Procédures modérées

Les dindes qui développent des signes respiratoires sévères sont mises à mort immédiatement. 40 dindes âgées de 4 à 6 semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour récolter leur sang. Elles reçoivent deux inoculations de métapneumovirus aviaire et subissent jusqu'à six prises de sang espacées d'une semaine, afin de produire quatre antisérums de référence qui serviront à identifier le sous-type en cause dans les élevages de dindes malades. Le porteur reconnaît qu'un groupe plus petit pourrait être proposé, et en retient 40 pour constituer un stock utilisable au moins trois ans.

Objectifs

Nous travaillons dans les moyens de surveillance et de diagnostique de maladies infectieuses des élevages de volailles. Les métapneumovirus aviaires provoquent la rhinotrachéite chez la dinde. Ce projet a pour objectif de produire des sérums de dinde contenant des anticorps dirigés contre les 4 sous-types de métapneumovirus aviaires nommés A, B, C et D. Ces sérums seront produits par infection des dindes avec l’un des sous-types de métapneumovirus aviaire. Ceci sera effectué pour tous les sous-types. Ces sérums nous servirons ensuite de sérums de référence afin de déterminer par quel sous-type de métapneumovirus aviaire est infecté un élevage de dinde malade et si les anticorps produits par ces dindes sont protecteurs vis-à-vis du virus. Cette étude ne nécessite pas d'analyses statistiques.

Bénéfices attendus

Ce travail nous permettra de poursuivre nos activités de diagnostique et de recherche dans le cadre des infections de dindes par les virus métapneumovirus aviaires.

Procédures

Tous les animaux de la procédure seront soumis aux interventions suivantes : manipulation des animaux pour les prises de sang, l’inoculation du virus et la mise à mort. Il y aura au maximum 6 prises de sang espacées d’une semaine et 2 inoculations de virus. Chaque intervention durera autour de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à ce que des symptômes respiratoires légers surviennent dans nos conditions expérimentales. Cependant, nous ne pouvons pas exclure formellement l’apparition de symptômes plus importants. Ces pourquoi les dindes seront surveillées cliniquement. Si des signes respiratoires sévères sont observées, les dindes concernées seront mises à mort immédiatement afin de limiter leur souffrance. D'autres nuisances liées aux interventions humaines sont également attendues, comme le stress passager des animaux lors des manipulations par les personnes impliquées dans l’essai et lors du nettoyage des animaleries.

Devenir

En fin de procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récolter le sang et ainsi produire un nouveau stock d’antisérum anti-aMPV-A, anti-aMPV-B, anti-aMPV-C ou anti-aMPV-D.

Remplacement

L’intérêt de l’antisérum anti-aMPV est qu’il soit produit par les mêmes animaux qui seraient naturellement infectés par ce virus, c’est-à-dire les dindes. A ce jour il n’existe pas de méthode alternative pouvant mimer le système immunitaire de dinde pour produire ce type d’antisérum de référence. Le recours à l’expérimentation sur dinde est donc indispensable.

Réduction

La quantité d’animaux prévus, à savoir 40 (10 par sous-type d’antisérum anti-aMPV), permettra de produire un stock utilisable sur au moins 3 ans. Un plus petit groupe d’animaux pourrait être proposé, mais cela réduirait d’autant de temps le stock utilisable. Etant donné que chaque stock d’antisérum subit divers tests de contrôle d’activité et de spécificité entre autres, il est préférable de constituer un plus gros stock de manière à limiter la quantité d’antisérums utilisée uniquement pour ces tests.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à une densité respectueuse de la réglementation en vigueur. Ils seront nourris et abreuvés à volonté. Leur environnement sera également enrichi par l’ajout d’un perchoir. Ceci afin de leur permettre d’exprimer certains comportements naturels et importants pour leur bien-être. Les stratégies appliquées pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse en cours de procédure sont la surveillance quotidienne des animaux, la définition d’un point limite à partir duquel il est impératif de mettre à mort l’animal afin de limiter au maximum le temps de souffrance ainsi que l’organisation des interventions sur animal afin de limiter les manipulations de chaque animal.

Choix des espèces

Les métapneumovirus aviaires infectent et rendent malades les dindes. Afin de disposer d’antisérums de référence qui serviront par la suite au diagnostic de la maladie, il est impératif que ces antisérums soient produits par des dindes. Les dindes utilisées ici auront leur système immunitaire parfaitement mature car elles seront âgées de 4 à 6 semaines.

Une injection dans la patte arrière provoque un œdème et une douleur qui dure de deux à sept jours, puis la voûte plantaire est soumise à un stimulus mécanique ou thermique jusqu'au retrait de la patte, à huit reprises en soixante-douze heures. 133 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet est de tester si un antihistaminique ancien, la mépyramine, encapsulé dans des nanoparticules, soulage durablement cette douleur après une seule injection. Le porteur qualifie ces mesures de "tests comportementaux non invasifs", tout en décrivant un stimulus qui "va déclencher une douleur légère à modérée provoquant le retrait spontané de la patte".

Objectifs

Les douleurs liées à l’inflammation (arthrites, tendinites, douleurs post-opératoires) sont très fréquentes et souvent traitées par des médicaments anti-inflammatoires ou des antidouleurs puissants (morphine et dérivés), dont l’usage prolongé expose à des effets indésirables et à un risque de dépendance. Ce projet étudie une nouvelle façon d’administrer un médicament antihistaminique connu depuis longtemps, la mépyramine, dont on a récemment découvert qu’il bloque des récepteurs impliqués dans la transmission de la douleur. Ce médicament est encapsulé dans des nanoparticules (NPs) qui permettent de le protéger, de le libérer progressivement et de prolonger son effet. Une autre nanoparticule, appelé hybride, associera la mépyramine à une morphine endogène naturellement produite par l’organisme pour soulager la douleur, afin de tester si la combinaison des deux est plus efficace. L’objectif est de vérifier, chez le rat, si ces nanoparticules permettent de soulager durablement la douleur liée à une inflammation, d’abord dans un modèle d’inflammation de courte durée (2-3 jours), puis, si les résultats sont positifs, dans un modèle d’inflammation plus durable (une semaine).

Bénéfices attendus

Si les résultats sont positifs, ce projet montrera qu’un médicament déjà connu, la mépyramine, reformulé sous forme de nanoparticules, peut soulager durablement la douleur d’inflammation après une seule injection, par un mécanisme différent de celui de la morphine et de ses dérivés. Cela ouvrirait la voie à de nouvelles options de traitement de la douleur inflammatoire, permettant de limiter le recours aux antidouleurs opioïdes et leurs effets indésirables (tolérance, dépendance), pour des pathologies très répandues (arthrites, douleurs post-opératoires). La combinaison avec la Leu-enképhaline, molécule naturelle de l’organisme impliquée dans le soulagement de la douleur, pourrait permettre de renforcer cet effet tout en utilisant de plus petites quantités de chaque substance. Ces résultats fourniront des données précliniques de preuve de concept et constitueront une étape importante avant d’envisager le développement clinique de ce type de traitement chez l’Homme (option analgésique périphérique non opioïde).

Procédures

80 rats seront soumis à : - trois injections sous anesthésie générale (quelques secondes par injection) - des tests comportementaux non invasifs sur animal vigile avec des mesures répétées sur les deux pattes, à 8 reprises sur 72 heures. Chaque mesure dure 10 à 20 secondes. 53 rats seront soumis à : - trois à sept injections maximum sous anesthésie générale (quelques secondes par injection, maximum une injection par jour), - des tests comportementaux non invasifs sur animal vigile avec des mesures répétées sur les deux pattes, à 6 reprises sur 7 jours. Chaque mesure dure 10 à 20 secondes.

Impact sur les animaux

Dans le modèle d’inflammation modérée de courte durée, les animaux développent un œdème local et une sensibilité douloureuse de la patte injectée (boiterie discrète, léger léchage de la patte), maximales entre 3 et 24 heures et résolutives en 48 à 72 heures. Aucune altération de l’état général, de la prise alimentaire ou du poids n’est habituellement observée à ces doses. Le modèle d’inflammation persistant induit un œdème plus marqué et plus durable, associé à une sensibilité douloureuse de la patte injectée, persistant sur toute la durée de la procédure (7 jours). Une boiterie modérée et une diminution transitoire de l’appui sur la patte affectée sont attendues. Une légère baisse de la prise alimentaire peut survenir dans les 48 premières heures. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise à un stimulus mécanique ou thermique, qui va déclencher une douleur légère à modérée provoquant le retrait spontané de la patte, l’animal n’étant pas contraint. L’anesthésie (pour réaliser les injections) entraînent un léger stress lié à la perte de conscience.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de leur procédure. Cette mise à mort systématique est justifiée par la nécessité de réaliser des prélèvements terminaux (sang et organes) indispensables aux analyses.

Remplacement

Comprendre comment un médicament soulage la douleur nécessite d’observer un comportement chez un animal possédant un système nerveux complet : aucune méthode alternative (cultures cellulaires, simulations informatiques) ne permet aujourd’hui de remplacer complètement cette étape. Avant d’en arriver à l’animal, des études en laboratoire (sur des cellules et sur les nanoparticules elles-mêmes) ont déjà permis de vérifier que les médicaments conservent leur activité une fois encapsulés, et de choisir les formulations les plus prometteuses, limitant ainsi le nombre de produits testés chez l’animal. Aucune méthode de remplacement total n’est donc disponible à ce stade pour atteindre l’objectif scientifique du projet, à savoir démontrer in vivo l’efficacité analgésique périphérique et prolongée des nanomédicaments étudiées dans un contexte de douleur inflammatoire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé au plus juste sur la base de tests statistiques pour obtenir des résultats fiables, en se basant sur l’expérience d’études similaires. Le projet est organisé en deux étapes : un premier test rapide (modèle de douleur transitoire, quelques jours) permet de vérifier si les nanoparticules sont efficaces avant de poursuivre, le cas échéant, avec un second test plus long (modèle de douleur persistante, une semaine). Si une formulation ne fonctionne pas lors du premier test, elle ne sera pas testée une seconde fois, ce qui évite d’utiliser des animaux pour des produits inefficaces. Chaque animal sera également son propre témoin, grâce à la comparaison entre la patte traitée et la patte non traitée, ce qui améliore la fiabilité des résultats sans augmenter le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont habitués à la manipulation et aux tests avant le début de l’expérience pour limiter leur stress le jour de la procédure. Toutes les injections sont réalisées par du personnel formé, sous une courte anesthésie générale. Un suivi clinique quotidien sera assuré par les expérimentateurs, avec des points limites permettant une intervention précoce en cas de signe de souffrance excédant les attendus du modèle. Les tests comportementaux seront réalisés dans une salle calme, par le même expérimentateur, afin de limiter le stress lié à la manipulation et la variabilité des mesures. Les animaux sont logés dans des cages aménagées, en groupes, avec accès libre à l’eau et à la nourriture, dans un environnement enrichi afin de favoriser le bien-être animal. L'accès à la nourriture et à l'eau sera facilité pendant la période où les animaux présentent une gêne locomotrice.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce de référence pour les tests de douleur utilisés dans ce projet (mesure de la sensibilité de la patte). Sa taille permet des mesures précises et répétées. Des rats adultes jeunes (8 à 12 semaines), mâles, seront utilisés : ce stade correspond à un système nerveux et immunitaire matures, garantissant des réponses stables et comparables aux études antérieures.

Une séance d'imagerie par semaine, chacune sous anesthésie gazeuse pendant quarante minutes, avec injection d'un agent de contraste dans la veine de la queue : 180 souris transgéniques qui développent spontanément des tumeurs mammaires vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une semaine sur deux s'y ajoutent trois prélèvements de sang à la queue en trente minutes. Le porteur liste les conséquences des anesthésies répétées, affaiblissement, perte de poids, déshydratation, hypothermie, et celles des ponctions répétées à la queue, lésions locales, risque d'infection, gêne pour se déplacer. Chaque semaine, quelques souris sont tuées après leur séance pour que leur tumeur soit analysée au microscope, et aucune ne reste en vie à la fin du projet.

Objectifs

Le cancer du sein est l’une des principales causes de mortalité chez les femmes, et son incidence continue d’augmenter. Aujourd’hui, son diagnostic et son suivi reposent en grande partie sur des examens utilisant des rayons X ainsi que sur des biopsies (prélèvements de tissu), qui sont invasives, parfois douloureuses et sources de stress pour les patientes. Ce projet vise à développer une alternative basée sur l’échographie, une technique : non invasive (sans chirurgie), sans rayonnement, plus confortable pour les patientes, et moins coûteuse. À terme, cela pourrait permettre de réduire le recours aux biopsies et d’améliorer significativement le confort et la prise en charge des patientes. Aujourd’hui, des informations essentielles pour évaluer une tumeur (comme sa rigidité, son réseau de vaisseaux sanguins ou l’organisation de ses fibres tissulaires) ne peuvent être obtenues qu’après prélèvement et analyse au microscope. L’IRM permet d’accéder partiellement à ces informations sans intervention, mais cette technique reste coûteuse, peu accessible, et contraignante pour certaines patientes. L’échographie ultrarapide, en revanche, est une technologie : plus accessible, portable, et adaptable à un usage à grande échelle. Elle pourrait donc permettre d’obtenir ces informations de manière simple et non invasive. Les avancées développées dans ce projet pourraient avoir plusieurs impacts majeurs : Améliorer le diagnostic en distinguant plus facilement les tumeurs bénignes des tumeurs malignes, Mieux caractériser les tumeurs pour choisir un traitement adapté, • Suivre plus rapidement l’efficacité des traitements, et éviter des thérapies inutiles ou inefficaces, • Réduire les contraintes pour les patientes, en limitant les examens lourds, invasifs ou stressants.

Bénéfices attendus

Le cancer du sein représente un enjeu majeur de santé publique. Les méthodes actuelles de diagnostic reposent sur des examens contraignants, incluant des biopsies invasives et des techniques d’imagerie coûteuses ou irradiantes. Ce projet vise à développer une approche d’imagerie par ultrasons non invasive, sans rayonnement et accessible, permettant de mieux caractériser les tumeurs. À terme, cette technologie pourrait réduire le recours aux biopsies, améliorer le confort des patientes et faciliter un diagnostic plus précoce et plus précis. Elle permettrait également d’adapter plus rapidement les traitements en identifiant précocement les thérapies inefficaces, contribuant ainsi à une médecine plus personnalisée. Enfin, grâce à son faible coût et à sa portabilité, cette approche pourrait être déployée à grande échelle, améliorant l’accès au diagnostic et la prise en charge des patientes.

Procédures

Les procédures réalisées dans ce projet impliquent des manipulations limitées et sont effectuées sous anesthésie ; Pour les acquisitions hebdomadaires d’imagerie de 40min environ, une injection intraveineuse sera réalisée au niveau de la queue de l’animal anesthésié. Cette injection concernera un agent de contraste utilisé en imagerie, ainsi qu’une solution de glucose, suivie d’une petite quantité de solution saline. Ces injections peuvent entraîner une gêne légère et transitoire liée à la manipulation et à l’injection. Dans le cadre de l’étude du métabolisme, 3 prélèvements d’une goutte de sang seront réalisés toutes les 10min sur une courte période (30 minutes). Ces prélèvements sont effectués à partir de la queue et représentent un volume total limité. Ils peuvent entraîner une gêne modérée liée aux manipulations répétées. Ils ne seront réalisés qu’une fois sur deux afin de permettre à l’animal de récupérer deux semaines entre deux séries de prélèvements.

Impact sur les animaux

Plusieurs effets indésirables peuvent survenir au cours de ce projet. Le transport pour faire venir les animaux, le changement d’environnement et les manipulations répétées peuvent être source de stress pour les animaux, pouvant se traduire par des modifications de comportement. Les séances d’imagerie nécessitent une anesthésie générale par voie gazeuse. Bien que maîtrisée, cette anesthésie peut entraîner : • un affaiblissement transitoire, • une perte de poids au fil des séances, • un risque de déshydratation, • ainsi qu’un risque d’hypothermie, en particulier lors d’anesthésies prolongées. Les injections intraveineuses et prélèvements répétés au niveau de la queue peuvent également entraîner : • des lésions locales, • un risque infectieux au site d’injection, • et une gêne pouvant affecter la mobilité de l’animal, • une difficulté à récupérer entre les séances. Un risque exceptionnel mais grave d’embolie gazeuse existe en cas d’injection accidentelle d’air dans la circulation sanguine, pouvant entraîner la mort de l’animal. Enfin, le modèle animal utilisé développe des tumeurs mammaires, ce qui peut induire : • une douleur liée au développement tumoral, • une gêne locomotrice, • une altération de l’état général (perte de poids, diminution de l’activité), • et des modifications du comportement (isolement, agressivité, diminution de la prise alimentaire ou hydrique).

Devenir

Les animaux seront réutilisés chaque semaine pour imagerie, la procédure d’imagerie étant peu sévère et l’anesthésie limitée à 40min. Un petit nombre d’animaux sera euthanasié à l’issue de la séance d’imagerie chaque semaine pour prélèvement de la tumeur et analyse histologique. Aucun animal ne sera gardé en vie à la fin du projet.

Remplacement

Dans le cadre du développement de ces techniques d’imagerie, des méthodes alternatives à l’expérimentation animale sont utilisées autant que possible. Des modèles in vitro sont notamment mis en œuvre, tels que des gels (agar ou gélatine) dont les propriétés (rigidité, organisation interne) peuvent être contrôlées. Ces modèles permettent de tester et d’optimiser les techniques d’imagerie dans des conditions maîtrisées. Des simulations numériques peuvent également être utilisées dans certains cas. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire la complexité d’une tumeur dans un organisme vivant. En particulier, elles ne permettent pas de représenter fidèlement : • l’organisation et le fonctionnement des vaisseaux sanguins, • les interactions entre la tumeur et les tissus environnants, • ni l’évolution dynamique de la tumeur dans le temps. Or, ces éléments sont essentiels pour répondre aux objectifs du projet, qui visent à caractériser les tumeurs dans des conditions proches de la réalité physiologique.

Réduction

Le projet est conçu de manière à utiliser le nombre minimal d’animaux nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques. L’imagerie ultrasonore utilisée est peu invasive, ce qui permet de réaliser des mesures répétées chez les mêmes animaux au cours du temps. Cette approche longitudinale (une séance d’imagerie par semaine) permet de suivre l’évolution des tumeurs sans multiplier les groupes expérimentaux, et donc de réduire significativement le nombre total d’animaux. Une phase initiale de mise au point sera réalisée afin d’optimiser les paramètres d’imagerie et d’éviter la réalisation d’expériences non exploitables. Cette étape permettra de garantir la fiabilité et la reproductibilité des mesures, en particulier pour l’étude de nouveaux biomarqueurs. Par ailleurs, l’expérience acquise lors de projets précédents utilisant le même modèle animal permet de limiter les ajustements nécessaires, notamment concernant le modèle biologique, contribuant ainsi à réduire le nombre d’animaux utilisés pour les phases préliminaires. Enfin, le nombre d’animaux prévu est volontairement estimé de manière prudente. Toutefois, une adaptation en cours d’étude sera mise en place : si les résultats obtenus sont suffisants avant d’atteindre l’effectif initialement prévu, les expériences seront arrêtées de manière anticipée, permettant de réduire encore le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de réduire la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les animaux sont acclimatés à leur environnement, manipulés de manière douce (tunnels, prise à la main) et hébergés en groupe dans des cages enrichies. Les souris développant des tumeurs font l’objet d’une surveillance quotidienne, avec des points limites définis entraînant l’arrêt de l’expérimentation si nécessaire. Les procédures sont réalisées sous anesthésie, avec maintien de la température corporelle et surveillance des paramètres physiologiques. Les sites d’injection sont désinfectés et traités pour limiter la douleur. Après les séances, les animaux bénéficient d’un réveil encadré en environnement chauffé et sont remis avec leurs congénères après récupération complète. Une évaluation régulière de l’état de l’animal est réalisée : administration de substances à effet analgésique (Meloxicam) si nécessaire, et euthanasie anticipée en cas de douleur persistante ou importante.

Choix des espèces

L’étude nécessite un modèle in vivo, car les caractéristiques des tumeurs (vascularisation, structure et interactions avec les tissus environnants) ne peuvent être reproduites en dehors d’un organisme vivant. La souris est choisie comme modèle expérimental car elle permet : • la mise en œuvre de modèles tumoraux pertinents, incluant des tumeurs apparaissant dans un environnement physiologique, • la possibilité d’études longitudinales, • et l’utilisation de modèles génétiques bien caractérisés. Ce modèle transgénique est particulièrement adapté à l’étude du microenvironnement tumoral, qui est central dans ce projet, car il permet d’étudier le développement spontané d’une tumeur dans son environnement. Par ailleurs, le laboratoire dispose d’une expertise solide sur ce modèle, ainsi que de l’ensemble des équipements adaptés à l’imagerie du rongeur. Nous avons choisi d’accueillir les souris au stade pré-pubère pour avoir le temps de les acclimater et de réaliser l’imagerie sur des petites tumeurs, avant qu’elles deviennent palpables.

Un prestataire de services en recherche préclinique vend l'évaluation de candidats médicaments sur des rats à qui il greffe une tumeur dans la vessie, protocole qu'il doit d'abord mettre au point : 1 200 rats vont être utilisés sur cinq ans, tous tués en fin d'étude parce qu'ils portent des tumeurs, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit un transpondeur sous la peau, subit une chirurgie d'induction tumorale de moins d'une heure trente, puis une seconde chirurgie pour poser un cathéter dans la vessie, et reste isolé de un à dix jours pendant l'infusion du traitement, opération répétable. Les effectifs par groupe vont de trois à quinze rats selon les paramètres évalués. À cela s'ajoutent jusqu'à 30 % de rats supplémentaires, prévus parce que les deux chirurgies sont "des phases critiques techniquement complexes".

Objectifs

En 2020, le GLOBOCAN estimait à environ 573 000 nouveaux cas de cancer de la vessie dans le monde; en 2022, les estimations dépassent 600 000 cas. Ce cancer est parmi les dix plus fréquents, avec de fortes disparités régionales et une prévalence nettement plus élevée chez les hommes; l’incidence est largement liée au tabagisme et augmente dans régions en lien avec vieillissement. L’objectif global de ce projet est d’améliorer la prise en charge clinique au travers du développement de nouvelles thérapies efficaces contre ce type de cancer par l’intermédiaire d’un modèle préclinique pertinent : - Comprendre la biologie : mécanismes moléculaires, voies de signalisation, hétérogénéité tumorale et résistance aux traitements. - Découvrir des cibles et biomarqueurs : identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et des marqueurs pronostiques/prédictifs. - Développer et optimiser des traitements : criblage de petites molécules, anticorps, immunothérapies, thérapies combinées et stratégies de délivrance locale (instillations intravésicales). - Évaluation de la toxicité et pharmacocinétique : sécurité systémique et locale avant essais cliniques. - Réduction des échecs en clinique : validation robuste des hypothèses pour mieux sélectionner candidats et schémas thérapeutiques. - Individualisation des soins : tests ex vivo (organoïdes, cultures primaires) pour prédire réponse et guider thérapie personnalisée. - Aspects translationnels et réglementaires : définir biomarqueurs d’effet, critères d’inclusion pour essais et preuves préalables exigées par autorité L’objectif de ce projet est de développer un modèle de cancer de vessie chez les rongeurs (rats), le plus prédictif possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des composés thérapeutiques dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques, à établir une réelle évaluation de l’efficacité de molécules destinées à traiter les tissus cancéreux localisés chez l’homme. Une fois le modèle établi, une évaluation complète des candidats médicament pourra aussi être réalisée avant de lancer un potentiel essai clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représentent un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux candidats médicament préalablement aux essais qui pourraient être ensuite mené chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases et également les voies d’administration telles que le mise en place d’un cathéter intra vésical par voie antérograde mime déjà pratiqué chez l’homme. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer

Procédures

L’implantation de transpondeur pour identifier l’animal sous la peau est réalisée sous anesthésie générale 0-3 jours avant le début de l’étude (inférieur à 5min). Chirurgie permettant l’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h30). Avant les traitements, les animaux sont sélectionnés pour former des groupes homogènes en poids et/ou volume tumoral (stress léger durant 1 à 2 jours). Au cours des études, des méthodes d’imagerie non invasives peuvent être réalisée, potentiellement après un transport (inférieur à 2h). Des méthodes d’imagerie non invasives (indolore) pourront être réalisées sous anesthésie générale (inférieur à 1h). Mise en place d’un cathéter par chirurgie nécessaire à la mise en œuvre des traitements sera réalisée sous anesthésie générale (inférieur à 1h30). Les animaux seront traités par un système d’infusion continue nécessitant le recours à l’isolement temporaire des animaux durant le traitement (1 à 10 jours répétable). La palpation des tumeurs nécessitera une contention des animaux (inférieur à 30s, stress léger). Des prélèvements de sang, pourront être faits sous anesthésie générale . Des prélèvements d’urine pourront être réalisés en hébergeant individuellement les animaux moins d’une heure ou par légère pression sur le ventre sous contention (inférieur à 5min, stress léger). En fin d’étude, tous les animaux sont euthanasiés

Impact sur les animaux

La chirurgie d’induction tumorale pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. Un traitement antidouleur sera appliqué aux animaux durant cette période. Le développement de la tumeur dans la vessie pourra également engendrer une gêne. L’implantation chirurgicale d’un cathéter dans la vessie pour la mise en œuvre des traitements pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2j et un stress modéré. Un traitement antidouleur sera appliqué aux animaux durant cette période. Les animaux seront maintenus en hébergement individuel durant le temps d’infusion, ce qui pourra engendrer un stress léger. Les périodes de traitements pourront engendrer un stress modéré. Les technique d’imagerie non invasive (IRM ou bioluminescence) pourront induire un stress léger. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral pourront entraîner un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon les critères définis dans l’étude. Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes (au minimum un groupe avec tumeur, non traité et un groupe avec tumeur, traité; plusieurs groupes traités possibles pour évaluer différents traitements, doses etc). Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 30% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement pour la mise en place du modèle au moment des chirurgies avant la sélection des animaux. La chirurgie d’implantation du cathéter et d’induction tumorale sont des phases critiques techniquement complexes qui nécessitent un nombre d’animaux excédentaires prenant en compte la complexité de la mise en place du modèle. Avec la pratique et l’amélioration continue des techniques, ce nombre pourra être réduit au cours du temps. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal

Raffinement

La chirurgie d’induction tumorale et l’implantation du catheter par chirurgie en intravesicale sont réalisées sous anesthésie générale avec couverture analgésique (antidouleur) durant toute la procédure et durant les 3 jours suivants celle-ci. Les chirurgies seront réalisées de façon aseptique, avec maintien de la température corporelle et surveillance jusqu’au réveil. Les chirurgies seront effectuées le matin pour surveiller les animaux durant la journée après leur réveil. L’induction tumorale et l’implantation du cathéter pourront se faire au cours de la même chirurgie. Dans le cas où l’induction tumorale et la mise en place du cathéter ne sont pas réalisés en même temps, un délai compris entre 5 et 12 jours devra être respecté avant la seconde intervention chirurgicale. La seconde intervention chirurgicale sera menée sous l’autorité du vétérinaire de l’établissement afin de s’assurer que les animaux est bien eu le temps nécessaire pour récupérer de la première intervention. Les prélèvements de sang seront effectués suivant les recommandations vétérinaires (anesthésie, volume, fréquence, antalgie). Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître les signes de souffrances et les points limites. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasives permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. Un enrichissement adapté aux animaux sera disposé dans chaque cage d’aniamux. Des animaux adultes seront utilisés. Une évaluation précise de l’état sanitaire des animaux sera mis en place de manière individuelle à l’apparition des premiers signes cliniques d’évolution de la maladie. Dans toutes les cages, une nourriture adaptée et de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée en fonction des besoins des animaux. Les scores cliniques les plus élevés, l’accumulation de scores intermédiaires et les pertes de poids élevées ou prolongées constitueront des points limites à l’experience.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, les rats autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales et l’implantation du cathéter en intra vésical. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

Une instillation nasale de virus grippal ou une injection de cytomégalovirus dans le péritoine, puis une série de tâches non nommées mesurant anxiété, humeur et mémoire : 856 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'infection provoque un syndrome fébrile pouvant durer sept jours, avec perte de poids et anxiété, et chaque souris passe jusqu'à dix jours seule en cage pour l'évaluation individuelle. Le porteur écrit pourtant que "les tests comportementaux ne génèrent aucun stress" et qu'il n'a pas noté d'état de stress lié à l'isolement, dans un projet dont l'objet est précisément de mesurer un état d'abattement et d'isolement provoqué par l'infection. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever organes et sang.

Objectifs

Le système immunitaire est requis pour la défense de l’hôte contre les agressions de corps étrangers (virus, bactéries, etc..). Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs clés du système immunitaire, en première ligne dans la reconnaissance des microbes. Lorsqu’elles détectent un corps étranger, les DC produisent des molécules véhiculées dans tout le corps pour orchestrer l’activation de tous les autres acteurs du système immunitaire. Une production de ces molécules spécifiques dérégulée en temps et/ou en quantité peut avoir un rôle délétère, parfois fatal, sur l’individu infecté, comme observé récemment dans le cadre du Covid. Au cours des infections virales, les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC), sont la principale source de molécules spécifiques qui signalent l'infection et sont source d'inflammation appelées Interférons (IFN). Les IFN sont indispensables pour limiter la propagation de virus. Cependant, lorsque les pDC sont absentes ou incapables de produire des IFN, l'hôte infecté contrôle toujours efficacement l'infection. La capacité des pDC de produire des IFN est retrouvée dans la majorité des vertébrés, cette capacité est donc probablement très ancienne. Il est alors possible que cette fonction ne serve pas uniquement à combattre des infections virales, mais aussi à remplir d'autres fonctions importantes dans l'organisme. Notre objectif est de tester si les molécules produites par les pDC induisent un état d'abattement, d’isolement et d'affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement à court ou long-terme, comportement qui ressemble aux états dépressifs. Les pDC pourraient aussi participer à la mise en place d'une détérioration des cellules du cerveau dans la maladie d'Alzheimer (AD), la première maladie neurodégénérative qui affecte plus d'1 million de personnes en France, a un poids sociétal lourd pour les familles et reste sans traitement efficace. Afin de tester cette hypothèse nous induirons la perte des cellules pDC dans un modèle de souris, combinée ou non à des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer et que nous infecterons avec deux types de virus : la souche A du virus de la grippe (IAV) qui induit une infection restreinte du système respiratoire, ou le cytomégalovirus murin (MCMV) qui induit une infection dans tout l'organisme et persiste sous forme latente, cachée. Nous évaluerons l’impact de ces infections sur le comportement des souris par des tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les interactions entre systèmes immunitaire et nerveux. Si notre hypothèse est correcte, il sera envisageable de cibler la production d'agent participant à l'inflammation pour développer de nouvelles stratégies de thérapie pour les patients dépressifs, ou souffrant d'un affaiblissement des capacités de reconnaisance/conscience de l'environnement progressifs. Ces nouvelles approches seront d’abord validées dans un cadre infectieux, ensuite elles pourront être étendues à d’autres contextes inflammatoires, les maladies impliquant une dégénérescence des cellules du cerveau et en particulier la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Des souris seront infectées soit par une courte injection par voie intrapéritonéale à l'état vigile d'un faible volume de liquide physiologique contenant du virus. D'autres souris recevront une faible dose de virus par instillation nasale réalisée une seule fois sous anesthésie générale gazeuse de courte durée. Une prise de sang sera effectuée sur les souris infectées, une seule fois sur animal vigile. Il s'agit d'un geste rapide (moins de 5 minute par souris). Un point de compression sera ensuite réalisé à l'aide d'une compresse stérile jusqu'à arrêt d'un saignement potentiel. Les souris effectueront ensuite une séquence de tâches afin d'évaluer leur comportement et plus précisément leur niveaux naturels d'anxiété, leur humeur motivée ou déprimée, et leurs capacités d'apprentissage et de mémoire. La séquence durera moins de deux semaines et comprendra la séparation des animaux pour leur évaluation à l'échelle individuelle sur une durée correspondant à moins de 30 minutes au total par jour pendant 4 jours, ou pendant moins de 10 jours dans le cas de l'évaluation de la mémoire à long-terme. Les souris seront libres de leurs mouvements et en capacité d'explorer dans des cages au cours de chaque test comportemental. Aucune tâche nécessite un effort particulier, ou génère quelque douleur ou angoisse, du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives.

Impact sur les animaux

Dans le cas d'infection par les virus, les animaux présentent un syndrome fébrile, associé à des symptômes généraux comme de la fièvre indiquant que l'organisme lutte contre une infection. Ce dernier peut durer jusqu'à 7 jours et entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les injections ne sont source d'aucun stress particulier, du fait qu'elles ne sont pas répétées, du faible volume injecté, et du fait de la manipulation journalière préalable des souris par le personnel qualifié dans la semaine précédente. La prise de sang peut généré un stress léger du fait de la contention. Dans le cadre d'un test d'évaluation du comportement, les animaux sont hébergés temporairement en cage individuelle. Du fait de l'enrichissement de leur habitat, du caractère temporaire (moins de 10 jours), il n'a pas été noté d'état de stress lié à l'isolement, mais ces manifestations seront étroitement surveillées. Les souris étant libres d'exploration, non restreintes et les tâches étant toutes effectuées dans la salle d'hébergement où elle ont été acclimatées, les tests comportementaux ne génèrent aucun stress et du fait que les stimulations ne dépassent pas celles rencontrées naturellement en zootechnie, et sont associées à des récompenses alimentaires positives, ceci afin de pouvoir justement mesurer leur état d'anxiété naturel.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de réaliser divers prélèvements d'organes et/ou de sang utilisés pour des analyses complémentaires. Ces prélèvements sont essentiels pour étudier les paramètres inflammatoires et les mécanismes cérébraux entrant en jeu dans ce projet.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades moléculaires impliquées dans les capacités cognitives et la réponse adaptative des comportements. Les études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition, et sont ainsi complétées par l'utilisation de l'animal qui seule permet d'étudier la coordination des différentes régions du cerveau entre elles et leurs intéractions avec le reste de l'organisme et en particulier le système immunitaire.

Réduction

Tous ces animaux seront sous un même fond génétique homogène (gènes communs) pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités. Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que l'analyse d'un total de 12 animaux par groupe répartis sur deux expériences reproduites étaient nécessaires. En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 2 fois de manière indépendante.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés de 2 à 5 individus compatibles. Un animal sera euthanasié en cas de mal-être trop important évalué par l'utilisation d'une grille de scoring. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont : respiration anormale, perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, aspect du poil anormal. Les souris sont préalablement familiarisées avec l'aliment de convalescence (gel) dans les jours précédant l'infection, ce qui optimise leur convalescence. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux (comme précisé pour chacune des expériences). Lors des prélèvement de sang, avec utilisation de tubes de contention, l'animal sera surveillé et le geste sera réalisé rapidement afin de limiter l'évènement stressant, les souris seront replacées avec leurs congénères et il sera vérifié que le prélèvement ne les a pas affaiblies ou perturbées (changement de comportement). Enfin, les tests comportementaux sont choisis et menés en respectant les besoins écologiques des modèles: la recherche spatiale est motivée par récompense positive, les souris sont acclimatées à tous les tests et habituées aux dispositifs au moins une semaine avant chaque test. Les tests ne requièrent que mobilité, exploration libre d'objets, d'eau de boisson sucrée ou stimulus sonore de niveau équivalent à celui auquel elles peuvent être exposée lors du change de cage.

Choix des espèces

Les réactions physiologiques de la souris face à des corps étrangers, ici des virus, sont suffisamment proches de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et nerveux de ces 2 espèces. Ce point est maintenant formellement établi dans la littérature en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires, notamment pour l'étude de la maladie d'Alzheimer. Seuls des animaux adultes seront étudiés ici de façon à ce que leur système immunitaire soit mature. Enfin dans le cas des modèles de la maladie d'Alzheimer, une maladie neurodégénérative dont le premier facteur de risque est l'age, des animaux adultes plus mûrs mais non vieillissants seront étudiés pour correspondre au mieux au métabolisme d'un humain de 45 ans ou plus.

Jusqu'à seize prélèvements de sang en sept jours, dont douze possibles sur vingt-quatre heures, et des ponctions d'urine directement dans la vessie sur un animal vigile maintenu sur le dos : 150 chats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aucun n'est tué, le porteur indiquant qu'ils sont tous gardés en vie et pourront être réutilisés dans d'autres projets. Les molécules testées visent le marché du médicament vétérinaire félin, et le porteur écrit qu'"il est indispensable de recourir à l'animal" faute de méthode reproduisant la diffusion d'un produit dans le sang au niveau de l'"organisme entier". Le nombre de chats par étude dépend du Donneur d'Ordre, qui ne réalise pas toujours d'approche statistique.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de pouvoir tester différents principes actifs et véhicules chez le chat et d'obtenir des données pharmacocinétiques et pharmacodynamiques. La pharmacocinétique et la pharmacodynamie sont des disciplines qui étudient le devenir de la molécule dans l’organisme. Le devenir du médicament selon les doses utilisées, sa voie d'administration et sa concentration sont étudiés chez l'animal: son absorption, sa distribution dans l'organisme, son métabolisme, son élimination. Les chats sont régulièrement utilisés pour la recherche biomédicale dans les domaines de santé animale (espèce pour laquelle le médicament est prévu). L'objectif est de pouvoir générer de nouveaux médicaments pour la médecine vétérinaire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir déterminer les paramètres pharmacocinétiques des éléments tests pour pouvoir ensuite générer de nouveaux médicaments pour la médecine vétérinaire principalement destinés à la médecine féline.

Procédures

Les animaux seront soumis à des administrations uniques ou répétées de molécules tests selon les études (1 administration à 5 administrations espacées d'au moins 1 semaine). Pour cela les animaux seront vigiles et auront une contention manuelle. Cette contention est facilitée par les entrainements réguliers des animaux à tenir ces positions (par exemple: assis sur la table, ouverture de la cavité buccale, tête légèrement orientée vers le haut, allongés sur le dos pour des prélèvements de cystocentèse). La durée d'une administration est inférieure à la minute. Des prélèvements sanguins seront réalisés sur les animaux vigiles. Pour une période de 7 jours, le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 16 maximum (volume environ égale à 1 mL par temps) et engendrera une période de récupération de 7 jours minimum, la durée du prélèvement est inférieure à la minute. Sur cette période de 7 jours, un total de 12 prélèvements sanguins maximum peuvent être réalisés sur 24h. Certains animaux peuvent être soumis à un recueil d'urine. Dans ce cas, cela se fera soit par miction spontanée ne nécessitant pas de manipulation de l'animal. Les animaux sont pour cela mis en hébergement individuel comprenant des bacs à litière spécifique pour le recueil d'urine. La durée de la mise en individuel peut être de 24h, soit le prélèvement urinaire peut se faire par ponction d'urine dans la vessie sur un animal vigile avec une contention manuelle. La durée du prélèvement est de l'ordre de la minute, l'animal est alors allongé sur le dos. Un maximum de deux prélèvements d'urine dans la vessie sur 24h est accepté, espacées d'au moins 6h. Cela se fait sous échographie pour eviter tout risque de blessure.

Impact sur les animaux

Toutes administrations des différents éléments tests vont engendrer une contention de l'animal. Malgré un entraînement régulier, toute contention peut engendrer un stress ou un inconfort. Les prélèvements de sang ou prélèvements d'urine peuvent également entraîner un stress, un inconfort si c'est un prélèvement dans la vessie directement. Cela se pratiquera sous échographie pour éviter tout risque de blessure

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à la fin du projet et de chaque protocole en accord avec le vétérinaire responsable. Les animaux pourront être réutilisés dans le cadre d'autres projets.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal. Les essais in vitro sont des tests de cinétique de dissolution et de désagrégation d'un produit. Les essais ex vivo sont des tests qui s'effectuent directement sur des organes ou tissus isolés. La possibilité de mettre en place ces techniques de remplacement seront évaluées avant la mise en place de chaque projet.

Réduction

150 animaux sont inclus dans ce projet pour une durée de 2 ans. Cela représente en moyenne 75 animaux par an soit en moyenne 7 études par an comprenant une moyenne de 10 à 12 individus par protocole. Un délai minimum de 4 semaines sera respecté entre chaque étude. Si aucune approche statistique n'est réalisée par le Donneur d'Ordre, on calculera pour chaque produit à tester le nombre d’animaux nécessaire, il sera, pour chaque protocole, toujours réduit au minimum, en tenant compte de la variabilité des résultats attendus, un minimum de 3 animaux par produit est nécessaire pour une interprétation des résultats exploitables. Ce nombre peut être augmenté pour obtenir une meilleure fiabilité des résultats, palier à une grande variabilité inter-individuelle ou être homogène dans le sex-ratio des animaux.

Raffinement

Les chats seront hébergés par groupe de 2 à 4 animaux par groupe, par sexe et par affinité dans le respect du plan d'hébergement et de la règlementation en vigueur. De l'enrichissement du milieu (exemple: griffoir, coussin,plateformes à différentes hauteurs, balles ou cordelettes) est présent dans chaque box. Un suivi quotidien est mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, observation des sites de prélèvement, observation du comportement de l'animal...). Une visite hebdomadaire par le vétérinaire désigné ou son suppléant est réalisée pour évaluer la stabilité et l'équilibre social de tous les groupes de chats.

Choix des espèces

Espèce cible pour les médicaments vétérinaires. MODIFICATION : élargir la tranche d'âge des animaux à partir de 6 mois et plus. Certaines applications médicamenteuses pourront être évalués et à viser thérapeutiques à partir de 6 mois d'âge. Jeunes adultes stérilisés ayant atteint leur taille adulte et un système immunitaire et métabolique mature.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement par voie orale vingt jours cumulés, jusqu'à cinq jours par semaine, subissent des régimes pauvres en sodium ou riches en potassium pendant trente jours au plus, passent cinq jours consécutifs en cage individuelle pour le recueil des urines, et voient leur pression artérielle mesurée cinq fois de suite par un ballonnet gonflé sur la queue. L'administration orale peut irriter leur œsophage, le régime et les traitements faire perdre du poids et modifier la mobilité, l'hébergement individuel provoquer un stress social. Cette recherche est fondamentale, et le porteur écrit avoir "besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat" parce qu'il juge impossible de recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

L'hypertension arterielle et ses complications cardiovasculaires et rénales a une très forte prévalence en Europe et augmente avec l'age pour atteindre près de 50 pour cent après 60 ans. L'hypertension arterielle participe au cercle vicieux liant insuffisance rénale chronique (IRC) et pathologies cardiovasculaires. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre vaisseaux, rein et coeur et d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités. Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’aldostérone, une hormone produite par les glandes surénales, joue un rôle important et induit inflammation et fibrose tissulaire, ce qui joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l'hypertension artérielle. L'aldostérone a également un role crucial dans la balance hydrosodée, régulant l'excretion rénale de sodium et potassium. Les objectifs du projet sont d'étudier les conséquences de l'inhibition de la synthèse d'aldosterone par un nouvel inhibiteur spécifique de l'aldosterone synthase sur la balance hydrosodée et la pression artérielle

Bénéfices attendus

L’insuffisance rénale chronique (IRC) dont la prévalence est d’environ 10 pour cent en europe, selon les pays, a des conséquences cardiovasculaires majeures avec une morbidité et mortalité importantes ce qui représente un cout sociétal considérable. Le nombre de décès liés à l’IRC est estimé à 1,5 million dans le monde et est la 5ieme cause de perte d’année de vie. La proportion de sujets en France ayant une qualité de vie altérée variait de 20 à 50 pour cent dans les dimensions à composante physique selon le degré d’IRC. Disposer d'un modèle rongeur permettant de tester les bénéfices éventuels d'un inhibiteur de la synthase d'aldosterone serait une avancée therapeutique potentielle

Procédures

Les animaux sont soumis à diverses interventions. Certains animaux seront mis sous régimes spéciaux (animal vigile) pendant un maximum de 30 jours pour chaque serie expérimentale. Les animaux seront soumis à une administration orale d'un traitement sur animal vigile, 20 jours maximum cumulés, 1 minute par geste, par periode de 5 jours par semaine, avec une periode de repos de 2 jours, puis une semaine entre les protocoles nourriture controle puis nourriture pauvre en sodium ou riche en potassium. Il est réalisé par une personne formée à cet acte. Pour le recueil des urines (3 fois pendant 8h, une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). Il est réalisé 5 jours consécutifs (animal vigile) pendant 4 périodes selon le protocole avec des temps de repos de 2 jours entre chaque période. Certains animaux ont une injection (1 fois, 1 minute, animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Elle consiste à placer un ballonnet gonflable sur la queue de l’animal puis à mesurer la pression du ballonnet à laquelle le pouls est de nouveau perçu. L’euthanasie est réalisée selon une méthode réglementaire en fin de période expérimentale après prélèvement sanguin sous analgésie et anesthésie (1 fois, quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) la douleur et le stress de contention lors de l'administration orale avec irritation possible de l'oesophage , 2) les conséquences de changement de la pression artérielle (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 3) le régime alimentaire spécial et les traitements peuvent entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux, 4) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress social mais les animaux seront dans la même pièce que leur congénères 5) le stress lié à la manipulation et la contention durant l'administration du traitement et la prise de pression artérielle 6) le stress et la douleur légère de courte durée au site d'injection 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.

Remplacement

Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro (spécificité de l'antagoniste aldosterone synthase (ASI) dans des cellules de surrénale). Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde par l'aldostérone et de la signalisation sous-jacente dans l'hypertension artérielle. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu

Réduction

Nous avons d'abord fait une étude de la littérature (ainsi qu'une estimation grâce à un algorithme fournis par un logiciel) pour s'assurer de la faisabilité du projet ainsi que pour estimer le nombre d'animaux nécessaire pour qu'on puisse mettre en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de 10 rats males ou femelles pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail. Le nombre total d’animaux sera de 120 rats

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique: les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après: carré de lanière kraft et batonnet en bois. Un enrichissement pour se cacher et grimper pourra être ajouté (tunnel, hutte ou équivalent en PVC ou autre). Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, certaines analyses cardiovasculaires seront réalisées après habituation, afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis. Pour réduire les nuisances les actions suivantes seront réalisées: le comportement des animaux sera surveillé attentivement, en référence à une grille de scoring de l’animalerie. Les rats sont maintenus 2 par cage au minimum (ça dépend de leur poids, nous suivons les recommandations de la réglementation française). Une période d’acclimatation réglementaire de 7 jours est respectée si les animaux proviennent d’un fournisseur extérieur.

Choix des espèces

L'espèce rat a été choisie car c'est un modèle établi pour le développement de l'hypertension et maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons d'un modèle de rats génétiquement modifiés Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé. Les animaux contrôles sont les littermates (frères et soeurs des même portée) non transgéniques donc élevés au même endroit.

Quatre lignées de souris à phénotype dommageable développent des lymphomes spontanés à partir de cinq mois, et des tumeurs intestinales à partir de six mois en condition d'obésité. 720 souris de ces lignées vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une alimentation qui les rend obèses, un traitement injecté dans le péritoine, des palpations abdominales deux fois par semaine, et pour les tests métaboliques une mise à jeun la veille puis des prélèvements de sang répétés à la veine de la queue après incision. Le porteur décrit des masses tumorales pouvant entraîner diarrhées, prolapsus, signes d'anémie, et annonce la mise à mort en fin d'expérimentation "afin de réaliser des prélèvements terminaux".

Objectifs

Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus fréquents et représente un enjeu majeur de santé publique. Bien que plusieurs facteurs génétiques jouent un rôle dans son initiation, la majorité des cancers colorectaux sporadiques sont imputables à des facteurs environnementaux tels que l'obésité, le tabagisme et les carcinogènes alimentaires. Il est bien connu que le risque de développer un cancer colorectal augmente avec l'obésité. Cependant, les mécanismes biologiques par lesquels les régimes alimentaires occidentaux influencent le développement du cancer colorectal ne sont pas bien compris. Ce projet de recherche a pour objectif global d’identifier comment les perturbations métaboliques déclenchées par une alimentation obésogène promeuvent la progression du cancer colorectal et de caractériser les liens complexes entre l'obésité et le contrôle du métabolisme.

Bénéfices attendus

Ce projet représente un enjeu majeur de santé publique et permettra de développer de nouvelles voies thérapeutiques pour les patients obèses atteints de cancers digestifs.

Procédures

Les souris seront soumises ou non à un régime alimentaire les rendant obèse, puis un traitement leur sera administré intra-péritonéalement (temps estimé : 15 secondes). Les animaux feront l’objet d’un suivi quotidien et seront pesés 2 fois par semaine (temps par pesée : 10 secondes). Afin de suivre l’évolution tumorale, les souris seront, à l'occasion de la pesée, palpées au niveau abdominal (temps estimé : 15 secondes). Pour les tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun la veille. Ensuite, les souris recevront une injection intrapéritonéale de glucose ou d'insuline (temps estimé : 15 secondes). A l’issue de l'injection, des prélèvements sanguins seront effectués (temps estimé : 30 secondes) à la veine caudale après incision transversale légère au niveau de la queue à intervalles de temps réguliers pour mesurer la glycémie ou une éventuelle intolérance à l’insuline.

Impact sur les animaux

Le phénotype attendu des animaux est le développement le développement spontané de lymphomes à partir de 5 mois de vie et en condition d’obésité, des tumeurs intestinales, à partir de 6 mois de vie. Les nuisances associées à ce développement de tumeurs peuvent être les suivantes : développement d’une masse tumorale pouvant entrainer des troubles digestifs (diarrhées, prolapsus notamment), des signes d'anémie, ou troubles du comportement. À ces effets liés au modèle s’ajoutent les nuisances expérimentales : les manipulations et contentions répétées peuvent être sources de stress pour les animaux. L’administration de tamoxifène est également susceptible d’induire des effets indésirables transitoires, tels qu’une gêne locale. Enfin, les prélèvements sanguins répétés peuvent engendrer une douleur légère à modérée au point de prélèvement, ainsi qu’un stress associé à la manipulation, et, en cas de répétition rapprochée, un risque d’affaiblissement ou d’anémie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées en fin d'expérimentation afin de réaliser des prélèvements terminaux

Remplacement

Les questions posées dans ce projet portent sur la manière dont les tumeurs apparaissent et évoluent au fil du temps. Pour y répondre, il est nécessaire d’utiliser des souris, car elles permettent d’étudier le fonctionnement du corps dans son ensemble. En effet, le comportement des cellules cancéreuses, notamment leur métabolisme, peut être très différent entre des expériences en laboratoire (sur cellules isolées) et un organisme vivant. À ce jour, il n’existe pas de méthode alternative permettant d’étudier ces phénomènes de façon aussi complète. L’utilisation de souris reste donc indispensable, en particulier pour comprendre les premières étapes de formation des tumeurs. Enfin, ce projet vise aussi à étudier les interactions entre différents organes et la tumeur, ainsi qu’à identifier des marqueurs détectables dans le sang. Ces objectifs nécessitent obligatoirement une étude sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé pour obtenir des résultats fiables, tout en évitant de devoir refaire les expériences. Seuls les régimes alimentaires ayant montré les effets les plus marqués seront testés. Chaque groupe comprendra 20 souris (10 par type d’alimentation), ce qui permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour tirer des conclusions solides. Pour analyser les résultats, nous comparerons la croissance des tumeurs entre les différents groupes au fil du temps, ainsi que les caractéristiques biologiques des tumeurs prélevées. Des méthodes statistiques adaptées seront utilisées pour comparer les données entre groupes. Au total, sur les 5 ans du projet, jusqu’à 720 souris pourront être utilisées, réparties en plusieurs groupes expérimentaux. Ce nombre repose sur des calculs statistiques ainsi que sur l’expérience du laboratoire avec des modèles similaires

Raffinement

Ces 4 lignées à phénotype dommageable présentent des caractéristiques phénotypiques spécifiques liées à l’émergence de lymphomes spontanés dont il faudra tenir compte. Un examen journalier des animaux inclus dans les groupes expérimentaux sera effectué pour renseigner dans des fiches de suivi individuelles les premiers signes comportementaux associés à une douleur liée à l’émergence de tumeurs (ataxie, troubles de la respiration, isolement, absence de mobilité ou agitation anormale, modification de l’embonpoint, hérissement des poils, dos voûté…). La sévérité de ces signes sera déterminée selon une grille d’évaluation jointe en annexe qui permettra la mise en place de soins éventuels ou conduira à l’euthanasie des animaux. Les souris seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 animaux maximum par cage. Dans chaque cage nous ajouterons de l'enrichissement (bâtonnets en coton (safe roll), frisottis, cabane en carton)). Les groupes expérimentaux seront réalisés de telle sorte à limiter la présence d’animaux isolés.

Choix des espèces

Les souris sont des mammifères qui sont un modèle représentatif de l’homme et présentant une reproduction rapide, ce qui permet de raccourcir le temps des projets. De plus, les modèles de souris ont été validés dans l'étude de la physiopathologie intestinale car elles développent des tumeurs proches de celles observées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris avec ou sans système immunitaire fonctionnel, traitées à partir de 7 semaines, âge correspondant à leur maturité sexuelle.

Former des techniciens aux gestes de la production de sérum : 1 000 lapins vont être utilisés sur cinq ans pour cet apprentissage, tous tués, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin sert cinq minutes en moyenne, dix au maximum, à des injections intraveineuses et sous-cutanées, à des prélèvements de sang à l'artère de l'oreille sous contention en étant vigile, puis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie sans réveil qui, écrit le porteur, "se termine toujours par la mort de l'animal". Les effets listés vont de la contention anormalement longue aux hématomes et aux saignements prolongés, jusqu'aux premiers signes de réveil pendant le prélèvement cardiaque quand le geste traîne, le technicien étant en apprentissage. Le nombre de lapins utilisés suit le turnover du personnel, et tous sont des lapins déclarés non conformes pour la production de sérum anti-thymocytaire.

Objectifs

Il s’agit d’un renouvellement de projet. Le projet de formation des techniciens animaliers à certains gestes techniques vise à assurer un complément à la formation pratique de base lors de la prise de poste, afin d’assurer le niveau de maîtrise technique requis par la réglementation de la protection animale et par les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Cette formation aux gestes techniques est précédée par une première période de tutorat, avec atteinte progressive d’acquis techniques préalables en matière d’approche, de contention et de réalisation des gestes techniques simples (telles les injections sous-cutanées). Arrivé à un tel stade, la technicité des gestes qui font l’objet du présent projet requiert un minimum de pratique en situation de formation avant de poursuivre et affiner par la pratique en conditions réelle sous tutorat. A la suite d’un turnover important de personnel et à une décision d’augmenter la durée de formation en préalable de la mise en œuvre en production, il a été décidé d’augmenter le nombre d’animaux à utiliser dans la formation aux gestes techniques. Par ailleurs, un raffinement de la technique de prélèvement de sang (prélèvement aux niveaux de l’oreille) est en cours de déploiement et nécessite un nombre d’animaux complémentaires à la DAP initiale. L’objectif de ce projet est également de former nos futurs techniciens aux points limites sur les phases d’injections et de prélèvements.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d'amener les techniciens à acquérir le niveau de maîtrise requis pour les gestes techniques sur le lapin dans le cadre du projet autorisé. La maîtrise technique permet en effet : - de minimiser le risque de douleurs et de stress sur les phases de prélèvements, donc de contribuer à l'objectif de raffinement - de minimiser le risque de pertes de sérum, donc de contribuer à l'objectif de réduction - de répondre aux exigences de qualification au poste exigées par les bonnes pratiques de fabrication (pharmaceutiques)

Procédures

Il s'agit d’injections intra-veineuse et sous-cutanée, de prélèvements sanguins au niveau de l'artère à l'oreille sur des animaux vigiles sur lesquels une contention est assurée pendant toute la durée du prélèvement ; ainsi que des prélèvements par voie intra-cardiaques sur des animaux préalablement anesthésiés avec une solution constituée par un mélange de xylazine et de kétamine. (Anesthésie sans réveil). La durée totale d'utilisation effective d'un lapin est généralement de 5 minutes avec une limite de 10 minutes avant anesthésie sans réveil.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette formation aux gestes techniques (sous tutorat d’un expert technique et/ou d'un tuteur de zone), les nuisances ou effets indésirables pouvant être rencontrés sont les suivants : • Stress et inconfort de l’animal (contention anormalement longue (> à 10 minutes), signes d’agitation de l’animal, halètement prononcé) • Effets directs du prélèvements sanguins (formation d’hématome(s), saignements prolongés) • Observation de premiers signes de phase de réveil (pendant le prélèvement intracardiaque, dans le cas d’une manipulation anormalement longue dû à l’apprentissage du geste technique par le technicien en formation). Comme décrit par ailleurs, les animaux sont euthanasiés en fin de séance de formation, et donc non réutilisés. Ceci permet d'éviter toute complication éventuelle plus tardive

Devenir

L'ensemble des animaux qui intègre ce projet sont utilisés pour la formation du geste technique du prélèvement intra cardiaque qui se termine toujours par la mort de l'animal.

Remplacement

Lors de la première phase de formation avec l’expert technique, les premiers gestes techniques sont effectués sur un modèle alternatif. Toutes les alternatives et étapes préalables au recours à des animaux ont été mises en œuvre : formation préliminaire sous tutorat (expert technique puis tuteur de zone), démonstrations mais il n’est pas possible d’éviter un minimum de pratiques pour les actes techniques décrits dans le présent projet. Une partie des actes techniques décrits dans la demande de projet précédente ont cependant pu être retirés du présent projet.

Réduction

Le nombre d’animaux requis est fonction du nombre d’actes techniques justifiant le recours à l’animal, qui est en réduction ainsi que du nombre de techniciens en prise de poste, qui est variable au cours du temps et non prévisible de façon précise. Une amélioration importante a été mise en œuvre à partir de l’année 2025, avec l’utilisation des animaux déclarés non conformes (exemple : poids insuffisant pour intégrer le protocole de production de sérum anti-thymocytaire (entre 2,0 Kg et 2,5 Kg)) pour la formation. Auparavant, seuls les animaux reproducteurs de réformes étaient utilisés. Mais, à ce jour, ils sont désormais autorisés à être utilisés dans la procédure de production de sérum. Cette évolution permet une utilisation de l’ensemble des animaux élevés et donc une diminution globale du nombre d’animaux à production équivalente. Le nombre d’animaux mentionné dans la présente demande d’autorisation représente un maximum, et ajusté au strict minimum nécessaire. Tous les animaux utilisés à des fins de formation à des gestes techniques spécifiques sont des animaux non conformes pour intégrer le protocole de production de sérum. Aucune utilisation d’animaux élevés à des fins d’utilisation scientifiques n’est prévue.

Raffinement

Une étape supplémentaire théorique préalablement à l’utilisation d’animaux a été ajoutée au process de formation des techniciens (modèle alternatif). L’étape d’utilisation d’animaux à des fins de formation à des actes techniques justifiant le recours à l’animal, est soumise au succès des étapes préalables de formation théorique et pratique, qui incluent une formation préliminaire sous tutorat (expert technique puis tuteur de zone). L’expert technique et/ou le tuteur est/sont obligatoirement présent(s) et, outre son rôle de formateur, est/sont garant(s) du respect de l’animal utilisé. Selon la difficulté du geste et le niveau d’habilité de la personne formée, l’expert technique ou le tuteur décide ou non de débuter la formation sous anesthésie sans réveil (il s’agit exclusivement d’animaux non conformes pour intégrer le protocole de production de sérum. Dans le cadre du prélèvement oreille, une crème anesthésique locale sera appliquée au préalable afin de réduire la douleur de l’animal. La formation au geste technique d’injection « sous-cutanée », se fera dans un premier temps sur animal mort (exemple : sur un animal post prélèvement intracardiaque). Avec pour objectif de limiter l’utilisation d’un animal vigile pendant le temps de la formation du technicien animalier, et de s’assurer ainsi de la maîtrise de ce geste technique avant passage sur un animal vigile. Une évolution de la technique de prélèvement au niveau de l’artère de l’oreille (corps de prélèvement + aiguilles remplacées par une aiguille épicrânienne) est actuellement en cours de déploiement progressif, et nécessite l’utilisation d’animaux de formation afin de maîtriser ce nouveau geste technique avant le déploiement dans les unités de production. Cette nouvelle technique permettra de réduire le stress de l’animal pendant la phase de prélèvement (pas de contention nécessaire). Ce geste est également moins contraignant pour le technicien car il ne nécessite pas de maintien de l’aiguille tout au long du déroulement du prélèvement. La technique de prélèvement avec aiguille épicrânienne ne sera peut-être pas applicable à l’ensemble des souches hébergées dans l’EU (spécificité de poids/vascularisation souche-dépendant).

Choix des espèces

L'espèce utilisée est celle avec laquelle le technicien sera amené à travailler dans le cadre du projet autorisé sur le site de l'EU. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont des lapins jeunes adultes (à partir de 15 semaines) et adultes (reproducteurs de réforme) mâle et femelle, correspondant au stade physiologique rencontré dans notre activité de production. Ce choix permet aux techniciens d'être formés sur des animaux présentant les caractéristiques anatomiques, comportementales et physiologiques qu'ils rencontreront lors de leurs activités professionnelles.