Procédures modérées

Tester des molécules fournies par des clients occupe 2 700 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le tétrachlorure de carbone leur est injecté deux fois par semaine pendant huit semaines au maximum, seize injections, pour abîmer leur foie jusqu'à la fibrose, et les composés à évaluer sont ensuite administrés une à deux fois par jour pendant quatre semaines. Le porteur indique que les souris peuvent présenter un poil ébouriffé, une position prostrée, une mobilité réduite dans les heures suivant l'injection et une perte de poids, et que les mises à jeun de trois heures avant les prises de sang constituent une source de stress supplémentaire. Toutes sont mises à mort pour récupérer tissus et sang, marquages histologiques et analyses d'expression génique devant mesurer l'efficacité des composés de ses clients.

Objectifs

La stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) qui se caractérise par l’accumulation de graisse dans les cellules du foie, touche un quart de la population française et environ 20% de la population générale. La stéatose hépatique non alcoolique est retrouvée préférentiellement chez les patients en surpoids. L’administration répétée d'un composé chimique défini induit une toxicité hépatique qui entraîne la fibrose. L’objectif de ce projet est de modéliser une atteinte hépatique chronique chez le rongeur afin d’évaluer les mécanismes de la fibrose et d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices scientifiques de ce projet attendus sont une meilleure compréhension de la fibrose hépatique. La fibrose hépatique est un problème de santé majeur pour lequel il n’existe aucun traitement autorisé à ce jour, ce projet vise à valider de nouvelles molécules données par nos clients capables de prévenir ou de ralentir la cirrhose ou la fibrose hépatique.

Procédures

L’injection du composé chimique induisant une fibrose hépatique, dure environ 30 secondes sur animal vigile et est réalisé 2 fois par semaines pendant maximum 8 semaines (16 injections). Les composés à tester seront administrés une à deux fois par jour par toutes les voies possibles pendant 4 semaines maximum. L’administration dure environ 30 secondes sur animal vigile et 1 min sur animal anesthésié. 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (2 en cours de projet et un prélèvement terminal) afin de suivre les paramètres biologiques ou l’exposition des composés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements visant à quantifier les paramètres biologiques une mise à jeun (retrait de l’aliment) d’une durée de 3h peut être réalisée.

Impact sur les animaux

Les animaux sont susceptibles de présenter des effets indésirables liés à l’administration du composé chimique, comme le poil ébouriffé ou encore une position prostrée, mobilité réduite pendant les heures qui suivent l’injection, ou encore une perte de poids. Un stress de l’animal peut être provoqué par les manipulations répétées (pesées, administrations de traitements). Les prélèvements sanguins peuvent créer des oedèmes au niveau du site de prélèvement. Les traitements pouvant se faire par injections répétées, il peut y avoir des effets indésirables comme des œdèmes. Les mises à jeun de 3h lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus et le sang dans le but d’évaluer l’efficacité des composés grâce à des marquages histologiques, des analyses d’expression de gènes ou protéines dans le sang et les tissus cibles.

Remplacement

La fibrose n’est pas une maladie d’un seul type cellulaire mais le résultat d’une interaction complexe entre plusieurs types cellulaires. Il n'existe pas de technique in vitro ou in silico fiables pour avoir des résultats probants mimant la pathologie dans son intégrité, l'utilisation de l'animal est donc nécessaire.

Réduction

Les protocoles sont réalisés en fonction des besoins expérimentaux exprimés par les chercheurs. Par ailleurs, notre savoir-faire et nos données historiques permettent d’utiliser le minimum d’animaux avec une optimisation de rendement pour des résultats robustes et reproductibles.

Raffinement

Lors de l’injection du composé chimique, celui-ci sera systématiquement dilué dans de l'huile neutre pour diminuer son effet corrosif. Les animaux seront pesés deux fois par semaine, en cas d’apparition de perte de poids ou signes cliniques, nous réaliserons une observation clinique approfondie en scorant différents paramètres (perte de poids, locomotion, aspect général). En cas de déshydratation, une injection de soluté de réhydratation sera réalisée. Dans les cas d’atteinte des points limites, l’animal est mis à mort. Les points limites sont définis de manière conservatrice afin d’éviter toute souffrance excessive. Les prélèvements intermédiaires et terminaux seront réalisés sous couverture anesthésique et analgésique adaptée.

Choix des espèces

Les animaux et la souche sélectionnée sont largement utilisés et caractérisés par la communauté scientifique afin d’étudier la progression des désordres hépatiques telle que la fibrose hépatique. Les animaux seront utilisés entre 6 et 10 semaines car à cet âge ils sont considérés comme jeune adulte, et ont un système immunitaire et tissulaire mature pour répondre à ce composé chimique.

Vingt-et-une injections sous-cutanées en trois semaines, une chirurgie crânienne d'environ cinq heures sous anesthésie générale, puis douze séances de test avec imagerie cérébrale de vingt à cent quarante minutes sur six semaines : 64 rats subissent ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le produit administré appartient à la famille du cannabis, et il s'agit de voir comment une exposition répétée à l'adolescence modifie les connexions cérébrales et la mémoire à l'âge adulte. Le porteur qualifie ces administrations de procédures "bien tolérées" et prévoit une douleur post-opératoire de 24 à 48 heures. Tous les rats sont mis à mort à la fin, la chirurgie et le traitement cannabinoïde excluant selon lui qu'ils servent ensuite à autre chose, et les tests de mémoire qui occupent six semaines du protocole ne sont jamais nommés.

Objectifs

Ce projet vise à mettre en place et à valider une technique d’imagerie cérébrale chez le rat en mouvement libre, afin d’étudier comment une exposition répétée à des substances psychoactives (de la même famille que le cannabis) pendant l’adolescence modifie les connections entre différentes régions du cerveau et les capacités de mémorisation. Les animaux utilisés bénéficieront d’une intervention chirurgicale (réalisée sous anesthésie complète et avec traitement de la douleur) permettant l’accès à l’imagerie cérébrale, ainsi que d’administrations de substances apparentées aux cannabinoïdes, procédures considérées comme bien tolérées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre comment une exposition aux cannabinoïdes à l’adolescence modifie durablement les circuits cérébraux liés à la mémoire. Ces connaissances pourront contribuer à identifier des marqueurs biologiques de vulnérabilité et à informer les politiques de prévention.

Procédures

Les interventions sur les animaux comprennent : • Injections sous-cutanées répétées (21 injections sur 3 semaines, environ 5 secondes chacune) • Une intervention chirurgicale sous anesthésie générale et traitement antidouleur (environ 5h), permettant l’imagerie cérébrale • 2 injections sous-cutanées post-chirurgicales (5 secondes chacune) • Sessions d’habituation (5 jours, 10 à 20 minutes par session) • 12 sessions de test comportemental avec imagerie cérébrale (20 à 140 minutes par session sur 6 semaines)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : • Douleur post-opératoire modérée (24 à 48h), prise en charge par analgésie • Douleurs brèves lors des injections sous-cutanées (quelques secondes) • Léger stress lors des séances d’imagerie cérébrale en état d’éveil (bruit modéré, changement d’environnement) • Modifications transitoires de la locomotion et de l’état général liées au traitement

Devenir

Les animaux seront mis à mort car pas de réutilisation possible dû à la chirurgie et au traitement cannabinoïde.

Remplacement

Aucun modèle in vitro ou informatique ne permet d’étudier simultanément le comportement complexe, la dynamique cérébrale en mouvement libre et de manière longitudinale sur plusieurs semaines. Le recours à l’animal est indispensable.

Réduction

Cette étude pilote utilise le nombre minimal d’animaux nécessaire. Les sessions longitudinales répétées évitent de multiplier les animaux. Les animaux serviront pour plusieurs types d’expériences (imagerie et comportement).

Raffinement

La chirurgie est réalisée sous analgésie et anesthésie complètes, avec suivi post-opératoire. Une grille de score et une liste de points limites permettent d’assurer le bien-être animal et d’interrompre l’expérience ou de procéder à la mise à mort dès qu’un point limite est atteint. Des analgésiques sont utilisés pour prévenir la douleur. Des séances d’habituation à l’imagerie et au comportement sont réalisées. Les souris [rats] sont élevés en groupes sociaux avec enrichissement du milieu.

Choix des espèces

Le rat a été choisi car il est adapté à l’implantation chronique d’un dispositif d’imagerie cérébrale, offre un volume cérébral suffisant pour l’imagerie des structures d’intérêt, et montre une robustesse comportementale pour les tests de mémoire. L’effet du traitement cannabinoïde a déjà été documenté chez cette espèce. Le traitement est administré au stade adolescent (en raison de la sensibilité accrue du cerveau en développement) et les enregistrements sont réalisés au stade adulte (cerveau mature, ossature crânienne plus résistante).

625 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les rates gestantes sont soumises à un régime pauvre en protéines pendant les 22 jours de gestation pour provoquer un retard de croissance chez leurs petits, dont les barrières sang-cerveau seront ensuite examinées, et les ratons reçoivent après la naissance des injections répétées de lipopeptide dans l'abdomen, sous anesthésie gazeuse. Le porteur indique que ces ratons se nourrissent moins pendant les premières 24 heures, avec une prise de poids réduite d'environ 25 % par rapport aux contrôles, et signale aussi l'effet de la séparation d'avec la mère pendant les mesures de vocalisation et les IRM. Les petits sont mis à mort entre 3 et 30 jours pour prélever leurs tissus, les mères après le sevrage, et le porteur écrit que l'analyse in vivo reste "incontournable" pour ce projet de recherche.

Objectifs

Les pathologies pré- et postnatales telles que le retard de croissance intra-utérin (RCIU) et l’inflammation chronique sont des facteurs de risque importants d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Mieux comprendre leurs effets est donc crucial pour identifier des approches thérapeutiques efficaces visant à minimiser ces risques. Dans ce contexte l’objectif de notre projet est de comprendre et traiter les lésions induites par ces pathologies pré- et postnatales individuelles et combinées, en mettant en lien ces lésions cérébrales avec l’altération des barrières sang-cerveau que nous avons précédemment mise en évidence, et en testant l’efficacité à long terme d’agents pharmacologique neuroprotecteurs.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’apporter des informations importantes sur le lien entre l’altération des barrières sang-cerveau et les troubles du neurodéveloppement. Less données antérieures montrent que la barrière sang-cerveau est plus impactée en cas d’agressions combinées à court terme. Il est probable que la compilation de plusieurs agressions soit à l’origine de lésions cérébrales plus durables incluant des altérations des fonctions des interfaces sang-cerveau à long terme. Par exemple des différences de signal à P21 pourraient être visualisées en micro-IRM chez les animaux ayant subi une inflammation chronique postnatale en sus du RCIU. Les deux types de stress que nous explorons, retard de croissance intra-utérin et inflammation chronique telles qu’induite par une infection périnatale, sont des facteurs de risque reconnus d’apparition de troubles neurodéveloppementaux. Ces travaux évaluant un défaut de neuroprotection assurée par les interfaces sang-cerveau vont générer les données mécanistiques indispensables à l’identification d’approches thérapeutiques efficaces visant à prévenir les effets neurologiques à court et à long termes induits par ces conditions délétères.

Procédures

Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et une femelle par cage) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime alimentaire hypo-protéiné durant toute la période de gestation (22 jours, 10 femelles). Enfin les animaux des portées sont soumis en postnatal à une injection intraperitonéale de lipopeptide accompagné ou non d'une molécule thérapeutique neuroprotectrice qui se fait sous anesthésie gazeuse. Les analyses sont ensuite effectuées entre 3 et 30 jours (586 animaux). Certains animaux sont soumis à des mesures de vocalise, et des IRM qui s'effectuent également sous anesthésie gazeuse (36 animaux). L'ensemble du projet sera réalisé dans l'établissement utilisateur EU1, sauf pour la réalisation des IRM qui sera réalisée dans l’établissement utilisateur EU2.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une prise de poids réduite associées à ce régime pourront être observées durant la période de gestation. Les ratons soumis à l'exposition au lipopetide se nourrissent moins pendant les Premières 24h (augmentation de poids réduite d'environ 25 % par rapport aux contrôles), différence qui disparait ensuite. Les ratons pourront être impactés par la séparation d’avec la mère pendant la période d’analyse de comportement, par les injections répétées sur plusieurs jours, ainsi que par les réveils d’anesthésie.

Devenir

Tous les animaux des portées ayant subi une intervention sont mis à mort à différents temps post-nataux afin de collecter les tissus pour analyses. Les mères soumises à un régime alimentaire hypoprotéiné sont mises à mort après utilisation ou sevrage des petits.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières sang-cerveau (e.g. cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier l'influence globale des différentes cellules cérébrales sur la perméabilité de ces interfaces, et ne permettent pas de mimer des pathologies périnatales tels que le retard de croissance intrautérin. Par ailleurs, la circulation du liquide cérébrospinal dont le rôle est reconnu dans les processus neuroinflammatoires, en particulier comme vecteur de cellules immunes et de cytokines, ne peut être reproduite in vitro à l'identique de la physiologie. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro. Nous testons une molécule neuroprotectrice dont l’administration ne prend sens que dans un modèle d’étude globale in situ. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

- Les rates gestantes non soumises à un régime pauvre en protéine au cours de la grossesse pourront être utilisées pour de nouvelles reproductions (jusqu’à 5 reproductions par femelle), puisque seuls les ratons subissent des traitements ultérieurs à la naissance. - Nous prévoyons un nombre de six animaux par lot expérimental, et chaque condition reproduite sur 2 portées différentes, afin de remplir les conditions statistiques de test de significativité réalisés précédemment pour ce type d’expérimentation. - Les portées chez ces rats sont habituellement d’au moins 12 animaux ce qui permettra de réaliser des comparaisons au sein d’une même portée.

Raffinement

- Le poids des rates gestantes soumises à un régime pauvre en protéine sera suivi régulièrement tous les trois jours à partir de la mise en reproduction. Les rates utilisées pour les reproductions observeront une période quiescente d’un mois minimum entre une naissance et une nouvelle mise en reproduction. - Cette méthode est reconnue comme moins invasive que les autres méthodes d’induction d’un retard de croissance (ligature des artères utérines). - Les ratons seront suivis attentivement avec un contrôle pondéral journalier jusqu’à P6, puis tous les trois jours, jusqu’à P15 puis à P21 ou P30. Le traitement des animaux se fera sos anesthésie gazeuse. Après traitement ou manipulation, les animaux seront replacés avec la rate avec suivi du comportement maternel et de l’allaitement. - Pour l’exploration par IRM, la mère avec la portée sera transférée avec la litière et l’enrichissement dans une cage de transport (500 m). La cage de transport présentera un couvercle avec un emballage carton opaque. Les ratons seront séparés de leur mère uniquement pendant le temps de l’examen, qui s'effectuera sous anesthésie gazeuse. Enfin une étude pilote sera menée pour tester si la voie sous-cutanée peut être utilisée pour l’injection de traceurs ou médicaments en place de l’injection intrapéritonéale très utilisée chez les animaux en développement mais pouvant engendrer de la variabilité et moins pertinente vis-à-vis de la médecine humaine.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats, espèce utilisée dansles APAFiS précédente. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requièrent une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits. Les données déjà acquises sur ce projet l'ont été avec ce modèle. Les animaux seront mis à mort soit à 8 jours postnatal (P8), soit à P30. Ces différents temps nous permettront d’évaluer l'effet du RCIU associés ou non à l'inflammation chronique sur l'intégrité des interfaces sang-cerveau au cours du développement précoce, ainsi qu'une fois la fenêtre de plasticité cérébrale refermées (Impact sur la programmation foetale, P30).

Pour comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire, 640 souris reçoivent une injection de cellules tumorales, parfois au cours d'une chirurgie de quinze à vingt minutes sous anesthésie générale. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, pour prélever la tumeur, les ganglions lymphatiques drainants, le foie, la rate et le sang. Entre-temps, elles reçoivent des injections de traitements expérimentaux une à deux fois par semaine pendant deux à quatre semaines, leur tumeur étant mesurée deux fois par semaine. Le porteur indique que les souris dont la perte de poids devient importante, dont le comportement s'altère ou dont la tumeur grossit trop seront mises à mort immédiatement.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire. Dans certains cas, les défenses de l’organisme ne reconnaissent pas ou n’attaquent pas efficacement les cellules cancéreuses. L’objectif est de comprendre les mécanismes responsables de cette perte d’efficacité du système immunitaire et d’identifier des moyens de le réactiver. À terme, ce projet vise à améliorer l’efficacité des traitements existants, notamment l’immunothérapie, et à proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les cancers du foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre pourquoi certaines tumeurs du foie échappent au système immunitaire et le rôle des ganglions lymphatiques proches de la tumeur dans ce phénomène. Les résultats devraient : • identifier les mécanismes qui empêchent le système immunitaire d’attaquer efficacement les cellules tumorales ; • comprendre comment les tumeurs modifient leur environnement pour favoriser leur développement ; • déterminer si certaines approches thérapeutiques peuvent améliorer l’efficacité des immunothérapies en réactivant les défenses immunitaires. À terme, ces travaux pourraient contribuer au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer la prise en charge des principaux cancers du foie.

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales afin de provoquer le développement d’une tumeur. Dans certains cas, cette injection pourra être réalisée lors d’une intervention chirurgicale courte sous anesthésie générale. Les animaux seront ensuite suivis régulièrement, avec des mesures de la taille de la tumeur deux fois par semaine lorsque cela est possible. Ils recevront également des injections de traitements expérimentaux, généralement 1 à 2 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume pourront être réalisés, au maximum une fois par semaine. Chaque injection dure quelques minutes. Les interventions chirurgicales durent environ 15 à 20 minutes et sont réalisées sous anesthésie avec prise en charge de la douleur. À la fin de l’expérience, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses sur les tissus.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront des tumeurs au cours de l’étude, pouvant entraîner une gêne progressive et une altération de leur état général. Les principales nuisances attendues sont : - le développement de la tumeur, - le stress lié aux manipulations, - les injections répétées, - et, dans certains cas, les suites d’une intervention chirurgicale. L’état des animaux sera surveillé régulièrement. Des critères stricts d’arrêt seront appliqués afin d’éviter toute souffrance, notamment en cas de perte de poids importante, d’altération du comportement ou d’augmentation excessive de la taille tumorale. Dans ces situations, les animaux seront euthanasiés immédiatement.

Devenir

La mise à mort de l’ensemble des animaux est nécessaire afin de réaliser les prélèvements terminaux indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Les analyses nécessitent notamment le prélèvement de la tumeur, des ganglions lymphatiques drainants et d’autres tissus et organes impliqués dans la réponse immunitaire, tels que le foie, la rate et le sang. Ces prélèvements permettent de caractériser conjointement la tumeur et la réponse immunitaire locale, ganglionnaire et systémique et ne sont pas compatibles avec le maintien en vie des animaux. Les animaux ne pourront donc pas être réutilisés à l’issue des procédures.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, nous avons recours autant que possible à des méthodes alternatives, comme des études sur des cellules en laboratoire ou l’analyse de données humaines. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions complexes entre une tumeur et le système immunitaire dans un organisme vivant. L’utilisation de modèles animaux reste donc nécessaire pour répondre aux questions posées dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Les expériences sont soigneusement planifiées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant la validité scientifique. Plusieurs analyses sont réalisées à partir d’un même animal afin de maximiser les informations obtenues. De plus, certaines expériences ne sont réalisées que lorsque cela est nécessaire, ce qui permet d’éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires.

Raffinement

Toutes les mesures sont prises pour limiter la douleur et le stress des animaux. Ils sont hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Leur état de santé est surveillé régulièrement tout au long de l’étude. Les interventions sont réalisées par du personnel formé, sous anesthésie lorsque cela est nécessaire, avec une prise en charge de la douleur. Des critères stricts sont définis pour arrêter l’expérience dès qu’un animal présente des signes de souffrance.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été retenue comme espèce modèle pour ce projet en raison de sa pertinence largement démontrée dans l’étude de l’immunologie tumorale et des cancers du foie. Les modèles murins permettent d’étudier dans un organisme immunocompétent les interactions complexes entre la tumeur, le système immunitaire et les organes lymphoïdes secondaires, notamment les ganglions lymphatiques drainants, qui ne peuvent être reproduites de manière fiable par des systèmes in vitro. Les lignées tumorales murines utilisées sont bien caractérisées et permettent de reproduire différents phénotypes immunitaires observés chez l’homme, notamment des tumeurs pauvrement infiltrées par les cellules immunitaires. Par ailleurs, la disponibilité d’outils génétiques, immunologiques et thérapeutiques adaptés chez la souris permet d’explorer de manière contrôlée les mécanismes d’immunotolérance et d’évaluer des stratégies immunothérapeutiques pertinentes pour les cancers primitifs du foie. Des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées. À cet âge, les animaux présentent une physiologie stable et un système immunitaire mature, ce qui est nécessaire pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales.

Faire observer une inflammation pulmonaire à seize étudiants de Master 2, à raison de seize souris par année universitaire pendant cinq ans : 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Sous anesthésie gazeuse, elles reçoivent par le nez de la bléomycine, un anticancéreux qui déclenche en une quinzaine de jours une inflammation puis une fibrose des poumons. Le résumé prévoit une gêne respiratoire, une altération transitoire de l'état général, une perte de poids modérée et une douleur possible pendant la phase inflammatoire aiguë. Aucune connaissance nouvelle n'est attendue de ce projet, dont le porteur écrit qu'il "a avant tout un objectif pédagogique", et dont les souris sont prises en priorité sur les excédents de reproduction de l'animalerie.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’expliquer à des étudiants de Master 2 en immunologie (parcours recherche) le fonctionnement du système immunitaire au niveau de la muqueuse respiratoire, dans un contexte d’inflammation pulmonaire. Pour cela, un modèle murin sera utilisé. Les animaux recevront une administration par voie nasale de bléomycine, un agent anticancéreux induisant une réponse inflammatoire pulmonaire, observable environ 15 jours après administration. Les animaux seront ensuite mis à mort et les étudiants analyseront les cellules du système immunitaire présentes dans les poumons à l’aide de techniques couramment utilisées en recherche biomédicale. Ce projet a un objectif essentiellement pédagogique : il permet aux étudiants de mieux comprendre les mécanismes immunitaires pulmonaires et leur évolution lors d’un processus inflammatoire, ainsi que de se familiariser avec l’utilisation de modèles animaux en recherche. Il vise également à développer des compétences en analyse et interprétation de données expérimentales, en identification des populations cellulaires et en compréhension des approches méthodologiques utilisées en immunologie expérimentale. Enfin, il contribue à préparer les étudiants à leur future intégration en laboratoire de recherche. Tous les gestes sont réalisés par l'équipe enseignante.

Bénéfices attendus

Ce projet a avant tout un objectif pédagogique. Il permettra à des étudiants de Master 2 de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire, en particulier au niveau pulmonaire dans un contexte d’inflammation. Il offrira également une première expérience concrète des méthodes utilisées en recherche biomédicale, en favorisant l’acquisition de compétences en observation, analyse et interprétation de données expérimentales, essentielles pour une future activité en laboratoire de recherche. Ce projet contribuera enfin à illustrer de manière concrète les mécanismes impliqués dans le développement de certaines pathologies pulmonaires, notamment l’inflammation et la fibrose.

Procédures

Les souris seront soumises à une administration par voie intranasale réalisée sous anesthésie générale gazeuse

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues sont liées à l’induction d’une inflammation pulmonaire par la bléomycine. Celle-ci peut entraîner une gêne respiratoire, une altération transitoire de l’état général, une perte de poids modérée et, potentiellement, une douleur au cours de la phase inflammatoire aiguë. Les animaux subiront une administration par voie nasale sous anesthésie générale gazeuse afin de limiter le stress et la douleur associés.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l’issue des interventions, car il est nécessaire d’analyser la réponse immunitaire dans plusieurs organes, tels que les poumons et les ganglions lymphatiques, à l’aide de techniques nécessitant le prélèvement précis de ces organes

Remplacement

La réponse du système immunitaire est un processus complexe qui fait intervenir de nombreux types de cellules et de molécules. À l’heure actuelle, il n’est pas possible de reproduire entièrement ce phénomène avec des méthodes in vitro. L’utilisation de la souris est donc nécessaire, car elle permet d’étudier de façon globale comment différentes cellules immunitaires sont recrutées et activées dans l’organisme. Le modèle de souris C57BL/6 traité à la bléomycine est bien connu et largement utilisé. Il s’agit de l’un des rares modèles non infectieux permettant de reproduire la formation de structures appelées « tissus lymphoïdes tertiaires », impliquées dans certaines réponses immunitaires

Réduction

Le nombre de 16 souris par année universitaire (soit 80 souris sur les 5 années du projet) est nécessaire et suffisant pour étudier la mise en place de la réponse immunitaire. Ce nombre permet également aux étudiants de travailler en binôme (16 étudiants par année), tout en limitant le nombre total d’animaux utilisés. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, des souris issues des excédents de reproduction de l’animalerie seront utilisées en priorité, lorsqu’elles sont compatibles avec les besoins de l’étude (âge, sexe et génotype). Des animaux pourront être commandés si nécessaire en complément

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages propres et enrichies (2 à 5 animaux par cage), avec une période d’acclimatation d’au moins sept jours. Les administrations par voie nasale seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de limiter la douleur et le stress. Le bien-être des animaux sera assuré par une surveillance quotidienne réalisée par le personnel de l’animalerie, ainsi que par un suivi régulier (observation et pesée) effectué par l’expérimentateur deux fois par semaine après l’administration de bléomycine. Des critères d’évaluation permettront d’interrompre l’expérience si un animal présente un état de santé préoccupant. À la fin de la procédure, les souris seront mises à mort afin d’analyser la réponse immunitaire. Tous les gestes sont réalisés par l'équipe enseignante.

Choix des espèces

Le modèle souris, largement utilisé en laboratoire, a été choisi pour sa grande praticité et la connaissance approfondie de son système immunitaire. De plus, nous disposons des outils nécessaires pour analyser de manière précise les réponses immunitaires dans ce modèle Animaux adultes livrés à 6–7 semaines d’âge, un âge constituant un bon compromis garantissant une maturité suffisante du système immunitaire. Ils seront utilisés à 7–8 semaines pour le début des procédures

Neuf séances d'imagerie de quarante minutes chacune, sous anesthésie par injection intrapéritonéale, étalées sur huit semaines : 180 souris porteuses d'un glioblastome vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. S'y ajoutent une chirurgie d'induction de la tumeur, des injections d'agent de contraste dans la veine de la queue, et pour une partie d'entre elles une craniotomie avec extraction de la tumeur. Le résumé prévoit un affaiblissement transitoire, une perte de poids au fil des séances, un risque d'hypothermie et une embolie gazeuse pouvant tuer l'animal, et pour la lignée transgénique l'apparition d'un comportement épileptique après induction. Les effectifs concernés par la craniotomie, par l'excision et par la mise à mort hebdomadaire ne sont jamais chiffrés, le résumé s'en tenant à "un petit nombre d'animaux" et à "un petit groupe".

Objectifs

Le cancer du cerveau, et en particulier le glioblastome multiforme (GBM), représente un des cancers au pronostic le plus faible. Aujourd’hui, son pronostic est largement lié à la réussite de la chirurgie, qui est rendue difficile par la présence de multiples vaisseaux afférents à la tumeur et au risque d’hémorragie. Ce projet vise à étudier la vascularisation du GBM afin de proposer des outils pour la chirurgie, grâce à une technique d’imagerie faiblement invasive et peu chère qui pourrait être utilisée de manière longitudinale, et en particulier pendant la chirurgie. À terme, cela pourrait permettre d’augmenter drastiquement la survie des patients atteints de GBM. Ce projet repose sur une technique récente basée sur l’échographie : l’imagerie de microscopie de localisation ultrasonore (ULM) ou superrésolution. Cette permet d’imager avec une précision sans précédent les vaisseaux sanguins, ainsi que de mesurer le flux précisément à chaque endroit. L’objectif de ce projet est - De mieux comprendre le développement vasculaire du GBM - De proposer des biomarqueurs permettant d’identifier les vaisseaux tumoraux - D’identifier l’effet de la récidive tumorale sur la vascularisation post-chirurgie Le but à long terme est de pouvoir mieux comprendre la maladie, et proposer des outils permettant aux chirurgiens d’optimiser l’extraction de la tumeur, afin d’augmenter le taux de survie des patients.

Bénéfices attendus

Le GBM est une tumeur du cerveau difficile à traiter, notamment parce qu’il est souvent difficile de distinguer la tumeur des tissus sains pendant l’opération. Ce projet vise à développer une nouvelle méthode d’imagerie par ultrasons permettant aux chirurgiens de mieux comprendre et identifier la tumeur, en particulier en termes de ses vaisseaux sanguins. Cette technique pourrait aider à retirer la tumeur de façon plus précise, tout en limitant les risques d’hémorragie et de récidive. À terme, elle pourrait améliorer la prise en charge des patients et augmenter leurs chances de guérison.

Procédures

Les procédures réalisées dans ce projet impliquent des manipulations limitées et sont effectuées sous anesthésie. Une chirurgie d’induction sera réalisée pour chacun des deux modèles utilisés, sous anesthésie générale gazeuse et avec injection d’analgésique, une fois par animal. Pour les acquisitions hebdomadaires d’imagerie, l’anesthésie sera réalisée par injection intrapéritonéale, et durera environ 40min. Il s’agira de 9 séances maximum par animal sur 8 semaines, avec deux séances uniquement réalisées le même jour pour un petit groupe (pré et post-excision tumorale). Une injection intraveineuse continue sera réalisée au niveau de la queue de l’animal anesthésié. Il s’agit d’un agent de contraste utilisé en imagerie. Ces injections peuvent entraîner une gêne légère et transitoire liée à la manipulation et à l’injection. Dans le cas du modèle transgénique, une craniotomie puis l’extraction tumorale sera réalisée une fois par animal sur un petit nombre d'animaux, également sous anesthésie générale gazeuse avec analgésique. Des analgésiques et du glucose seront administrés par injections dans les jours suivant l’excision de la tumeur.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables peuvent survenir au cours de ce projet. Le transport pour faire venir les animaux, le changement d’environnement et les manipulations répétées peuvent être source de stress pour les animaux, pouvant se traduire par des modifications de comportement. Les séances d’imagerie ainsi que les chirurgies nécessitent une anesthésie générale. Bien que maîtrisée, cette anesthésie peut entraîner : • un affaiblissement transitoire, • une perte de poids au fil des séances, • un risque de déshydratation, • ainsi qu’un risque d’hypothermie, en particulier lors d’anesthésies prolongées. Les chirurgies, ainsi que les injections intraveineuses répétées au niveau de la queue peuvent également entraîner : • des lésions locales, • un risque infectieux, • une hémorragie, • et une gêne pouvant affecter la mobilité de l’animal. Un risque exceptionnel mais grave d’embolie gazeuse existe en cas d’injection accidentelle d’air dans la circulation sanguine, pouvant entraîner la mort de l’animal. Le glioblastome étant une tumeur agressive, il peut induire : • une douleur liée au développement tumoral, • une altération de l’état général (perte de poids, diminution de l’activité), • et des modifications du comportement (isolement, agressivité, diminution de la prise alimentaire ou hydrique). Enfin, dans le cas des souris transgéniques, un phénotype dommageable apparait après induction, avec la mise en place d’un comportement épileptique

Devenir

La plupart des animaux seront réutilisés chaque semaine pour imagerie, la procédure d’imagerie étant peu sévère et l’anesthésie limitée à 40min. Pour le modèle syngénique, un petit nombre d’animaux sera mis à mort à l’issue de la séance d’imagerie chaque semaine à partir de la semaine 4 après induction pour prélèvement et analyse histologique. Pour le second modèle, un petit groupe d’animaux sera mis à mort chaque semaine après l’imagerie prélèvement du cerveau à partir de la semaine 4 après induction, à l’exception du groupe de mise au point et du groupe pour lequel la tumeur sera excisée, qui seront mis à mort après l’imagerie de la semaine 9 après induction. Aucun animal ne sera gardé en vie.

Remplacement

Dans le cadre du développement de ces techniques d’imagerie, des méthodes alternatives à l’expérimentation animale sont utilisées autant que possible. Des modèles in vitro sont notamment mis en œuvre, tels que des gels (agar ou gélatine) dont les propriétés (rigidité, organisation interne) peuvent être contrôlées. Ces modèles permettent de tester et d’optimiser les techniques d’imagerie dans des conditions maîtrisées. Des simulations numériques peuvent également être utilisées dans certains cas. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’une tumeur dans un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas de représenter fidèlement : • l’organisation et le fonctionnement des vaisseaux sanguins, • les interactions entre la tumeur et les tissus environnants, • ni l’évolution dynamique de la tumeur dans le temps. Or, ces éléments sont essentiels pour répondre aux objectifs du projet, qui visent à caractériser les tumeurs dans des conditions proches de la réalité physiologique.

Réduction

Le projet est conçu de manière à utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. Nos protocoles d’imagerie ont été optimisés de manière exhaustive sur des modèles in-vitro afin de s’assurer de leur efficacité et limiter le nombre d’animaux utilisés inutilement. L’imagerie ultrasonore utilisée est peu invasive, ce qui permet de réaliser des mesures répétées chez les mêmes animaux au cours du temps. Cette approche longitudinale (une séance d’imagerie par semaine) permet de suivre l’évolution des tumeurs sans multiplier les groupes expérimentaux, et donc de réduire significativement le nombre total d’animaux, même si des animaux seront mis à mort à chaque stade tumoral pour référence histologique. Enfin, le nombre d’animaux prévu est volontairement estimé de manière prudente. Toutefois, une adaptation en cours d’étude sera mise en place : si les résultats obtenus sont suffisants avant d’atteindre l’effectif initialement prévu, les expériences seront arrêtées de manière anticipée, permettant de réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de réduire la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux sont acclimatés à leur environnement, manipulés de manière douce (tunnels, prise à la main) et hébergés en groupe dans des cages enrichies. Les souris développant des tumeurs font l’objet d’une surveillance régulière, avec des points limites définis entraînant l’arrêt de l’expérimentation si nécessaire. Les procédures sont réalisées sous anesthésie, avec maintien de la température corporelle et surveillance des paramètres physiologiques. Après les anesthésies les animaux bénéficient d’un réveil encadré en environnement chauffé et sont remis avec leurs congénères après récupération complète. Une évaluation régulière de l’animal est réalisée : administration de substances à effet analgésique si nécessaire, et mise à mort anticipée en cas de douleur ou détresse persistante ou importante. Une évaluation accrue est mise en place pour les animaux au phénotype dommageable après l’induction de ce phénotype, avec évaluation spécifique des conséquences de ce phénotype et points limites pour l’administration d’antalgiques ou la mise à mort précoce.

Choix des espèces

L’étude nécessite un modèle in vivo, car les caractéristiques des tumeurs (vascularisation et interactions avec les tissus environnants) ne peuvent être reproduites en dehors d’un organisme vivant. La souris est choisie comme modèle expérimental car elle permet : • la mise en œuvre de modèles tumoraux pertinents, incluant des tumeurs apparaissant dans un environnement physiologique, • la possibilité d’études longitudinales, • et l’utilisation de modèles génétiques bien caractérisés. Les modèles choisis sont particulièrement adaptés à l’étude du microenvironnement tumoral, qui est central dans ce projet. Par ailleurs, le laboratoire dispose d’une expertise solide sur l’imagerie du rongeur, et en particulier l’imagerie cérébrale. Les souris seront accueillies à l’âge adulte afin de limiter l’impact du développement cérébral sur le développement vasculaire observé.