Procédures modérées

46 rats vont être utilisés, tous tués pour prélever et analyser leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection d'antibiotique dans la veine de la queue, puis subit sous anesthésie une ponction de liquide cérébrospinal et un prélèvement de sang, après quatre séances d'habituation au tube de contention. Le porteur signale que l'injection provoque une perte d'équilibre et une attitude prostrée. Tout tient à une mesure de concentration, et les résultats attendus "constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement" de l'antibiotique, formule qui tient le bénéfice pour les patients à bonne distance.

Objectifs

Les infections neuroméningées sont difficiles à traiter de par la présence de barrières physiologiques dans l'organisme protégeant le cerveau. De plus, l'émergence de résistance aux antibiotiques actuels accentuent cette problématique. La recherche de nouveaux antibiotiques pouvant traiter ces infections devient donc un enjeu majeur. L'objectif de ce projet est d'évaluer la capacité d'un nouvel antibiotique à passer la barrière qui protège le cerveau et à pénétrer dans le liquide cérébrospinal et dans le cerveau. L'antibiotique choisit a fait ses preuves dans des infections rénales ou pulmonaires compliquées.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de cette étude chez l'animal constitueront une base scientifique pour envisager, de manière raisonnée, la poursuite du développement de cet antibiotique dans l’indication des infections neuro-méningées chez l'homme.

Procédures

Tous les animaux recevront au cours du projet une injection d'antibiotique de 30 secondes environ, et 2 prélévements (liquide cérébrospinal et sang) seront réalisés sous anesthésie. La durée de l'anesthésie sera de 5 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Injection caudale :légère douleur, brève et transitoire. Injection antibiotique : Perte d'équilibre et attitude prostrée

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement et analyse de cerveaux

Remplacement

Dans les premières phases de développement d'un médicament à visée cérébrale, il est possible d'utiliser des cultures de cellules. Cependant ces cultures ne reproduisent pas la complexité des barrières protégeant le cerveau et elles ne prennent pas en compte l'existence d'autres organes dans lequel le médicament se distribue via la circulation sanguine. Les modèles animaux restent donc nécessaires avant de tester le médicament chez l'Homme.

Réduction

L'étude sera faite en deux étapes ; la première permettra de trouver les conditions optimales d'administration sur un rat par condition. Les résultats seront confirmés dans la seconde étape sur des lots de plusieurs d'animaux. En se basant sur des données de la littérature, nous avons calculé le nombre minimal d'animaux par lot permettant d'obtenir des résultats robustes.

Raffinement

Les rats seront acclimatés pendant 10 jours. Une habituation au tube de contention qui permettra l'injection est prévue : 4 séances de 5 min sur 4 jours différents précédents l’administration . Les prélèvements seront faits sur des animaux anesthésiés sous couverture antalgique. Des points limites gradés ont été établis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations ce qui permettra d'agir sans délai.

Choix des espèces

Nous utiliserons des rats agés de 8 semaines ayant atteint la maturité physiologique, modèle couramment utilisé en pharmacologie. Il s’agit d'une lignée consanguine qui présente une certaine variabilité génétique entre les individus ce qui permet de mieux refléter la diversité génétique observée dans les concentrations d'antibiotiques dans la population humaine. De plus, leurs paramètres physiologiques, métaboliques et anatomiques sont bien connus, cela permet une interprétation fiable des données chez le rat et donc une extrapolation des résultats à l'homme plus robuste.

760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse de leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous anesthésie générale, puis jusqu'à neuf injections hebdomadaires sur animal vigile, la tumeur étant mesurée au pied à coulisse ou par imagerie tous les trois jours. Le composé testé a déjà montré une forte activité antitumorale, y compris sur une xénogreffe de cancer du poumon, ce qui l'oriente selon le porteur vers des essais cliniques. Il écrit qu'il est "absolument indispensable" de passer par un modèle vivant pour confirmer que cette efficacité passe par le système immunitaire.

Objectifs

Les microtubules sont les composants majeurs du cytosquelette de la cellule et sont composés d’un seul type de protéine : la tubuline. Ils sont impliqués notamment dans la division cellulaire et la vascularisation tumorale. C’est pourquoi, en chimiothérapie antitumorale, cibler les microtubules est la stratégie thérapeutique à large spectre la plus efficace. Des petites molécules appelées agents ciblant les microtubules sont responsables de la régulation de la tubuline. Une société a développé un nouvel agent synthétique capable de réduler la tubuline et montrant une forte activité antitumorale ainsi que la capacité à outrepasser les mécanismes de résistance habituels. De plus, cette forte activité est également observée dans un modèle de xénogreffe de cancer du poumon non à petites cellules, orientant ainsi ce composé vers des essais cliniques en tant que nouveau médicament anticancéreux prometteur. Nos résultats in vitro (données non publiées) nous ont aussi permis d’observer que ce composé active la mort cellulaire immunogène, c’est-à-dire que le système immunitaire se retrouve activé par la mort des cellules tumorales. C’est pourquoi, nous souhaitons confirmer in vivo que l’efficacité antitumoral de ce composé synthétique est lié à l’activation du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Notre composé a déjà démontré un fort potentiel in vitro pour le traitement du cancer du poumon. Cette étude in vivo explore le potentiel immunogène et l'efficacité d'un schéma thérapeutique combiné à une immunothérapie conventionnelle par blocage des points de contrôle immunitaire. Ainsi, cette étude préclinique ouvrira la voie à des essais cliniques ultérieurs et à une éventuelle homologation clinique.

Procédures

Les animaux recevront une injection sous anesthésie générale (2min) puis deux injections sous anesthésie locale (vigile,

Impact sur les animaux

Les nuisances découleront des interventions et greffes de cellules tumorales sous anesthésie générale, des injections de traitements, des suivis de croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse ou d’imagerie tous les trois jours. Ces différentes manipulations peuvent entraîner du stress chez l’animal et les croissances tumorales en sous-cutanées peuvent entraîner des douleurs locales et modérées. Une perte d’appétit modérée et donc une perte de poids modérée peuvent apparaître chez la souris suite aux traitements médicamenteux.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour analyse des tumeurs après traitement, post-mortem.

Remplacement

Ce projet ayant pour objectif de tester si notre nouveau composé synthétique induit une réduction de la croissance tumorale avec une activation du système immunitaire, il est donc nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument indispensable pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre minimum d’animaux par groupe statistiquement nécessaire afin de réaliser notre étude. Nous aurons donc 9 animaux par groupe. Une souris supplémentaire a été ajoutée par groupe (soit un total de 9+1 souris par groupe) pour prendre en compte d’éventuelles exclusions d’animaux dans l’étude, telles que des tumeurs hétérogènes au moment du traitement, des problèmes comportementaux, l’atteint précoce d’un point limite, où la mort pendant l’expérimentation. Dans un souci de réduction du nombre des animaux contrôles, nous chercherons à regrouper les expérimentations lors que cela est possible. L’étude sera interrompue si l’hypothèse initiale n’est pas validée lors des premières procédures, les procédures suivantes ne seront pas entreprises. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement afin de détecter tous changements. Nous enrichirons le milieu à l’aide de sizzlenests, tunnels, maisons. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation, des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par plusieurs raisons. Tout d’abord, la souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue, ce qui nous permet un contrôle précis de nos expérimentations. Ensuite, la souris est un animal très utilisé en oncologie, de nombreuses données sont déjà accessibles et utilisables ce qui permet de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Et pour finir, la méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une grande pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à 7 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et un système immunitaire mature.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une restriction alimentaire de trois à six semaines, la pose de canules cérébrales ou d'une pompe osmotique sous la peau lors d'une chirurgie de 45 minutes à une heure, huit injections directement dans le cerveau et des prélèvements de sang à la queue deux à trois fois par semaine. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi l'anorexie mentale persiste chez les patientes, en affamant des souris jusqu'à reproduire leur état de dénutrition. Un amendement ajoute des souris supplémentaires pour "confirmer et valider" des résultats déjà obtenus, et le porteur écrit que des explorations comportementales complexes sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro.

Objectifs

L’anorexie mentale est un trouble des conduites alimentaires qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique et à une détérioration de la santé physique et mentale. Elle a le taux de mortalité le plus élevé de tous les troubles psychiatriques et il n’existe, à ce jour, aucun traitement pharmacologique efficace. D’autre part, les taux de rechute sont importants (>40%) et la pathologieévolue souvent de façon chronique. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’anorexie mentale et son évolution est donc essentielle et représente un enjeu de santé publique. L’objectif de ce projet, mené dans un modèle murin qui mime l’état de dénutrition des patientes, est de déterminer le rôle de facteurs sanguins qui sont dérégulés au cours de la dénutrition chronique, dans la persistance et l’aggravation des symptômes de l’anorexie et qui pourraient expliquer la chronicité de cette pathologie. AMENDEMENT 1: Ajout de souris supplémentaires pour confirmer et valider nos résultats et modification d'une étape du projet pour inclure l'implantation d'une mini-pompe sous la peau qui permet l'administration en continue des molécules mimant les facteurs sanguins dérégulés dans la pathologie humaine et ainsi éviter des administrations répétées.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle murin innovant, rassemblant des facteurs de risque environnementaux de la maladie, peut apporter des éléments de compréhension des mécanismes mis en jeu dans les anomalies du comportement alimentaire dans l’anorexie mentale.

Procédures

Pose de canules cérébrales et/ou pompe osmotique sous anesthésie générale et analgésie: 1 fois, durée environ 45 minutes à 1 heure. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure de la glycémie: 2 à 3 fois par semaine en cours de restriction alimentaire, durée 5 secondes. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure des marqueurs métaboliques : 1 fois au cours de la procédure, durée 60 secondes. Injections pharmacologiques croisées souscutanées: 8 injections, durée 5 secondes. Injections pharmacologiques croisées intra-cérébrales: 8 injections, durée 5 minutes. Durée de la restriction alimentaire : 3 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

Le protocole de restriction alimentaire entraine une perte de poids et une baisse de la glycémie. Les prélèvements sanguins à la queue peuvent provoquer une irritation locale et un stress. L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. Une douleur peut également être associée aux injections d’analgésique et à l’acte chirurgical.

Devenir

Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau afin de permettre des analyses biochimiques ou moléculaires de biomarqueurs en post-mortem dans les différentes structures cérébrales.

Remplacement

Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition, comportement alimentaire, activité motrice) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Une analyse de puissance statistique a permis de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. Les résultats obtenus sont analysés avec des tests statistiques adaptés à chaque procédure. L’utilisation d’un protocole de pharmacologie qui permet de tester l'effet de différents traitements chez le même animal permet de réduire de façon importante le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont surveillés quotidiennement par un personnel compétent pour vérifier leur état physique et comportemental et leur poids est mesuré au moins 3 fois par semaine au cours de la restriction alimentaire. Pour réduire le stress lié à l’isolement ponctuel pour la mesure individuelle du comportement alimentaire, les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi en cages ouvertes permettant de sentir et entendre leurs congénères. La chirurgie est effectuée sous analgésie et anesthésie générale. D’autre part, des grilles de points limites gradés et un arbre décisionnel adaptés à chaque procédure sont mis en place. En fonction des observations faites, des mesures sont prises, à savoir soit des soins quand ceux-ci peuvent être mis en place, soit l’arrêt de l’expérience.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire et des comportements motivés permettant l’étude d’altération du système de la récompense. Les régulations mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études comparatives entre les observations faites chez la souris et certains aspects de la pathologie humaine. L’anorexie mentale fait partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets adolescents et jeunes adultes. Dans ce projet, les procédures sont initiées aux stades équivalents chez la souris.

Chaque jour, du cinquième au trentième jour après l'éclosion, l'image d'un prédateur est projetée trente secondes devant une seiche enfermée seule dans son dispositif, sans échappatoire. 240 seiches vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses neurobiologiques du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Élevées dès le stade œuf dans une eau chauffée et acidifiée selon les scénarios climatiques du GIEC, elles subissent ces expositions pour établir si ces conditions dérèglent leur reconnaissance des proies et des prédateurs. Le porteur présente l'isolement individuel comme respectueux du comportement naturel d'une espèce non sociale et affirme qu'aucun stress extrême n'est atteint, tout en décrivant la seiche comme "particulièrement vulnérable aux changements environnementaux durant ses premiers mois de vie".

Objectifs

L’ objectif de ce projet est de caractériser les effets du changement climatique sur les mécanismes visuels permettant à la seiche commune, Sepia officinalis, de reconnaître les espèces vivantes en tant que proies ou prédateurs après l’éclosion. Plus précisément, dès le stade oeuf, des seiches seront incubées à diverses conditions de température et de pression partielle de CO2 dans l’eau, sur la base des scénarios de changement climatique émis par le Groupe d'experts Intergouvernemental sur l'Evolution du Climat (GIEC). Dès l’éclosion, des stimuli visuels artificiels (vidéo sur écran) spécifiques de mouvements représentatifs de proies ou de prédateurs seront alors présentés aux juvéniles nouvellement éclos, et ce jusqu’à l'âge d’un mois. Les réponses comportementales seront filmées et les effets cérébraux entre les différentes conditions expérimentales seront analysés. Nous émettons les hypothèses que 1) les élévations de températures et CO2 ne vont pas significativement affecter les performances visuelles, mais 2) pourront perturber le traitement des informations visuelles par un dysfonctionnement des mécanismes neuronaux et 3) perturber les stratégies, séquences, et vitesse des réactions d’attaque de proies ou d’évitement de prédateurs.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet, qui vise à déterminer les effets des changements globaux océaniques sur les mécanismes visuels innés impliqués dans la survie des seiches, apportera une contribution majeure à la recherche fondamentale en écologie marine et en biologie sensorielle. À moyen et long terme, il aura également un impact significatif sur la gestion durable des écosystèmes marins. Les seiches jouent en effet un rôle central dans les écosystèmes, en tant que proies, prédateurs, et espèces exploitées par la pêche dans la mer du Nord, au large de l’Afrique de l’Ouest et en Méditerranée. Une meilleure compréhension des effets de ces changements sur la perception et les comportements des seiches contribuera à l’élaboration de stratégies de gestion et de conservation adaptées aux enjeux climatiques à venir.

Procédures

Dans ce projet, les seiches seront maintenues dans des conditions d'eau de mer simulant la température et les teneurs en CO2 en milieu littoral telles qu'attendues en 2100. Ces expositions à différents niveaux de CO2 et de température dureront de la période embryonnaire (variant entre 40 et 60 jours selon les conditions) jusqu'au premier mois de vie des individus juvéniles. Cinq jours après l’éclosion, les seiches seront exposées à un premier stimulus visuel (de type contrôle, proie ou prédateur) pendant 10 minutes. Ensuite, les seiches seront exposées quotidiennement à un stimulus de proie et de prédateur durant 30 secondes chacun jusqu’au trentième jour post-éclosion ou chaque individu sera exposé au premier stimulus reçu au cinquième jour post-éclosion (de type contrôle ou proie ou prédateur).

Impact sur les animaux

Les valeurs choisies de température et de CO2 restent dans la gamme de variabilité naturelle de ces paramètres en milieu littoral et ne sont pas considérées comme extrêmes. Compte tenu de la littérature sur ce modèle, nous nous attendons à un développement embryonnaire plus rapide en lien avec l'élévation de température et à une croissance des juvéniles diminuée. Néanmoins, cela n'entraînera pas d’effets significativement néfastes sur la formation des embryons, le taux d’éclosion ou sur la survie des nouveaux-nés. Des nuisances comportementales et émotionnelles sont attendues en lien avec l’exposition à des stimuli visuels de prédateurs sans échappatoire, pouvant provoquer un stress modéré et temporaire (pendant le temps d’exposition au stimulus visuel).

Devenir

Les 240 seiches utilisées dans ce projet seront mises à mort. Cette procédure est justifiée par la nécessité de réaliser des analyses neurobiologiques approfondies afin de déterminer les structures et mécanismes potentiellement altérés par les changements de température et de CO2.

Remplacement

Ce projet cherche à comprendre comment le changement climatique peut influencer la façon dont les seiches voient et réagissent à leurs proies ou à leurs prédateurs. Pour cela, il est indispensable d'observer le comportement de seiches vivantes et conscientes. Il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico permettant de reproduire les mécanismes visuels étudiés et les comportements. Par conséquent, la substitution d'animaux dans ce projet n'est pas envisageable.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé grâce à des tests statistiques. Le nombre de conditions expérimentales a été réduit au strict nécessaire, et les observations seront optimisées grâce à l’enregistrement vidéo et une analyse automatisée des comportements. Ces choix permettent de maximiser les données recueillies par animal.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet, plusieurs mesures de raffinement sont mises en place afin d’assurer le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation. Une semaine avant l’éclosion, les œufs seront transférés dans les dispositifs expérimentaux individuels (un dispositif par seiche), où les individus resteront jusqu’à la fin de la procédure. Étant une espèce non sociale, la seiche ne présente pas de besoin spécifique d’interactions avec ses congénères. L’isolement des individus permet donc non seulement de respecter leur comportement naturel, mais aussi de limiter le stress associé aux manipulations et aux transferts entre bacs, tout en garantissant un contrôle précis de leur environnement visuel. Chaque dispositif est équipé d’une zone d’ombre accessible à l’animal, lui offrant la possibilité de se camoufler, conformément à son comportement naturel. De plus, les expositions à différents niveaux de température et de CO2, bien que modélisées sur les projections climatiques futures, restent dans des gammes compatibles avec les variations naturelles ponctuellement observées dans l’habitat des seiches. Aucun seuil sublétal, létal ni niveau de stress extrême n’est atteint dans le cadre de ces conditions expérimentales. Enfin, nous avons établi une grille de scores pour permettre un suivi rigoureux et individualisé de chaque seiche. Ce système permet une détection précoce des signes de détresse ou de dégradation de l’état général, et l’adaptation rapide des soins (changement d’eau, nourrissage surveillé) ou l’interruption de l’expérimentation si nécessaire.

Choix des espèces

En tant qu’espèce centrale des écosystèmes marins et particulièrement vulnérable aux changements environnementaux durant ses premiers mois de vie, la seiche constitue un modèle idéal pour étudier les impacts du changement climatique sur les mécanismes innés qui lui permettent de survivre au cours de cette période critique. L’expérience prévue dans ce projet sera menée au cours du premier mois suivant l'éclosion des animaux, période comprenant les étapes cruciales du développement cérébral, comportemental et cognitif de la seiche.

Une injection déclenche une fibrose rénale, puis deux à six injections ou gavages de molécules suivent, avec des collectes d'urine obtenues par contention. 280 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leurs reins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage et les injections enflammer le site de piqûre, alors que le porteur écrit que ces souris "ne présentent aucun phénotype dommageable". Sur la réduction, il indique avoir dimensionné les groupes avec un plan d'expérimentation, sans donner un seul chiffre justifiant les 280 animaux.

Objectifs

La fibrose est une augmentation anormale de la quantité de tissu conjonctif fibreux dans un tissu ou un organe. Cette fibrose entraine des défauts d'organes puisque les cellules spécialisées de l'organe sont remplacées par des fibres non fonctionnelles d’où le nom de fibrose. Les maladies fibrotiques, telles que la fibrose rénale associée à l’insuffisance rénale chronique (IRC), constituent des enjeux thérapeutiques majeurs en raison de l’absence de traitements curatifs. Des résultats récents suggèrent que des récepteurs cellulaires de molécules présentes dans le rein lors de l'IRC jouent un rôle prépondérant dans l’initiation et la progression de la fibrose rénale. Dans ce projet, nous allons tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant ces facteurs pro-fibrotiques dans un modèle murin de fibrose rénale. L’évaluation du degré de fibrose rénale après traitement avec les molécules innovantes permettra d’évaluer le potentiel thérapeutique de ces molécules pour traiter les patients atteints de fibrose rénale.

Bénéfices attendus

Les résultats générés par ce projet permettront d’envisager la mise en place en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant la fibrose rénale et ainsi d’améliorer la prise en charge des patients souffrant d’insuffisance rénale chronique.

Procédures

Les animaux recevront une injection pour induire la fibrose rénale. Les molécules thérapeutiques seront ensuite administrées par injections (2 à 6 maximum) ou par gavage. Durée des injections : 3 à 5 secondes. Durée des gavages : environ 10 secondes. Les collectes d’urines permettant de suivre la fonction rénale se feront par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ne présentent aucun phénotype dommageable. Le produit injecté en début d'étude va entrainer une fibrose rénale qui peut avoir des conséquences sur l’état de santé général des souris. Les injections répétées des produits thérapeutiques peuvent occasionner une gêne et une inflammation au niveau du site d’injection. Les gavages répétés peuvent induire une gêne et une irritation de l’œsophage. Les contentions pour traitement et prélèvement d’urine peuvent occasionner un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques de leurs reins.

Remplacement

Les composés thérapeutiques innovants que nous testerons dans ce projet on fait l’objet d’études in vitro préliminaires. Néanmoins, le but de ce projet est de définir le potentiel thérapeutique de ces molécules dans l’apparition de la fibrose rénale. La complexité des processus cellulaires responsables de la fibrose ne peut être étudiée que dans un modèle in vivo intégrant tous ces facteurs.

Réduction

Pour cette étude nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et ainsi de garantir l’obtention de résultat pertinents biologiquement et exploitable tout en minimisant le nombre d’animaux.

Raffinement

Notre expérience sur le modèle nous a permis d’adapter la fréquence de suivi et de préciser les différents points d’observation clinique qui caractérisent de manière précoce et prédictive les points limites. Ainsi nous accélèrerons la fréquence de suivi de animaux et de pesé dès la deuxième semaine après traitement afin de s’adapter à la cinétique réelle d’apparition de la maladie. Un examen clinique sera réalisé 2 à 3 fois par semaine dès le début des études et le remplissage d'une grille de score lors de ces examens cliniques permettra de déterminer de façon objective le devenir de l'animal.

Choix des espèces

Le but de ce projet est de tester l’effet thérapeutique de molécules innovantes ciblant la fibrose rénale. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’être humain. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal qui n’est pas encore altéré par le vieillissement.

Capturés, anesthésiés, incisés pour recevoir une puce puis remis à l'eau, 992 poissons sauvages de treize espèces vont être marqués dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'opération dure environ une minute et se fait sans point de suture, les poissons pouvant garder plusieurs semaines une inflammation ou une gêne au site d'implantation. Le suivi porte sur le franchissement de quatre ouvrages récemment aménagés sur un cours d'eau, pendant trois ans. L'effectif de 992 individus, environ soixante-dix par espèce, a été calculé en intégrant un taux de rejet des marques et un taux de mortalité que le porteur ne chiffre pas.

Objectifs

L’objectif est d’effectuer une étude des déplacements piscicoles au droit des 4 ouvrages récemment aménagés sur un cours d’eau. L’étude des déplacements par télémétrie (à l’aide de la technologie RFID) vise à analyser si la libre circulation des poissons holobiotiques sur les sites étudiés. Le suivi aura également pour objectif de comprendre les relations entre le cours d’eau naturel et le canal adjacent. L’étude des déplacements permettra en complément d’analyser : - l’attractivité du cours d’eau naturel sur le site le plus amont grâce à l’installation de 2 antennes ; - la fréquentation piscicole de l’ensemble des sites avec une analyse saisonnière - le taux de transfert entre les différents sites Le projet est étalé sur 3 années afin d’observer la saisonnalité des déplacements piscicoles (reproduction, alimentation, hivernage) mais également pour prendre en compte les variations interannuelles de l’hydrologie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont d'ordres écologiques. Il permettra d’évaluer la libre circulation des poissons après les travaux et d’identifier des points de blocages dans le cas contraire. Il permettra également de connaître les mouvements piscicoles entre le cours d’eau naturel et le canal.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédures chirugicale d'un maximum d'une minute.

Impact sur les animaux

Voici la liste des nuisances ou effets indésirables sur les animaux : stress lié à la capture et à la manipulation, effets de l’anesthésiant, effets post-opératoire (inflammation liée à l’implantation ou gêne locale pouvant aller jusqu’à quelques semaines), altération temporaire du comportement (lié au stress, à l’implantation, à l’anesthésie pouvant aller jusqu’à quelques heures).

Devenir

Les animaux sont replacés dans leurs milieu naturel à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’objectif du projet étant d’évaluer la capacité des poissons à franchir différents ouvrages aménagés, il est indispensable d’observer les comportements individuels de déplacement en milieu naturel. Le remplacement n’est donc pas envisageable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été limité au minimum nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, tout en garantissant la puissance statistique pour l’analyse des déplacements piscicoles. Un minimum de 30 individus par espèces ou groupes d’espèce est necessaire pour mener des analyses robustes. En fonction du taux de redétection, du taux de rejet et du taux de mortalité, le total de poisson à marquer va donc s'élever à 992 individus soit environ 70 individus par espèce. Après études des inventaires piscicoles réalisés annuellement par la Féderation de pêche du département, le choix des espèces s’est porté sur les suivantes : Anguille européenne, Gardon, Brèmes, Hotu, Brochet, Perche, Carassin, Rotengle, Carpe, Tanche, Chevaine, Vandoise, Barbeau.

Raffinement

La technologie utilisée permet un marquage rapide, peu intrusif et avec une durée de suivi illimitée. Aucune autre méthode n’offre un rapport aussi favorable entre impact sur l’animal et précision des données. Les opérations d'implantation sont réalisées sous anesthésie et ont la durée la plus courte possible soit environ 1 min. Le poids de l'émetteur ne dépasse pas 2% du poids de l'individu. Concernant le marquage, les solutions d'anesthésiant sont changées tous les 20 individus. Les poissons sont manipulés à l'aide d'épuisette en maille en silicone pour éviter l'abrasion provoquée par les mailles classiques en nylon. D’après les retours d’expériences, il est plus bénéfique de ne pas faire de point de suture pour les petits émetteurs. En effet, le faible diamètre des puces (3mm) permet incision limité ne necissitant pas de suture. Un pansement de povidone iodée est appliqué sur la cicatrice du poisson, ayant un effet antiseptique dans les heures suivant le marquage. Lors des stabulations pré et post marquage, les poissons sont placés dans des volumes d'eau adaptés aux espèces, une pompe à air à grande capacité permet de maintenir le taux d'oxygène adapté et une limitation à l'exposition à la lumière est prévue. La température est également contrôlée pour éviter le stress thermique. Afin de limiter le stress, les poissons sont relâchés le plus rapidement possible (

Choix des espèces

Les espèces piscicoles choisies dans le projet correspondent à celles présentes dans le milieu local. Elles ont été tirées des inventaires de pêches de la Fédération de pêche locale. Il prend en compte un large spectre d’espèce que ça soit en taille, capacité de nage ou comportementale (espèce de fond, prédateur…) afin d’avoir la meilleure représentativité possible. Les stades de développement étudiés seront les stades adultes ou juvénile (dans la mesure ou le poids de l’émetteur ait un poids inférieur à 2% de celui de l'individu).

440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue en raison du volume de sang prélevé ou de l'injection de cellules tumorales. Selon la procédure, chacune reçoit une injection éveillée et une ou trois autres sous anesthésie, puis une prise de sang de 20 minutes au plus sous anesthésie, ou la pose d'un cathéter intraveineux et une chirurgie qui peut durer 3 h 30 avec l'observation au microscope. Sous anesthésie, leur respiration peut devenir irrégulière ou marquer des apnées, et les molécules antiplaquettaires injectées peuvent provoquer des saignements. L'objectif est de savoir si le blocage du récepteur plaquettaire GPIb, avec deux agents conçus par l'équipe et des souris mutées qui expriment ce récepteur sous sa forme humaine ou en sont dépourvues, réduit les interactions entre plaquettes et cellules tumorales aux premières étapes de la formation de métastases. Le porteur affirme que "les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués" pour reproduire ce processus, puis annonce des études in vitro préalables sur des plaquettes et des cellules tumorales humaines.

Objectifs

Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont également impliquées dans diverses pathologies, notamment la thrombose artérielle, les processus inflammatoires et les cancers. Il est connu que les plaquettes favorisent le développement de métastases. Malgré l’implication des plaquettes, les traitements anti-plaquettaires actuels ne peuvent pas être utilisés en clinique chez des patients présentant un cancer en raison du risque de saignement qui y est associé. Le récepteur plaquettaire GPIb assure l’interaction entre les plaquettes et le facteur Willebrand conduisant à l’arrêt du saignement. Il est également une cible antithrombotique connue de par son rôle important dans la croissance du caillot. Nous avons généré 2 agents ciblant ce récepteur et bloquant son interaction avec le facteur Willebrand. Leur effet sur la thrombose a préalablement été validé, tout comme l’absence d’induction de saignement. Il a été montré dans la littérature que la GPIb plaquettaire serait impliquée dans la formation de métastases. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle de la GPIb dans la formation de métastases afin d’identifier une nouvelle cible pour réduire les interactions plaquettes – cellules tumorales et potentiellement réduire le développement de métastases dans le cadre de cancers du poumon, du sein et de la peau.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont l’éventuelle observation d’une réduction de l’interaction des cellules tumorales avec les plaquettes lorsque le récepteur GPIb est inactif. Un effet attendu serait également une réduction de la formation des métastases. L’identification d’un tel effet pourrait mener au développement d’un nouveau traitement permettant de réduire la formation de métastases et donc mener à une meilleure prise en charge des patients atteints de cancer.

Procédures

Pour la première procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et une injection sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié est réalisé (maximum 20 min). Pour la seconde procédure, les animaux sont soumis à une injection sur animal vigile et 3 injections sur animal anesthésié (moins d’une minute chacune). Un cathéter intraveineux est mis en place et une procédure chirurgicale est réalisée (maximum 3h30, observation au microscope comprises).

Impact sur les animaux

Une des nuisances attendue est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). On pourra également observer une douleur localisée de courte durée après les injections. On pourra observer d’éventuels saignements dus à la nature antiplaquettaire des molécules injectées.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux sont mis à mort car la quantité de sang prélevée n’est pas compatible avec un maintien en vie des animaux. De même, l’injection de cellules tumorales ne permet pas un maintien en vie des animaux pour réutilisation dans une procédure ultérieure.

Remplacement

Le processus de formation de métastases étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types de cellules (plaquettes, globules blancs, cellules endothéliales, cellules tumorales etc), l’environnement de la tumeur ainsi que les conditions de flux sanguin (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. Nous disposons néamoins de modèles in vitro qui permettront d’étudier au préalable ce processus avec des plaquettes et des cellules tumorales humaines.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum. Ces effectifs permettent l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Une habituation est prévue 5 jours avant le début de l’expérimentation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: •Par l’hébergement en groupes sociaux. •Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée des procédures. •Par l’injection d’antalgique et d’analgésiant aux site d’incisions et application d’anesthésique local sur l’oeil •Contre la déshydratation, une injection de sérum physiologique est réalisée avant la procédure. •Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant la procédure. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de cancer. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant un récepteur humain permettant d’étudier l’effet de nouveaux traitements ciblant ce récepteur. De même, cela a permis la génération de souris déficientes pour ce récepteur. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois pour toutes les procédures. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement.

1 200 souris et 150 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit trois injections de vaccin sous anesthésie, espacées de quinze jours sur soixante jours, et subit cinq prélèvements de sang, avec une fièvre, une perte d'appétit et un gonflement au point d'injection attendus pendant un à deux jours. Il s'agit de tester de nouveaux adjuvants censés déclencher une réponse cellulaire cytotoxique que les adjuvants autorisés chez l'humain n'obtiennent pas. Le porteur écrit vouloir démontrer que ses modèles cellulaires pourraient à terme remplacer les animaux, et tire de cette comparaison même la "nécessité de l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques".

Objectifs

Les vaccins protéiques sont une classe de vaccins qui utilisent des protéines spécifiques de pathogènes pour stimuler une réponse immunitaire protectrice chez l'organisme. A cette composante protéique est ajouté un adjuvant afin d’obtenir une réponse immunitaire capable de protéger contre le pathogène ciblé. A ce jour, les adjuvants acceptés chez l’homme induisent de bonne réponses anticorps, mais la réponse cellulaire cytotoxique est très faible. Ces vaccins protéiques sont donc à ce jour peu efficaces pour protéger des infections virales. Nous avons développé de nouveaux adjuvants dans le but d’augmenter fortement cette réponse cellulaire cytotoxique. Nous avons développé de plus des stratégies pour limiter les effets secondaires tel que fièvre, inflammation locale… Nous nous proposons maintenant de tester ces candidats adjuvants chez le rongeur sur un modèle de vaccination très classique nous permettant d’évaluer la réponse immunitaire ainsi que vérifier l’absence d’effets secondaires importants.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but premier de trouver de nouveaux adjuvants pour des vaccins protéiques capable d’induire une bonne réponse immunitaire humorale et cellulaire importante sans générer d’effets secondaires importants. Il est important de noter qu’à ce jour il n’y a pas d’adjuvants réellement efficaces pour les vaccins protéiques qui permettent d’obtenir une bonne protection contre les pathogènes viraux. Ce projet pourrait permettre de mettre au point des vaccins contre des maladies virales pour lesquelles il n’existe aucun vaccin efficace à ce jour.

Procédures

Les animaux anesthésiés auront 3 injections de vaccins (temps injection 1 min max) espacés de 15 jours sur une durée de 60 jours. Cinq prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal (temps prèlèvement 1 min maximum) et sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sont ceux attendus après une vaccination : Une rougeur locale au site d’injection, un petit gonflement, une induration, et une douleur au toucher pourront être observés, leur intensité est légère à modérée sur une durée de quelques heures à 1 jour. De la fièvre, une perte d’appétit et des poils hérissés peuvent également apparaître et persister en théorie de 1 à 2 jours, entraînant une nuisance modérée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever des tissus dans le but d’étudier au mieux la réponse vaccinale.

Remplacement

Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’avoir un système immunitaire complet pour mesurer l’immunogénicité et la réactogenicité de nos formulations vaccinales. Le recours à des animaux semble donc inévitable à ce jour. L’un des buts de ce projet est aussi de démontrer l’intérêt de nos modèles cellulaires ainsi que nos modèles de diffusion /relarguage in vitro pour remplacer ou fortement diminuer à terme l’utilisation des animaux. Mais, pour obtenir cet objectif, nous devons comparer les réponses entre modèles cellulaire et modèles animaux, d’où la nécessité de l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Chaque expérimentation chez la souris est réalisée avec un maximum de 8 groupes de 6 souris. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé à partir des publications de vaccination. D’après notre expérience, il est suffisant pour permettre à l’expérimentation de mettre en évidence des différences significatives sur le titre anticorps entre les groupes, notre critère majeur. Ces expériences chez la souris permettront de déterminer une ou 2 formulations vaccinales optimisées qui seront ensuite testées chez le rat. Les expérimentations chez le rat sont réalisées sur un maximum de 3 groupes de 5 rats. Ce nombre restreint permet de garder suffisamment d’animaux par groupe pour réaliser des études statistiques significatives.

Raffinement

Les animaux sont anesthésiés avant chaque injection ou prélèvement pour limiter au maximum le stress et la douleur. Les animaux immunisés ne sont pas censés avoir de troubles de leur santé suite à l’injection des candidats vaccins. Une réaction locale au niveau du site d’injection ou de la fièvre peut cependant être induite par la réponse immunitaire innée de l’animal vis-à-vis du vaccin. Une surveillance particulière avec examen clinique individuel 4h et 24h après injection sera réalisée en plus de la surveillance quotidienne. Une grille de « scoring » permettra de mettre en place un traitement pour palier à la douleur que pourrait ressentir l’animal. A l’aide de cette grille de scoring, les éventuels signes cliniques de douleur (locale ou générale) sont détectés, et un traitement d’analgésique locaux ou injectable est appliqué pour y remédier. Dans le cas exceptionnel de douleur non maitrisée par ces traitements, les animaux sont immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les espèces animales sélectionnées, souris et rats, sont les espèces couramment utilisées pour les premiers tests de vaccination : la souris est utilisée dans un premier temps car notre modèle d’étude est le modèle immunologique de référence chez la souris. Dans un second temps, le rat est utilisé comme second modèle car sa taille plus importante permet d’avoir une première idée de l’extrapolation des doses injectables à un plus gros animal. Ces expériences seront réalisées sur des souris ou rats adultes matures âgées de 8 à 12 semaines. A cet âge, le système immunitaire est totalement développé.