Procédures modérées
Vectorisation d’acides ribonucléiques circulaires à visée thérapeutique EU1/2 MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Des souris femelles de cinq semaines, choisies parce que le projet porte sur le lymphœdème qui suit la chirurgie du cancer du sein, elles sont 370, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Une opération d'une vingtaine de minutes sous anesthésie leur provoque un lymphœdème, puis trois injections dans le derme leur administrent des vecteurs à ARN circulaires censés faire repousser les vaisseaux lymphatiques. Le porteur reconnaît que la chirurgie et le lymphœdème provoquent des douleurs modérées. Les souris sont ensuite transportées vers un second établissement où on les tue pour prélever les tissus, une modification que le porteur présente comme se faisant sans ajout d'animaux.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué́ dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphœdème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphœdème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude récente menée au laboratoire , notre équipe a montré que l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques permettant la production de facteurs lymphangiogéniques permettait d’améliorer la résolution du lymphoedème sur une durée courte. Dans cette étude, nous nous appuierons sur les résultats déjà obtenus par notre équipe et testerons l’efficacité d’une nouvelle génération de vecteurs à acides ribonucléiques développés au laboratoire. Ces nouveaux vecteurs produiront les mêmes facteurs lymphangiogéniques mais basés sur une nouvelle technologie qui permet de produire des lentivecteurs contenant des acides ribonucléiques thérapeutiques circulaires. La particularité des acides ribonucléiques circulaires est d’être beaucoup plus stable que les acides ribonucléiques linéaires utilisés dans nos études précédantes et devraient ainsi permettre une expression prolongée des molécules thérapeutiques. Le bénéfice attendu sera une meilleure efficacité et un effet renforcé par rapport aux résultats obtenus précédemment. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs. La réalisation de la dernière étape des procédures dans un 2eme établissement utilisateur nécessite la modification d’un projet initial autorisé sans ajout d’animaux
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’évaluer l’utilisation de lentivecteurs à acides ribonucléiques circulaires pour la première fois in-vivo et de faire la preuve du concept de leur utilisation. Les données obtenues au cours de ce projet et comparées à celles obtenues dans nos études précédantes visent à démontrer que cette nouvelle génération de vecteurs possède un avantage thérapeutique en permettant une expression prolongée du vecteur et des molécules thérapeutiques produites.
Procédures
Les animaux subiront une chirurgie sous anestésie générale d'une durée d'envion 20 minutes, 3 injections intradermiques lors d'une même anesthésie générale soit une durée d'envion 5 minutes. Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subissent des injections intradermiques et une procédure chirurgicale (15 min par animal) . Dans le second établissement utilisateur, les procédures terminales sont réalisées
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de lymphœdème vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux seront euthanasiée à l'issue de chaque procédure afin de collecter les échantillons nécessaires à l'étude.
Remplacement
Les données relatives à l’expression du vecteur ont été évaluées in-vitro (culture de cellules) mais ne sont pas suffisantes pour évaluer le niveau d’expression et la durée d’expression dans un contexte intégré in-vivo (implication de la réponse immunitaire en particulier). Par ailleurs, Le développement du lymphœdème fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche intégrée permettant de comprendre les interactions complexes entre le vecteur et l’hôte (souris). Par ailleurs l’approche in-vivo seule permet d’évaluer le bénéfice thérapeutique des molécules exprimées dans le cadre du lymphoedème et la restauration de la fonction endothéliale lymphatique. Le lymphœdème fait intervenir de nombreux acteurs cellulaires (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux…) ; il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permette de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre de l’étude et du traitement du lymphœdème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport)
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris afin de pouvoir obtenir des résultats comparables et à mettre en perspective par rapport à ceux obtenus dans nos études précédentes dans lequel le même modèle de souris a été utilisé. L’utilisation d’une autre espèce ferait perdre tout le bénéfice des données précédemment obtenues et ne permettrait pas d’évaluer le bénéfice attendu produit par les nouveaux vecteurs à ARN circulaires Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.
Suivi de la franchissabilité de la passe à poissons n°1 nouvellement aménagée dans un grand fleuve
- Protection de l’environnement
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
5 000 poissons de douze espèces, du goujon au silure, subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré avant d'être remis dans le fleuve. Chacun est pêché, anesthésié trois à cinq minutes, mesuré, pesé, ouvert sur trois à cinq millimètres du ventre pour y glisser une puce, et maintenu hors de l'eau jusqu'à une minute. La moitié des individus capturés en amont est transportée en aval de la passe avant d'être marquée, pour ne suivre que des poissons enclins à remonter. Le porteur reconnaît que certains perdront leur puce et que des femelles peuvent l'expulser en se reproduisant, et écrit qu'il est "indispensable" de réaliser ce suivi pour savoir s'il faut améliorer l'ouvrage.
Objectifs
Suite à différents aménagements au niveau des fleuves ou de cours d'eau plus petits, la migration des poissons n'est plus possible. Ainsi des "passes à poissons" sont mises en place pour aider le passage des poissons au niveau de ces ouvrages et ainsi permettre notamment leur reproduction. L'objectif de ce projet est de vérifier l'efficacité d'une "passe à poisson" nouvellement installée en suivant le passage des individus au travers de celle-ci. Pour ce faire, un éventail des poissons représentatifs du cours d'eau correspondant est pêché par différentes techniques. Les caractéristiques des poissons sont rapportées (taille, poids, sexe) sous-anesthésie générale et une puce, dont la taille est adaptée aux mensurations du poisson est implantée dans la cavité abdominale par chirurgie. Le poisson est ensuite remis en eau sous surveillance avant d'être relâché. Le poisson portant la puce pourra être détecté s’il passe au travers de la passe à poissons, ce qui permettra de vérifier que l'aménagement réalisé est bien efficace pour permettre le passage des individus au travers de l'ouvrage.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de vérifier l’efficacité de la passe à poissons pour les espèces présentes. Il est indispensable de réaliser ce type de suivi biologique en milieu naturel pour vérifier s’il est nécessaire de réaliser des travaux d’amélioration de la passe à poissons, pour que les poissons puissent librement circuler.
Procédures
Après anesthésie générale pendant 3 à 5 minutes, les animaux seront mesurés puis pesés, puis une incision ventrale de 3 à 5 mm sera réalisée et une puce électronique sera implantée manuellement sur 5000 poissons. Ces interventions nécessiteront de maintenir les poissons entre 30 secondes et une minute hors d’eau.
Impact sur les animaux
La capture, le transport, la stabulation et le marquage sont autant d’étapes nécessaires à l’étude et susceptibles d’induire un stress modéré sur les animaux. Il existe également un risque de douleur légère post-anesthésie suite à l’incision.
Devenir
Tous les individus seront replacés dans leur habitat naturel
Remplacement
Le modèle biologique ne peut être remplacé pour cette étude comportementale qui implique de travailler nécessairement sur des individus vivants dans leur milieu naturel. L'évaluation du franchissement d’un aménagement (ici une passe à poissons) doit obligatoirement être réalisée in situ en étudiant le comportement migratoire des espèces considérées.
Réduction
L’effectif prévu est un minimum (règle des 3 R : réduction) pour pouvoir décrire les comportements des poissons par espèce et par stade, et évaluer la franchissabilité de la passe à poissons. Il est adapté au gabarit du milieu (grand fleuve) et à la diversité spécifique et la densité de population. L’effectif tient compte de plusieurs facteurs, pour garantir un certain nombre de détections : - L’implantation des puces ne génère en principe pas ou très peu de mortalité post-opératoire en respectant les préconisations de tailles minimales. Toutefois, certains individus peuvent perdre leur puce dans les semaines suivant l'implantation. - Certaines femelles peuvent également expulser la puce lors de la reproduction. Tous les individus d'une même espèce ne vont pas forcément migrer. Les individus pêchés en amont de la passe à poissons (50%), seront transportés en aval de la passe, où ils seront pucés puis relâchés, de manière à privilégier l'étude sur des individus enclins à migrer et in fine réduire le nombre d'individus marqués. Il n'est pas prévu d'analyses statistiques dans le cadre de cette étude comportementale menée en milieu naturel, en-dehors des statistiques descriptives (taux de franchissement, durée moyenne de franchissement).
Raffinement
Le raffinement des procédures sera pris en compte de la capture des animaux jusqu’au relâcher dans leur milieu naturel. Le maintien des conditions thermiques et d’oxygénation optimales sera assuré. Les animaux capturés seront soit stockés dans un vivier placé dans la rivière, soit dans un bac oxygéné et refroidi. Ainsi, la teneur en oxygène et la température seront constantes. La solution d'anesthésie sera renouvelée toutes les 30 minutes, pour éviter que la température du bain n’augmente et soit toujours suffisamment fraiche pour éviter le stress des poissons et l’altération de l’efficacité de l’anesthésiant. En outre, l’accent sera mis sur la rapidité d’exécution des mesures biométriques et du marquage pour réduire le temps d’anesthésie, sachant que les poissons seront maintenus hors d’eau pendant toute la durée de la prise des mesures biométriques et marquages. La taille des puces sera adaptée à la taille de l’animal. Un chiffon humide sera placé au niveau de la tête de l’animal et la règle de biométrie sera humidifiée en permanence pour éviter d’ôter le mucus. Seuls les individus jugés visuellement en bonne santé seront marqués, les autres seront relâchés sans marquage, après stabulation. Aucun antibiotique ne sera utilisé, par contre une pommade iodée antiseptique sera appliquée au niveau de l’incision. Le réveil sera contrôlé dans un vivier placé dans la rivière. L’application de points limites stricts et spécifiques du projet limitera les risques de douleur tout au long de la procédure.
Choix des espèces
12 espèces de poissons sont ciblées et sont représentatives du fleuve et de la zone concernée : - Poissons d’eau courante : barbeau fluviatile, hotu, chevaine, goujon, spirlin, chabot - Cyprinidés d’eau calme : brème, gardon, ablette - Carnassiers : Brochet, silure, perche 2 stades de développement sont retenus : juvéniles et subadultes-adultes. Les juvéniles peuvent migrer à la recherche d’habitats plus favorables ; les adultes migrent avant et/ou après leur reproduction. Au total, les juvéniles représentent environ 17% de l’effectif marqué, le reste étant des subadultes et adultes, qui sont les stades préférentiellement ciblés. Les plus petits individus seront relâchés sans être marqués.
Neuroprotection des motoneurones de la moelle épinière dans des modèles SLA : mécanismes et biomarqueurs thérapeutiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Constituer le dossier d'une demande d'essai clinique de phase I/II, voilà à quoi vont servir 1 732 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles portent trois lignées transgéniques de sclérose latérale amyotrophique, dont l'une où la souffrance s'installe à l'âge adulte et s'aggrave pendant trois à quatre mois. Chacune reçoit une injection dans le canal rachidien sous anesthésie, puis passe dix à quinze fois quatre tests moteurs, préhension, endurance musculaire, extension des membres et coordination. Le porteur indique que les organismes de réglementation demandent spécifiquement un modèle in vivo, et renvoie au conditionnel le bénéfice pour des patients dont l'espérance de vie reste inférieure à cinq ans après le diagnostic.
Objectifs
Les motoneurones (MNs) de la moelle épinière contrôlent les mouvements volontaires ainsi que la respiration. Dans la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA), ces cellules dégénèrent ce qui entraîne des troubles moteurs. Nous avons identifié une protéine exprimée et sécrétée par les interneurones qui est importante pour la survie des MN. Une injection intrathécale de cette protéine synthétisée au laboratoire permet de bloquer la neurodégénérescence pendant 3 mois, et son injection répétée permet de maintenir l’effet neuroprotecteur sur une durée plus longue. En utilisant trois lignées transgéniques murines validées de la SLA présentant des impacts progressifs sur la survie des motoneurones nous testerons l’effet neuroprotecteur de la protéine recombinante à court, moyen ou plus long terme, en analysant en parallèle le comportement ainsi que les données physiologiques et histologiques des animaux transgéniques et des groupes contrôles appropriés, soit un total de 1732 souris.
Bénéfices attendus
La prévalence des maladies neurodégénératives est en constante augmentation à l’échelle planétaire. En France, la SLA affecte actuellement 5000 à 7000 patients, avec une incidence annuelle proche de 2,5 pour 100 000 habitants. Chez les patients atteints de SLA, les motoneurones (MN) de la moelle épinière contrôlant les mouvements volontaires ainsi que la respiration dégénèrent, ce qui entraîne des troubles moteurs. Cette maladie est progressive et fatale. L’espérance de vie des patients est en général inférieure à 5 ans après établissement du diagnostic. A ce jour, il n’existe pas de traitement pour cette pathologie. En plus de la lourde souffrance pour les patients et leurs proches, le coût de prise en charge pour la santé publique est important. Une protéine recombinante humaine promeut la survie des MN. Ce projet évaluera l'activité de cette protéine dans plusieurs modèles animaux de la SLA. Il permettra notamment d'étudier les biomarqueurs putatifs et d'évaluer l'activité de la protéine par l'analyse d'échantillons de plasma. L’ensemble de ces expériences est d’une importance critique pour permettre la soumission d’une demande d’essai clinique de Phase I/II.
Procédures
Une injection intrathécale sera effectuée sur des animaux anesthésiés ; cette procédure chirurgicale dure environ 15 minutes et sera effectuée une seule fois. Des évaluations de la capacité motrice par 4 tests moteurs seront réalisées 10-15 fois sur animaux vigiles. Les animaux seront soumis à un test de préhension qui durent 2 minutes, un test d’endurance musculaire qui durent 3 minutes, un test d’extension des membres qui durent
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale, ceci pouvant se traduire par une activité/mobilité réduite, une posture voûtée, des problèmes digestifs, une hyperactivité, et des difficultés respiratoires. Les modèles de souris SLA utilisés dans ces expériences perdent progressivement leur capacité motrice à des moments bien définis et prévisibles. Pour le premier modèle, les phénotypes durent plusieurs mois, sont modérés et se déclenchent uniquement après induction. Pour le deuxième modèle, la souffrance est légère et s’installe dans la durée à l’âge adulte. Pour le troisième modèle, la souffrance se déclenche à l’âge adulte et devient de plus en plus sévère pendant 3 à 4 mois.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau, moelle épinière et muscles seront collectés afin de permettre des analyses histochimiques.
Remplacement
L’identification des biomarqueurs affectés par la PER pour utilisation dans des essais cliniques nécessite des modèles animaux de la SLA. Les organismes de réglementation demandent spécifiquement un modèle in vivo de la SLA pour la validation de PER en tant que cible thérapeutique.
Réduction
Les procédures ont été optimisées afin de minimiser le nombre d’animaux à utiliser, grâce notamment à une réalisation séquentielle de nos expériences évitant l’initiation de travaux avant la caractérisation complète des outils et méthodes utilisés. Nous utiliserons mâles et femelles ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à générer dans le cadre de l’élevage maintenu au sein de notre animalerie. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à une injection intrathécale suivie de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de définir le nombre d’animaux par condition expérimentale afin d'obtenir une puissance statistique satisfaisante. Nous effectuerons plusieurs analyses et/ou prélèvements sur chaque souris, ce qui nous permettra de réduire davantage le nombre d'animaux.
Raffinement
Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine, pour éviter le stress de l'isolement, et sont observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours avec alimentation plus riche. Pour évaluer les points limites, les animaux seront inspectés quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciale), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront une alimentation enrichie. Les animaux à mobilité réduite auront de la nourriture et de l’eau au sol pour leur faciliter l’accès.
Choix des espèces
La souris est majoritairement utilisée dans le domaine des maladies neurodégénératives. Son utilisation permet une comparaison directe des résultats obtenus avec les données disponibles dans la littérature scientifique. De plus, un grand nombre de modèles de SLA ont été caractérisés chez la souris. La génétique de la souris est très documentée et proche de l’homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour nos travaux visant à préparer une demande d’essai clinique. La SLA est une maladie neurodégénérative mortelle qui affecte de nombreux systèmes chez l'homme. Il a été démontré que les modèles murins récapitulent un certain nombre de ces caractéristiques. Les souris présentent une atteinte multi-systémique, notamment du cerveau, de la moelle épinière, des jonctions neuromusculaires et des muscles, ce qui en fait un bon modèle pour l'évaluation d'agents thérapeutiques potentiels pour la SLA. Ce projet vise à caractériser le rôle neuroprotecteur de PER dans des modèles murins adulte de la maladie SLA étant donné que cette maladie neurodégénérative se déclare normalement chez l’adulte. La maladie sera déclenchée à 2 mois d’âge dans le modèle choisi. Nous prévoyons donc d’injecter la PER après ce stade afin d’évaluer sa capacité à bloquer le phénomène de dégénérescence progressive des motoneurones.
Développement et caractérisation des effets d’un nouveau traitement innovant de la maladie d’Alzheimer à l’aide de modèles murins.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour accumuler dans leur cerveau les protéines de la maladie d'Alzheimer, les souris de ce projet développent vers six à huit mois des lésions entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs et un amaigrissement. 1 284 souris vont être utilisées, 924 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une biopsie de queue au génotypage, puis jusqu'à dix-neuf administrations intranasales sous anesthésie, une à trois séances d'imagerie de trois heures et des tests de mémoire dont une épreuve de nage. Toutes sont tuées à six ou sept mois pour prélever le cerveau, le porteur ajoutant qu'elles ne pourraient de toute façon pas être placées ni réutilisées du fait de leur modification génétique.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui, en raison du vieillissement croissant de la population, est devenue un problème majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients, qui se propagent d’une région cérébrale à l’autre et se dépose sous forme de plaques ou s’agrège à l’intérieur des neurones. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose sur l’existence d'une barrière sang-cerveau qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau, cependant, elle rend aussi difficile le passage de molécules thérapeutiques. Ces dernières années, une technologie de petites molécules thérapeutiques, appelée nano-anticorps a été développée, avec un potentiel plus élevé pour traverser cette barrière, diffuser et atteindre ces cibles dans le tissu cérébral. Une approche complémentaire pour contourner cette barrière, consiste à administrer les médicaments par voie nasale. En effet, certaines zones situées à l’avant du cerveau, près du bulbe olfactif (zone du cerveau impliqué dans l’odorat), au-dessus des fosses nasales, offrent un passage plus accessible grâce à de petites ouvertures dans l’os du crâne et permettent ainsi la pénétration accélérée de molécules thérapeutiques. Par ailleurs, il existe des types de matériaux particuliers appelés thermogel qui à température ambiante sont liquides, ce qui les rend faciles à appliquer et qui au contact de la chaleur du corps, se transforment en gel. Cette transformation permet au médicament de rester en place et d’être libéré progressivement sur plusieurs heures. Cela en fait une excellente option pour ce projet, car ils aident les petites molécules thérapeutiques, comme les nano-anticorps, à adhérer à la muqueuse nasale et à atteindre le cerveau plus efficacement. En résumé, ce projet vise à évaluer la combinaison de ces différentes technologies pour le traitement de la maladie d’Alzheimer. Des nano-anticorps visant les agrégats de protéines seront diffusés à partir de thermogels appliqués dans les fosses nasales. Nous déterminerons si cette stratégie, testée chez l’animal modèle de maladie d’Alzheimer (souris génétiquement modifiées pour reproduire des accumulations de protéines), permet de freiner la propagation des lésions et d’améliorer les capacités de mémoire des animaux traités.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à évaluer une stratégie thérapeutique innovante pour le diagnostic et le traitement de la maladie d’Alzheimer. Si les résultats s’avèrent concluants cela pourrait contribuer à évaluer cette nouvelle méthode de diagnostic de la maladie et cette nouvelle stratégie thérapeutique chez l’homme. Ainsi, à plus long terme, ces recherches pourraient donc permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes pour les patients et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Tous les jeunes souriceaux produits auront un prélèvement, à l’état vigile, d'un fragment de l’extrémité de la queue pour définir leur patrimoine génétique (moins d’une minute par animal, une fois). Une partie des animaux recevra une seule administration de notre thérapie ou son contrôle. Cette administration sera réalisée (durée de l’administration : 45 secondes environ) sous anesthésie générale pour une durée de maximum 5 minutes Pour une partie de ces animaux des séances d’imagerie par résonance magnétique (IRM) seront effectuées avant et, ou, après l’administration : 1 à 3 séances d’IRM (3 heures maximum par séance, à 44h d’intervalle minimum), le tout sous anesthésie générale. Si la mise en place du thermogel est validée sur les procédures précédentes, une autre partie des animaux recevra plusieurs administrations de notre thérapie ou son contrôle (19 administration au total, durée de chaque administration : 45 secondes environ), le tout sous anesthésie générale (durée de maximum 5 minutes).Ces animaux réaliseront ensuite des tests comportementaux visant à évaluer leur mémoire (des objets et des lieux) : 2 tests répartis sur une durée de 9 jours. Le premier test sera composé de 3 essais de 10 minutes répartis sur 3 jours, et le deuxième test consistera en 4 essais par jour pendant 5 jours (essais de 90 secondes maximum) puis 1 essai de 90 secondes maximum le sixième jour. A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés par une méthode règlementaire.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent des signes cliniques et développent vers l’âge de 6 à 8 mois (parfois plus tôt) des lésions cérébrales entraînant une paralysie partielle des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement. Les animaux ressentiront une légère et brève douleur au moment du prélèvement du fragment de queue pour définir leur patrimoine génétique. Un léger saignement est à prévoir. Les administrations et examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie générale et donc sont associés aux risques anesthésiques suivants : risque d’hypothermie, risque de déshydratation et risque d’anomalies cardiaques et respiratoires. Le risque sera très faible pour les administrations puisque la durée d’anesthésie sera inférieure à 5 minutes. Les administrations pourront générer une légère douleur et un inconfort et possiblement des saignements locaux limités. Les tests comportementaux impliqueront un stress lié au placement dans un nouvel environnement et un risque d’hypothermie lorsque l’animal sera mouillé.
Devenir
A l’issue de toutes les procédures, l’ensemble des animaux seront euthanasiés d’une part pour le prélèvement de leurs cerveaux post-mortem à visée d’analyse et d’autre part parce qu’ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leur modification génétique.
Remplacement
L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. En effet les études in vitro, dans des cellules, ne permettent pas d’évaluer l’effet de thérapies sur des fonctions complexes (comme la mémoire ou d’autres fonctions mentales). Dans le cadre de ce projet les études vitro ont permis de sélectionner les meilleurs agents thérapeutiques à tester sur l’animal. Par ailleurs les travaux sur les modèles souris qui miment les lésions et les symptômes de la maladie humaine ont permis ces dernières années des avancées importantes dans le domaine thérapeutique, notamment le développement d’anticorps qui ont ensuite été testés avec succès chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux pour ce projet (1284 souris) est réduit au maximum. Nous piloterons notre élevage de manière raisonnée afin de ne produire que le nombre d’animaux nécessaire pour nos lots expérimentaux et nos recherches. La taille des groupes d’animaux utilisés pour les études a été définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature. Les résultats seront analysés avec les tests statistiques appropriés. Les animaux surnuméraires produits seront cédés, dans la mesure du possible, pour être utilisés dans d’autres projets.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans un établissement agréé, dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement (coton ou kraft pour faire un nid, bâtonnets de bois à ronger, maisonnettes). Un programme de suivi rapproché des lignées de souris modèles de maladie d’Alzheimer est mis en place afin de détecter l’apparition de symptômes cliniques liés à la modification génétique. Ce suivi sera réalisé à partir de 5 à 6 mois en fonction de la lignée et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées. Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir le plus précocement possible pour minimiser toute souffrance animale. La biopsie de queue pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera de la plus petite taille possible, elle sera réalisée dans un endroit calme et le petit sera replacé immédiatement après le geste avec sa mère et le reste de la portée. Il sera surveillé immédiatement puis environ 30 minutes après pour s’assurer qu’il ne saigne pas et qu’il soit bien pris en charge par sa mère. Pour prendre en charge les différents risques liés à l’anesthésie générale des animaux plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-anesthésie sera également mise en place. Pour vérifier l’innocuité et la tolérance de nos administrations intranasales, nous ferons un suivi rapproché des animaux traités afin d’assurer une prise en charge rapide des éventuelles gênes ou douleurs qui pourraient être visibles avec l’avis du vétérinaire. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur des comportements spontanés et innés de l’animal, n’impliquant pas de stress majeur. Nous réaliserons des périodes d’habituation à l’expérimentateur et au nouvel environnement avant les tests pour minimiser le stress induit. Pour l’épreuve de nage les essais seront espacés d’une heure minimum pour minimiser la fatigue motrice (pas d’épuisement des animaux) et le risque d’hypothermie sera minimisé par le séchage régulier des souris.
Choix des espèces
Les souris sont des modèles particulièrement pertinents et largement utilisés dans la recherche, notamment pour l’étude du système nerveux. Leur génome est connu et de nombreux outils sont disponibles pour le modifier, permettant ainsi d’introduire des mutations génétiques spécifiques pour la modélisation de pathologies humaines. Dans le cadre de notre projet 2 lignées transgéniques d’intérêt nous permettront de mener à bien nos recherches. Nous utiliserons ces souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Les animaux produits seront prélevés pour connaitre leur patrimoine génétique à l’âge de 7 à 10 jours après leur naissance. Cet âge est choisi car il permet de bénéficier de la cicatrisation rapide observée chez les jeunes animaux et de connaitre très tôt leur génotype. Toutes les expérimentations visant à évaluer notre thérapie seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les administrations seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 2 à 7 mois). Dans le cadre diagnostique, les administrations intranasales et examens d’imagerie associés seront initiés à 6 ou 7 mois (lésions denses). Les traitements thérapeutiques seront eux initiés à 2 ou 3 mois (début des lésions) sur une durée de 4 mois avant évaluation comportementale. L’euthanasie des animaux sera réalisée à l’âge de 6,2 ou 7,2 mois. L’évolution des lésions pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.
Etude de la formation des cellules responsables de la réponse immunitaire médiée par les anticorps
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Gavées à deux et trois jours de vie, amputées d'un fragment de queue entre le cinquième et le onzième jour, puis soumises adultes à une injection et à six prélèvements sanguins, 1 968 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 240 d'entre elles et modéré pour 1 728. Toutes sont tuées à la fin pour analyse. Le porteur précise que seule l'injection sous-cutanée se fait sous anesthésie, les autres gestes étant pratiqués sur animal vigile parce qu'ils sont courts et maîtrisés par l'opérateur. Il justifie l'effectif par la seule affirmation d'avoir retenu le minimum permettant des résultats statistiquement significatifs, sans donner ni calcul ni taille de groupe.
Objectifs
La production d’anticorps protège contre des pathogènes mais provoque aussi l’autoimmunité, comme la maladie de Sjögren ou l’arthrite rhumatoïde. La production d’anticorps implique un type de cellule particulier, appelé cellules dendritique folliculaire, qui se retrouve dans les ganglions lymphatiques et la rate. L’origine de ces cellules et leur mécanisme de différenciation ne sont pas bien connus, ce qui empêche la découverte de nouveaux médicaments contre ces maladies autoimmunes. Ce projet vise à mieux comprendre l’origine de cette cellule et à étudier l’implication d’un récepteur, qui pourrait alors être ciblé par de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur le développement du système immunitaire et la réponse immune. Etant donné que la protéine étudiée est actuellement ciblée en thérapie contre la sclérose en plaque, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’auto-immunité.
Procédures
Des souris nouveau-nés sont soumises à un gavage à jour 2 et à jour 3 (durée < 1 min). Les juvéniles (entre jour 5 et jour 11 après naissance) sont soumis à une biopsie de queue pour déterminer une mutation génétique (durée < 1 min). Les souris adultes sont soumises à une injection (durée < 1 min) et à 6 prélèvements de sang (durée du prélèvement < 2 min). L’injection par voie sous-cutanée s’effectue sur animal anesthésié. Les autres interventions se feront sur animal vigile car il s'agit de gestes courtes et qui sont parfaitement maitrisés par l'opérateur.
Impact sur les animaux
Le gavage, l’injection des produits et le prélèvement sanguin peuvent être source de stress et de l’anxiété pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation peut conduire à une inflammation au site d’injection.
Devenir
Mise à mort de toutes les animaux à fin du projet pour analyse post-mortem
Remplacement
Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le développement du système immunitaire ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.
Réduction
Les sites et la fréquence des interventions ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible stress ou inconfort sont entrepris. Les point limites ont été mis en place et seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour connaitre l’origine des cellules dendritiques folliculaires et tester la fonction d’un récepteur dans leur formation. Ce projet nécessite alors une bonne connaissance des organes lymphoïdes, les ganglions et la rate, où se trouvent ces cellules. Chez la souris, les structures des ganglions et de la rate sont bien connues et en plus sont identiques à l’homme. De plus, la souris étant bien étudiée du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour ces travaux qui reposent sur des modifications génétiques. Les souris sont étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des nouveau-nés ont également été choisis, pour mieux étudier le développement le du système immunitaire impliquant la formation des cellules folliculaires dendritiques.
Utilisation de faibles doses d’interleukine 2 dans un modèle murin d’autisme médié par une activation immunitaire maternelle pendant la grossesse
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
210 souris vont être utilisées, 150 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue pour prélèvements et 60 femelles réutilisées dans d'autres accouplements ou d'autres projets. Trente femelles gestantes reçoivent une injection destinée à activer leur système immunitaire, pour que leur descendance développe un phénotype autistique. Une partie des 180 petits reçoit ensuite de la vitamine D dans son alimentation pendant six semaines et passe un test comportemental de quatorze heures, l'autre partie est opérée sous anesthésie et tuée sans réveil. Le porteur écrit que le projet répond aussi à la "nécessité" d'obtenir des données complémentaires in vivo en vue d'une publication, ce qui rend selon lui l'utilisation d'animaux "indispensable".
Objectifs
Les troubles du spectre autistique (TSA) touchent une personne sur 100. Il s’agit d’un trouble neurodéveloppemental caractérisé par des anomalies de la communication sociale ainsi que des comportements stéréotypés et des intérêts restreints. Cependant, derrière cette définition générale se trouve un spectre clinique large et hétérogène. Récemment, la piste d’une activation du système immunitaire de la mère durant la grossesse (MIA) a été suspectée par des études épidémiologiques puis confirmée par des modèles animaux. Grâce à une collaboration étroite entre psychiatres et immunologistes, des données cliniques combinées avec des modèles animaux, nous permettrons de mieux comprendre les toubles autistiques des patients. En effet, dans notre projet,nous allons développer des modèles murins d’autisme liés à une MIA afin de mieux comprendre et de caractériser expérimentalement les conséquences de ces modifications neuro-immunologiques in vivo. Nous examinerons également le comportement de ces modèles animaux. Nous explorerons donc, sous des angles très divers, les relations entre immunologie et susceptibilité aux troubles du spectre autistique.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont multiples: 1- Permettre une meilleure compréhension des mécanismes pathologiques en lien avec l'immunité dans le champ de l'autisme 2- Identifier des sous-groupes homogènes de patients à l'aide de biomarqueurs diagnostiques 3- Développer une prise en charge thérapeutique spécifique pour ces patients
Procédures
Dans le cadre de ce projet, des femelles gestantes recevront une injection (animal vigile, 1 fois, quelques secondes) afin d’induire le modèle de troubles du spectre autistique dans la descendance qui sera étudié. Une partie de la descendance recevra une injection (animal vigile, 1 fois, quelques secondes) ou une supplémentation en vitamine par l'alimentation à visée thérapeuthique (animal vigile, 6 semaines en continu) et suivra un test comportemental non stressant (animal vigile, 1 fois, 14h avec enrichissement, accès à l'eau et la nourriture et en groupe). L'autre partie sera soumise à une chirurgie sans réveil (animal sous anesthésie et analgésie, 1 fois, 5 minutes) a des fins de meilleurs compréhension des mécanismes pathologiques.
Impact sur les animaux
L'injection d'une molécule pourra induire une douleur légère de courte durée aux femelles gestantes et va induire un phénotype de comportement autistique dans la descendance. Le changement de régime pourra induire une baisse de la consommation alimentaire de manière transitoire en raison de la néophobie du modèle animal. Une partie des animaux aura une chirurgie sans réveil. L'anesthésie lors de cette chirurgie pourra entrainer une hypothermie ou encore une détresse respiratoire. L'autre partie des animaux recevra une injection et suivra un test comportemental. L'injection peut induire un stress et une douleur légère de courte durée. Le test comportemental peut générer un stress transitoire.
Devenir
Une partie des femelles impliquées et produites dans le projet pourra être réutilisée. Les autres animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements nécessaires pour des analyses.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement du cerveau et la mise en place des processus comportementaux de socialisation. Ils sont donc nécessaire dans la mise en oeuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans les processus d'interactions sociales. Ce projet répond également à la nécessité d'obtenir des données complémentaires in vivo en vue d'une publication, rendant l'utilisation d'animaux indispensable.
Réduction
Au total 30 femelles et 180 petits de la descendance seront utilisés pour ce projet. Le nombre total d’animaux impliqués sera réduit au minimum. Les 15 mères n'ayant pas reçu d'injection induisant de l'inflammation, seront réutilisées pour d'autres accouplements programmés. De plus les 45 femelles issues de mère contrôle pourront être réutilisées dans d'autre projets. Concernant les tests comportementaux nous avons utilisés le nombre minimum d'animaux afin d'assurer la fiabilité des résultats avec une puissance suffisante. Par ailleurs, dans la suite, seuls les males seront utilisé pour la biologie et le comportement.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les injections sont réalisées rapidement par du personnel formé afin de limiter le stress des animaux. Les croquettes supplémentées en vitamine D sont de consistance normale et ne nécessite donc pas d'enrichissement particulier. Le système du test comportemental permet de maintenir les animaux en groupe ce qui réduit aussi le stress des animaux en procédure. La procédure chirurgicale sera effectuée sous anesthésie et analgésie et elle sera sans réveil. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
La souris est un modèle validé en immunologie et particulièrement pour les études de développement de nouvelles immunothérapies. De plus, les comportements pro-sociaux de la souris commencent à être de mieux en mieux connus, même si les aspects liés à la communication chez ce modèle demandent à être approfondis, elle représente un modèle de choix pour l'analyse des comportements autistiques Les femelles seront utilisées entre 10 et 12 semaines pour la reproduction, à cet âge les femelles sont robustes et fertiles. Afin de compléter nos précédents résultats les mâles seront ensuite utilisés entre 8 semaines pour compléter nos précédents résultats et assurer la reproductibilité et 24 semaines afin de completer nos résultats pour évaluer le maintien de l'éfficacité clinique à long terme
Inflammation et autophagie : etude de la modulation de l’inflammation et l’autophagie sur la perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE) et les transformations hémorragiques lors des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées pour des analyses post-mortem du cerveau, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réparties en vingt-quatre groupes de trente. Chacune subit une craniotomie de soixante-dix minutes pour accéder à l'artère cérébrale moyenne et provoquer un accident vasculaire ischémique, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie, à 24 heures et à cinq jours. Trente souris âgées de dix-huit mois sont incluses pour observer l'effet du vieillissement. Le porteur affirme que des techniques de remplacement n'apporteraient pas le même niveau d'information et présente la souris comme le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l'espèce.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre comment l’inflammation et certains mécanismes cellulaires favorisent la fragilisation des vaisseaux cérébraux et les saignements lors des AVC ischémiques. En utilisant des inhibiteurs ciblant l’inflammation et les réponses cellulaires, nous analyserons leur impact sur la fragilité des vaisseaux après un AVC. Nous étudierons aussi le rôle d’une protéine produite par les cellules des vaisseaux sanguins en cas de stress ischémique, ainsi que l’influence du vieillissement. Ce dernier étant un facteur de risque clé dans les AVC, régulant les mécanismes cellulaires d’intérêts dans cette étude. Ce projet vise à mieux comprendre ces mécanismes pour proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour les traitements de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes impliqués dans la perméabilité de la BHE et les transformations hémorragiques après un AVC ischémique afin de pouvoir proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie permettant l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 70 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à des acquisitions par imagerie par résonnance magnétique (IRM) à 24h et 5 jours après l’induction de l’AVC, sous anesthésie générale. Une partie des animaux seront soumis à la pose de cathéters intraveineux, et une autre partie des animaux recevront des injections intrapéritonéales.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effet indésirables étant susceptibles d'apparaître chez les animaux seraient : - une perte de poids anormale (nuisance modérée associée à l'état post chirurgie) - des douleurs post-chirurgie (nuisance modérée associée à la chirurgie) - du stress induit par les déplacements des cages, la chirurgie, la manipulation des animaux par l'expérimentateur, les situations de réveil (nuisance modérée) - des déficits fonctionnels et/ou cognitifs (nuisance modérée associée à la chirurgie)
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours du projet (720) seront mis à mort pour les analyses post-mortem.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, et selon nos travaux précédents publiés et la littérature. 720 souris seront nécessaires pour réaliser cette étude, et l’utilisation d’outils d’imagerie non invasive permettant de mesurer les lésions cérébrales et l’inflammation cérébrale permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total : 720) a été évalué via un test d’analyse de puissance (α=0.05 ; β=0.8). Notre projet comporte 24 groupes expérimentaux de 30 souris, soit 720 souris.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les animaux recevront une injection sous-cutanée d’analgésique pour prévenir toute douleur occasionnée par la procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés, et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable : signes de douleurs extérieures indexés sur le grimace-scale souris, absence de réaction, perte de poids. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Après le réveil des animaux à l'issue de la chirurgie, les animaux seront observés jusqu'à l'obtention d'un comportement animal normal. La moitié de la cage des animaux sera placée sur une couverture chauffante leur donnant le choix quant à la température de la cage. De la nourriture humidifiée sera déposée dans la cage pour un accès plus simple à l'alimentation après la chirurgie. Le transport des animaux en salle d'expérimentation sera réalisé en limitant les secousses et le bruit. La température en salle d'expérimentation est contrôlée et adaptée au bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence pour l’étude de l’inflammation et l’ischémie cérébrale. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la réponse inflammatoire suite à un AVC ischémique. es souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte (n=690) ainsi que des souris agées (18 mois) (n=30). Ces stades sont classiquement utilisés dans la littérature pour l’étude de la neuroinflammation et des AVC.
Mécanismes neurobiologiques impliqués dans la compulsion à consommer de la nourriture sucrée chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie crânienne de deux heures, l'implantation d'un dispositif d'enregistrement, puis cent jours d'isolement et soixante-sept jours consécutifs de restriction alimentaire : 1 488 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever le cerveau. Les tests de compulsion associent une récompense sucrée à des stimulus électriques, jusqu'à quatre-vingts sessions d'une heure par animal. L'objet déclaré est de comprendre pourquoi certaines personnes résistent mal aux aliments sucrés, et de tester si la modification d'un gène du système endocannabinoïde prévient ou corrige ce comportement chez le rat. Le porteur ramène la justification de ces 1 488 rats à un calcul statistique dont il ne donne ni les paramètres ni les tailles de groupes.
Objectifs
Ce projet cherche à mieux comprendre pourquoi certaines personnes ont du mal à résister à manger des aliments très sucrés, même si cela peut être mauvais pour leur santé (comme l’obésité ou le diabète). Ce comportement ressemble parfois à une addiction, un peu comme avec la drogue, où la personne continue même si elle sait que c’est mauvais. Nous souhaitons observer ce qui se passe dans le cerveau quand un animal mange de façon compulsive (c’est-à-dire sans pouvoir s’arrêter), pour cela nous nous concentrerons sur deux parties du cerveau : le striatum et le cortex insulaire. D’abord, nous mettrons en place un système pour enregistrer l’activité des neurones dans ces zones. Cela permettra de voir comment le cerveau réagit quand l’animal mange trop de sucre. Ensuite, nous regarderons si l’activité de ces neurones change quand l’animal commence à avoir un comportement compulsif. Cela nous aidera à mieux comprendre ce lien entre le cerveau et le comportement. Dans les étapes suivantes, nous étudierons un gène particulier lié à un récepteur appelé endocannabinoïde, par deux approches : 1.Prévenir la compulsion en modifiant ce gène avant que le comportement apparaisse, pour voir si cela peut empêcher le problème. 2.Soigner en modifiant le gène après que la compulsion soit installée, pour voir si cela peut réduire ou faire disparaître le comportement. Au total, il y a donc quatre étapes dans ce projet : • Les deux premières servent à observer et comprendre le fonctionnement du cerveau. • Les deux dernières testent des solutions pour prévenir ou soigner le comportement compulsif chez l’animal. Grâce à ce travail, nous espérons mieux comprendre le rôle du cerveau et de certains gènes dans la compulsion alimentaire, et évaluer l’efficacité de certaines stratégies pour réduire cette compulsion.
Bénéfices attendus
Cette recherche vise à mieux comprendre ce qui se passe dans le cerveau lorsqu’on mange de façon compulsive (c’est-à-dire sans pouvoir s’arrêter), en étudiant deux zones importantes du cerveau : le striatum et le cortex insulaire, qui jouent un rôle dans ce type de comportement. Nous nous intéressons également à un gène du système des endocannabinoïdes qui est un système qui influence l’appétit et le plaisir. En changeant l’activité de ce gène chez des animaux, nous observeront comment cela modifie le fonctionnement du cerveau et le comportement alimentaire. - À court terme, cette étude permet de mieux comprendre comment fonctionne le cerveau dans les cas de compulsion alimentaire. Ce savoir est très utile pour faire avancer la recherche scientifique. - À moyen et long terme, ces découvertes pourraient aider à créer des traitements pour les personnes qui souffrent de troubles alimentaires, en ciblant plus précisément les zones ou mécanismes du cerveau impliqués. Mais il faut bien comprendre que cette étude est encore préliminaire : elle est faite sur des animaux, donc on ne peut pas encore utiliser les résultats directement chez l’humain. Le but est d’abord de poser les bases pour de futures recherches qui, elles, pourraient aboutir à des traitements pour les humains.
Procédures
Sur animaux anesthésiés : - chirurgie crâniale pour injections pour moduler l'activité neuronale et implantation du dispositif d’enregistrement de l’activité des neurones : 1 fois (2 heures par animal, pour 848rats). - chirurgie crâniale pour injections pour moduler l’expression d’un gène : 1 fois (2 heures par animal, pour 640rats) Sur animaux vigiles : - 40 sessions de mesure de compulsion (1 session / jour, 60minutes/session, pour 640rats) - 80 sessions de mesure de compulsion (1 session / jour, 60minutes/session, pour 320rats) - enregistrement de l’activité cérébrale (6 sessions maximum, 1 session / jour, 60minutes/session pour 848 rats)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour ce projet sont : -Chirurgies : inconfort au réveil (maximum 2 heures), et douleur postopératoire minorée par des antalgiques (pendant 2 jours) -Dispositif de mesure de l’activité cérébrale : gène légère pendant 100 jours maximum - Isolement nécessaire dès lors que l’animal est équipé avec le dispositif de mesure de l’activité cérébrale : cause un stress modéré pendant 100 jours maximum. -Restriction alimentaire nécessaire pour l’induction et la mesure de la compulsion : léger stress pendant les 3 premiers jours de la restriction alimentaire (la restriction dure pendant 67 jours consécutifs) -Les tests de compulsion sur animal vigile avec stimulus électriques induisent un stress modéré (20 secondes de stimulus cumulé par session de 60 minutes, pendant 20 sessions).
Devenir
Tous les animaux, à l’issue des procédures seront mis à mort afin de prélever le cerveau pour des études moléculaires.
Remplacement
Ce type de recherche, visant à comprendre les mécanismes comportementaux et neurobiologiques impliqués dans la compulsion à consommer de la nourriture sucrée peut-être uniquement menée sur un animal vivant. En effet, l’étude du comportement nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.
Réduction
Dans cette étude, nous faisons tout pour utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables. Nous adoptons une démarche par étape avec la réussite d’une étape qui conditionne la réalisation de la suivante. Ainsi le nombre d’animaux indiqué est donc un maximum. Nous utilisation un calcul avec une méthode statistique pour déterminer le nombre d'animaux à utiliser par lot permettant l'obtention de résultats robustes malgré la variabilité biologique.
Raffinement
Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière de l’état de santé des animaux (alimentation, apparence, comportement) et des actions seront mises en place en cas de problème(s) observé(s), avec la mise en place d’une grille de score, l’utilisation de points limites adaptés, gradés, précis et spécifiques, d’un arbre décisionnel et de critères d’intervention et d’arrêt de souffrance suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation à l’animalerie de 10 jours minimum. Lors des chirurgies un recours à une anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques, ainsi que d’un maintien de la température par tapis chauffant sera effectué. Un traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire durant 48heures, soit une couverture totale de 72 heures. Une semaine avant les enregistrements de l'activité neuronale, les rats seront connectés par la fibre optique dans une cage opérante pendant 5-10 minutes / jour pour une habituation.
Choix des espèces
Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction et de la compulsion dans les modèles animaux.En effet, les rats montrent des comportements compulsifs vis-à-vis des récompenses similaires à ceux de l’humain. Nous utiliserons des rats avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une certaine variabilité génétique entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’humain. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet afin de limiter le risque de variabilité qui pourrait être lié à l’utilisation de rats en phase d’adolescence (juvéniles).
Étude du potentiel thérapeutique de l’inhibition d’un transporteur de glucose (SGLT2) dans l’insuffisance ventriculaire droite chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
200 rats vont être utilisés, 160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués pour analyser leur cœur et leurs poumons. Une chirurgie de 25 minutes installe une insuffisance cardiaque droite chronique, suivie d'une échocardiographie sous anesthésie chaque semaine pendant quatre ou huit semaines. Le porteur décrit des douleurs thoraciques, une forte fatigue, une mobilité réduite, de l'inconfort respiratoire et un essoufflement à l'effort, tout en affirmant que les conditions d'entretien sont contrôlées pour que les animaux ne subissent aucun stress. Il conclut qu'aucune simulation in vitro ou in silico ne reproduit la mise en place de cette insuffisance et que l'étude ne peut se faire sans ce modèle de cerclage chez le rat.
Objectifs
L'hypertension pulmonaire (HTP) est un groupe de maladies rares et sévères qui touchent environ 1% de la population mondiale et dont la survie à long terme est très limitée. En effet progressivement les patients atteints d'HTP développent une insuffisance ventirculaire droite (IVD). Cette insuffisance ventriculaire droite correspond à un mauvais fonctionnement du ventricule droit, qui va amener à un mauvais fonctionnement du ventricule gauche et donc de tout le cœur, qui à terme entraine le décès des patients. Actuellement l'IVD n'est ciblée par aucun médicament. L'objectif du projet est donc d'améliorer la compréhension de l’insuffisance ventriculaire droite et de déterminer si l’inhibition in vivo, d'un transporteur de glucose, serait bénéfique pour réduire le développement l'IVD, ce qui permettrait d'ouvrir le champ à des nouveaux candidats thérapeutiques pour cette maladie.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra de confirmer l’implication d'un transporteur de glucose (SGLT2) dans le développement de l’insuffisance ventriculaire droite, et permettra de déterminer s’il est possible de repositionner les inhibiteurs de SGLT2 dpour réduire l'insuffisance ventriculaire droite. Au vu de l'absence de thérapeutique curative pour lutter contre le développement de l’insuffisance ventriculaire droite, ce projet présente une utilité majeure dans la prise en charge de ces malades.
Procédures
Le début de protocole commence par l'induction de l'insuffisance ventriculaire droite, qui sera réalisée par chirurgie sous anesthésie générale et analgésie (25 min par animal). Tous les animaux subiront des échocardiographies, une fois par semaine (pendant 4 ou 8 semaines selon le protocole) réalisées sous anesthésie générale (15 min par animal). A la fin des procédures, tous les animaux subiront un prélèvement sanguin à la veine caudale ainsi qu'un dernier bilan de ses fonctions cardiaques sous anesthésie générale (25 min par animal, J28 ou J56).
Impact sur les animaux
Comme décris précédemment, les procédures chirurgicales conduiront au développement d'une insuffisance cardiaque droite chez tous les animaux opérés. Celle-ci va dans un premier temps engendrer des douleurs au niveau thoracique pour l’animal. Puis à une forte fatigue conduisant à une mobilité réduite de l'animal, surtout dans les premiers jours post-chirurgies. Enfin, cela conduira également à des effets secondaires important tels que de l'inconfort respiratoire ou encore de l'essoufflement à l'effort. En effet, une maladie dite « chronique » va alors se mettre en place comme chez l’humain. Les réveils des anesthésies réalisées pour les échographies peuvent également être une source de stress pour l'animal. Tout comme le gavage ainsi que la contention pour réaliser les traitements. Les animaux auront également une prise de sang en fin de protocole sous anesthésie peuvent également être source de nuisance pour l’animal.
Devenir
Euthanasie de tous les animaux pour analyses post-mortem sur le coeur et les poumons.
Remplacement
L’objectif de recherche est d’étudier et de comprendre le rôle du transporteur SGLT2 dans le développement de l'insuffisance ventriculaire droite et de déterminer si ce transporteur peut être une nouvelle cible thérapeutique dans l'hypertension pulmonaire en ciblant directement le ventricule droit. Le recours à des animaux se justifie par la nécessité d’étudier la fonction cardiovasculaire dans un contexte dit normal ou sain (physiologique) et un contexte ou l'animal est malade (physiopathologique). Il se justifie par l'impossibilité de simuler ex vivo, que ce soit in vitro ou in silico, la mise en place de cette insuffisance ventriculaire droite qui est un processus complexe. L'obtention des nouvelles connaissances, nécessaires à une meilleure compréhension de la maladie et de futures thérapies, recherchées par cette étude ne peuvent donc pas avoir lieu sans l'utilisation de ce modèle de banding et donc de rats.
Réduction
Les fonctions cardiovasculaires seront étudiées par des méthodes non invasives chaque semaine (échocardiographie) permettant de limiter le nombre d'animaux utilisés. Un dernier bilan de leur fonction cardiaque est réallisé à la fin de l'expérimentation afin de collecter un maximum de données. Le nombre total de rats utilisés sera de 200 sur l'ensemble de l'étude en combinant plusieurs approches expérimentales sur le même animal. Des expériences de biochimie et de biologie moléculaire à partir des différents tissus collectés et des études sur cellules isolées seront également effectuées. Le test statistique adéquat (test Wilcoxon-Mann-Whitney avec une valeur alpha de 0,05 et une valeur Beta de 0,1) permet de bien définir le nombre d’animaux nécessaires à cette étude.
Raffinement
Une semaine d’acclimatation sont prévues à l’arrivée des animaux. Toutes les procédures seront pratiquées en utilisant des anesthésiques par voie gazeuse (Isoflurane®) et des analgésiques (Buprecare®) afin de minimiser le stress des animaux. L'eau ainsi que la nourriture sera en illimité pour les animaux. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. La procédure conduira à une insuffisance cardiaque droite, les animaux seront donc surveillés quotidiennement (évaluation de la présence de points limites précoces, notamment la perte de poids, qualité de la fourrure et posture des animaux en post-chirurgie) et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux ne subissent aucun stress.
Choix des espèces
Les rats sont des modèles standards de maladies cardiovasculaires. Ils présentent une anatomie vasculaire et des caractéristiques hémodynamiques similaires à celle de l’homme. De plus notre équipe travaille en routine avec des modèles expérimentaux utilisant les rats pour l’étude de maladies vasculaires pulmonaires et cardiaque. Jeune adulte (8 semaines, 200g à 250g). A ce stade de développement (pleine phase de croissance) l’induction de l’insuffisance ventriculaire droite est plus rapide. De plus, chez l'Homme l'hypertension pulmonaire et l'insuffisance ventriculaire droite se développe chez les jeunes adultes.
Etude de toxicité systémique après administration(s) orale(s) d’un produit de santé
- Formation professionnelle
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
3 280 rats vont être utilisés, 2 980 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour autopsie. Ils reçoivent par sonde orale un produit de santé, sur des durées allant de trois jours à un an, avec des prélèvements sanguins en cours d'étude. Le porteur décrit une irritation liée au passage répété de la sonde, des vocalises lors de la manipulation, de l'agressivité, des douleurs abdominales et une possible détresse respiratoire. L'étude est conduite pour un client qui s'engage par contrat à ne pas dupliquer les essais, et le porteur indique que l'utilisation d'animaux est "requise" par la réglementation et donc "obligatoire".
Objectifs
Le projet vise à respecter les exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur avant l’utilisation d’un produit de santé chez l’Homme. Il évalue la toxicité (i.e. les éventuels effets néfastes sur le corps) du produit de santé ou de ses composants après administration orale (une seule ou plusieurs administration(s)) chez le rat, sur une durée de 3 jours à un an, tout en reproduisant au mieux l'utilisation clinique. Les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit doivent être acceptables et garantir une haute protection de la santé et de la sécurité des patients et des utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de s’assurer avant sa mise sur le marché que l’utilisation du produit de santé est sûr pour les patients afin de répondre aux exigences des autorités réglementaires et des normes en vigueur. Il permet d’évaluer les risques éventuels liés à l’utilisation de ce produit et de s’assurer que les éventuels risques sont acceptables par rapport aux bienfaits/bénéfices apportés aux patients. Les résultats des études aideront à décider si le produit peut être mis ou maintenu sur le marché pour utilisation chez l'Homme, conformément aux règles en vigueur.
Procédures
La fréquence et la dose d’administration orale sont définies en fonction des textes auxquels on se réfère. L’administration sera réalisée de sorte à minimiser autant que possible les nuisances à l’animal (maximum 4 minutes par administration par animal). Pendant l'étude (si besoin), selon une fréquence et un volume n'affectant pas l'animal, des prélèvements sanguins (environ 5 minutes par animal) pourront être réalisés. La durée des interventions en fin d'étude est d'environ 10 minutes chez le rat.
Impact sur les animaux
L’administration par voie orale peut engendrer chez les animaux un stress lié à la contention, un stress ou une gêne légère lié au passage de la sonde, une légère irritation liée au passage répété de la sonde avec gêne légère à la déglutition. Ceci pouvant entraîner de petites pertes de poids, une baisse d'appétit, des comportements atypiques pour l’espèce, vocalises lors de la manipulation et/ou agressivité. Les effets liés au produit (si une toxicité systémique est constatée) et/ou à une mauvaise administration sont des pertes de poids, une baisse d’activité, des douleurs abdominales, voire une détresse respiratoire.
Devenir
Pour les besoins de l'étude, une autopsie est nécessaire. Ceci permet d'évaluer les effets potentiels de toxicité systémique du produit de santé à tester. Ces analyses expliquent l'impossibilité en fin d'étude de maintenir en vie les animaux utilisés. De plus, l’analyse des paramètres sanguins ainsi qu'une évaluation des tissus au microscope (analyse histopathologique) pourra s’avérer nécessaire.
Remplacement
L’utilisation d’animaux est requise dans la réglementation. Les méthodes alternatives existantes ne permettent pas d’évaluer les effets toxiques à court, moyen ou long terme des produits de santé en raison de la complexité des mécanismes de régulation d’un organisme vivant. Il n'existe pas de test in vitro validé ni de modèle simulé par ordinateur capable de reproduire la complexité d'une réaction tissulaire et/ou des effets systémiques. L’utilisation d’animaux est alors obligatoire pour y parvenir.
Réduction
A la constitution de l’étude, le nombre minimal d'animaux requis par les textes de références est considéré. Dans la mesure du possible, les animaux témoins sont mutualisés entre les différents essais (un même groupe d’animaux "témoin" pour plusieurs groupes d’animaux "test" recevant des produits à tester différents). Pour chaque étude, le client pour lequel l'étude est conduite s’engage à ne pas dupliquer les essais via la signature du protocole d’essai. Les études dites "de faisabilité", sur un nombre restreint d’animaux, peuvent aussi servir à orienter les choix de poursuite de développement d'un produit avant d'entamer les études réglementaires à plus grande échelle et devant répondre aux normes en vigueur. Le cas échéant, le nombre d'animaux doit être suffisant pour permettre une analyse statistique pertinente (i.e. nombre minimum d’animaux requis) et cela est défini dans la norme. Les analyses statistiques sont réalisées sur le poids des animaux, le poids des organes (absolus et relatifs) et les paramètres sanguins.
Raffinement
La stratégie de raffinement est établie afin de limiter le stress et la douleur des animaux. Elle repose sur la présence d’enrichissements du milieu en systématique, un suivi sanitaire et clinique renforcé pendant la/les phase(s) d’administration avec une visite vétérinaire en cas d’anomalie clinique, sanitaire ou comportementale, pour permettre une gestion adéquate de la douleur ou de l’anomalie constatée selon chaque cas. Un suivi des points limites spécifiques au projet sera mis en place et tracé en temps réel au moment des observations.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est définie dans le(s) texte(s) de référence. De plus, il est largement utilisé, rendant disponibles de nombreuses données dans la littérature (données sur différents modèles - raffinement, données basales de pathologie…). Le choix du stade de développement est décrit dans le(s) texte(s) de référence qui recommande(nt) l'utilisation d'animaux adultes, âgés d’environ 6 à 12 semaines.
Les vésicules extracellulaires comme approche thérapeutique dans un modèle d’ischémie cérébrale chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une perte de poids supérieure à 15 pour cent, des troubles neurologiques persistant plus de 48 heures ou un refus de boire au-delà de 24 heures déclenchent la mise à mort. 240 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever le cerveau. Chacun subit une heure de chirurgie pour provoquer une ischémie cérébrale, une injection dans la carotide et deux séances d'imagerie, 120 d'entre eux passant en plus des tests de marche spontanée, de latéralisation et de mémoire à court terme. Le porteur annonce une récupération complète de l'état général en une semaine et attend de cette combinaison de vésicules extracellulaires et d'une molécule mimétique un impact socioéconomique très important.
Objectifs
Dans le cadre de développement de traitements permettant de protéger et/ou réparer le cerveau après un AVC, ce projet a pour but dd’évaluer une nouvelle thérapie combinant les vésicules extracellulaires (VE) et un traitement moléculaire mimétique des héparanes sulfates, à la suite d’une ischémie cérébrale chez le rat. Les effets bénéfiques des VE et du traitement moléculaire, administrés séparément, ont déjà été montrés dans des modèles in vitro et in vivo, y compris dans notre laboratoire. Les VE seront issues des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines préalablement traités ou non par le traitement moléculaire.
Bénéfices attendus
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un problème majeur de santé public. Ils représentent la 2ème cause de mortalité et la 1ère cause d’handicap chez l’adulte. Plusieurs facteurs de risque favorisent le déclenchement de cette pathologie dont l'hypertension artérielle chronique qui est le facteur de risque le plus important. Dans les AVC de types ischémiques, la thrombolyse et la thrombectomie mécanique sont les seules interventions approuvées par les autorités de santé. Cependant, ces interventions ne sont applicables que chez une minorité de patients. Aussi, il est crucial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les AVC. Dans ce contexte, notre projet devrait permettre le développement d’une nouvelle intervention thérapeutique associant les VE et le traitement moléculaire pour protéger et réparer le cerveau et améliorer la récupération neurologique après un AVC. L’impact socioéconomique d’un tel développement sera très important.
Procédures
Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - Chirurgie (induction de l’AVC sous anesthésie générale) : 1 heure maximum par animal, réalisée une seule fois sur chaque animal, les 240 animaux sont concernés. - Injection intra-carotidienne (animal anesthésié) : 1 fois (1 h après l’induction de l’AVC) ; 5 min maximum par animal, les 240 animaux sont concernés - Séances d’imagerie cérébrale : réalisées sous anesthésie générale pour visualiser l’ischémie. Il s’agit de deux séances (à 24h et 14 jours après ischémie) d’une durée maximum de 10-15min par rat. 240 animaux sont concernés. - Evaluations comportementales : les tests de comportement réalisés ont pour but l’évaluation de l’état général de l’animal (la marche spontanée, fonctionnement de différents membres …), la latéralisation après ischémie, la mémoire à court terme ainsi que la composante spatiale de la mémoire à court terme. De plus, le dysfonctionnement sensorimoteur et l’asymétrie motrice seront évalués. La durée minimale est de 10min jusqu’à 30min. 120 rats sont concernés. L’objectif est de quantifier les déficits moteurs et la récupération fonctionnelle. - Chirurgie sans réveil pour prélèvement du cerveau : sous anesthésie profonde précédée d’une couverture antalgique administrée 30 min auparavant. La durée est de 15-20 min par rat. 240 rats sont concernés.
Impact sur les animaux
Dans le modèle d’ischémie, les nuisances attendues sont directement liées à l’induction de l’ischémie et aux manipulations associées. L’anesthésie générale préalable, induite par l’isoflurane, est considéré comme nuisance légère. L’occlusion temporaire d’une artère cérébrale entraîne des déficits neurologiques transitoires (hypoactivité, troubles locomoteurs) et une perte de poids d’environ 15 % pendant les 3 à 4 jours suivants, qualifiés de nuisances modérées. Ces altérations sont généralement réversibles, avec une récupération complète de l’état général en une semaine. La procédure se termine par une mise à mort sous anesthésie profonde, sans nuisance perçue. Toutes ces nuisances seront prises en compte dans la définition des points limites.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort dans le but de récupérer les cerveaux pour des analyses en post-mortem.
Remplacement
L’AVC, une pathologie complexe, fait intervenir différents acteurs moléculaires et cellulaires (y compris neurones, les cellules gliales et les cellules endothéliales). Bien que des tests aient déjà été réalisés sur des modèles cellulaires in vitro, pour l’instant, il n’existe aucun modèle de substitution qui permet de mimer, dans sa complexité, la physiopathologie de l’AVC.
Réduction
L’utilisation des méthodes d’investigation non invasives telles que l’imagerie par IRM et les tests de comportements se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux. Celles-ci permettent de suivre l’évolution de l’AVC à différents temps sans nécessité d’euthanasier plusieurs animaux à chacun de ces temps. Chaque animal est dans ce cas son propre contrôle ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour l’étude. Dans le but de pouvoir réaliser des tests statistiques, l’estimation du nombre d’animaux par groupe est basée sur les données de nos études antérieures chez le rat et la réalisation d’un test de puissance statistique. Ces simulations ont permis de mettre en évidence un nombre minimum de 37 animaux par groupe pour obtenir une différence significative. En raison d’une certaine variabilité observée sur les différents modèles d’ischémie cérébrale ainsi que les tests comportements au sien de l’équipe, nous estimons que le nombre d’animaux doit être augmenté à 40 animaux par groupe. Ce nombre de 40 animaux est cependant un nombre maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude. Les résultats de la première cohorte nous permettront de réaliser des statistiques séquentielles et ainsi de décider du nombre d’animaux à inclure dans la deuxième cohorte pour obtenir des résultats significatifs et ainsi de réduire le nombre d’animaux au total.
Raffinement
Dès leur arrivée, les animaux seront mis en groupe sociaux (2 rats par cage) dans des cages standards répondant aux normes en vigueur. Ils auront un temps d’adaptation avant toute expérimentation. Ils bénéficieront également d’enrichissement via des stimulations sensorielles par différents objets disposés dans les cages afin de favoriser l’exploration et le bien-être. Tout au long du protocole, un personnel compétent surveillera les animaux afin de déterminer leur état (poids, apparence physique) et la mise en place, si nécessaire, de mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera réalisée quotidiennement pendant la première semaine après ischémie ensuite 2 fois par semaine durant le reste du protocole. Enfin, les différents protocoles ont été pensés de manière à limiter la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriées et par le choix de points limites cohérents. En cas de dégradation de l’état général, un arbre décisionnel sera appliqué : -Observation d’un signe léger à modéré : surveillance renforcée, environnement adapté, administration d’analgésique si nécessaire -Persistance ou aggravation malgré les soins : évaluation par une personne compétente ou le vétérinaire -Atteinte d’un ou plusieurs critères d’arrêt (points limites) : mise à mort sous anesthésie profonde suivi d’une mise à mort. Les critères d’arrêt incluent : perte de poids supérieure à 15%, troubles neurologiques sévères persistants (> 48h sans amélioration), refus de s’alimenter ou boire > 24h, souffrance non soulagée malgré les soins. L’ensemble des protocoles est conçu pour minimiser les douleurs, grâce à l’utilisation d’analgésiques adaptés, ainsi qu’une réflexion préalable sur la limitation des nuisances liées aux interventions.
Choix des espèces
Le rat est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale : les modèles d’ischémie focale sont bien connus et de nombreux mécanismes de cette pathologie ainsi que des essais de neuroprotection ont ainsi été étudiés chez cette espèce animale. En effet, l’anatomie ainsi que la circulation cérébrale sanguine du rat sont bien décrites et, par ses grands traits, semblables à celles de l’Homme. De plus, cette espèce se prête facilement à l’étude fine des capacités sensorimotrices et cognitives par l’intermédiaire de tests comportementaux appropriés. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour l’étude de l’ischémie cérébrale. Les animaux utilisés ont un poids d’environ 250-350 g, âgés de 7-8 semaines au début du protocole, ce qui correspond à la maturité cérébrale adulte. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes pour comparer les données obtenues avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’AVC chez le rat. De plus, chez l’Homme, les AVC surviennent très majoritairement chez l’adulte.
Compréhension des mécanismes moléculaires d’adaptation des neurones thalamiques à l’altération de l’expérience visuelle dans l’amblyopie, une des principales causes de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. MODIFICATION
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour reproduire l'amblyopie, une paupière est suturée en quatre points chez des ratons avant l'ouverture de leurs yeux, entre le douzième et le vingt-deuxième jour de vie. 144 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever le tissu cérébral, dont neuf en chirurgie terminale sans réveil ajoutée par cette version modifiée du projet. L'intervention dure dix minutes, après quoi les ratons sont rendus à leur mère. Le porteur annonce une surveillance quotidienne du risque d'infection, d'arrachement des points de suture et d'isolement, l'animal touché étant écarté du lot et tué immédiatement.
Objectifs
Notre équipe a le projet de décrypter les mécanismes de plasticité neuronale mis en jeu dans l’amblyopie, une pathologie dont la conséquence première est une vision anormale. Elle est l’une des principales causes de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Ce n’est pas une maladie de l’œil, le récepteur visuel étant normal mais du système nerveux intégrateur. L’acuité visuelle à la naissance est faible à cause de l’immaturité du système nerveux visuel. Pendant une période de forte plasticité neuronale chez le petit enfant, des différences de réfraction, d’alignement entre les deux yeux ou une opacité d’un œil amènent à un défaut d’intégration des signaux neuronaux provenant de l’œil faible. Le traitement, seulement possible avant 6-7 ans, se fait d'abord en corrigeant le défaut visuel, puis en rééduquant l’œil amblyope par pénalisation de l’œil dominant. Ce projet propose de déterminer les mécanismes moléculaires et cellulaires de la plasticité cérébrale au cours du développement des neurones du corps genouillé lateral dorsal (dLGN), premiers relais thalamiques de la stimulation visuelle en mimant l’amblyopie sur le rat Long Evans par suture d’une paupière avant l’ouverture des yeux. MODIFICATION DE PROJET INITIAL SANS AJOUT D’ANIMAUX CAR NECESSITE D’UNE CHIRURGIE TERMINALE POUR LA PREPARATION ET LA COLLECTE D’ORGANE EN VUE D’ANALYSE POST MORTEM.
Bénéfices attendus
L’amblyopie est un déficit visuel fonctionnel chez l’humain qui, s’il n’est pas traité dans une période de temps limité avant 6-7 ans, est irréversible. C’est la principale cause de malvoyance qui touche 2 à 5 % de la population mondiale. Le but de ce travail est d’identifier les mécanismes neuronaux à l’origine de la perte de réponse du cortex cérébral aux stimuli visuels dans l’objectif d’allonger la fenêtre thérapeutique au-delà de l’enfance.
Procédures
Suture de la paupière (4 points de sutures) sur un matelas chauffant sous anesthésie profonde associée à une analgésie locale oculaire. Après le réveil les ratons sont remis à la mère . Durée totale de l’intervention : 10 minutes. CHIRURGIE SANS REVEIL POUR PRELEVEMENT D’ORGANE SOUS ANESTHESIE PROFONDE ET ANALGESIE LOCALE ET GENERALE POUR 9 ANIMAUX PARMI LES 144 DU PROJET.
Impact sur les animaux
Suite à la procédure de privation visuelle monoculaire par suture palpébrale, l’apparition d’effets indésirables sera contrôlée quotidiennement, en particulier : - risque d’infection au niveau des points de suture - risque d’arrachement des points de suture - risque comportemental (isolement, perte de mobilité).
Devenir
Euthanasie préalable au prélèvement du tissu cérébral sur lequel seront réalisées les expérimentations.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est indispensable dans le cadre de ce projet dans la mesure où il est nécessaire de priver le système nerveux d’entrées sensorielles au cours du développement. L’utilisation de culture de neurones est donc naturellement exclue.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux sera faite -Grâce à l’utilisation de rat des 2 sexes. - En multipliant le nombre d’expérimentateurs qui travaillent en parallèle sur le cerveau d’un rat sacrifié pour les mesures des phénomènes électriques des neurones, leur durée de survie étant limitée. -En miniaturisant le matériel cellulaire à prélever pour les analyses biochimiques grâce à l’utilisation de technologies de dernière génération de grande sensibilité. -En maintenant une formation régulière du personnel sur les techniques de sutures de paupières par les praticiens hospitaliers de notre laboratoire
Raffinement
Suture de la paupière (4 points de sutures) sur un matelas chauffant sous anesthésie profonde associée à une analgésie locale oculaire. Après le réveil les ratons sont remis à la mère en vérifiant que celle-ci les reprend bien en charge. Ils sont ensuite surveillés quotidiennement par un personnel expérimenté. En cas de problème lié à la suture (par exemple infection) l’animal sera écarté du lot et sera immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le rat est le modèle animal le plus utilisé actuellement dans la littérature pour l’étude des mécanismes neuronaux de plasticité du système visuel. Notre laboratoire a acquis depuis quelques années une grande expertise dans le domaine de l’électrophysiologie neuronale, en particulier chez le rat. Nous avons choisi de mener notre étude sur des rats Long Evans dont l’acuité visuelle est supérieure à celle des rats Wistar habituellement utilisés au laboratoire. Les animaux seront utilisés entre J12 et J22, période critique de développement de la fonction visuelle.