Procédures modérées

Capturés, anesthésiés, mesurés, raclés au grattoir de silicone pour prélever leur mucus, puis opérés cinq minutes pour recevoir un émetteur acoustique et une puce d'identification : 165 silures, carpes et brochets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont ensuite exposés à des sons attractifs couplés à un stimulus électrique dissuasif, pour tester si le silure glane peut être conditionné à fuir les passes à poissons où il prédate les migrateurs. Le porteur reconnaît que le champ électrique stresse tous les individus présents dans son champ d'action, silures ou non, et qu'une hémorragie est possible lors de l'implantation. Trente-six heures au maximum séparent la capture du relâcher, et les poissons "en bon état sanitaire et en apparente bonne forme physique" retournent là où ils ont été pêchés.

Objectifs

En France, de nombreuses pressions pèsent sur les poissons migrateurs amphihalins (saumons, aloses, lamproies, anguilles) et engendrent leur déclin, à tel point que tous sont menacés voire en danger d’extinction. Atténuer les pressions qui s’exercent sur ces espèces migratrices constitue donc un enjeu de conservation majeur. Afin de rétablir la continuité au niveau des barrages, des ouvrages de franchissement (passes et ascenseurs à poissons) sont construits pour permettre la libre circulation des espèces. Ces sites constituent cependant des goulets d’étranglement fréquentés par de nombreux silures Silurus glanis ; le silure est une espèce exotique qui, par sa taille imposante, est la seule capable de prédater ces espèces migratrices au stade adulte en rivières. Sur plusieurs grands fleuves, il a été estimé que le silure pouvait localement prédater jusqu’à 80% des migrateurs lors de leur montaison vers les sites de reproduction, réduisant ainsi considérablement l’efficacité de ces ouvrages de franchissement. Parmi les poissons, le silure possède d’excellentes capacités auditives, illustrées par la technique de pêche au clonk qui consiste à attirer les silures en émettant un bruit caractéristique à la surface de l’eau. Cependant, dans les zones de pêche intensive, il a été rapporté que le clonk, au contraire, les faisait fuir, ce qui souligne les capacités d’apprentissage de cette espèce. Le présent travail vise à tester les possibilités de contrôler le comportement du silure par conditionnement à l'aide de dispositifs sonores et à l’appliquer à sa gestion locale.

Bénéfices attendus

Face à la pression de prédation du silure sur les poissons migrateurs amphihalins, actuellement différentes méthodes d’intervention directe, principalement basées sur le prélèvement d’individus, sont testées ; elles s’avèrent cependant chronophages, coûteuses et d’une efficacité limitée. Elles sont aussi parfois sources de conflit entre gestionnaires et acteurs favorables aux silures en tant que poissons trophées « no kill ». Elargir le panel de mesures à disposition des gestionnaires apparaît donc crucial. Une fois notre outil acoustique d’effarouchement calibré sur un étang constituant un laboratoire à ciel ouvert, il sera testé sur une rivière, aux abords d’un ouvrage de franchissement, en situation réelle avec la présence de silures et de poissons migrateurs. La méthode sera peaufinée pour élaborer un outil destiné aux gestionnaires, ciblant spécifiquement le silure et limitant son impact sur les poissons migrateurs au niveau des sites à enjeux. Les bénéfices sont l’effarouchement du silure dans des zones où il pose problème, ceci sans manutention des individus. Potentiellement, l’outil peut intéresser de nombreux sites en France. Par ailleurs, le projet éclairera également la communauté scientifique et des gestionnaires sur la capacité des prélèvements de mucus à diagnostiquer l’état sanitaire d’une population.

Procédures

1. Capture (temps maximum entre capture et relâcher : 36h) 2. Anesthésie générale (temps total du début à la fin de la procédure : 15 mn) 3. Mesure taille et poids (1mn) 4. Prélèvement mucus (1ml pour des individus d'1m; 1 mn) 5. insertion puce d'identification électronique (1mn) 6. intervention chirurgicale pour implantation émetteur acoustique (5 mn).

Impact sur les animaux

La capture et la manipulation génèrent un stress. Le prélèvement non invasif de mucus enlève temporairement la première barrière immunitaire. Une douleur pourrait être ressentie en lien avec l’opération, que ce soit pendant l’acte chirurgical ou au réveil ; une hémorragie pourrait également être possible en lien avec cet acte chirurgical. L’anesthésie pourrait causer une désorientation et une perte de repères. La diffusion de sons peut potentiellement engendrer une angoisse chez certaines espèces. Le stimulus électrique dissuasif associé aux sons attractifs pour le silure est également une source de stress, potentiellement pour tous les individus, silures ou non, se trouvant dans le champ d’action du champ électrique.

Devenir

Tous les animaux en bon état sanitaire et en apparente bonne forme physique seront relâchés sur leur lieu de capture

Remplacement

Il est nécessaire d’avoir recours à des animaux car il s’agit d’étudier leur comportement en réaction à des stimuli sonores en milieu naturel et également d’évaluer leurs capacités d’apprentissage et la durée de leur mémorisation (au bout de combien de temps les silures associent-ils le signal répulsif au stimulus initialement attractif ? au bout de combien de temps ne font-ils plus cette association ? quelle est la variabilité entre les individus ? Concernant les deux autres espèces qui seront marquées mais qui ne sont pas les cibles directes du dispositif de conditionnement se pose a minima la question de l’influence des émissions sonores sur leur comportement). Il n’existe, à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Réduction

De manière générale, le choix du nombre d’individus est guidé par des besoins de représentativité statistique. Sur la base de notre expérience précédente, le suivi des poissons par télémétrie acoustique est loin d’atteindre 100% : des individus peuvent être pêchés, mourir ou ne plus être suivis sans raison évidente. Parmi les individus suivis, les périodes lors desquelles les marques sont entendues peuvent être éparses car il est difficile de couvrir intégralement un système d’une centaine d’hectares et il y a forcément des zones d’ombre ; par ailleurs, les individus peuvent aussi simplement être masqués du système de réception par des obstacles physiques, l’un des plus problématiques étant la végétation aquatique les années où celle-ci se développe densément. A l'issue de la capture, certains individus peuvent également ne pas être en état d'intégrer la procédure. Une simulation statistique par test de puissance montre qu’un échantillon initial de 55 individus par espèce cible, incluant les différents aléas cités ci-dessus, permettrait de tirer des conclusions robustes.

Raffinement

Les opérations se dérouleront en automne pour éviter une température de l’eau trop élevée ce qui augmenterait les risques d’infections. Les bacs de stabulations et d’anesthésie seront à l’ombre, oxygénés par un bulleur et suffisamment grands pour assurer une aisance de mouvement des poissons. Les bacs seront régulièrement contrôlés (oxygène, température, pH) pour limiter un écart de température maximum de 2°C avec l’eau de l’étang. La propreté de l’eau sera contrôlée visuellement pour s’assurer de l’absence de fécès, mucus, particules, sang (bain de secours à proximité). Un même bain ne pourra pas servir à deux espèces différentes. L’eau sera changée si un de ces paramètres était anormal et au moins toutes les cinq opérations ou toutes les heures. Le personnel manipulant les individus portera des gants humides et utilisera des épuisettes et des housses de transport spécifiques pour les plus gros individus. Une fois anesthésiés, les individus seront pesés dans un bac ou à l'aide d'un filet avec un peson, puis mesurés sur un tapis de réception humide pour limiter l’écrasement des organes et la dessication cutanée. Le mucus sera prélevé par raclement très doux du dos avec un grattoir en silicone souple ; la zone grattée sera ensuite rincée avec du liquide physiologique stérile et un pansement hydrorésistant sera appliqué pour éviter toute infection. Le poisson sera ensuite immergé dans une solution d'anesthésiant et maintenu sur le ventre par une épaisseur en mousse. La zone d'insertion de la puce est préalablement rincée avec du liquide physiologique puis une injection locale d'analgésique est réalisée pour atténuer la douleur et éviter que les individus ne se grattent et perdent leur puce. Un pansement antiseptique sera appliqué à l’emplacement de la piqûre. L’émetteur pèsera moins de 2% du poids de l'animal pour limiter toute gêne. Il sera légèrement poussé au-dessus de la ceinture pelvienne pour reposer sur celle-ci plutôt que sur les parties molles plus fragiles et désinfecté préalablement à son insertion. L’individu est placé en observation pendant plusieurs heures dans un bac aéré, contrôlé. Du matériel stérile à usage unique (champ de travail, gants, lames, fils, aiguilles) ou désinfecté (pinces) sera utilisé. Des points limites ont été mis en place pour chacune des interventions auxquelles les poissons seront soumis.

Choix des espèces

Seuls des silures (Silurus glanis) longs d'un mètre au minimum sont capables de prédater les poissons migrateurs amphihalins adultes. Les silures entrant dans cette procédure seront donc adultes et il est indispensable de travailler sur l’espèce même pour étudier son comportement finement. Pour cibler spécifiquement le silure, nous avons opté pour des stimuli attractifs, que nous pensons plus spécifiques, non délétères pour les autres espèces et pour lesquels nous avons des candidats prometteurs (sons de congénères, clonk). Il est très difficile de travailler directement aux abords des ouvrages de franchissement ou même dans des milieux aussi ouverts que les grandes rivières fréquentées par les migrateurs pour étudier le comportement des silures. Le travail sur des individus de pisciculture n’est pas simple non plus (individus de taille conséquente capables d’effectuer de très grands déplacements et nécessitant donc de très grands bassins pour étudier leur comportement vis à vis de stimuli sonores) et amènerait à des conclusions difficilement extrapolables au milieu naturel bien plus vaste. D’ailleurs, les principaux enseignements tirés des études de laboratoire concernant leur réaction comportementale à des stimuli sonores sont l’obtention d’audiogrammes donnant les seuils de fréquences et d’intensités auxquels les espèces sont sensibles. C’est un premier pas mais il est nécessaire d’aller plus loin et notamment de mesurer la variabilité inter-individuelle et de quantifier l’influence potentielle de ces stimuli sur d’autres espèces. A cette fin, la carpe (Cyprinus carpio), espèce possédant comme le silure un appareil de Weber lui conférant d’excellentes capacités auditives, et le brochet (Esox lucius), prédateur emblématique de nos milieux aquatiques continentaux ne disposant pas de telles capacités, ont été choisis ; ces deux espèces sont par ailleurs communes dans le site d'étude. Les carpes et brochets entrant dans cette procédure auront un stade de subadulte à adulte (poids supérieur à 600g pour éviter toute gêne occasionnée par la marque acoustique). Des échantillons de mucus seront prélevés uniquement sur les silures. À l'heure actuelle, l'état de santé des populations de poissons sauvages, et en particulier des silures, espèce en pleine expansion en France, n'est pas connu. Ces prélèvements non invasifs permettront de connaître l’état de santé des individus relâchés et de le relier à leurs capacités de mouvement.

Les vésicules testées viennent des os de souris mises à mort pour les fournir, et 768 autres souris vont être utilisées pour les évaluer, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. L'opération du crâne dure une vingtaine de minutes, le temps de déposer un matériau chargé de ces vésicules dans un défaut osseux créé au préalable, suivie de deux injections intrapéritonéales de fluorochromes six jours et un jour avant la fin. Le porteur écrit n'attendre ni gêne fonctionnelle ni perte de poids, seulement quelques signes de stress après la pose de l'implant et des douleurs post-chirurgicales légères. Sur la réduction, il fait état d'un calcul du nombre d'implants nécessaires, sans expliquer comment ce calcul aboutit à 768 souris.

Objectifs

En vieillissant, la communication entre les cellules responsables de la formation et de la destruction des os se modifie, ce qui peut entraîner une perte de densité osseuse. Récemment, des petites particules, les vésicules extracellulaires, ont été découvertes comme un moyen de communication entre ces cellules osseuses, et elles pourraient jouer un rôle important dans la réparation des os. Nous pensons que ces particules pourraient aider à stimuler la régénération du tissu osseux. Dans ce projet, nous allons tester si ces particules peuvent effectivement aider à la régénération des os. Pour cela, nous allons les extraire des os de souris mises à mort et les tester dans des conditions réelles, en comparant leur effet à celui d’un traitement déjà utilisé en clinique pour stimuler la guérison osseuse mais présentant des effets secondaires. Ces particules seront associées à un matériau permettant leur maintien sur le site osseux à réparer. Cette étude sera réalisée sur des souris en implantant ce matériau contenant les particules au niveau du crâne sous médication adaptée (anesthésie et analgésie), pour voir s’il y a formation d’os et réparation.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra pour la première fois de valider chez l’animal la capacité de ces particules extraites d’os à former du tissu osseux. Les perspectives de cette étude pourront nous apporter de nouvelles connaissances des phénomènes impliqués dans la régénération osseuse. A plus long terme, l’utilisation de ces particules pourra permettre de remplacer les thérapies actuelles et pourront être appliquées à l’Homme.

Procédures

Une première procédure chirurgicale sera réalisée durant laquelle les animaux seront soumis à l’implantation d’un matériau chargé en particules dans l’os du crâne au niveau d’un défaut osseux, préalablement réalisé, ou directement au contact de celui-ci (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie pré- et post-opératoire adaptée sera appliquée. Les animaux vigiles recevront également deux injections intrapéritonéales de deux fluorochromes possédant une affinité pour le tissu osseux respectivement 6 jours et 1 jour avant la fin de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

En se basant sur nos connaissances et nos études antérieures, nous n’attendons aucune gêne fonctionnelle ni perte de poids au cours de cette expérimentation. Quelques signes de stress peuvent être observés après la pose de l’implant. Des douleurs post chirurgicales légères pourraient être observées. Pour cela, les animaux seront soumis à une analgésie pré-opératoire et post-opératoire.

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort et les crânes seront prélevés pour analyser la pousse osseuse ou le comblement des défauts osseux.

Remplacement

Des analyses in vitro ont été réalisées afin d’évaluer le rôle de ces particules sur des cellules osseuses. L’utilisation de souris reste maintenant nécessaire afin de valider les propriétés des matériaux chargés en particules en termes de régénération osseuse. Il n’existe malheureusement pas de solution de remplacement complet ou par des invertébrés en raison de l’étude menée sur le tissu osseux.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, le matériau utilisé a été sélectionné en amont et déjà testé pour sa biocompatibilité in vivo. Par ailleurs une approche statistique, nous a aidé à calculer le nombre d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs afin de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants à l’obtention de résultats significatifs et à la valorisation des résultats de cette étude.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Après leur arrivée, pendant leur acclimatation à l’animalerie, les animaux seront habitués à être manipulés par l’expérimentateur avant toute intervention de sorte à limiter leur stress à son contact le jour de l’expérimentation. Les animaux seront anesthésiés et recevront une analgésie adaptée en prémédication et jusqu’à 48 heures après la chirurgie. La surveillance régulière des animaux permettra d’évaluer des points limites selon une grille d’évaluation détaillé. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à sa mise à mort en fin d’étude. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux dans des cages enrichies sous forme de frisottis, cabane en carton et tube en plexiglas et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum.

Choix des espèces

Les modèles de repousse osseuse chez la souris au niveau du crâne sont couramment utilisés dans la littérature et parfaitement validés. De plus, les particules que nous étudions étant issues de souris, nous avons décidé de rester chez la même espèce pour la validation expérimentale de notre hypothèse d’étude.

Tester les molécules candidates de clients contre l'inflammation liée à l'obésité : un laboratoire de recherche contractuelle va utiliser 600 souris et 300 rats dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux sont d'abord rendus obèses par un régime hypercalorique prolongé, puis soumis à un à six jeûnes de deux à douze heures, jusqu'à six tests de tolérance au glucose ou à l'insuline de deux heures trente, des séjours de 72 à 120 heures seuls en cage de calorimétrie, des injections répétées du composé du client et des prélèvements sanguins. Le porteur ramène les nuisances de la surcharge pondérale à un "léger inconfort" pour la mobilité dans la cage, et indique que l'enrichissement peut varier "en concertation avec le souhait du client". Tous les animaux sont tués en fin de procédure pour prélever leurs organes et caractériser leur statut inflammatoire et métabolique terminal.

Objectifs

Le surpoids est défini comme une accumulation excessive de masse grasse dans l’organisme. L’obésité est une maladie chronique complexe définie comme une accumulation excessive de masse grasse pouvant altérer l’état de santé d’un individu. Actuellement, 2,5 milliards de personnes dans le monde sont atteintes de surpoids, dont plus de 800 millions sont obèses (OMS, 2022). La prévalence du surpoids ne cesse de croître depuis les dernières décennies et l’un des facteurs prépondérants de cette évolution est la surconsommation de régimes déséquilibrés, riches en graisses et en sucres. L’obésité s’accompagne d’une inflammation systémique constante et d’intensité faible voire modérée, dite de bas-bruit. Cet état inflammatoire chronique contribue à développer d’autres maladies, telles que le diabète, la stéatose hépatique et bien d’autres, et cause ainsi quelques millions de morts chaque année. Dans ce contexte, l’importance de contenir ce statut inflammatoire et surtout, de stimuler sa résolution, est capitale. L’administration prolongée de régime hypercalorique chez le rongeur est l’un des moyens les plus simples et les plus couramment utilisés pour modéliser le surpoids et l’obésité chez l’animal. En faisant varier la durée du régime ainsi que sa valeur calorique, ce modèle permettra de collecter et d’étayer des données cruciales sur les mécanismes inflammatoires cellulaires et moléculaires impliqués. Le premier objectif consiste donc à détenir au sein de notre laboratoire le modèle de surpoids/obésité induit par un régime hypercalorique. Notre laboratoire étant un organisme de recherche contractuelle, notre activité consiste à étudier le potentiel résolutif de molécules candidates dans différents contextes inflammatoires, ici dans l’obésité. Ainsi, l’objectif final de ce projet est de tester l’administration conjointe de molécules candidates dans la résolution de l’inflammation induite par le surpoids ; et ainsi contribuer à terme à réduire voire supprimer l’impact délétère de l’obésité à tous les niveaux ; humains, sociaux, sociétaux et économiques. De plus, l'ajout d'une méthode d’analyse métabolique nécessite une modification du projet initial autorisé sans ajout d’animaux, faite dans un 2eme EU. Le projet devient multisite : Cette APAFIS est une modification d’un projet autorisé.

Bénéfices attendus

Le modèle animal utilisé dans cette étude, largement décrit dans la littérature, est pertinent pour évaluer de nouveaux candidats médicaments dans le traitement des altérations induites par le surpoids/obésité. Plusieurs voies d’administration des molécules seront employées afin de couvrir au mieux les possibilités d’amélioration des symptômes inflammatoires du modèle. Le bénéfice global de ce projet réside dans l'objectif d’optimisation de la formulation et de l’efficacité de médicaments candidats pour réduire les altérations multiples dues au surpoids et à l’obésité.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les animaux pourront être soumis à : 1. 1 à 6 cessions de jeûne d’une durée de 2h à 12h sur la période diurne ou nocturne, espacées d’une semaine minimum. (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2) 2. Au maximum, 6 tests de tolérance au glucose et/ou à l’insuline (durée 2h30 environ). (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2) 3. Des mesures de composition corporelle, l’acquisition dure au maximum 2 minutes et cette mesure sera effectuée 1 à 5 fois au cours du protocole. (EU0549_EU 2/2) 4. Des expériences de calorimétrie : les souris seront isolées en cage individuelles entre 72h et 120h. Chaque animal sera soumis une seule fois à ce genre de procédure. (EU0549_EU 2/2) 5. Des administrations répétées du composé-client selon les modalités suivantes : Les modes d’administration possibles incluent l’alimentation, l’eau de boisson, le gavage, les injections intrapéritonéales, sous- cutanées, intravasculaires, intradermiques. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les modes d’injection. Ils dureront moins d’une minute par animal (saisie de l’animal, pesée de l’animal pour adapter la dose, puis administration de la substance). (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2) 6. Un prélèvement sanguin unique ou répété, précédé ou non d’un jeûne de 2 à 6h, suivi d’une semaine de récupération minimum sur souris vigile ou anesthésiée et sur rats anesthésiés, selon le volume prélevé. La durée d’un prélèvement sera de l’ordre d’une minute par animal; (EU0548 (Nouveau EU0775)_ EU 1/2)

Impact sur les animaux

Les trois principales nuisances attendues concernent la surcharge pondérale des animaux, la réalisation de prélèvements sanguins répétés sur la durée du protocole expérimental, l’administration répétée des molécules- clients à tester. Les modes d’administration considérés comme nuisibles incluent tous les types d’injection (intrapéritonéale, sous-cutanée, gavage, intradermique, intravasculaire). La surcharge pondérale pourra induire un léger inconfort chez les animaux, en comparaison avec des souris de poids normal, notamment pour leur mobilité au sein de la cage.

Devenir

Tous les animaux de la procédure seront mis à mort à l'issue des procédures afin de pouvoir procéder aux prélèvements d'organes et à la caractérisation du statut inflammatoire et métabolique terminal.

Remplacement

Lorsque ce sera possible, les composés de nos clients seront évalués sur culture cellulaire ou organe isolé en remplacement ou en complément des tests animaux afin de remplacer le nombre d'animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement complet de l'expérimentation animale par des essais in vitro n'est pas envisageable pour une étude portant sur le surpoids. Les modèles vitro ne permettent pas de réunir toute la complexité des interactions moléculaires et cellulaires de la physiopathologie d'un animal entier. De plus, les étapes de validation d'une molécule thérapeutique nécessite qu'elle soit testée chez l'animal avant de pouvoir passer à l'étape de validation suivante : l'Homme.

Réduction

La problématique de ce projet faisant intervenir la régulation métabolique et inflammatoire sur du moyen/long terme (semaines, mois), induit intrinsèquement une variabilité interindividuelle, qui nécessite d’être contrecarrée par la taille de nos groupes (n=12 souris / groupe expérimentaux). Le nombre de rats et de souris nécessaires a été défini ainsi pour pallier la diminution de la robustesse statistique lors de comparaisons multiples, en particulier sur des protocoles de plus courte durée. Nous avons également estimé cette nécessité sur la base d’estimations statistiques. D’autre part, si plusieurs prélèvements sanguins sont à réaliser, nous les réaliserions sur des animaux dédiés (6 et 6 au sein d’un même groupe) afin de respecter les volumes, les délais de récupération et limiter le nombre de gestes invasifs sur un même animal. Enfin, nous utiliserons en priorité (sauf exigence spécifique de la part de nos clients) des lignées consanguines, qui présentent un génotype contrôlé, ce qui réduit significativement la variabilité interindividuelle, et par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. C’est la conjonction de tous ces éléments qui nous a conduit à considérer des groupes de 12 animaux maximum.

Raffinement

Leur environnement sera enrichi (igloo, carré de coton et buchette de manière systématique et quelle que soit la durée du protocole. Une boule en bois et/ou tunnel pourront être ajoutés, en concertation avec le souhait du client) afin de leur permettre de se distraire, d’éveiller leur curiosité et de réaliser un peu d’activité physique. Les animaux seront vus quotidiennement. En cas de signe de mal-être (défini dans la procédure), un suivi renforcé sera mis en place : l’animal sera pesé et des soins adaptés à son cas seront mis en œuvre. L’atteinte d’un point limite critique conduira à l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

L'utilisation de rats et de souris se justifie, d'une part, par leur proximité avec l'Homme (mammifères). En effet, l'homologie entre les rongeurs et l'Homme facilite considérablement les procédés de modélisation des pathologies humaines et par conséquent, les interprétations qui en découlent. D'autre part, les performances de reproduction des rats et souris permet d'obtenir des effectifs exploitables en termes d'analyses statistiques, dans un délai relativement court et donc compatibles avec nos contraintes de production. Enfin, l'utilisation de rats et de souris comme modèle de surpoids/obésité est très largement documentée dans la littérature scientifique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (à partir de 7 semaines), car toutes leurs fonctions biologiques sont alors matures. L'âge des animaux pourra exceptionnellement être inférieur à 7 semaines, si le client souhaite étudier les conséquences du surpoids/obésité juvénile sur l'âge adulte. Dans ce cas, le régime hypercalorique pourra débuter au plus tôt à l'âge de 3 semaines.

Jusqu'à vingt-deux semaines en cage individuelle pour mesurer la consommation de sucre de chaque animal, une chirurgie cérébrale de quarante-cinq minutes, quatre à huit semaines d'antibiotiques puis sept jours de gavage : 3 804 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem. Elles ont chaque jour le choix entre de l'eau et une boisson sucrée, quatre ou vingt-quatre heures selon le groupe, et subissent trois prélèvements sanguins. L'objet déclaré est de comprendre l'hyperphagie boulimique en passant par le microbiote intestinal, transféré par gavage d'une souris à l'autre. Le porteur écrit que l'isolement "n'interfère pas avec le bien-être des animaux" dans ses conditions, et annonce dans le même texte des troubles de l'humeur et de la motivation chez les souris consommatrices de boisson sucrée, qu'il compte justement mettre en évidence.

Objectifs

Les troubles du comportement alimentaire se définissent par une relation dysfonctionnelle avec l’alimentation, souvent orientée vers la consommation excessive d’aliments, riches en graisses et en sucres. Ces comportements, au-delà de leur dimension psychologique et comportementale, sont associés à des conséquences sanitaires majeures telles que les maladies cardiovasculaires, l’obésité et le diabète. L’hyperphagie boulimique est le plus prévalent de ces troubles et se caractérise par des épisodes récurrents de perte de contrôle sur la prise alimentaire, mais les mécanismes biologiques sous-jacents demeurent en grande partie méconnus. Des travaux récents mettent en lumière l’importance du microbiote intestinal dans l’émergence et/ou le maintien des troubles alimentaires. Le projet souhaite caractériser les altérations comportementales, cérébrales et du microbiote induites par une consommation excessive de saccharose ; examiner l’impact d’une manipulation ciblée du microbiote sur les comportements alimentaires ; et explorer les interactions entre le microbiote et le cerveau. Ces investigations seront menées sur des souris des deux sexes, afin d’identifier d’éventuelles différences intersexuelles, déjà décrites chez l’humain.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre, au niveau préclinique, comment un régime riche en saccharose altère la physiologie animale, en tenant compte des interactions intestin-cerveau. Les résultats attendus permettront d’approfondir la compréhension des mécanismes biologiques sous-jacents à ce trouble alimentaire. En outre, à long terme, ces travaux précliniques fourniront une base scientifique pour le développement de stratégies hygiéno-diététiques innovantes et mieux adaptées à la prise en charge des patients.

Procédures

Les animaux sont soumis à une chirurgie et des injections pour l'anesthésie (1 chirurgie par animal, durée 45 min; une injection intrapéritonéale d’une durée d’environ 20 secondes). Ils seront également soumis à des traitements chroniques d’antibiotiques (sur 4 ou 8 semaines maximum) et un transfert de leur microbiote intestinal (gavage, 1/jour sur 7 jours, d’une durée d’environ 30 sec). Il y aura des prélèvements de sang à 3 reprises lors du protocole (durée environ 30 sec).

Impact sur les animaux

Consommation excessive de saccharose : les animaux ont le choix entre de l’eau et du sucre tous les jours, pendant 4h ou 24h selon le groupe expérimental. Nous devons évaluer précisément la consommation individuelle de saccharose des souris et nous avons montré que l’isolement nécessaire (au maximum 22 semaines en cage ouverte permettant un contact auditif et olfactif) n’interfère pas avec le bien-être des animaux dans nos conditions. Nous n’avons à ce jour pas mis en évidence de pathologies chroniques dans notre modèle, mais justement, nous poursuivons notre caractérisation et le suivi de différents paramètres afin de suivre l’évolution chez les souris. Nous n’avons pas identifié d’effets sur les seuils nociceptifs. De plus, des troubles de l'humeur et de la motivation sont envisageables chez les animaux consommateurs de boisson sucrée (le but de l'étude est de les mettre en évidence). Lors de l’utilisation de traitement antibiotique, une attention particulière sera portée sur les potentielles pertes de poids et diarrhées. Le gavage intra-gastrique répété (1x/J, 7j) peut conduire à un inconfort léger lié au stress de la contention au moment de l’administration. La chirurgie sur animal anesthésié (1 heure maximum/animal) peut induire de la douleur et une inflammation transitoire et/ou un inconfort pour les animaux. Le prélèvement de sang lors du protocole de consommation de saccharose peut induire une douleur légère de courte durée et une inflammation. L’injection d’anesthésique avant la perfusion peut engendrer une douleur aigüe.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à l’issue de chaque procédure pour analyse post-mortem.

Remplacement

La compréhension des mécanismes de mises en place et des conséquences des troubles du comportement alimentaire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal entier, vigile. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer les processus neuronaux mis en jeu. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines. Il nous est donc impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d'animaux pour permettre des analyses statistiques pour les analyses comportementales et moléculaires et les analyses de l'activité cérébrale. Les expériences seront toujours réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, nous composerons donc toujours nos groupes dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Notamment, l’utilisation de tests longitudinaux permettra d’obtenir des informations concernant l’activité des circuits cérébraux lors de l’ensemble de l’exposition au saccharose. De même, les prélèvements d’organes après perfusions permettront de décrire les altérations provoquées par le régime alimentaire autant au niveau cérébral que périphérique.

Raffinement

Tout au long du déroulement des expériences, une observation quotidienne de l’état clinique des souris sera assurée. De plus, une pesée au minimum 2x/semaine est réalisée lors du suivi des consommations (nourriture/saccharose/eau), permettant de s’assurer du bien-être des souris. Les souris ont toujours accès à de l’eau. Les souris seront habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Les animaux sont isolés dans des cages enrichies et en cages ouvertes ce qui permet les contacts olfactifs entre congénères et permet aux animaux de communiquer entre eux ce qui concourt à limiter l’impact du stress d’isolement. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie per et post opératoire et les souris seront placées sur des tapis chauffants, permettant de maintenir la température corporelle de l’animal durant la procédure en plus de monitorer cette donnée physiologique. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel formé, avec une attention particulière la première semaine post-chirurgicale. L’état de santé des animaux est évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale (ciblant notamment les risques d’inflammation au niveau de la zone opérée et la reprise de poids de l’animal). Des points limites spécifiques ont été définis pour l'état général, la prise alimentaire.

Choix des espèces

Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des troubles alimentaires. Sur un plan évolutif, les rongeurs, appartiennent au clade des mammifères le plus proche de celui des Primates. Nous choisissons de travailler avec la souris car nous pourrons ensuite étudier le rôle de gènes précis dans les adaptations observées, en utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées Souris jeunes adultes (au moins 8 semaines en début de procédure). Le jeune adulte correspond à la période de vie de vulnérabilité accrue chez l’Homme vis-à-vis des troubles alimentaires

Opérés sous anesthésie générale pendant environ cinquante minutes pour recevoir des marqueurs directement dans le cerveau, 150 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués au terme d'une ponction de liquide cérébrospinal. Ils passent aussi par une contention en tube destinée à provoquer un stress, trois prélèvements sanguins, cinq injections sous-cutanées de BrdU, et un labyrinthe aquatique où ils nagent quatre fois par jour pendant neuf jours, à 3,5 mois puis à 8, 12 et 18 mois. Le projet cherche quelles molécules franchissent la barrière hémato-encéphalique en vieillissant, pour identifier des marqueurs précoces du déclin cognitif chez les personnes âgées. Les rats vieillissent jusqu'à dix-huit mois avec les tumeurs, l'alopécie et les plaies que le porteur anticipe, sous une grille de score où un total de 9 ou de 12 selon la période déclenche la mise à mort.

Objectifs

En vieillissant, notre mémoire peut souffrir, ce qui affecte notre bien-être et notre qualité de vie. Le vieillissement entraîne souvent une baisse progressive des capacités cognitives, mais l’intensité varie d'une personne à l'autre. Une partie du cerveau, l'hippocampe, est particulièrement touchée. Cependant, certaines personnes en vieillissant arrivent à maintenir une bonne mémoire, tandis que d'autres voient leur mémoire se dégrader de manière irréversible. Ce phénomène montre que le cerveau essaie de compenser cette perte en formant de nouveaux neurones, notamment dans l'hippocampe, grâce à un processus appelé neurogenèse. Ce processus est lié au stress et a été observé dans des tests chez les animaux, où une bonne neurogenèse favorisait de meilleures performances cognitives, comme la mémoire spatiale. Les nouveaux neurones formés dans l'hippocampe aident à préserver la mémoire pendant le vieillissement. Nous pensions que seuls les neurones étaient responsables des fonctions du cerveau, cependant nous avons émis l'hypothèse que la barrière hémato-encéphalique (BHE), une barrière entre le cerveau et le reste du corps, jouerait aussi un rôle important dans le déclin cognitif. Quand cette barrière augmente sa perméabilité, cela peut permettre à des éléments externes ou internes de perturber les processus neuro-cognitifs. C'est notamment le cas dans des maladies neurodégénératives, où la BHE devient plus perméable, laissant passer des substances qui déséquilibrent l'équilibre de la fonction cérébrale. Cela pourrait expliquer pourquoi les capacités cognitives des individus vieillissant se détériorent avec le temps. L’objectif de ce projet est de comprendre quelles molécules traversent cette barrière quand elle est perméable et comment cela affecte notre mémoire. Il permettrait également de déterminer des biomarqueurs précoces du vieillissement cognitif de manière à envisager des thérapies de préventions.

Bénéfices attendus

Ce projet est le premier à étudier comment les échanges de substances entre le sang et le cerveau changent avec le vieillissement. Il propose une approche nouvelle, car la recherche jusqu'ici s'est surtout concentrée sur l'idée que c'est l'activité des neurones qui cause le déclin cognitif lié à l'âge. Cette étude pourrait donc aider à mieux comprendre les mécanismes du vieillissement cérébral. En mesurant les substances contenues dans le sang des animaux vieillissants, nous espérons identifier des marqueurs qui pourraient indiquer la vulnérabilité cognitive des personnes âgées. Cela ouvrirait la voie à des traitements préventifs ou des recommandations alimentaires pour prévenir ou ralentir ce déclin cognitif.

Procédures

Six interventions seront réalisées sur les animaux pour les besoins de l’étude. Test de réaction au stress : À 2,5 mois, les animaux sont placés brièvement dans un petit tube, ce qui provoque un stress. Du sang est ensuite prélevé juste après, puis à 2 autres temps (30 et 120 minutes plus tard), pour mesurer leur réaction biologique au stress. Chirurgie pour l’injection intra-cérébrales : Une opération chirurgicale est réalisée sous anesthésie générale pour injecter des marqueurs directement dans le cerveau. Cette intervention dure environ 50 minutes. Injections de BrdU : Ce produit permet de repérer les nouveaux neurones. Il est injecté (en sous-cutanée) à plusieurs reprises (5 fois au total), directement sur l’animal éveillé. Chaque injection prend environ 4 minutes. Test du labyrinthe aquatique : Les animaux doivent apprendre à trouver une plateforme cachée dans une piscine. Ils s’entraînent pendant plusieurs jours, en nageant plusieurs fois par jour (4 essais par jour pendant 9 jours avec 90 secondes par essai espacés de 30 secondes, maximum 450s dans la piscine). Ce test permet d’évaluer leur mémoire et leur capacité d’apprentissage. Il est réalisé à 3,5 mois pour chaque lot, puis selon les lots, à 8, 12 et 18 mois. Un test final est aussi réalisé sans la plateforme, pour voir s’ils se souviennent de son emplacement. Prélèvement de sang : un prélèvement de sang est réalisé à la queue avant le deuxième test du labyrinthe aquatique. Cette intervention dure 3 minutes. Ponction du liquide cérébrospinal : une ponction de leur liquide cérébrospinal sous anesthésie profonde est réalisée pour étudier les substances qui sont retrouvées dans le cerveau. Cette intervention dure 10 minutes avec la mise à mort de l’animal à la fin de la ponction.

Impact sur les animaux

Comme pour tout projet impliquant des injections et des opérations précises sur le cerveau, certains effets secondaires peuvent apparaître, même si nous faisons très attention et suivons des procédures adaptées. Par exemple, il arrive, même si c’est rare, que les endroits où l’on fait les injections (dans le ventre ou sous la peau) ou les plaies liées à l’opération s’irritent. En plus, dans les deux jours qui suivent l’opération au niveau du cerveau, les animaux peuvent perdre un peu de poids (jusqu’à 5 % de leur poids de départ). C’est pour cela que nous les surveillons de près pendant les 3 jours qui suivent ces interventions, pour nous assurer qu’ils vont bien. De plus, les animaux sont susceptibles de souffrir des effets secondaires dus au vieillissement, comme par exemple une alopécie spontanée, un manque de toilettage dans le dos ou au niveau des yeux, l’apparition de tumeurs. Pendant cette période, la personne responsable du projet remplit une fiche de suivi de l’état de santé et du bien-être des animaux, à l’aide d’une grille d’évaluation et met en œuvre toute mesure compensatoire jugée utile et conservatoire.

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour permettre l'étude poussée du cerveau.

Remplacement

Dans ce projet, l'objectif est de comprendre comment le vieillissement affecte le métabolisme et la mémoire des animaux, et comment cela se relie à la création de nouvelles cellules nerveuses. Pour ce faire, on va tester leur comportement, puis analyser leurs capacités cognitives et leur cerveau dans un cadre global. C'est une approche qui nécessite d'étudier l'animal dans son ensemble, en observant comment son cerveau et son corps interagissent. Nous ne pouvons pas reproduire ça en laboratoire avec des cellules isolées ou des simulations sur ordinateur. De plus, pour avoir une vue complète de l'impact du vieillissement et de l'altération de la barrière hémato-encéphalique (BHE) — qui protège le cerveau — on doit utiliser un organisme entier. C'est pourquoi on ne peut pas se contenter de méthodes de remplacement comme les cultures cellulaires ou les modèles 3D.

Réduction

Ce projet vise à étudier les effets du vieillissement sur le cerveau à trois étapes de la vie : adulte (8 mois), milieu de vie (12 mois) et fin de vie (18 mois). Pour cela, trois lots d’animaux seront constitués, correspondant à ces âges. Dans chaque lot, les animaux seront répartis en un groupe contrôle de l’apprentissage et 2 groupes expérimentaux selon leurs performances à un test comportemental à 3,5 mois (groupe contrôle, groupe résilient et groupe vulnérable). Le nombre de rats a été estimé en tenant compte de nos données précédentes et des pertes possibles liées à l’âge (problèmes de santé, décès naturel) ou aux procédures expérimentales (comme des chirurgies). Pour garantir des résultats fiables, 50 rats seront utilisés par lot (6 rats contrôles, 22 rats résilients, 22 rats vulnérables), soit un total de 150 animaux. Ce nombre pourra être réduit si les différences entre les groupes sont plus marquées que prévu et sans nuire à la qualité scientifique de l’étude.

Raffinement

À leur arrivée, les rats seront placés par 2 dans des cages collectives, avec des nids faits de fibres de bois compressées pour réduire le stress et l'ennui. Les rats pesant plus d'1kg seront mis en cage individuelle. L'environnement sera contrôlé, avec une température et un taux d'humidité constants, et un cycle jour/nuit de 12 heures. Ils auront de la nourriture et de l'eau à volonté, et la litière ainsi que les enrichissements seront changés chaque semaine. Les rats seront observés tous les jours pour vérifier leur état de santé général et leur comportement, et manipulés une fois par semaine jusqu'à leur euthanasie. Leur poids sera vérifié tous les mois. Si une opération chirurgicale est réalisée, un suivi précis sera effectué pendant trois jours. Leur état sera noté sur une grille qui évalue différents critères comme la plaie chirurgicale, la perte de poids, l'hydratation, l'aspect général, la mobilité, et les signes de mal-être. Si un rat a un score élevé (12 ou plus), il sera euthanasié. Si son score est entre 0 et 5, il est considéré en bonne santé, entre 6 et 11 il nécessite des soins vétérinaires (par exemple, des médicaments contre la douleur), et si aucune amélioration n'est constatée après 48 heures, il sera euthanasié. Au fur et à mesure de leur vieillissement, les rats seront suivis chaque semaine avec la même grille. Si des maladies ou des problèmes apparaissent (comme des tumeurs ou des plaies nécessitant une chirurgie), le même suivi post-opératoire sera appliqué. Si aucune chirurgie n'est nécessaire, la grille sera utilisée sans la partie concernant les plaies. Un score de 9 ou plus entraînera l'euthanasie de l'animal, tandis qu'un score entre 0 et 3 indique une bonne santé, et entre 4 et 8, un état de détresse nécessitant une attention vétérinaire.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat (Sprague-Dawley). La complexité du système nerveux des mammifères et les comportements qu’il régit rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (e.g., invertébrés). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la néo-neurogénèse hippocampique est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, constituant une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 2,5 mois (10 semaines) afin d’être âgés de 3 mois (12 semaines) au moment des chirurgies stéréotaxiques. Ensuite, les études seront réalisées de 5 à 15 mois après les injections intracérébrales. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : 3 mois - jeune adulte ; 8 mois - adulte ; 12 mois - milieu de vie ; 18 mois - fin de vie. Ces âges ont été choisis rendant possible une étude pseudo-longitudinale du rôle des néo-neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de déficits mnésiques.

340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 180 mises à mort dans les quarante-cinq minutes suivant une injection sous anesthésie générale. Les autres reçoivent une injection à un, deux, trois ou quatre jours de vie, sur nouveau-né vigile, que le porteur déclare sans douleur et sans nécessité d'anesthésie. Ces animaux sont modifiés génétiquement pour altérer la production de dérivés réactifs de l'oxygène dans leurs seuls astrocytes, et leurs cerveaux sont prélevés à cinq stades, de cinq à soixante jours après la naissance. Le bénéfice annoncé se limite à des connaissances nouvelles sur le développement cérébral et vasculaire et à l'identification de cibles mitochondriales, sans application énoncée.

Objectifs

Le cerveau contient différents types de cellules, dont des cellules appelées astrocytes. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans le bon fonctionnement du cerveau, en particulier dans la communication entre les neurones et l’apport de nutriments depuis les vaisseaux sanguins. Certaines substances produites naturellement par les cellules, appelées dérivés réactifs de l’oxygène (ou ROS), sont impliquées dans le bon développement et le fonctionnement des astrocytes. Bien que souvent associées au stress cellulaire, ces molécules ont aussi des effets bénéfiques, que ce projet vise à mieux comprendre. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris modifiées génétiquement, dans lequel la production de ROS est altérée uniquement dans les astrocytes. Dans ce projet nous souhaitons évaluer le rôle des ROS dans la maturation des astrocytes en analysant le réseau mitochondrial, le niveau d’expression de gènes impliqués dans la maturation ; mais également la morphologie de ces cellules. Toutes nos analyses seront réalisées à plusieurs stades le naissance jusque chez l'adulte et prendra en compte le sexe de l'animal. Le projet nécessite l'utilisation de 340 animaux sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Aucune étude à ce jour n'a étudié l'importance des ROS astrocytaires sur le développement du système nerveux central. Or les mitochondries jouent un rôle important dans le métabolisme des cellules et permettent leur bon développement. Cette étude permettra d'identifier de nouvelles cibles spécifiques de ces mitochondries astrocytaires et ainsi apporter de nouvelles connaissances sur le développement cérébral et vasculaire.

Procédures

Deux interventions seront utilisées dans ce projet. 1) Injection chez des nouveaux-nés de 1, 2 et 3 jours ou au 4ème jour après la naissance en fonction du modèle utilisé. L'injection dure 1 minute au maximum (temps d'injection et délai avant de retirer l'aiguille pour que la solution ne sorte pas). Elle est sans douleur et ne nécessite pas d'anesthésie. Nombre d'animaux concernés : 340 animaux. 2) Injection à différents temps de développement après la naissance sous anesthésie générale pour visualiser le système vasculaire. Les animaux seront ensuite immédiatement mis à mort sous anesthésie générale. Nombre d'animaux concernés : 180 animaux. Le temps de procédure comprend à la fois l'induction (analgésie et anesthésie), l’injection et la mise à mort, cette procédure n'excède pas 45 minutes.

Impact sur les animaux

Certains lots de souris subiront une injection pouvant entraîner une lègère irritation au point d'injection. Les lignées d'animaux sont déjà existantes et n'induit pas de changement de phénotype.

Devenir

Les animaux utilisés pour les différentes étude (histologiques, cytométrie en flux et biochimique) seront mis à mort afin de préléver les cerveaux et de faire nos analyses.

Remplacement

L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe en développement. De plus l’existence de lignées génétiquement modifiées adaptées à cette étude est uniquement chez la souris. Il n’existe pas d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Nous ne possédons pas assez de données pour réaliser une analyse de puissance. Ainsi, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux par expérimentation : 5) a été évalué au regard de nos données antérieures et de la littérature disponible.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement de l’environnement et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal. Pour chaque intervention pouvant générer de l’inconfort ou de la souffrance, une procédure avec des points limites gradés a été mise en place. Ces points évaluent le bien-être des animaux en se basant sur leur apparence physique, leur mobilité, la prise alimentaire et la présence de nid. Une note de 0 à 3 est attribuée pour chaque critère et le score total permet d’établir un plan d’action pour maintenir/rétablir le bien-être de l’animal. Pour tout protocole nécessitant une anesthésie, des analgésiques seront coadministrés pour limiter toute souffrance à l’animal. Une observation particulière des animaux les jours suivants une intervention sera réalisée. La manipulation des nouveau-nés sera minimisée afin d'éviter tout rejet par la mère.

Choix des espèces

La souris est un mammifère où les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'Homme. Leur génome est entièrement caractérisé, ce qui permet la création de lignées génétiquement modifiées spécialement adaptées pour l’étude de nos questions biologiques. De tels modèles n’existent pas chez d’autres espèces. Les animaux seront utilisés à 4 ou 5 stades de développement post-natals : 5 jours, 10 jours, 15 jours, 30 jours et 60 jours après la naissance. Ces stades correspondent à des moments clés du développement cérébral et en particulier des astrocytes et de leurs interactions avec les vaisseaux sanguins.

1 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs muscles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des gavages ou des injections sous-cutanées, intrapéritonéales ou intramusculaires jusqu'à sept jours par semaine pendant quatre semaines, et un prélèvement sanguin sous anesthésie tous les quinze jours. Le porteur annonce des tests moteurs et comportementaux susceptibles de provoquer un stress léger à modéré et une fatigue passagère, sans préciser lesquels. L'objet réel du projet reste l'évaluation préclinique de quinze produits en cinq ans pour l'industrie agroalimentaire ou pharmaceutique, un passage chez la souris que le porteur qualifie d'"indispensable" pour mesurer les effets sur "l'ensemble de l'organisme".

Objectifs

Les muscles squelettiques assurent de nombreuses fonctions au sein de l’organisme. Aussi, leurs altérations peuvent avoir des répercussions sur la fonction motrice et la qualité de vie des patients. L’industrie du secteur agroalimentaire ou pharmacologique s’oriente vers le développement de produits qui visent à diminuer les états de fatigue ou de faiblesse musculaire. Notre équipe développe un ensemble d’approches expérimentales afin d’évaluer au niveau pré-clinique l’efficacité de nouveaux produits, alimentaire ou pharmacologique, pour le maintien ou l’amélioration de la fonction musculaire. Ainsi, nous envisageons de tester 15 produits en 5 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à évaluer les effets d’approches thérapeutiques innovantes sur la fonction musculaire chez la souris, dans un objectif de transfert vers des populations humaines souffrant de troubles musculaires, notamment les patients atteints de pathologies neuromusculaires et les personnes âgées présentant une perte de la fonction musculaire. L'utilisation du modèle murin permettra également de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dégradation de la fonction musculaire. Les connaissances acquises contribueront à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et à l'élaboration de stratégies innovantes pour préserver ou restaurer la masse et la fonction musculaire. À terme, les résultats obtenus pourront ainsi déboucher sur le développement de traitements efficaces, améliorant significativement la qualité de vie des patients concernés.

Procédures

(1) Prélèvement de sang sous anesthésie gazeuse - Fréquence maximale : 1 prélèvement tous les 15 jours ; durée : 5 min maximum (pous tous les animaux) (2) Gavage - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par gavage) (3) Injection sous-cutanée - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection sous-cutanée) (4) Injection intrapéritonéale - fréquence maximale : 7/7 jour sur 4 semaines, ou 3/7 jours sur 8 semaines ; durée : 5 min maximum (pour les animaux traités par injection intrapéritonéale) (5) Iinjection intramusculaire sous anesthésie gazeuse : fréquence maximale : 5/7j sur une semaine, 1/7j sur 4 semaines ;- durée : 10 min maximum (pour les animaux traités par injection intramusculaire).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables susceptibles d’être observés sont principalement dus aux modalités d’administration retenues ou aux prélèvements de sang réalisés au cours du protocole. Les nuisances attendues sur les animaux sont : (1) inflammation transitoire au niveau du site d’injection (2) fausse-route ou blessure du tractus digestif dans le cas d’administration par gavage (3) traumatisme et douleur transitoire au niveau du site de prélèvement de sang (4) risque infectieux liés à la réalisation de gestes invasifs. Les tests moteurs et comportementaux peuvent induire un stress léger à modéré du fait de la manipulation des animaux et leur isolement temporaire, ainsi qu'un fatigue passagère du fait de la répétition des mesures.

Devenir

A la fin de la durée du traitement, les animaux seront euthanasiés. Plusieurs muscles squelettiques seront ensuite rapidement prélevés pour étudier leur fonctionnalité.

Remplacement

Dans le cadre d’évaluation préclinique d’une nouvelle approche thérapeutique, le passage chez l’animal reste indispensable afin d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme. Aucune méthode alternative ne permet donc actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est limité autant que possible, tout en garantissant des résultats fiables. En raison de la variabilité attendue des réponses aux traitements testés, 15 souris par groupe ont été prévues. Ce nombre permet de détecter des différences significatives entre groupes tout en respectant le bien-être animal et en limitant le nombre d'animaux. Il est basé sur nos expériences passées, où des différences de 20 à 30 % entre groupes ont pu être observées avec ce type d’effectif. Plusieurs mesures sont mises en place pour limiter encore le nombre d’animaux : (1) Utilisation de produits déjà connus comme sûrs (2) Choix réfléchi des groupes de comparaison (3) Suivi répété des mêmes paramètres chez chaque animal (4) Réalisation de tests multiples sur les mêmes animaux, sans nuire à leur bien-être (5) Combinaison de tests in vivo et in vitro sur les mêmes animaux (6) Réutilisation des données de groupes témoins dans des expériences similaires (7) Mutualisation des données issues de groupes recevant un produit de référence.

Raffinement

Les nuisances ou effets indésirables attendus étants principalement dus aux modalités d’administration des produits à tester, des méthodes moins stressantes et moins invasives seront utilisées, tout en tenant compte des contraintes liées au composé à tester (solubilité, stabilité, dose/volume…), les objectifs de l’étude et la pharmacocinétique souhaitée : Liste des actions pour réduire la douleur et le stress des animaux liées au traitement : - Conditionnement positif des animaux à la manipulation/méthode d’administration - Utilisation préférentielle des voies orales volontaires (eau de boisson/alimentation) - Remplacement du gavage par la technique d'administration guidée par micropipette dès que possible - Remplacement des injections intrapéritonéales par des injections sous-cutanés, sans contention. Les méthodes utilisées pour étudier la fonction musculaire des animaux sont validées et non invasives, des périodes d’acclimatation et d’habituation sont systématiquement effectuées. Lors de la réalisation des tests, un renforcement positif par récompense est mis en place pour limiter le stress des animaux. Liste des actions pour réduire la douleur et souffrance des animaux liées aux tests d’exploration de la fonction musculaire - Choix de tests non invasifs pour analyse in vivo de la fonction musculaire, - Prélèvement de sang effectué sous anesthésie générale, - Observation quotidienne des animaux : définition de points d’arrêts anticipés pour identification des souris souffrantes (aspect et comportement général, poids…), exclusion du protocole et euthanasie des animaux ayant atteints ces points d’arrêt. Liste des actions pour réduire l’angoisse des animaux tout au long du protocole - condition d’hébergement selon réglementation, - réalisation des tests fonctionnels et prélèvements dans une salle d’expérimentation différente de la salle d’hébergement, - familiarisation des animaux avec dispositifs expérimentaux avant les essais, - renforcement positif : récompense de l’animale suite à la réalisation des essais, - un expérimentateur et un soigneur dédiés.

Choix des espèces

Le modèle animal est le seul permettant une évaluation de la fonction motrice dans sa globalité. Au stade préclinique, ce modèle permet également de voir non seulement les effets d’un composé sur le système ou une fonction d’intérêt mais également les effets sur l’ensemble de l’organisme. La souris est également un bon modèle pour ce type d’étude incluant de nombreux tests in vivo d’exploration fonctionnelle du fait de sa docilité et de son aptitude à effectuer les différents exercices. Aussi, sa longévité en fait un modèle de choix pour l’analyse des conséquences du vieillissement, modèle validé par des études antérieures. Le stade de développement des animaux sera défini avant chaque protocole et sera adapté en fonction de la nature du projet : Souris de 5-6 semaines pour les souris adultes Souris âgées de de 18 à 24 mois d’âge, pour le modèle d’altération lié à l’âge avec une fonte importante de la masse musculaire (degrés d’atteinte en fonction de l’âge retenu).

Une tonte, une injection de cellules tumorales tuées dans le flanc gauche sous anesthésie, puis huit jours plus tard une injection de cellules cancéreuses vivantes dans le flanc droit sur animal vigile, 70 souris subissent cette séquence, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs tumeurs. Les cellules viennent d'un adénocarcinome du pancréas de souris, modifié pour qu'on puisse en déclencher la mort à volonté. L'hypothèse testée est qu'une mort cellulaire inflammatoire vaccine l'organisme contre la tumeur qui suit. La croissance tumorale est mesurée au pied à coulisse pendant 28 jours, et le porteur annonce des points limites établis sans indiquer à quelle taille de tumeur ils se déclenchent.

Objectifs

Afin de tester l’effet vaccinal d'une mort inflammatoire des cellules issues d'adénocarcinomes du pancréas (PDAC) murines, sur l’induction d’une immunitée anti-tumorale, nous avons introduit dans une lignée de PDAC ( isolées de tumeurs d’animaux mutants portant les mutations sur l'oncogène K-ras et le gène suppresseur de tumeur TP53) une construction permettant d'actionner la mort des cellules sur commande. Sept jours après leur acclimatation, les souris sauvages seront injectées en sous-cutanée avec ces cellules qui auront été préalablement stimulées à mourir puis 8 jours plus tard les cellules PDAC vivantes seront injectées dans le flanc droit des souris. La croissance tumorale sera suivie sur 28 jours avec un pied à coulisse en mesurant la longueur et la largeur de la masse tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si la mort inflammatoire des cellules de PDAC active une réponse immunitaire contre la tumeur en fournissant à la fois les signaux inflammatoires et l’antigène tumoral. Si cette hypothèse est validée par ce test, elle ouvrira la voie d’une étude plus complète sur la séquence de recrutement et d’activation des cellules immunitaires dans ce contexte précis, mais également au développement d’approche thérapeutique basée sur l'outil que nous avons déveoloppé et qui permettra de tuer les cellules cancéreuses de patients de façon ciblée.

Procédures

Les animaux recevront une ou deux injections en sous-cutanée précédées d'une tonte à une semaine d’intervalle l'injection flanc gauche aura lieu sous anesthésiant l'injection flanc droit aura lieu sur animal vigile.Le geste dure moins d’une minute

Impact sur les animaux

Différentes nuisances peuvent être attendues : Stress liés à la contention des animaux et l’injection, et une douleur est éventuellement possible liée à l’injection des cellules mortes et à la pousse tumorale

Devenir

Les animaux entrés dans la procédure développeront des tumeurs. Ils ne pourront pas être ré-utilisés, ils seront mis à mort, et les tumeurs seront collectés pour une analyse anatomopathologique.

Remplacement

Nous avons généré des données solides in vitro en démontrant l’activation des cellules immunitaires humaines qui nécessitent une validation in vivo. A ce jour, pas de méthode alternative possible que le modèle animal car nous avons besoin de tous les acteurs de la réponse immunitaire pour évaluer la réponse anti-tumorale. Néanmoins nous travaillons en parallèle à mettre au point des modèles cellulaires 3D humains dans le but de remplacement futur.

Réduction

L'effet minimal souhaité de l’approche vaccinale serait une réduction de 50% de la pousse tumorale. Le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de l’expérience a été calculé sur la base d’un test statisitqie non paramétrique, non pairé avec un risque de 5% ainsi qu'une puissance de 80%. La simulation projette 20 animaux par groupe. Pour la procédure n°1 qui prépare la procédure N°2, le nombre d’animaux est réduit de moitié car il s’agit d’estimer le comportement de différentes conditions de culture cellulaire afin de déterminer la condition la plus appropriée pour la procédure N°2. Il s’agira de 3 groupes avec 10 animaux par groupes.

Raffinement

Les tumeurs PDAC injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases. Les animaux sont hébergés en groupe, dans un milieu enrichi pour limiter le stress. En cas d’agressivité, surtout des mâles, des bâtonnets de bois seront mis dans les cages. Si l’agressivité persistait le mâle agresseur sera hébergé individuellement de façon temporaire. Des points limites ont été établis entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si necessaire Les souris seront suivies quotidiennement, en cas de douleur de la buprenorphine sera administrée par injection sous-cutanéee. Si une alteration de l’état general de l’animal est observée des aliments gélifiés ou de l’eau gélifié sera utilisé.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux pré́-cliniques sont bien établis chez la souris. De nombreuses lignées cancéreuses syngéniques sont disponibles comme celles du PDAC. Des animaux adultesmâles et femelles âgés de 8-10 semaines seront utilisés. Pour ces expériences de vaccination des animaux adultes avec un système immunitaire mature sont requis