajoutons seulement un individu de plus par groupe pour éviter des pertes imprévisibles durant l'expérimentation.

Raffinement

Les animaux seront hébergés et manipulés dans le calme, à distance des autres groupes, dans une salle indépendante (y compris pour les euthanasies). Si des prélèvements sanguins s’avèrent nécessaires, ils seront réalisés par ponction sous-mandibulaire, sous anesthésie locale à la lidocaïne, et espacés dans le temps (J0, J15, J30, J36). Un enrichissement de l’environnement est systématiquement assuré dans notre animalerie (maisons et carrés de cellulose dans toutes les cages). Pour évaluer l’effet du gavage et des prélèvements sanguins, une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place. Si une souris présente des signes de souffrance, elle sera euthanasiée afin d’éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix du fait de son utilisation majoritaire comme modèle d'étude dans la communauté scientifique: cela permet ainsi de comparer ses résultats avec ceux d'autres laboratoires, et échanger avec eux, idées et modèles, à un niveau international. De plus, la souris est l’animal le plus utilisé dans la littérature pour les expérimentations sur transcriptomiques et les modifications du microbiote intestinal puisqu’elles présentent un génome très bien connu et annoté, un métabolisme proche de l’homme et un microbiote présentant de nombreuses similitudes avec celui de l’homme. Le modèle animal souris présente l’avantage d’un gavage relativement facile, et des résultats extrapolable chez l’homme. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes de 6 à 9 semaines puisque ces stades de développement sont fréquemment utilisés dans la littérature sur le sujet.

Évaluer la toxicité de candidats médicaments avant les premiers essais chez l'humain conduit à utiliser 2 550 macaques, 2 508 crabiers et 42 rhésus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 2 473 d'entre eux sont tués à la fin pour l'analyse histopathologique de leurs organes, exigée par la réglementation, et 77 sont gardés en vie pour être réutilisés. Ils reçoivent le composé chaque jour ou chaque semaine, restent attachés en chaise de contention jusqu'à quatre heures, sont mis à jeun seize heures avant sédation, et pour certains opérés sous anesthésie générale afin de recevoir un émetteur de télémétrie. L'hébergement seul dure de un jour à trois mois quand le protocole l'impose. Le porteur affirme que l'évaluation chez une espèce non-rongeur est "indispensable" pour chaque nouveau candidat médicament, et que le macaque est parfois "l'unique espèce pertinente".

Objectifs

Le projet réalisé dans un cadre réglementaire a comme objectif de permettre l'évaluation du potentiel toxique d'un candidat médicament dans le cadre de son développement préclinique (tests réalisés chez l’animal). Conformément aux lignes directrices, l’évaluation chez une espèce non-rongeur est indispensable pour chaque nouveau candidat médicament avant de démarrer les essais cliniques chez l’homme et avant toute autorisation de mise sur le marché. L'espèce primate non humain est parfois l’unique espèce pertinente pour le développement préclinique de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins anti-cancer). Ces études permettent d’évaluer le schéma thérapeutique envisagé et de réduire le risque potentiel encouru par le volontaire sain à la suite de l’administration du candidat médicament au cours des premiers essais cliniques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont le développement et la mise sur le marché de nouveaux médicaments pour des pathologies invalidantes, des maladies graves, en caractérisant les effets et les doses toxiques des médicaments en développement, selon la règlementation, pour assurer la sécurité des nouveaux médicaments.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (ex : orale, injection intramusculaire) de façon journalière ou hebdomadaire avec le composé d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 4h maximum dans le cas de perfusion intraveineuse. Les prélèvements réalisés chez l’animal vigile (ex : sang, par les voies veineuses périphériques) nécessitent une contention de courte durée (jusque 4h maximum pour des perfusions intraveineuses). Les prélèvements nécessitant une sédation et/ou une anesthésie (ex. biopsie) ont une durée estimée à une heure maximum, Pour certaines études (rares), un hébergement individuel peut être requis pour collecter des données individuelles ou éviter les contaminations d'un animal à l'autre. Par exemple, des examens urinaires ou de selles peuvent nécessiter un hébergement individuel en cage à métabolisme (4 heures en général, 18 heures maximum). Si la procédure expérimentale ne permet pas de regrouper les animaux (ex : traitement dans l'alimentation ou l'eau de boisson avec nécessité de déterminer précisément la dose administrée à chaque animal et/ou cinétiques de collecte de fécès ou d’urine), ou en cas d’agressivité et d’incompatibilité sociale entre les animaux (ex : animaux sexuellement matures), les animaux doivent être hébergés individuellement (volières habituelles) pendant toute la durée de l’étude (de un jour à 3 mois). Pour les évaluations cardiovasculaires par télémétrie, soit les animaux portent un gilet (après habituation), soit sont implantés chirurgicalement sous anesthésie générale (durée de 2h maximum, avec analgésie et suivi péri-opératoire adaptés, sur au moins 10 jours).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables ou nuisances attendus correspondent essentiellement : - aux effets du produit administré (exemple : variation de la fréquence respiratoire) - aux effets systémiques (exemple : perte de poids, baisse de consommation alimentaire) - à l’inconfort généré par les procédures : de contention (exemple : contention en chaise sur une durée maximale de 4 heures, port du gilet de télémétre), d’administration (exemple : cas des administrations répétées), et/ou de prélèvement sur animal vigile (exemple : prélèvement de sang, de sperme) - à la sédation/anesthésie générale requises pour certaines procédures (prélèvements de biopsie, implantations chirurgicales d’émetteurs de télémétrie) et nécessitant une mise à jeun (environ 16 heures) - à la chirurgie (par exemple pour implanter un emetteur de télémétrie pour l’enregistrement des paramètres cardiovasculaires) et aux effets indésirables post-opératoires éventuels. - hébergement individuel (contacts olfactifs, visuels, sonores préservés), le cas échéant

Devenir

Les études de toxicologie règlementaires incluent une évaluation obligatoire des effets sur les organes et tissus (analyse histopathologique), et nécessitent par conséquent une mise à mort des animaux en fin d’étude. Pour les études où une analyse des tissus et organes en fin d’étude n'est pas nécessaire, et si les animaux ont subi uniquement des effets légers ou modérés et réversibles, les animaux peuvent être gardés en vie, et être réutilisés dans un autre projet après une période de récupération et autorisation du vétérinaire. Il est estimé qu’environ 77 animaux seront gardés en vie.

Remplacement

L'évaluation de la toxicité d'un candidat médicament et/ou d’un dispositif médical ne peut pas être réalisée in vitro. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ce type de procédure de traitement identique à celle utilisée chez l'homme, en raison notamment de la complexité que représente un organisme vivant. Dans certains cas, l'espèce primate non humain est la seule espèce pertinente pour les essais pré-cliniques (similarités physiologiques ou métaboliques Homme-primate non humain), par exemple dans le cas de composés biologiques (protéines thérapeutiques, anticorps monoclonaux, vaccins thérapeutiques anti-cancer...).

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est celui recommandé dans les lignes directrices ICH (International Council for Harmonisation) ou OCDE (Organisation de coopération et de développement économiques), et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude. Le besoin de groupe contrôle, le nombre de doses nécessaires, ainsi que les techniques de prélèvements sanguins sont évalués systématiquement pour assurer une réduction du nombre d’animaux. En incluant dans une même étude (i.e. sur les mêmes animaux), l’évaluation toxicologique et l’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité, le nombre d’animaux utilisés est très nettement réduit.

Raffinement

Les procédures, les conditions d’hébergement et matériel utilisés ainsi que les enrichissements fournis sont adaptés aux animaux utilisés dans ce projet. Des enrichissements variés (ex : graines dans des copeaux, tablettes à différentes hauteur) sont fournis aux animaux leur permettant d’exprimer les comportements physiologiques et activités qu’ils auraient dans leur habitat naturel (ex : recherche d’aliment, épouillage, temps d’isolement). Les actes pouvant engendrer du stress, de l’inconfort ou des douleurs importantes seront réduits au minimum nécessaire et seront réalisés sous sédation ou anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté dans le cas échéant. Dans le cas où l’anesthésie est jugée plus traumatisante pour l’animal et/ou si l’anesthésie est incompatible avec les prélèvements prévus, les prélèvements seront réalisés sur l’animal vigile, notamment les prélèvements sanguins et le recueil d’urine, par exemple. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'étude et évalué grâce à la mise en place de points limites qui permettront d'intervenir immédiatement s'il y a un signe d’inconfort ou de souffrance et de veiller au bien-être des animaux. Les mesures sont prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux. D’autres traitements peuvent être mis en place suivant les recommandations des vétérinaires, selon les observations, conditions d’expérimentation. L’évaluation des paramètres de pharmacologie de sécurité est effectuée par télémétrie, permettant l’obtention de données fiables, sur des périodes de temps prolongées, et avec des contraintes sur l’animal minimisées.

Choix des espèces

Le choix du primate non humain est justifié notamment par : - les homologies avec l'homme - la disponibilité d'études préliminaires dans cette espèce, - les données de pharmacocinétique, pharmacodynamie Certains composés biologiques ciblant le système immunitaire [anticorps monoclonaux, protéines et vaccins thérapeutiques (tels que les composés pour des traitements anti-cancer, anti-Alzheimer)] ne peuvent être testés que chez le primate non-humain (espèce non-rongeur avec le système immunitaire le plus proche de l'Homme). Le choix de l’espèce de primate non humain est le plus souvent déterminé par des études in vitro permettant de comparer le métabolisme de ces espèces avec celui de l’homme, ou de prouver que le candidat médicament a la même affinité pour sa cible chez le primate non humain et l’homme. La pharmacocinétique du candidat médicament est également prise en compte, ainsi que les connaissances acquises avec des produits de même classe pharmacologique. Les macaques (crabiers ou rhésus) sont les seules espèces de primates non humain utilisées dans les études de toxicologie réglementaire. Les animaux seront âgés de 2 à 4 ans en standard. Pour certains composés, des animaux mâtures (d'un point de vue maturité sexuelle ou maturité du système immunitaire) doivent être utilisés (ex : nouveau produit contraceptif, anticancéreux, immunomodulateurs). Dans ce cas les femelles ont en général au-moins 4 ans, et les mâles au minimum 4 à 5 ans. Pour certaines indications, il sera indispensable de tester le candidat chez un animal un peu plus jeune (20 mois minimum).