Procédures modérées

Capturés en milieu naturel, transportés isolément en moins de trente minutes, anesthésiés puis injectés d'hormones pour déclencher la ponte : trois couples de grenouilles vertes et six couples de xénopes ouvrent ce protocole, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs têtards, 1 152 répartis dans 24 bacs placés en milieu naturel à raison d'un ou trois par litre, plus 165 passés en test de comportement de quinze minutes dans un aquarium d'un litre, servent à mesurer si la présence du xénope ralentit la croissance de la grenouille verte. 1 335 amphibiens sont déclarés au total. Les six grenouilles vertes adultes et leurs 636 têtards sont remis à l'eau sur leur mare d'origine, tandis que les 693 xénopes, adultes et têtards, sont anesthésiés puis tués par surdose d'anesthésiant parce que leur espèce est classée exotique envahissante.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’apporter des éléments de connaissance sur la sensibilité des populations d’amphibiens autochtones comme la grenouille verte à des changements environnementaux majeurs auxquels l’espèce est confrontée. Si les études scientifiques sur l’écologie de la grenouille verte sont nombreuses, l’impact de la présence de potentiels compétiteurs invasifs sur la dynamique des populations de grenouille verte restent très mal documentés. L’étude se propose ici de tester l’impact de la présence des têtards de xénope lisse Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis une quarantaine d’années en France. Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet visera à étudier l’impact de la présence du xénope sur la croissance (durée de la période larvaire), la survie, la taille à la métamorphose et le comportement de la grenouille verte. Pour ce faire, il est nécessaire d’obtenir des pontes de grenouille verte et de xénopes à partir d’adultes capturés en milieu naturel puis injectés à l’aide d’une hormone. Une fois les pontes obtenues les adultes de grenouille verte seront relâchés et les adultes de xénopes seront mis à mort (dû à son statut d’espèce exotique envahissante) puis les têtards seront placés en bacs en milieu naturel. Les têtards seront placés sous des conditions de compétition différentes (intra- et interspécifique) et sous une ou deux densité différentes (1 et 3 têtards par litre). Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature) en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé.

Bénéfices attendus

Ce projet s’insère dans les problématiques de conservation et gestion de la biodiversité. Il s’inscrit dans le défi scientifique actuel visant à comprendre les mécanismes en lien avec la sensibilité des organismes à l’altération spatio-temporelle de leur habitat dont la présence des espèces exotiques envahissantes est annoncée comme l’une des principales causes de l’érosion de la biodiversité. Ce projet nous permettra de tester pour la première fois l’impact de la présence du xénope sur la croissance, la survie, la taille à la métamorphose et le comportement des grenouilles vertes en milieu naturel. Nous émettons l’hypothèse que la présence de têtards de xénope dans le milieu de vie des grenouilles vertes pourrait induire une diminution de leur croissance et survie en affectant des fonctions écologiques vitales chez la grenouille verte. D’un point de vue comportemental, nous émettons l’hypothèse que la présence de têtards de xénope induirait un changement dans l’occupation spatiale des têtards de grenouille verte. Ces résultats permettraient une meilleure compréhension de la biologie et de l’écologie de ces deux espèces et plus encore sur leur interaction. De manière plus globale, cette étude permettra d’apporter des éléments scientifiques qui viendront enrichir les discussions sur les stratégies de gestion/conservation de ces espèces à l’échelle du territoire notamment depuis que le xénope a colonisé beaucoup de zones humides dans l’Hexagone.

Procédures

Le transport sera assuré jusqu’au laboratoire en moins de 30 minutes. Les femelles préalablement anesthésiées seront injectés d’hormones une fois (durée d’injection : 30 secondes) pour induire l’ovulation et stimuler l’accouplement. Après isolement et éclosion des pontes, les têtards seront répartis dans des bacs placés en milieu naturel sous deux densités différentes (1 têtard par litre et 3 têtards par litre) et en interaction inter- et intra-spécifique (plurispécifiques ou monospécifiques). D’un côté, nous testerons quatre réplicats pour chaque modalité, nous aurons donc 24 bacs et 576 têtards de grenouille verte et 576 têtards de xénopes en tout. Au moment de la métamorphose (dès la sortie de la première patte) les individus seront pesés et mesurés. D’un autre côté, des têtards seront répartis, au sein de quatre bacs pour les xénopes et trois bacs pour les grenouilles vertes (env. 1 têtard par litre). Nous aurons besoin de 60 têtards de grenouille verte et 105 têtards de xénopes. Une fois que les individus ont trois jours, ils seront placés par groupe dans un dispositif de test de comportement (aquarium de 1 L contenant de l’eau de mare). Les têtards seront placés en acclimatation pendant 15 minutes dans le dispositif (3 réplicats de 5 grenouilles vertes seules, 3 réplicats de 5 xénopes seuls puis 3 réplicats avec trois densités différentes (5, 10, 15) de xénopes confrontés à 5 grenouilles vertes). Le test durera 15 minutes puis les individus seront tous replacés dans un bac à part afin de ne pas repasser les mêmes individus en test. Une fois les tests passés, les adultes et les têtards de grenouilles vertes seront replacés dans le milieu naturel sur leur site d’origine. Les xénopes ne pouvant pas être libérés dans la nature seront placés dans un bain de sédatif pour être anesthésiés puis une surdose d’anesthésiant sera ajoutée pour la mise à mort des têtards et des adultes.

Impact sur les animaux

Fort de notre expérience, nous ne prévoyons aucun problème lors de la capture d’adulte et le transfert vers l’EU. Il est envisageable qu’un amphibien soit blessé lors de la capture ou de la manipulation et donc développe une maladie. Pour l’injection d’hormones (1 fois pendant la durée de la procédure, douleur légère et temporaire (10 secondes) lors de l’injection), les amphibiens seront anesthésiés pendant 15 minutes. Le transport (1 fois pour les xénopes, 2 fois pour les grenouilles vertes) entre le site de prélèvement et l’EU (< 30 km), est un stress léger à modéré sur la durée (30-40 minutes). Afin de limiter les agressions entre les individus ils seront transportés isolément dans leur boîte. Seront contrôlés pendant l’expérimentation, l’activité et la décoloration de la peau. Le nourrissage se déroulera en fin de journée (intervention de 5 minutes maximum dans l’EU). La bonne prise alimentaire sera vérifiée par la prise de poids.

Devenir

Les 6 grenouilles vertes adultes et les 636 têtards seront remis en liberté avec une acclimatation à leur milieu naturel en ouvrant les boites de transports à côté de leur mare d’origine. Les animaux seront observés le temps qu’ils sont visibles après l’ouverture des boites afin de s’assurer de leur bonne acclimatation à leur milieu. Les 12 xénopes adultes et les 636 têtards seront mis à mort avec une surdose d’anesthésiant après une anesthésie car il est impossible de relâcher dans le milieu naturel cette espèce classée comme espèce exotique envahissante.

Remplacement

L’objectif de l’étude étant d’étudier la survie et la croissance des premiers stades de vie de la grenouille verte face à la présence d’un compétiteur, il n’est pas possible de remplacer les animaux prévus pour cette expérimentation. Il est donc nécessaire de recourir à des animaux. De plus, il est impossible de modéliser les réponses des têtards face à la compétition car c’est la première fois que cette question sera posée pour ces deux espèces dans un contexte semi-contrôlé et en testant la compétition indirecte. Par conséquent, aucun modèle ne pourra permettre de prédire ce qu’il va se passer.

Réduction

Les trois couples de grenouille verte et les six couples de xénopes soit trois femelles et trois mâles Pelophylax spp. et six femelles et six mâles Xenopus laevis seront amenés au laboratoire et injectés d’hormones permettant d’induire la ponte et de stimuler l’accouplement. Les trois couples de chaque espèce sont le minimum pour assurer la quantité d’œufs nécessaire pour l’expérimentation en bacs. Par ailleurs, la densité de têtards (1 ou 3 têtards par litre), nous semble appropriée pour pouvoir observer des interactions entre les individus.

Raffinement

Le transport de la zone de prélèvement en milieu naturel vers le laboratoire sera effectué dans des bacs fermés et à l’abri de la lumière pour limiter le stress des animaux. Les amphibiens étant des espèces proies, il est important de leur fournir un abri. Des tuyaux en plastiques et des objets flottants seront alors disposés dans les bacs permettant aux amphibiens de se cacher. De plus, afin d’apporter un environnement plus complexe aux amphibiens, des pierres seront disposées dans les bacs. Avant, l’expérimentation, la qualité de l’eau (dureté et chlore) sera testée. Chaque jour, une personne habilitée et formée sera en charge de vérifier le comportement des amphibiens avant et après l’injection d’hormones (en dehors des périodes de nourrissage). La qualité d’eau, c’est-à-dire les paramètres physico-chimiques sera mesurée une fois par semaine. En cas de mauvaise qualité d’eau, un changement d’eau sera effectué puis une mesure deux jours après sera reprise pour s’assurer que les amphibiens sont dans un environnement stable. Enfin, l’anesthésie avant l’injection d’hormone permettra de limiter tout stress. Les différentes phases de réveil seront surveillées ainsi qu’un retour à l’alimentation 24h après l’injection. Pour la phase expérimentale en bacs, le transport de la zone d’élevage à la zone expérimentale sera effectué dans des bacs couverts permettant de placer les individus dans le noir limitant le stress des amphibiens lors du transport. Une mauvaise qualité d’eau reportera le test prévu. Enfin, il y aura une période de 15 minutes d’acclimatation dans l’arène avant de commencer le test de comportement. Le bien-être sera évalué par une grille déterminant les points limites à la continuité du projet. Infections, blessures, comportement, dépigmentation et prise alimentaire seront évalués grâce à une échelle de score donnant un score global compris entre 0 (normal – aucune action) à supérieur à 7 (mise à mort de l’amphibien avec une surdose d’anesthésique).

Choix des espèces

Les deux espèces choisies sont : la grenouille verte Pelophylax spp. et le xénope Xenopus laevis. L’objectif de cette étude est de comprendre l’impact de la présence des têtards de xénope lisse Xenopus laevis sur la grenouille verte Pelophylax spp. Le xénope lisse est une espèce d’amphibien originaire d’Afrique australe introduite et envahissante depuis quelques années dans les mares, cours d’eau et rivières . Cette espèce au stade adulte est aujourd’hui connue pour menacer la biodiversité locale par de la compétition directe avec les amphibiens ou encore par la transmission de maladies. Cependant, il n’a pas encore été décrit l’impact indirect de la présence du xénope lisse dès les premiers stades de vie sur la faune locale. Ce projet apportera des informations essentielles sur l’impact du xénope lisse sur une espèce locale d’amphibien, la grenouille verte qui est aujourd’hui classée en quasi-menacée sur la liste rouge de l’IUCN (Union Internationale pour la Conservation de la Nature) en France. Ce classement implique que si des mesures rapides ne sont pas prises, leur statut de conservation sera menacé. Aujourd’hui, il apparaît donc nécessaire de comprendre l’impact de la colonisation du xénope dans sa globalité dès les plus jeunes stades de vie. Les animaux impliqués dans la première procédure seront des adultes. Notre objectif étant d’obtenir des pontes, nous n’avons la possibilité que de travailler sur des animaux matures et prêts à se reproduire et des femelles prêtes à pondre. C’est pour ces raisons que les animaux ne seront mis en captivité que lorsqu’ils seront prêts à s’accoupler. Pour la seconde procédure, les animaux utilisés seront des têtards des deux mêmes espèces. Notre objectif est d’étudier l’impact de la présence d’un compétiteur ou non sur le comportement de fuite, sur l’activité ainsi que sur les potentielles capacités des individus à se regrouper pour se défendre dès les premiers stades de vie.

129 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome sous la peau du flanc, puis dix injections de prodrogue étalées sur cinq semaines, ou la chimiothérapie de référence cinq jours de suite tous les 28 jours, avant une séance d'imagerie sous anesthésie de moins d'une heure et la mise à mort. Une partie d'entre elles est immunodéprimée, ce qui les expose à un risque d'infection, et les molécules administrées peuvent provoquer une perte de poids et une gêne à la locomotion quand la tumeur devient encombrante. Le porteur annonce une prodrogue active uniquement dans la tumeur, donc "sans effets secondaires" sur les tissus sains, affirme qu'aucun modèle alternatif n'existe, et dit tirer de ses essais antérieurs des arguments en faveur d'une "efficacité redoutable".

Objectifs

Ce projet a pour but d’évaluer une nouvelle thérapie plus efficace que la chimiothérapie de référence. Pour cela notre stratégie en deux temps repose sur l’utilisation de nouvelles molécules, délivrant de manière ciblée un agent chimiothérapeutique au sein même des glioblastomes. Cette prodrogue activable transporte une molécule de chimiothérapie sous sa forme inactive, et n’est activée uniquement au sein de la tumeur, présentant donc une efficacité maximale, sans effets secondaires, sur les tissus sains où elle reste sous sa forme inactive. Nous validerons cette approche chez l’animal immunocompétent, permettant d’évaluer sa réponse immunitaire contre le cancer, et chez l’animal immunodéprimé pour évaluer la réponse sur une tumeur humaine. Notre approche s’inscrit dans un contexte de médecine de précision. Une fois validée chez le petit animal, cette stratégie pourrait être appliquée chez l’homme très rapidement.

Bénéfices attendus

L'administration contrôlée d'agents anticancéreux améliorera l'efficacité des systèmes moléculaires proposés sur le glioblastome, et augmentera ainsi les bénéfices en termes de survie et de qualité de vie des patients. Si cette approche se révèle efficace sur ces modèles de glioblastomes, elle pourrait être mise à profit pour beaucoup d’autres types de tumeurs. Cette stratégie de prise en charge pourrait potentiellement devenir universelle, quel que soit le type de tumeurs.

Procédures

Les animaux recevront une unique injection de cellules tumorales sous la peau (durée 2 minutes). Pour tous les groupes traités en deux temps par la prodrogue, le traitement sera administré 1 fois tous les 7 jours pour 5x2 injections au total (durée de l’acte

Impact sur les animaux

Pour ce protocole, l’implantation tumorale sur le flanc des souris entrainera un léger stress à l’implantation, et sera réalisé sous anesthésie volatile. Chez ces animaux, il est possible qu’ils ressentent une faible gêne lors de la locomotion suite à l’encombrement que la tumeur peut engendrer. Les animaux immunodéprimés présenteront un risque faible d’infection. Les protocoles d’imagerie entraineront un stress bref et modéré lié à l’injection des agents d’imagerie à des animaux vigiles. Les administrations de molécules thérapeutiques entraineront un stress bref et modéré lié à l’injection des molécules à des animaux vigiles. Ces molécules thérapeutiques (chimiothérapie de référence et prodrogue d’intérêt) pourraient provoquer une légère perte de poids dans les jours suivants les administrations.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées en particulier sur les tumeurs afin de valider l’efficacité de la thérapie au niveau cellulaire.

Remplacement

Aucun modèle alternatif n’est disponible actuellement pour s’affranchir de ce type d’étude. Seuls les tests in vivo pourront nous permettre de valider la supériorité en termes d’efficacité de la prodrogue pour la thérapie du glioblastome. Cependant, les études préliminaires réalisées in vitro et in vivo avec d’autres constructions moléculaires ont permis d’avoir des arguments en faveur d’une efficacité redoutable sur les tumeurs.

Réduction

Nous limiterons notre étude au strict minimum requis dans le nombre de souris et les différents modèles murins à utiliser afin de sélectionner et de caractériser cette prodrogue pour la prise en charge du glioblastome. Dans ce projet, ce nombre est fixé à 129 animaux.

Raffinement

L’existence de points limites, basés sur un scoring clinique, comportemental et adaptés à ces modèles tumoraux, seront utilisés afin de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie, d’une durée inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit thermostaté le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance de l’animal si les tumeurs atteignent un volume impactant le bien-être animal. En ce qui concerne le phénotype dommageable des animaux immunodéprimés, ces animaux seront hébergés en environnement stérile (boite, litière, boisson et nourriture) et la manipulation des animaux se fera sous hotte. Nous utiliserons des lignées de cellules tumorales murines qui seront implantées chez des animaux ayant un phénotype non-dommageable lorsque possible.

Choix des espèces

Les études précédentes utilisant notre chimiothérapie activable ont toutes été effectuées chez la souris. Les modèles sélectionnés sont les seuls à pouvoir permettre une expression de l'enzyme d'intérêt au niveau tumoral et ainsi déclencher l’activation de notre molécule. Ces modèles sont très pertinents vis-à-vis de la pathologie clinique puisque ce sont des modèles qui présentent des caractéristiques similaires aux tumeurs humaines. Les protocoles concerneront uniquement des souris qui seront âgées entre 5 et 6 semaines au moment de leur arrivée dans le laboratoire, pour permettre une implantation et un développement tumoral optimal.

2 904 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois à neuf injections intrapéritonéales à l'état vigile, un à quatre prélèvements sanguins sous anesthésie, un prélèvement de lymphe, puis une perfusion intracardiaque terminale. Le projet vise à décrire le rôle d'une voie de signalisation dans le développement du réseau lymphatique, les retombées pour l'humain restant énoncées comme un "potentiel de ciblage" pour corriger des dysfonctionnements. Sur les effectifs, le porteur renvoie à la littérature et à des tests statistiques sans donner de chiffre, et affirme qu'aucune culture cellulaire ni aucun organoïde ne reproduit un réseau lymphatique, ce qui fait de l'expérimentation animale le "seul modèle" possible.

Objectifs

Le réseau lymphatique joue un rôle important dans la réponse immunitaire par le transport des antigènes et des cellules immunitaires. Un dysfonctionnement du développement et des fonctions de ce réseau peut entraîne une diminution de l'efficacité des défenses de l'hôte contre les agents pathogènes ainsi que la surveillance tumorale. Les mécanismes qui régulent le développement et les fonctions lymphatiques partagent des caractéristiques avec le développement vasculaire sanguin, mais sont moins bien définis. L'objectif de ce projet est d'étudier la contribution d'une voie essentielle de signalisation vasculaire sanguine au développement et à la fonction lymphatiques chez la souris, ainsi que le potentiel de ciblage de cette voie pour la correction des dysfonctionnements lymphatiques.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus permettront de mieux comprendre l’impact potentiel de certains lipides sur leurs contributions à une voie essentielle de la signalisation vasculaire ainsi que le potentiel de ciblage de cette voie pour la correction des dysfonctionnements lymphatiques chez l’humain.

Procédures

Les animaux subiront : - 3 à 9 injections intrapéritonéales sur souris vigiles d’une durée de 30 secondes. - 1 à 4 prélèvements sang sous anesthésie d’une durée d’environ 60 secondes. - Une récupération de la lymphe sous anesthésie d'une durée d'environ 5 minutes. - 1 perfusion intra cardiaque terminale sous anesthésie d'une durée d'environ 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections en intra péritonéal peuvent causer une douleur et un stress de courte durée. L'anesthésie peut entrainer un stress et une douleur légère de courte durée. Les prelévements de sang en intra veineux ainsi que la contention pré anesthésie peuvent occasionner une douleur et un stress de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Les modèles sur souris sont une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le développement du système vasculaire lymphatique. Il n'existe actuellement aucun modèle permettant d'étudier la structuration vasculaire et la formation des valves dans toute leur complexité en culture cellulaire ou sur organoïdes. En effet, actuellement il n'y a pas de systèmes en culture cellulaire qui reproduisent, imitent ou permettent la modélisation d’un système vasculaire lymphatique. L’expérimentation animale est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie.

Réduction

Les effectifs sont déterminés à partir des données de la littérature et avec des tests statistiques adaptés. Pour chaque expérience, le maximum de tissus est prélevé afin de maximiser les analyses biologiques possibles.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales notamment l'utilisation d’analgésique ainsi que d’anesthésie adaptées durant la procédure, et l’établissement de points limites adéquats. Les animaux sont surveillés tout au long du projet. Des grilles de score et de points limites spécifiques au projet ont été établis, permettant d'intervenir pour soulager les animaux en cas de souffrance. L'atteinte d'un point limite qui ne pourra pas être soulagé entrainera une mise à mort anticipée de l'animal avant la fin du protocole.

Choix des espèces

L’utilisation des animaux est nécessaire car il n’existe pas, à ce jour, de modèles de réseau lymphatique vasculaire en culture cellulaire permettant de reproduire sa physiopathologie. Le choix de l'espèce « souris » nous permet d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés. Ces animaux nous permettront d’analyser finement le rôle spécifique de certains lipides. Ces animaux seront utilisés à différents stade de vie (jusq'à 1 an) afin de pouvoir mettre en évidence l'évolution des réponses physiologiques en fonction de l'age.

Les souris dont la prostate grossit au point de gêner la miction sont mises à mort et disséquées, de même que celles qui perdent plus de 20 % de leur poids ou cessent d'interagir avec leurs congénères. 3 200 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à différents points de cinétique pour prélever la prostate et d'autres organes. Elles reçoivent une injection quotidienne cinq jours de suite pour inactiver un gène, puis jusqu'à trois prélèvements sanguins espacés de 28 jours, et développent des lésions précancéreuses qui peuvent évoluer vers des tumeurs volumineuses et douloureuses jusqu'à quinze mois après l'induction. Le porteur annonce des groupes de vingt souris par point de cinétique et une réduction possible après les premières cohortes, sans expliquer comment il arrive au plafond de 3 200 animaux qu'il se réserve.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'Homme. L'objectif de ce protocole, qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, est le suivi et la caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera surveillée pendant une période suffisante afin de détecter l'apparition de formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 1 injection quotidienne réalisés pendant 5 jours successifs, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ces injections seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après inactivation du gène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris.

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, une infection peut se développer dans les journées qui suivent. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur, vérifiée par palpation abdominale, sera donc un point limite clé. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. les injections et les prélèvements de sang entrainent une légère douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate gêne une miction naturelle, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes les plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

Des écouvillons oculaires, buccaux, nasaux, rectaux ou vaginaux, parfois quotidiens, des administrations intranasales, orales, intra-oculaires ou intrapéritonéales sous anesthésie générale, des injections sous-cutanées sur animaux éveillés et des prises de sang régulières : 260 chats de moins d'un an vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par le calicivirus, le virus de la panleucopénie, l'herpèsvirus félin, Chlamydia felis ou le virus leucémogène, et peuvent développer ulcères buccaux, conjonctivite, kératite, dyspnée, diarrhées, vomissements, déshydratation et douleurs abdominales. Le projet sert à mettre au point des vaccins vétérinaires, 192 chats étant tués pour des prélèvements terminaux, 40 réutilisés et 28 adoptés sous réserve d'un feu vert sanitaire. Le porteur chiffre les effectifs par souche pour trois virus, s'en tient à une fourchette de deux à huit chats par groupe pour les autres pathogènes, et ne précise ni le nombre d'interventions par animal ni la fréquence exacte des écouvillonnages.

Objectifs

Le projet vise à développer de nouveaux vaccins pour les chats, notamment dirigé contre le calicivirus félin (FCV), le virus de la panleucopénie (FPV), le virus de l'herpes félin (FHV), la Chlamydia felis, et le virus leucémogène félin (FeLV). Les objectifs principaux sont la sélection de souches récentes à inclure dans un nouveau vaccin plus efficace, la mise au point de modèles félins d'infection par les différents pathogènes à partir de souches récentes collectées sur le terrain, la vérification de sûreté/innocuité des vaccins mis au point, ainsi que la vérification de leur efficacité.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mettre au point de nouveaux vaccins à destination des chats, afin d'offrir une meilleure protection contre des maladies courantes et potentiellement graves, telles que le coryza, le typhus, l'herpèse virose et la chlamydiose, la leucose féline.

Procédures

Les animaux recevront des administrations intranasales, orales, intra-oculaires ou intrapéritonéales (sous anesthésie générale) ainsi que les injections sous-cutanée (sur les animaux vigiles) et dans le respect des ligne directrices sur les volumes reçus. Cela représente environ 15 minutes/animal Des prises de sang seront effectuées régulièrement, en respectant les volumes maximaux, non préjudiciables aux animaux (quelques millilitres/semaine). Afin de ne pas stresser les animaux, elles pourront être effectuées sous sédation. (env. 2 minute par prise de sang) Des écouvillons seront également effectués, parfois quotidiennement, au niveau oculaire, buccal, nasal, rectal ou vaginal, pour mesurer la présence des virus ou bactéries. Le matériel utilisé est des très petite taille, de façon à être compatible avec la taille des animaux, et à ne pas générer de douleur (env. 2 minutes par jour)

Impact sur les animaux

Dans le cadre de la mise en place d’un modèle infectieux, le projet nécessite l’administration de virus ou de bactéries aux chats. Ils pourraient ainsi développer des symptômes spécifiques aux maladies ciblées : - Pour le calicivirus félin : symptômes du coryza, incluant abattement, perte de poids, hyperthermie, jetage nasal et/ou oculaire, éternuements, toux, ulcères buccaux et/ou nasaux, conjonctivite, dyspnée. - Pour le virus de la panleucopénie féline : symptômes du typhus félin, tels que abattement, perte de poids, hyperthermie, perte d'appétit, diarrhées, vomissements, déshydratation, douleurs abdominales. Les symptômes, s’ils apparaissent, devraient être modérés et transitoires, avec une expression maximale sur quelques jours (3 à 5 jours), bien que des manifestations légères puissent persister jusqu’à 1 à 2 semaines. - Pour le virus de l’herpès félin (rhinotrachéite infectieuse) : encombrement des voies respiratoires, écoulement nasal, conjonctivite, kératite, et écoulements oculaires. Dans le cas d’une vaccination avec un virus atténué, le projet implique l’administration de virus atténués aux chats, pouvant entraîner des symptômes légers et transitoires : -Pour le virus de la leucose féline (FeLV, vaccin à virus atténué) : les effets attendus devraient être limités et temporaires, comprenant une légère fièvre, un discret abattement et une diminution passagère de l’appétit. Les animaux seront également soumis à des contentions brèves (quelques minutes au plus) et à des anesthésies légères pour la réalisation des différents actes techniques. Un conditionnement positif sera mis en place afin de réduire la contrainte et le stress, garantissant ainsi leur bien-être tout au long de l’étude.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux de sang et/ou d'organes ou pourront être réutilisés si ces prélèvements ne sont pas nécessaires. Quelques animaux pourront être réutilisés, sous réserve de leur état de santé, ou adoptés, à condition d'avoir retrouvé un état de santé compatible, de ne présenter aucun risque de contagion pour l'humain ou d'autres animaux et sous réserve de la validation de l'adoption par les autorités sanitaires.

Remplacement

La production d'immunserum felin contre différentes souches virales de FCV necessite un organisme complet avec un système immunitaire fonctionnel et un système sanguin, qui ne peuvent être reproduits artificiellement. Il s'agit d'anticorps polyclonaux ne pouvant être produits à partir de banques de phages / culture cellulaire. La mise au point de modèles d'infection par différents virus félins, l'évaluation ultérieure de vaccins innovants, ainsi que l'évaluation de sureté et d'immunogénicité de souches bactériennes ou virales necessitent également un organisme complet avec un système immunitaire fonctionnel, un système sanguin et la présence des organes cibles des pathogènes, qui ne peuvent être reproduits artificiellement du fait de la complexité des mécanismes / intéractions.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est réduit au strict minimum nécessaire, et ajusté selon les exigences de la pharmacopée européenne: deux chats / souche de FCV justifié par la quantité d'antisérums nécessaires pour réaliser l'essai de neutralisation croisée contre un panel de 25-50 isolats de terrain du FCV (tests in vitro) et quatre chats / souche de FCV, pour les essais d'epreuve virulente pour lesquelles la pharmacopée correspondante indique 10 chats par groupe, cependant considérant que cela est suffisant pour une étude d’efficacité visant à évaluer la protection contre la calicivirose féline causée par une souche du FCV pré-selectionnée. Quatre chats / souche de FPV: la pharmacopée correspondante indique 5 chats par groupe témoin infecté non vacciné pour les essai d'épreuve virulente, cependant considérant qu'il s'agit d'études de mise au point il a été décidé d'utiliser un nombre inférieur jugé suffisant pour l'obtention de données cliniques. Cinq chats / groupe de FHV: la pharmacopée correspondante indique 10 chats par groupe pour les essai d'épreuve virulente, cependant considérant que cela est suffisant pour une étude d’efficacité visant à évaluer la protection contre la rhinotrachéite féline causée par une souche du FHV pré-selectionnée. Pour les autres pathogènes, le nombre sera également réduit au minimum nécessaire à l'obtention de données pertinentes, tout en respectant les exigences réglementaires, soit 2 à 8 chats par groupe expérimental.

Raffinement

Les animaux seront retirés de l'étude s'ils doivent suivre un traitement concomitant qui compromet leur aptitude à participer à l'étude, ou si leur état de santé se détériore au point de compromettre leur bien-être. Afin d'éviter de compromettre le bien-être des animaux pendant l'essai, les chats seront évalués quotidiennement par du personnel qualifié et, si le bien-être des animaux est compromis, des mesures correctives seront appliquées. Des tableaux de signes cliniques seront utilisés afin de déterminer un score journalier d'état clinique. Dans le cas où l'animal présenterait de la douleur, de la souffrance ou de la détresse, selon la ponctuation obtenue dans l'évaluation des signes cliniques, un vétérinaire examinera l'animal afin de déterminer l'origine de la douleur, de la souffrance ou de la détresse et des actions correctives seront appliquées (traitement si possible, ou sortie d'étude) Les animaux seront hébergés en groupe d'individus compatibles, dans de grandes salles d'hébergement, avec un enrichissement adapté à l'espèce et à leur âge, et avec des intéractions positives quotidiennes avec le personnel en charge des soins. Un programme d'entrainement basé sur le renforcement positif sera mis en place afin de limiter le stress engendré par les manipulations nécessaires à l'étude, et de diminuer autant que possible le recours aux sédations.

Choix des espèces

Le chat est l'espèce cible des vaccins mis au points et des virus utilisés. Les animaux seront de jeunes chats âgés de moins d'un an, correspondant à la population la plus sévèrement touchée par les virus étudiés.

Les souris mâles utilisées portent une mutation qui les fait naître avec 20 à 30 % de poids en moins, les rend stériles et fait chuter leur proportion dans les portées à 10 % au lieu des 25 % attendus. 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever sang et organes. Elles sont gavées une fois par jour pendant trois mois au maximum, prélevées par ponction rétro-orbitaire, mises à courir sur tapis et à tenir sur une roue en rotation, passées en IRM pendant une heure trente et en échocardiographie, avec des transferts routiers entre trois établissements. Le porteur indique qu'une fausse route lors du gavage entraîne la mise à mort immédiate de l'animal, et qu'une perte de poids de 20 % ou l'absence d'amélioration après 48 heures y conduit également.

Objectifs

Le syndrome de Barth est une maladie liée à des déficiences mitochondriales et pricipalement caractérisée par une cardiomyopathie. Il existe pour l'heure aucun traitement curatif. Différents criblages sur des modèles cellulaires levure et humain du syndrome de Barth ont permis l'identification de composés actifs. Les composés testés sont déjà utilisés sur le marché pour le traitement d'autres maladies. Notre objectif principal pour ce projet est de valider chez le modèle murin l'efficacité des composés identifiés comme actifs dans des modèles cellulaires du syndrome de Barth. Notre approche est donc celle d'un reposotionnement thérapeutique. Le test chez la souris est un requis obligatoire avant le passage à l'homme. Si l'objectif est atteint, des tests cliniques chez l'homme pourront rapidement être mis en place et à plus long terme des traitements curatifs pour les patients pourront voir le jour. Le projet se déroule dans 3 Etablissements Utilisateur: EU 1/3, EU 2/3, et EU 3/3.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l'identification de candidats médicaments efficaces pour le traitement du syndrome de Barth pour lequel il n'existe toujours pas de traitement à l'heure actuelle.

Procédures

Les seuls gestes invasifs qui se feront sur animaux vigiles sont le gavage (1 fois par jour pendant 3 mois maximum; quelques secondes pour chaque geste, et uniquement si le traitement en eau de boisson n'a pas d'effet bénéfique) et les prélèvements de sang rétro-orbitaux (5 minutes maximum pour chaque geste). Sur un même animal seront effectuées plusieurs gestes afin de tester la capacité des médicaments à supprimer des déficits: 1- suivi de poids à l'EU 1/3 (20 secondes par animal) 2- Course sur un tapis roulant et équilibre sur une roue en rotation, dans le but d'évaluer les fonctions musculaires (endurance, motricité et équilibre) à l'EU 1/3 (15 minutes maximum par animal) 3- Prélèvements sanguins dans le but d'effectuer des dosages à l'EU 1/3 (30 secondes par animal) 5- IRM dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 3/3 (1H30 par animal) 6- Echocardiographie dans le but de tester les fonctions cardiaques à l'EU 2/3 (20 minutes par animal).

Impact sur les animaux

Les projets précédents nous ont permis de décrire de façon détaillée les caractéristiques du phénotype dommageable du modèle souris du syndrome de Barth : A l'echelle de l'animal entier un déficit de poids d'environ 20 pourcents est observé dès la naissance et un défaut cardiaque (echocardiographie) et musculaire (course sur tapis (treadmill)) est observé à partir de l'âge de 4 et 3 mois respectivement. Par ailleurs, il est à noter que les souris mâles modèles du syndrome de Barth sont stériles, qu'elles naissent avec un ratio non mendélien (10 pourcents au lieu des 25 pourcents attendus) mais qu'elles vivent comme les souris contrôles jusqu'à 8 mois (pas testé plus longtemps). Les nuisances/effets indésirables causés par les expérimentations (manipulations/gestes expérimentaux sur l'animal) sont classées de sévérité modéré. Les prélèvements sanguins sur souris vivantes nécessitent une anesthésie mais n'induisent pas de conséquence sur le bien être de l'animal. L'éventuel gavage (uniquement si le traitement dans l'eau de boisson n'est pas bénéfique) pourrait à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Les mises au points de gavage 1 fois par jour durant 3 mois lors d'un précédent projet n'ont pas révélé de nuisances particulières. Néanmoins, lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l’animal sera mis à mort.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements de sang et organes. Ces prélèvements permettront de faire différentes analyses afin de déterminer l'efficacité du médicament à supprimer certains déficits mis en évidences dans les demandes d'autorisation de projet précédentes.

Remplacement

Nous utilisons des modèles cellulaires pour répondre à certaines questions, cependant, ces méthodes alternatives restent incomplètes pour l’étude de phénomènes physiologiques aussi complexes que les mécanismes impliqués dans le syndrome de Barth, puisqu'elles ne tiennent pas compte de l’ensemble des interactions existantes au sein d’un organisme tout entier. L'utilisation du modèle animal est donc une nécessité pour compléter nos résultats in vitro mais également pour procéder aux essais cliniques chez l'homme.

Réduction

Seules les expériences indispensables seront réalisées. Il n'y aura pas de répétition inutile d'expérience. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit au minimum, tout en permettant de garantir l’analyse statistique des résultats. Les mêmes animaux seront utilisés pour tous les gestes. Des travaux antérieurs ont montré des écarts types importants pour les différents paramètres analysés (analyse cardiaque, analyses biochimiques mitochondriales, expression des gènes). Cette variabilité impose de travailler avec des effectifs minimum de 8-10 animaux par groupe. Une analyse statistique adaptée des résultats sera réalisée.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Le poids sera suivi 3 fois par semaine. Si l'animal perd entre 5 et 10% par rapport à son poids le plus haut, on rajoutera du gel alimentaire et on augmentera la fréquence de surveillance, et en cas de perte de 20% l'animal sera euthanasié. Si un animal montre un problème de comportement, de locomotion ou autre, des mesures conservatoires seront prises: nourriture mouillée dans la cage, biberon à longue tétine. Si au bout de 48 heures aucune amélioration n'est constatée alors l'animal sera mis à mort. Points limites attendus: - poids des souris mâles modèles du syndrome de Barth inférieur de 20 à 30 pourcents dès la naissance - points limites spécifiques à chaque geste développé dans chaque procédure. Le gavage 1 fois par jour pourra à terme induire des irritations au niveau de l'oesophage mais afin de les réduire au maximum, le geste sera effectué par des personnes très expérimentées et les sondes de gavage utilisées seront adaptées à l'âge et au poids de l'animal. Lors des gavages des phénomènes de "fausse route" peuvent survenir. Dans ce cas, l'animal sera immédiatement euthanasié. La surveillance de la profondeur de l’anesthésie se fera tout au long de la procédure par sensibilité au stimulus douloureux (pincement des pattes ou de la queue), réflexe oculaire, hyperventilation. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant lors de la procédure afin d'éviter toute hypothermie. Pour les animaux mâles modèles du syndrome de Barth, plus petits, de la nourriture sera posée au sol et les souris contrôle seront séparés des souris mâles modèles du syndrome de Barth dans les cages. Néanmoins les souris mâles modèles du syndrome de Barth n'ont pas montré de difficultés à se nourrir et à boire. Les animaux seront transférés par nos soins en voiture, en prenant toutes les précautions nécessaires (température adéquat et stress diminué au mieux en adaptant une conduite souple et non rapide). Le transfert entre établissements utilisateurs ne durera pas plus de 30 minutes. Les animaux seront dans des caisses agréées contenant copeaux, cotons, nourritures et litière propre sous condition d'autorisation pour le statut sanitaire; Puis période d'acclimatation de 3-4 jours sur le site d'accueil.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris comme modèle pour plusieurs raisons : - animal de petite taille, facile à héberger et à contentionner - modèle idéal pour la création de lignée : temps de gestation court (19 à 21 jours), - 6 à 15 souriceaux par portée - modèle très utilisé pour mimer les maladies humaines de par les 99% d'homologies entre son génome et le génome humain - modèle très bien maitrisé en terme de manipulation génétique. - le modèle souris du syndrome de Barth récapitule parfaitement les défauts observés chez les patients atteints de la maladie Les animaux seront utilisés dès le sevrage. jusqu'à l'âge d'environ 6-8 mois. Le déficit de poids se voit dès la naissance, il est donc intéréssant de pouvoir commencer le gavage des candidats médicaments au plus tôt. Notre demande d'autorisation de projet précédente a montré qu'on pouvait gaver au plus tôt sans problème dès le sevrage. Par ailleurs, les femelles allaitantes auront le traitement dans l'eau de boisson afin que les petits en bénéficie dès la naissance via le lait jusqu'au sevrage.

Ovariectomisées, équipées d'une minipompe osmotique implantée sous la peau, injectées deux fois par jour, soumises chaque semaine à une mesure de pression artérielle et mises à courir trente minutes sur un tapis trois fois par semaine : 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet leur induit une insuffisance cardiaque dont le porteur écrit que la dyspnée "peut être sévère", accompagnée d'une incapacité à l'effort et d'un stress psychique en phase terminale. Il qualifie néanmoins les deux opérations de "chirurgie minimale" à la douleur "très limitée", et avance que l'absence d'ovaire n'est pas douloureuse. Toutes sont tuées à l'issue pour récolter leurs tissus et conduire des analyses de biologie moléculaire, de physiologie, de biochimie et d'enzymologie.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque (IC) se caractérise par une incapacité du coeur à assurer sa fonction de pompe circulatoire et donc à remplir les besoins de l’organisme en perfusion de sang oxygéné. Dans cette étude nous étudierons l’IC dite préservée qui se caractérise plutôt par des défauts de relaxation du muscle cardiaque. Cette forme d’IC touche un peu plus les femmes que les hommes, ; elle est fortement associée à l’âge et touche près de 50% des patients en IC. Ces patients souffrent d’une sévère perte de qualité de vie et d’hospitalisations répétées avec une mortalité importante. Actuellement, aucun traitement efficace contre cette pathologie n’a été identifié. Notre projet général d’équipe a pour but de tester de nouveaux principes thérapeutiques sur un modèle murin. Le but de ce projet consiste à développer de nouvelles thérapies avec moins d’effets secondaires l’organisme. Pour cela nous étudierons commaent l’exercice physique combiné à un complément alimentaire peuvent protéger le cœur de souris jeune ou agée contre l’IC. L'exercice physique régulier est connu depuis des années comme une solution préventive pour éviter le développement des maladies cardiovasculaires. Il permet de réduire le nombre de décès ou d'hospitalisations et d’améliorer la qualité de vie des patients. Ce type d’approche présente un intérêt majeur pour les patients en n’ajoutant pas de médicaments supplémentaires, et présente de plus l’intérêt d’un coût économique raisonnable pour le système de santé publique.

Bénéfices attendus

La capacité fonctionnelle et la qualité de vie chez les sujets souffrant de l’insuffisance cardiaque sont gravement altérées. En effet, le coeur de ces patients n’arrive pas à éjecter suffisamment de sang vers les organes car il n’arrive pas à se relaxer suffisamment. Ce dysfonctionnement conduit à une intolérance à l’exercice physique et des effets néfastes sur d’autres organes comme les poumons (hypertension pulmonaire) et les muscles squelettiques. Les traitements développés depuis plusieurs décennies ne sont pas ou peu efficaces pour les patients. L'IC est une maladie affectant plus d’ 1 million de personnes en France et environ la moitié de ces patients ce qui représente un coût socio-économique et humain majeur pour le système de santé en France. Il est donc essentiel de poursuivre la recherche thérapeutique dans ce domaine. Notre projet général d’équipe a pour but de tester de nouveaux principes thérapeutiques sur un modèle murin. Le but de ce projet consiste à développer de nouvelles thérapies avec moins d’effets secondaires sur d’autre fonction physiologique de l’organisme. Pour cela nous combinerons un traitement nutritionnel complémentaire au à ma vitamines B3 avec un exercice physique.

Procédures

Certains lots de souris seront soumis à deux chirurgies sous anesthésie générale d'environ 10 minutes, les injections de vitamines sous anesthésie locale dureront 1 min deux fois par jours. Trois échocardiographie sous anesthésie générale seront réalisées d'une durée de 10 minutes chacune. Une mesure de pression artérielle de 5 minutes sera réalisée une fois par semaine. Enfin les souris coureront trois fois par semaine sur un tapis de course (environ 30 minutes pour une souris contrôle).

Impact sur les animaux

La procédure de chirurgie correspond à une chirurgie minimale, très souvent source d'un niveau de douleur très limitée et relativement bien tolérée par les animaux. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une ouverture de la cicatrice. De plus du fait de l’opération les souris peuvent avoir une difficulté à l’accès à la nourriture ce qui pourrait entrainer une perte de poids. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement. Une légère douleur peut être associée à l’ovariectomie correspondant à l'incision musculaire et cutanée de plus l’absence d’ovaire n’est pas associée à une douleur. La mesure de la pression artérielle peut engendrer un petit stress lié à la contention. L’insuffisance cardiaque induit une dyspnée qui peut être sévère et une incapacité à l’effort. Ces deux symptômes peuvent induire un stress psychique sur la souris en phase terminale.

Devenir

À l’issue de toutes les procédures expérimentales, tous les animaux seront euthanasiés de manière éthique et rapide. Les tissus seront récoltés pour réaliser des expériences de biologie moléculaire, physiologie, biochimie et d’enzymologie.

Remplacement

Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine avec pression artérielle, une régulation neurohormonale du rythme et de la contractilité cardiaque et une étude du retentissement sur différents organes majeurs impliqués dans l’évolution de l’insuffisance cardiaque tels que les poumons, les reins et les muscles squelettiques notamment. Les modèles cellulaires ne permettent pas d’étudier le fonctionnement physiologique intégré du coeur et l’effet de l’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée sur d’autres organes.

Réduction

Une planification minutieuse basée sur un calcul de puissance et l’expertise de l’équipe ont permis l'estimation de la taille d'échantillon optimale. Ceci a permis de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité statistique de l’étude, et de conserver une puissance statistique suffisante pour observer un effet de 40% obtenu l’altération de la fonction diastolique (critère principal retenu dans cette étude). Les fonctions cardiovasculaires sont étudiées par des méthodes non invasives permettant de limiter le nombre d’animaux. Les méthodes invasives sont des procédures terminales où un cathéter est inséré dans le ventricule pour mesurer la pression et le volume de la chambre cardiaque. De plus, afin de minimiser encore le nombre d’animaux utilisés, en fin d’expérimentation les tissus prélevés sont partagés entre les domaines explorés.

Raffinement

Après implantation de la minipompe osmotique, les souris seront observées tous les jours. Les cages sont changées 1 fois par semaine. Les animaux sont hébergés selon les conditions fixées par l'arrêté du 1er février 2013 fixant les conditions d'agrément, d'aménagement et de fonctionnement des établissements utilisateurs. Les opérations chirurgicales (pose de minipompe et ovariectomie) sont induites en respectant au maximum les procédures du bien-être animal et en limitant la souffrance par le respect des méthodes anesthésiques et analgésiques. L’expérimentateur, le personnel de l’animalerie seront informés des critères d’observation des animaux qui seront : l’état général, l’état de la cicatrice, le comportement de prostration, la courbure de la colonne vertébrale, l’état du poil (manque d’hygiène), et un critère propre à l’étude de l’insuffisance cardiaque qui est la manifestation d’une dyspnée sévère. Le poids des animaux sera également relevé quotidiennement. Pour l’échographie, le gel échographique utilisé est chauffé au bain marie à 37°C. Après l’échographie l’animal est placé dans une cage propre à 28 °C sous lampe chauffante. Au moment de l’échographie les yeux des souris peuvent subir un léger dessèchement ainsi une pommade de protection sera appliqué. Après son réveil complet (environ 10 minutes), il est remis dans sa cage. Pour les opérations chirurgicales, les animaux sont anesthésiés, pour les maintenir immobiles, par anesthésie gazeuse. Une fois anesthésiés et endormis, ils reçoivent une injection en sous-cutanée d'analgésique. Au réveil, chaque souris est isolée dans une cage pendant quelques heures, au calme et au chaud puis stabulé à 4 ou 5 souris /cage. En post opération, la cicatrisation cutanée de la zone opérée est surveillée régulièrement. Le seul risque (rare) observé lors de ces interventions correspond à une protrusion de la pompe. Dans ce cas, la pompe peut être réinstallée et la suture refaire. Un traitement antalgique est alors donné en complément. Une habituation est réalisée pendant 4 jours précédents la première mesure de pression artérielle qui a lieu le 5ème jour pour diminuer l’élévation de la pression artérielle par le stress associé à la procédure.

Choix des espèces

Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d'étudier la fonction cardiaque dans un contexte physiopathologique complexe et multifactoriel impliquant une circulation sanguine. Le fonctionnement physiologique du coeur et l'altération structurelle du coeur rend impossible de faire cette étude sur les cellules en culture. La souris est un des modèles les plus utilisés en recherche biomédicale. La structure des tissus musculaires et cardiaques murins est très proche de celle de l’homme. De plus les souris se reproduisent rapidement et de nombreuses études en insuffisance cardiaque ont été réalisées chez la souris ce qui nous permettra plus tard de discuter nos résultats par rapport aux autres études publiées.

Des injections intramusculaires quatre jours de suite sous anesthésie, des injections intrapéritonéales deux à cinq fois par semaine sur animaux éveillés, des prélèvements sanguins deux fois par semaine : 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles et leurs organes. Les molécules injectées sont pro-inflammatoires. Le porteur décrit la réaction locale ou générale qu'elles provoquent comme transitoire, résolue en moins de 76 heures, et situe l'objet du projet dans la compréhension du lien entre inflammation et aggravation d'une myopathie des ceintures, les retombées pour les patients tenant à des "perspectives d'amélioration". Il retient la souris adulte parce que son muscle est assez volumineux pour recevoir la quantité de produit voulue, et affirme avoir "besoin" d'un modèle animal parce que les cultures cellulaires n'intègrent pas les interactions avec le système immunitaire.

Objectifs

Les dystrophies des ceintures sont des maladies génétiques qui affectent principalement les muscles proches du tronc, comme ceux des épaules et des hanches. Ces maladies entraînent une dégradation des muscles, ce qui cause une perte de mobilité des bras et des jambes. Parmi les différentes formes existantes, notre laboratoire étudie particulièrement la LGMD-R9 (Limb Girdle Muscular Dystrophy R9 en anglais ou Myopathie des Ceintures de type R9 en français), causée par des mutations dans le gène responsable de la production de la protéine FKRP. Une des options pour traiter cette maladie est la thérapie génique. Cela consiste à utiliser des virus modifiés pour introduire une version saine du gène FKRP (Fukutin Related Protein) dans les cellules malades. Cependant, même si cette méthode a montré des résultats prometteurs, elle pose encore des défis importants. Par exemple, les doses nécessaires pour traiter les muscles sont très élevées, ce qui peut provoquer des réactions immunitaires et des inflammations. Le but de notre projet est de comprendre comment l'inflammation est liée à l'aggravation des symptômes de cette maladie. En comprenant mieux ce lien, nous espérons développer de nouvelles méthodes de traitement pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permet d’approfondir nos connaissances fondamentales sur l’expression du gène FKRP. Les approches thérapeutiques destinées aux patients atteints de LGMD-R9 pourraient directement bénéficier des résultats générés par cette étude. Ces résultats pourraient contribuer aux perspectives d’amélioration des traitements de thérapie génique dans le cadre de cette maladie.

Procédures

Des injections sont réalisées par voie intramusculaire au maximum 1 fois par jour pendant 4 jours, ou en une seule fois sur la durée de l’étude, sous anesthésie gazeuse de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. D’autres injections seront faites par voie intra-péritonéale (durée d’injection : moins de 1 minute), sur animaux vigiles. Dans ce cas les molécules seront injectées entre 2 et 5 fois par semaine en fonction de leur demi-vie. Des prélèvements de sang seront faits au maximum deux fois par semaine sur animaux sous anesthésie gazeuse de courte durée, c’est-à-dire moins de 5 minutes. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée.

Impact sur les animaux

Les nuisances (douleur ou stress) attendues sur les animaux sont classées légères à modérées. Certaines sont liées à la nature des différents actes réalisés : douleur de l’injection pour administration de molécules en intramusculaire ou intra-péritonéale (classe légère). Certains actes qui seraient susceptibles d’entrainer des douleurs sont réalisés sous anesthésie, la nuisance sera donc liée à l’acte d’anesthésie (classe légère). Il y a une possibilité de sécheresse oculaire au cours des anesthésies. D’autres nuisances sont liées à la nature des molécules injectées. Il s’agit de molécules pro-inflammatoires induisant une réaction inflammatoire systémique ou locale (classe modérée). Il s’agit de réactions transitoires qui sont résolues en moins de 76h.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin de réaliser le prélèvement des muscles et des organes.

Remplacement

Les méthodes in vitro les plus utilisées aujourd’hui comme alternative en expérimentation animale sont basées sur l’utilisation de cultures cellulaires. Elles présentent l’avantage d’offrir la possibilité d’utiliser des cellules humaines avec les considérations éthiques correspondantes bien sûr. Il est possible de réaliser des cultures cellulaires ou des organoïdes pour les organes considérés avec, même une certaine complexité, comme en co-culture avec certaines cellules additionnelles. Cependant, ces modèles ne permettent pas d’aborder les questions posées dans ce projet qui doit prendre en compte des paramètres tels que les interactions avec le système immunitaire. Pour poursuivre l’étude et en tirer des conclusions potentiellement applicables à l’espèce humaine, nous avons donc besoin d’utiliser un modèle animal.

Réduction

Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l'exploitation maximale des données obtenues. Lorsque ce sera possible, nous utiliserons les mêmes souris contrôles pour des expériences différentes en tant que contrôles pour les différentes conditions évaluées. De plus, un maximum d’analyses sera réalisé sur organes prélevés après la mort des animaux pour éviter des doublons de procédures expérimentales. Un test statistique a été utilisé pour pouvoir tirer des conclusions à partir des expériences.

Raffinement

Le raffinement du projet inclut la sélection des modèles : la souris est un modèle déjà utilisé et bien étudié pour les maladies musculaires. Les souris étant des animaux sociaux, elles sont hébergées par groupes. Une phase d’adaptation de 7 jours est mise en place avant l’entrée en protocole. Les animaux sont élevés dans un environnement enrichi et sont observés quotidiennement. Les souris sont anesthésiées lorsque les procédures expérimentales sont potentiellement douloureuses ou stressantes. Dans ce cas, les animaux reçoivent au préalable un traitement analgésique. Les prélèvements de sang seront effectués sous anesthésie de courte durée (moins de 5 minutes). Nous appliquons les points limites établis préalablement grâce à l’utilisation d’une grille d’évaluation de la souffrance pour lesquels des mesures sont mises en œuvre. Nous utilisons les procédures d’euthanasie appropriées. Des mesures pour augmenter le confort des animaux sont également appliquées, telles que l’utilisation d’une plaque thermostatée pour maintenir une température corporelle stable lors de la phase de réveil et l’application de gel oculaire pour éviter le dessèchement des tissus lors des anesthésies.

Choix des espèces

Pour ce projet, nous utiliserons l’espèce souris car les modèles existants des pathologies étudiées sont sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte. A ce stade les animaux présentent une taille de muscle suffisamment importante pour injecter une quantité suffisante de molécules. Chez une souris plus jeune nous ne pourrions pas injecter une quantité suffisante pour mesurer l’efficacité du traitement administré.