Procédures modérées
Cellules souches et réparation osseuse chez la souris – 8
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Des points limites et une grille de scoring déclenchent la mise à mort anticipée des souris dont l'état se dégrade après la fracture. 370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des tissus osseux, dont 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent sous anesthésie une fracture ou un défaut cortical de trente à quarante-cinq minutes, parfois une greffe, une injection de vecteurs viraux de vingt minutes, et reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection intrapéritonéale, pour étudier les cellules souches de la réparation osseuse. Le porteur décrit des animaux qui "boitent les premiers jours" mais gardent "une activité normale dans la cage", alors que 300 des 370 relèvent d'un niveau de souffrance sévère.
Objectifs
Cette étude préliminaire vise à valider l’utilisation de lignées de souris transgéniques et un nouveau protocole de ciblage génique pour élucider les mécanismes de la régénération osseuse. La régénération osseuse a lieu dans un environnement tissulaire complexe impliquant les os, les vaisseaux sanguins, les nerfs, les cellules inflammatoires et le muscle adjacent à l’os. Nous cherchons à comprendre le role des cellules souches qui sont essentielles à la réparation et dont la fonction dépend de cet environnement complexe. En utilisant des modèles de souris, nous explorons le rôle des cellules souches et des gènes impliqués dans la réparation osseuse. Ces modèles nous permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’évaluer leur potentiel pour des applications humaines. En effet de nouveaux traitements sont nécessaires pour corriger les défauts de consolidation après fracture. Ces défauts peuvent etre liés aux maladies du système musculosquelettique ou à un traumatisme sévère. Actuellement, la chirurgie et les greffes osseuses sont les principaux traitements, mais la thérapie cellulaire ou des traitements pharmacologiques pourraient offrir des solutions innovantes. Dans ce projet nous nous concentrons sur le role de la vascularisation, sur une nouvelle population de cellules souches osseuses et sur une nouvelle mutation entrainant la pseudarthrose congénitale de jambe, une déficience sévère de réparation osseuse. Ce projet multisite est réalisé dans les 2 établissements utilisateurs concernés.
Bénéfices attendus
Les fractures sont les blessures les plus fréquentes du système musculosquelettique. Bien que la réparation osseuse soit un processus très efficace, environ 20% des fractures présentent un retard ou absence de réparation. Le traitement de ces défauts de réparation est complexe, nécessitant généralement une prise en charge chirurgicale. Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la régénération osseuse en condition physiologique et pathologique. D’un point de vue fondamental, il permettra une meilleure compréhension du rôle des différents acteurs cellulaires et de différentes voies de signalisation. Il s’agit également d’un projet permettant l’étude de nouveaux traitements sur les défauts de régénération osseuse. Les potentielles applications cliniques sont concrètes et ouvrivont la voie à l’utilisation de ces traitements chez les patients.
Procédures
L’administration du Tamoxifène ou de molécules est réalisée par injection intraperitonéale ou gavage. La greffe et la blessure osseuse (fracture, défaut cortical) sont réalisées sous anesthésie générale avec une analgésie péri- et post- opératoire (durée de la procédure entre 30 et 45 min). L’injection d’AAV est réalisée sous anesthésie générale à l’isoflurane (3 à 4% en induction ; durée de l’injection ou du scan est 20 minutes/souris). Une analgésie péri-opératoire est utilisée pour l’injection AAV. Il s’agit d’un projet multisite et chaque intervention est réalisée dans les 2 établissements utilisateurs.
Impact sur les animaux
Après injection de Tamoxifène ou EdU, les animaux sont observés quotidiennement jusqu’au prélèvement. Les animaux utilisés pour l’induction locale par le gel d’Endoxifène reçoivent une dose supplémentaire de buprénorphine dans les 24h après l’opération. De plus, la plaie sera examinée pendant le suivi des animaux. En cas de signes de souffrance (mauvaise apparence physique, diminution de l’activité) ou d’infection (rougeurs, animaux léchant leur plaie), les réponses appropriées seront mises en place (voir grille de scoring ci- dessus). Le processus de régénération osseuse est spontané. Le cal est formé en une semaine stabilisant la fracture et les animaux sont guéris après 3 semaines lorsque le cal est entièrement ossifié. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et présentent une apparence physique externe normale. Les effets tels que la douleur et la mobilité réduite sont généralement limités aux premiers jours. Les animaux retrouvent leur pleine mobilité par la suite. Un traitement antalgique et un suivi quotidien seront effectués, et nous nous référons à une grille de scoring afin d'agir sur le bien-être des animaux lorsque nécessaire.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de l’ensemble des procédures afin de permettre l’analyse tissulaire et cellulaire des tissus osseux.
Remplacement
Le processus de régénération osseuse est complexe et implique de multiples types cellulaires, dont l’activité coordonnée et les interactions sont indispensables. Ces évènements ont lieu dans un environnement tissulaire complexe impliquant des interactions entre l’os, les vaisseaux, le système immunitaire, le système nerveux et les muscles. Expérimentalement, il n'est pas possible de reproduire la complexité de cet environnement dans un système cellulaire in vitro, et il est nécessaire de recourir à l’utilisation de modèles murins. En utilisant des modèles de souris et des modèles de blessure osseuse, nous explorons le rôle des cellules souches et des gènes impliqués dans la réparation osseuse. Ces modèles nous permettent également de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques et d’évaluer leur potentiel pour des applications humaines.
Réduction
Notre expérience antérieure nous permet de définir un nombre réduit de temps clés à analyser au cours de la régénération osseuse pour rendre compte de l’ensemble du processus. Par ailleurs, nous avons établi qu’une taille d'échantillon de 10 animaux par groupe est suffisante pour fournir des résultats statistiques valables
Raffinement
Le processus de régénération osseuse est spontané et est complet en moins de 3 semaines. Les animaux sont suivis de façon régulière. Ils boitent les premiers jours mais ont une activité normale dans la cage (marchent, grimpent, boivent, se nourrissent etc...) et présentent une apparence physique externe normale. Nos expérimentations sont accompagnées d’une analgésie en péri- et post-opératoire. Des points limites ont été définis et permettent un suivi efficace des animaux et la mise en place de réponses adaptées le cas échéant grâce à une grille de scoring. Pour le bien-être animal, des enrichissements (coton, maisonnette et papier) sont placés dans les cages.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour étudier les mécanismes de la réparation osseuse, car les étapes de réparation ressemblent aux étapes observées chez l’homme. La souris permet d’analyser les bases génétiques de la réparation osseuse normale ou pathologique grâce aux nombreux outils cellulaires et moléculaires à notre disposition. Les procédures sont réalisées sur des animaux aux jours 5-14 postnatal et des animaux adultes entre 2 et 16 mois.
Etude de l’efficacité d’une nouvelle formulation vaccinale BCG chez le furet
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Douze furets reçoivent un vaccin BCG par voie orale puis une administration intratrachéale de BCG recombinant, avec huit prises de sang et un lavage broncho-alvéolaire répartis sur dix-huit semaines, la plupart de ces actes sous anesthésie générale de quinze à trente minutes. Ces douze individus, six vaccinés et six témoins, subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et le fournisseur est chargé de castrer les mâles avant livraison. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animaux ne reproduit la complexité du tissu pulmonaire, et présente le furet comme un bon modèle pour "remplacer" le blaireau, espèce sauvage réellement visée par ce vaccin vétérinaire mais dont l'expérimentation est plus lourdement encadrée. Tous seront mis à mort pour prélever trachée, poumons, ganglions et rate.
Objectifs
Ce projet s’inscrit dans un projet scientifique visant à étudier la vaccination contre la tuberculose dans la faune sauvage. Le champ d’application du vaccin est donc vétérinaire. Le furet et le blaireau sont deux espèces sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Notre partenaire pour ce projet, a validé la pertinence du furet comme modèle du blaireau pour l’infection à Mycobacterium bovis. Les objectifs sont d’analyser l’influence de la voie de vaccination orale sur la mise en place d’une réponse immunitaire contre les mycobactéries. Les protocoles précédents ont permis : 1/ de prendre en main le modèle furets et de développer des outils afin d’analyser la réponse immunitaire induite chez le furet. 2/ de valider les outils développés dans le protocole 1 et l'efficacité de l’administration du vaccin par voie orale. Le protocole 3 (proposé dans cette DAP) a pour objectif de tester l’efficacité de la réponse vaccinale induite par l’administration, par voie orale, du vaccin BCG formulé . L’intérêt de la formulation est de potentialiser la mise en place de la réponse vaccinale par rapport à du BCG non formulé (c’est-à-dire augmenter l’intensité des réponses immunitaires et/ou leur durée sans augmenter la dose d’antigène). La formulation améliore aussi la stabilité du vaccin. Le choix de la formulation vaccinale a été réalisé par notre partenaire qui a testé 4 formulations. L’innocuité de la formulation a été validée in vivo sur modèle furet par notre partenaire. Dans ce protocole, nous allons analyser les réponses immunitaires des animaux et valider ou non l’efficacité de ce nouveau vaccin. Le présent projet est prévu pour au maximum 12 furets : un lot de 6 animaux vaccinés (BCG formulé) administré par voie orale et un lot de 6 animaux témoins non vaccinés recevant un placebo par voie orale. Les 2 lots sont ensuite challengés par administration de BCG recombinant (fluorescent) par voie intratracheale. Ce projet a pour but de vérifier à l’aide d’un challenge avec un BCG recombinant (fluorescent) l’efficacité de la réponse vaccinale induite par la vaccination BCG par voie orale. L’intégralité du protocole (vaccination et épreuve) est réalisée avec la souche vaccinale BCG utilisée en médecine humaine. Nous restons donc sur un modèle d’infection non virulente.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de valider l’efficacité de la réponse vaccinale induite par la vaccination BCG par voie orale permettant la mise en place d’une protection optimale contre les mycobactéries. Ce projet nous permettra de definir les corrélats de la protection contre une exposition mycobacterienne qui sont induits dans le poumon et dans le sang par la vaccination orale au BCG.
Procédures
Au cours des 18 semaines du projet, chaque furet sera soumis au maximum à : 1/ Un traitement anti-parasitaire et son rappel si besoin (1 à 2 min) 2/ 1 pose de puces télémétriques qui durent quelques secondes 3/ 8 prises de sang : au maximum 1 prélèvement par semaine. Une prise de sang dure quelques secondes 4/1 LBA (lavage-broncho-alvéolaire) qui dure 2 à 5 min 5/ 1 administration par voie orale d’un vaccin BCG qui dure quelques secondes 6/ 1 administration en intra-trachéale d’un vaccin BCG recombinant, qui dure quelques secondes Tous ces actes, hormis la vermifugation et l’administration par voie orale se feront sous anesthésie générale pendant 15 à 30 minutes selon la nature et le nombre d’actes effectués
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pourraient être liés à une mauvaise réaction des animaux à l’anesthésie générale ou à un des gestes techniques qui induirait une réaction inflammatoire locale, un hématome ou une infection. Les injections et prises de sang peuvent engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection/prélèvement. Les administrations par voie orale et par voie intra-trachéale peuvent engendrer une légère irritation de la trachée. L’ensemble de ces interventions peuvent générer du stress pour les furets.
Devenir
La totalité des animaux sera mis à mort à l’issue du projet. Des prélévements de tissus seront réalisés par les concepteurs : trachée, poumons, ganglions, rate... pour des analyses.
Remplacement
A ce jour, il n’existe aucun système in vitro ou méthode alternative permettant de reproduire la complexité du tissu pulmonaire et les processus complexes de recrutement des cellules immunitaires. Le blaireau est l’espèce cible pour l’étude de la tuberculose mais les expériences sur cette espèce sauvage sont difficiles à mettre en œuvre. Cependant, il a été démontré par la communauté scientifique que le furet est un bon modèle pour remplacer le blaireau.
Réduction
Pour ce projet, le nombre minimal d’animaux a été fixé à 6 par lot pour favoriser d’une part le lien social entre les animaux (hébergement en couple) et pour avoir suffisamment d’échantillons biologiques qui soient statistiquement pertinents pour la suite du projet. En fonction de ce que le fournisseur sera en mesure de nous fournir au moment de la commande, le sexe ratio de chaque lot pourra être adapté. L’expérimentation contient 2 lots d’animaux : un lot de 6 animaux vaccinés au BCG par voie orale puis challengés par administration de BCG recombinant (fluorescent) par voie intratracheale et un lot de 6 animaux témoins non vaccinés recevant un placebo (du PBS par voie orale) puis challengés par administration de BCG recombinant (fluorescent) par voie intratracheale. Le nombre d’animaux utilisés pour fournir des échantillons a été déterminé grâce à un test statistique de calcul de la puissance ou de l'effectif nécessaire en utilisant un test de comparaison de deux échantillons indépendants. Un maximum d’analyses sera effectué sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, évaluation de la charge vaccinale).
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d’acclimatation de 4 semaines sera respectée pour habituer les animaux aux interventions du personnel (manipulations, jeux, friandises). Ils seront uniquement vermifugés et un test de formulation sans BCG avec du Chitosan sera proposé (200µL par voie orale) pour vérifier la prise par les animaux. Pour leur bien-être, la pose d’implants hormonaux et de puces télémétriques se fera donc après la phase d’acclimatation au cours de la même anesthésie générale. Pour limiter les blessures infligées par les mâles sur les femelles, nous demanderons une castration des mâles par le fournisseur. Les animaux seront hébergés dans des cages conçues pour le furet. Chaque furet disposera de sa propre cage connectée par 2 avec un tunnel pour se regrouper. Un hamac en tissu sera suspendu permettant aux furets d’avoir un coin de repos. Différents jouets seront utilisés (balle, jouets en plastique dur, tissus…). Des récompenses alimentaires (saumon, jus de thon, pâte appétente) seront données après les interventions sans anesthésies et dès l’acclimatation pour habituer les animaux à l’administration orale du vaccin. Pour certaines interventions, les furets seront maintenus sous anesthésie générale gazeuse avec monitoring (fréquence respiratoire, fréquence cardiaque, température), sous lampe et tapis chauffant et sous la supervision du personnel en charge des anesthésies. Lors de l’intubation intra-trachéale, du gel anesthésiant sera mis sur la sonde d’intubation pour anesthésier la gorge. Pour détendre la mâchoire des furets et faciliter l’intubation ils recevront une injection d’anesthésiques. Lors de la phase de réveil, une surveillance rapprochée de l’animal sera effectuée. Des molécules seront disponibles, pour faciliter le réveil et gérer la douleur. En cas d'infection, un traitement antibiotique de 1ère intention sera mis en place en accord avec la vétérinaire de l’unité. Deux visites quotidiennes seront réalisées pour assurer les soins et surveiller l’état de santé des furets. Des point limites ont été définis. Si un animal présente des signes cliniques (atteinte de l’état général, perte d’appétit, isolement, prostration…), la vétérinaire d’unité sera consultée et un vétérinaire praticien pourra être contacté (espèce furet).
Choix des espèces
Le furet est un modèle validé pour l’étude d’espèces de la faune sauvage (blaireau) qui constitue l’espèce ciblée par le projet de vaccination contre la tuberculose animale. Le furet et le blaireau sont deux espèces de Mustélidés qui sont sensibles à Mycobacterium bovis. Le blaireau étant une espèce sauvage, l’expérimentation sur cette espèce est soumise à une réglementation complémentaire contrairement au furet qui est une espèce domestique. Animaux adultes âgés d’environ 12 mois (poids d’environ 1000 g pour les mâles et 800 g pour les femelles). Le choix d’animaux adultes agés de 12 mois est conditionné d’une part par le fait que la vaccination est plus pertinente sur animaux adultes que chez des jeunes dont le système immunitaire est en cours de développement et d’autre part pour avoir des animaux d’un poids suffisant (notamment les femelles) pour faciliter les procédures d’anesthésies et de prélèvements sur les animaux et réduire au maximum l’impact sur leur état de santé.
Nouveaux modèles transgéniques murins pour étudier les cardiomyopathies et neuropathies associées à des déficiences génétiques mitochondriales
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un lot de souris est laissé vivre jusqu'à l'âge létal, pour caler la chronologie entre le remodelage moléculaire et l'apparition des phénotypes délétères. 917 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, dont 872 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie une injection de particules virales dans le sinus rétro-orbitaire, une injection sous-cutanée, une injection intrapéritonéale, et pour une partie d'entre elles un prélèvement de 200 microlitres de sang par incision de la queue juste avant la mise à mort, afin d'élucider le rôle des mitofusines dans les cellules cardiaques et nerveuses. Le porteur justifie le choix de la souris par la présence des mitofusines chez les seuls mammifères et par la possibilité de constituer de grands lots expérimentaux, et juge ce recours "indispensable" à la compréhension du rôle des mitochondries dans l'insuffisance cardiaque.
Objectifs
Les mitochondries sont les centrales énergétiques de nos cellules car elles consomment l’oxygène afin de produire l’énergie chimique nécessaire au fonctionnement cellulaire. Les mitochondries possèdent leur propre génome essentiel qui est essentiel à la production d’énergie. Du fait de leur rôle clé pour l’apport d’énergie, les mitochondries possèdent une machinerie enzymatique complexe contrôlant leur positionnement, leur mobilité et leur morphologie au sein des cellules. Bien qu’exprimées dans l’ensemble de nos cellules, les pertes de fonction des protéines médiant la fusion et la dynamique des mitochondries (comme les mitofusines) aboutissent à des altérations tissues spécifiques telles que l’atrophie optique ou des neuropathies périphériques telles que la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A). La CMT2A est une neuropathie héréditaire sensitivomotrice génétiquement associée à des mutations invalidant la fonction de la protéine mitofusine 2. L’absence de compréhension des mécanismes pathogènes impliqués dans les maladies neurodégénératives associés à la dynamique mitochondriale explique en grande partie les difficultés diagnostiques mais aussi l’absence de traitement pour ces pathologies invalidantes. Les travaux du laboratoire ont récemment mis en évidence que la perte de fonction de mitofusine 2 entrainait une perte du génome mitochondrial causant une crise énergétique cellulaire. La découverte de ce nouveau mécanisme pathogène pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des maladies neurodégénératives associées aux enzymes de la dynamique mitochondriale. Pour autant, bien qu’ayant démontré la validité des modèles transgéniques murins dans l’étude des mécanismes pathogènes des défauts des mitofusines, nos études étaient jusqu’alors concentrées sur des modèles animaux n’atteignant l’âge adulte et donc une maturation du métabolisme cellulaire comparable à celui de l’homme. Ainsi, cette saisine vise à encadrer la validation et l’établissement de nouvelles stratégies permettant de générer des modèles transgéniques chez la souris adulte visant à (i) élucider les différentes fonctions des mitofusines dans les cellules cardiaques et (ii) élucider les mécanismes pathogènes des neuropathies associées à mitofusine 2 à travers une étude se focalisant spécifiquement sur la physiologie des neurones.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre comment la dysfonction de la fusion mitochondriale peut perturber à la fois le mécanisme gérant la réplication de l’ADN mitochondrial et le métabolisme énergétique. Nos travaux s’inscrivent dans le contexte clinique de la neurodégénérescence périphérique et des cardiomyopathies. Les modèles transgéniques seront générés grâce à l’utilisation de particules virales de dernières générations ciblant spécifiquement soit les neurones soit les cellules cardiaques et deviendront à la suite du projet disponible pour les communautés scientifiques et cliniques. Les nouveaux mécanismes moléculaires découverts dans ce projet seront en partie transposables aux cellules humaines dysfonctionnelles secondairement à l’altération de la dynamique mitochondriale. De plus, nous utiliserons un système de particules virales équivalent à celui utilisé dans le contexte de la thérapie génique chez l’homme. Nous espérons faire avancer les connaissances sur les mécanismes biologiques fondamentaux responsables du développement des symptômes de la CMT2A. Notre objectif à long terme est de participer au développement d’une stratégie thérapeutique pour les patients diagnostiqués avec cette neuropathie périphérique qui à ce jour reste incurable. Nos travaux amèneront également un nouveau regard sur l’impact de la déficience du génome mitochondrial sur l’homéostasie métabolique et énergétique cardiaque avec des applications potentielles dans le domaine de l’insuffisance cardiaque.
Procédures
L'injection dans le sinus rétro-orbitaire des particules virales sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie locale. Elle prendra en moyenne 3 minutes de l'induction jusqu'au réveil. Les souris recevront une injection sous-cutanée d'anticoagulant puis une injection intrapéritonéale d'un anesthésiant et analgésiant. Le prélèvement sanguin (200µL), réalisé sur une partie seulement des animaux inclus dans le projet, sera effectué sur animal anesthésie et analgésié suite à l’incision au niveau de la queue juste avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Élevage et suivi des lignées présentant un phénotype délétère : Ces animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie avec feuille d’observation pour suivre la santé et le bien-être. Notamment, la motivation des souris pour (i) s’alimenter, (ii) explorer la cage, et (iii) interagir avec ses congénères seront surveillés. La réduction et/ou l’absence de toilettage seront également surveillés. La feuille d’observation permettra donc de suivre la santé et le bien-être des animaux à travers l’aspect extérieur (activité dans la cage, isolement de l’animale, posture normale ou voutée, aspect du pelage, respiration) et le poids des animaux. Un lot de souris sera suivi jusqu’à l’âge létal afin de définir la temporalité du remodelage moléculaire par rapport au développement des phénotypes délétères. L’atteinte d’un point limite sera communiqué par téléphone et par mail à l’expérimentateur qui prendra alors la décision de l’euthanasie, par dislocation cervicale ou asphyxie au dioxyde de carbone. Procédures expérimentales sur animale vivant : Ces procédures seront strictement restreintes à (i) l’injection dans le sinus rétro-orbitaire des particules virales adéno-associées. La procédure d’injection d’une durée totale de 3 min sera réalisées sous-anesthésie générale et secondairement à l’application d’une analgésie locale au niveau du site d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à l'issue de l'ensemble des procédures expérimentales.
Remplacement
Le premier objectif de ce projet est d’affiner notre compréhension des mécanismes biologiques responsables du développement de la neuropathie périphérique de Charcot-Marie-Tooth de type 2A (CMT2A). Le deuxième objectif vise à évaluer les conséquences d’une altération de la réplication du génome mitochondrial sur le fonctionnement et le métabolisme cardiaque. L’incidence fonctionnelle sur le myocarde sera étudiée à travers les modèles transgéniques cardiaques et les mécanismes pathogènes de la CMT2A seront étudiés grâce aux modèles transgéniques neurones spécifiques. Nos analyses requièrent l’utilisation de modèles animaux, qui expriment les protéines mitofusines 1 et 2. Notre projet comprend également la mise en place de nouveaux modèles cellulaires dans lesquels l'invalidation des mitofusines sera induite pendant la culture des cellules et non chez les animaux. Cette stratégie permettra l’établissement d'un modèle d'étude robuste, du point de vue des interprétations scientifiques, assurant ainsi la mise en place d’une stratégie de remplacement solide pour les futurs projets du laboratoire. En effet, la congélation d’ampoules de cellules permettra de réaliser de nombreuses expérimentations visant à caractériser les fonctions des protéines mitofusines sur de nombreux aspects sans avoir à sacrifier de nouvelles souris.
Réduction
La première phase du projet vise à étudier in vitro, sur un nouveau modèle cellulaire inductible, les effets de la perte des mitofusines ou de TFAM (une protéine indispensable pour la réplication de l’ADN mitochondrial) sur le métabolisme énergétique cellulaire. La validation de cette approche réduira de manière significative le nombre de souris nécessaire pour caractériser les effets de l’invalidation des mitofusines ou de TFAM. Les résultats générés par cette première approche guideront en partie le choix des paramètres biologiques à étudier sur animaux et permettra donc d’optimiser le nombre d’animaux à utiliser pour tester la solidité des hypothèses scientifiques du projet de recherche.
Raffinement
Tous les animaux sont utilisés soit pour l’expérimentation soit pour le renouvellement de géniteurs. Nos conditions d'élevage permettent aux phénotypes dommageables de ne pas s’exprimer : cages ventilées, change sous hotte à la pince, litière, eau et aliments stérilisés. Les enrichissements sont variés et adaptés au type d'animaux dans la cage. L’induction des KO via l’injection des AAVs s’exprimera de manière tissue spécifique limitant ainsi la sévérité et le nombre de phénotypes délétères. L’injection des AAVs dans le sinus rétro-orbitaire sera réalisée sous anesthésie en présence d’une analgésie. Les souris gestantes portant les embryons exprimant les KO inductibles ubiquitaires seront utilisées pour la mise en place d’un nouveau modèle de fibroblaste embryonnaire portant le KO d’intérêt qui sera induit in vitro uniquement. Dans notre projet une partie des animaux vivants subiront une injection dans le sinus rétro-orbitaire (réalisée sous anesthésie, durée procédure 3min), une injection sous-cutanée et une injection intrapéritonéale. Les animaux seront surveillés et en accord avec l’application de points limites stricts et spécifiques du projet.
Choix des espèces
La souris reste le modèle expérimental de référence pour la mise en place des modifications génétiques permettant l’étude de mécanismes biologiques impliqués dans le développement de maladies humaines. Notre projet vise à mieux comprendre les différentes fonctions des mitofusines, comme la mitofusine 2, dont le dysfonctionnement est responsable du développement de la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A. Les protéines mitofusines sont uniquement présentes chez les mammifères empêchant ainsi l’utilisation d’organismes modèles unicellulaire (bactéries, levures) ou d'invertébrés. De nombreuses études réalisées par différents laboratoires indépendants ont précédemment établit que le modèle souris transgénique est un modèle valide pour l’étude des maladies neurodégénératives. Le modèle souris permet la production de lots expérimentaux de taille importante offrant une flexibilité au projet de recherche mais également la possibilité de reproduire de nombreuses fois les expérimentations afin d’en évaluer la solidité du point de vue statistique. Finalement, la proximité des mécanismes physiologiques entre la souris et l’homme donne la possibilité de transférer une partie des connaissances développées vers le lit du patient. Notre projet, utilisant des souris adultes (8 semaines), permettra de faire un premier pas vers la clinique en étudiant les mécanismes biologiques de la maladie de Charcot-Marie-Tooth de type 2A dans un modèle murin adulte. Pour les mêmes raisons l'utilisation du modèle souris s'avère indispensable à la compréhension du rôle des mitochondries dans le développement de l’insuffisance cardiaque.
Prévention de la bactériémie et endotoxémie dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
2 880 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 905 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection d'endotoxine bactérienne ou de bactéries vivantes pour déclencher un sepsis, précédée pour certaines de cinq injections quotidiennes sur une semaine ou de quatre injections hebdomadaires sur un mois, et suivie pour d'autres de dix injections en sept jours. Le porteur énumère les atteintes attendues : inflammation systémique sévère, défaillance du foie, des reins, du cœur et des poumons, troubles de la coagulation, hypotension, hypothermie ou fièvre. Il écrit qu'aucun modèle in vitro ne reproduit cette complexité et qu'il reste attentif aux avancées qui pourraient un jour limiter le recours aux animaux, tout en programmant l'induction d'un choc septique chez près de trois mille souris.
Objectifs
Le sepsis est une complication très grave des infections bactériennes et virales. Il peut apparaître de manière soudaine et imprévisible. Cette maladie survient lorsque le système immunitaire, censé protéger l’organisme contre les infections, s’emballe et déclenche une inflammation excessive, appelée choc cytokinique. Cette réaction incontrôlée peut entraîner un dysfonctionnement des organes et, dans les cas les plus graves, une défaillance généralisée (Source : Ministère des Solidarités et de la Santé). Des recherches récentes ont mis en évidence l’existence de certaines molécules jouant un rôle clé dans la régulation du métabolisme et du comportement alimentaire. Ces molécules sont naturellement produites par les cellules et les organes. Chez la souris, leur inhibition entraîne une diminution de la prise alimentaire et une perte de poids. De plus, leur neutralisation active un mécanisme biologique appelé autophagie, qui permet aux cellules d’éliminer leurs composants endommagés et de mieux résister aux agressions, notamment dans certaines maladies du foie. Sur la base de ces découvertes, ce projet de recherche vise à déterminer si la modulation de l’autophagie pourrait aider à prévenir le choc septique. Pour cela, deux modèles expérimentaux seront étudiés sur des souris : Un modèle d’endotoxémie, où une toxine bactérienne est injectée pour déclencher une forte réaction inflammatoire. Un modèle de bactériémie, où des bactéries vivantes sont injectées afin de reproduire une infection généralisée plus proche des cas observés chez l’humain. L’objectif de cette recherche est d’explorer une nouvelle approche thérapeutique pour limiter l’inflammation excessive et améliorer la prise en charge du sepsis, une condition qui reste à ce jour un défi médical majeur.
Bénéfices attendus
Le sepsis représente un problème majeur de santé publique à l’échelle mondiale. Chaque année, il affecte près de 50 millions de personnes, avec une mortalité particulièrement élevée chez les enfants de moins de 5 ans, qui représentent plus de 40 pour cent des cas. Cette pathologie touche de manière disproportionnée les pays à faibles et moyens revenus, mais reste également l’une des principales causes de décès dans les pays développés. Globalement, le sepsis est responsable de plus de 11 millions de décès annuels, alors que beaucoup de ces décès pourraient être évités grâce à une prise en charge rapide et efficace. En Europe, le sepsis est à l’origine de près de 700 000 décès chaque année, dont environ 57 000 en France, soulignant l’urgence d’améliorer les stratégies de prévention et de traitement. Ce projet vise à valider une nouvelle approche thérapeutique contre la septicémie, en testant l’activation du flux autophagique dans un modèle préclinique approprié et représentatif de l’évolution clinique de la maladie. L’objectif est double : Évaluer l’efficacité et la pertinence de cette stratégie thérapeutique dans un cadre expérimental rigoureux, permettant d’identifier une nouvelle cible pour limiter l’hyper-inflammation et améliorer la survie des patients atteints de sepsis. Mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques sous-jacents au sepsis, qui restent encore insuffisamment caractérisés, notamment en ce qui concerne l’impact du métabolisme cellulaire et de l’autophagie dans la réponse inflammatoire systémique. En apportant de nouvelles connaissances sur ces mécanismes et en ouvrant des perspectives thérapeutiques innovantes, ce projet pourrait contribuer à la réduction de la mortalité associée au sepsis et à l’amélioration des stratégies de prise en charge clinique.
Procédures
La mise en place des modèles murins de sepsis implique plusieurs types d'interventions. Celles-ci comprennent des injections ainsi que des procédures de suivi et d'analyse. Avant de déclencher le sepsis, certaines souris recevront 5 injections quotidiennes sur une semaine (traitement par une molécule pour l’induction de la délétion génique). Certaines souris recevront 4 injections hebdomadaires sur 4 semaines. Chaque injection dure quelques secondes et est réalisée sur animal vigile. Enfin, certaines souris ne recevront aucune injection préalable. Pour la mise en place du sepsis, toutes les souris recevront une injection unique (quelques secondes) sur animal vigile. Après le déclenchement de la maladie, certains animaux recevront 10 injections sur 7 jours en fonction des groupes expérimentaux sur animal vigile. Chaque injection dure quelques secondes. Chaque pesée dure également quelques secondes. L'examen non invasif de la pression artérielle sera effectué sans anesthésie et durera environ 15 minutes. L'échocardiographie nécessite une anesthésie légère et dure environ 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus dans ce projet sont principalement liés à l’induction de l’endotoxémie et de la bactériémie. Les effets indésirables attendus sont ceux classiquement associés à l’induction du sepsis expérimental, sans effets additionnels imprévus. Les principales nuisances incluent : Inflammation systémique sévère, associée à une production excessive de cytokines pro-inflammatoires. Dysfonction d’organes (foie, reins, cœur, poumons), due à l’hypoperfusion tissulaire et au stress oxydatif. Altération de la coagulation, avec un risque accru de thromboses ou d’hémorragies. Hypotension, résultant d’une vasodilatation excessive et d’une augmentation de la perméabilité vasculaire. Altération de la barrière intestinale, favorisant la translocation bactérienne. Dysfonction immunitaire, avec une phase initiale d’hyperactivation suivie d’une immunosuppression secondaire. Altération de la thermorégulation, pouvant entraîner hypothermie ou fièvre. Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress temporaire, lié à la contention des animaux, une douleur locale transitoire au point d’injection, une inflammation locale (rougeur, œdème), un risque d’infection au site d’injection, notamment dans le modèle de bactériémie. Les effets liés aux interventions pharmacologiques pourraient induire des perturbations du métabolisme énergétique et modifications du poids corporel. Les mesures de pression artérielle non invasives peuvent induire un stress lié à la contention, malgré l’habituation préalable des animaux. L’échocardiographie nécessite une anesthésie, qui peut provoquer une hypothermie transitoire, et une récupération retardée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés conformément à la réglementation en vigueur afin de prélever les différents organes pour des analyses biochimiques, histologiques et métaboliques.
Remplacement
Le sepsis résulte d’une réponse immunitaire incontrôlée à une infection, impliquant une activation excessive des cellules immunitaires, la libération massive de cytokines, l’activation des voies de coagulation et un dysfonctionnement vasculaire, conduisant à une défaillance multi-organes. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité du sepsis, notamment les interactions dynamiques entre le système immunitaire, les organes vitaux et le microbiote. Bien que des alternatives comme les cultures cellulaires et les organoïdes permettent d’étudier certains mécanismes isolés, elles ne remplacent pas l’étude sur organisme entier. L’expérimentation animale reste donc nécessaire à ce stade, mais nous restons attentifs aux avancées scientifiques qui pourraient, à terme, proposer des alternatives fiables permettant de limiter davantage le recours aux animaux.
Réduction
Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 2880 souris, avec une optimisation des expérimentations pour réduire le nombre d’animaux témoins. Ce nombre a été rigoureusement déterminé à l’aide d’une analyse statistique préalable, incluant des calculs de puissance fondés sur les effets observés dans des études préliminaires et des données publiées dans des travaux similaires. L’étude sera interrompue si la première série d’expériences invalide l’hypothèse de travail, afin d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Afin de maximiser l’exploitation des données, plusieurs tissus seront prélevés (analyses immunologiques, histologiques, biologie cellulaire et moléculaire). Ces échantillons seront partagés avec nos collaborateurs, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux utilisés dans des études complémentaires.
Raffinement
Les conditions d’hébergement seront conformes aux réglementations en vigueur et adaptées en collaboration avec le personnel de l’animalerie. Les animaux auront un accès libre à une alimentation équilibrée et à de l’eau ad libitum. Leur environnement sera enrichi avec du coton de nidification et des structures adaptées (tunnels en carton, morceaux de bois) afin de favoriser leurs comportements naturels et réduire le stress. En cas de difficulté alimentaire, un gel nutritif sera placé dans les cages pour faciliter l’accès à une nutrition adaptée et prévenir toute perte de poids excessive. Toutes les manipulations expérimentales seront réalisées en veillant à minimiser l’inconfort et la souffrance des animaux. Un suivi rigoureux sera mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter toute anomalie. Le personnel impliqué dans ce projet est hautement qualifié et bénéficie d’une formation continue aux bonnes pratiques d’expérimentation animale. Toutes les procédures seront réalisées avec du matériel approprié pour réduire la douleur et le stress, notamment : L’utilisation d’aiguilles de petit calibre pour minimiser la douleur des injections. Le recours à des anesthésiques adaptés lorsque nécessaire. Les sites d’injection feront l’objet d’une surveillance rigoureuse afin de détecter toute inflammation ou infection. En cas de complication, des interventions appropriées seront réalisées, notamment l’application d’antiseptiques. Si des comportements agressifs ou des blessures sont observés chez les mâles, ils seront placés en hébergement individuel, avec un enrichissement adapté (coton de nidification, morceaux de bois) pour maintenir leur bien-être. Toute blessure sera immédiatement prise en charge.
Choix des espèces
Le choix des souris comme modèle animal se justifie par plusieurs raisons scientifiques. Elles représentent le modèle de laboratoire le plus couramment utilisé, ce qui permet de s'appuyer sur une vaste expertise en élevage, manipulation expérimentale et suivi vétérinaire. Les lignées de souris offrent l’avantage de disposer de modèles génétiquement modifiés spécifiques de nos protéines d’intérêt. Les lignées choisies sont immunocompétentes et ne présentent pas de phénotypes préjudiciables. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines, afin de disposer d’un organisme dont le développement est achevé.
Traçage des cellules progénitrices rénales au cours de la régénération des podocytes induite par la télomérase chez la souris adulte
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
2 400 souris vont être utilisées pour que 264 d'entre elles portent le génotype recherché, les autres naissant, se faisant couper un bout d'oreille pour génotypage, puis étant tuées faute d'avoir hérité de la bonne combinaison génétique. Les 264 retenues subissent trois injections intrapéritonéales, trois semaines de croquettes additionnées d'un composé de marquage, puis un traitement oral de quinze à vingt jours qui perturbe volontairement leur fonction rénale. Le porteur indique interrompre ce traitement dès détection d'une protéinurie, et déclare un niveau de souffrance modéré pour ces 264 animaux, léger pour les 2 136 autres. L'élevage revient ainsi à huit souris tuées pour une souris étudiée.
Objectifs
Le rein est un organe jouant un rôle fondamental dans la filtration du sang et l’élimination des déchets via l’urine. Ce processus de filtration dépend essentiellement de la bonne santé de cellules du rein appelées podocytes, qui permettent de trier les toxines contenues dans le sang pour les éliminer tout en conservant les éléments sanguins bénéfiques pour le corps. Les podocytes sont endommagés dans 90% des cas de maladies rénales chroniques, et la faible capacité du rein à remplacer ces cellules blessées conduit à une défaillance rénale qui est actuellement incurable. Cependant, des recherches récentes montrent que la régénération des podocytes peut être stimulée de manière efficace. Le renouvellement des podocytes est assuré par des cellules souches adultes qui présentent un marqueur spécifique. Dans ce projet, nous allons utiliser ce marqueur afin de suivre les cellules souches au cours de la régénération des podocytes et d'identifier les facteurs permettant de contrôler l’activation de ces cellules. Ce travail permettra à terme de développer des approches thérapeutiques innovantes afin de traiter les patients souffrants de maladies rénales chroniques. Les effectifs ont été dimensionnés en utilisant G*Power. Pour réaliser l’étude, nous devons produire 264 souris issues de croisements où seul 12,5% des souriceaux présenteront le bon génotype (expérimentaux et témoins). Il faut donc produire 2112 souris pour obtenir les 264 souris nécessaires. En tenant compte des pertes liées à la mortalité juvénile et aux aléas de la génétique mendélienne nous appliquons une marge d’environ 15% amenant à 2400 souris.
Bénéfices attendus
Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les mécanismes régulant les cellules souches des podocytes dans le rein adulte. Ce travail ouvre la voie pour de nouvelles approches thérapeutiques visant à stimuler ou à restaurer la fonction de ces cellules souches des podocytes lorsque les reins sont endommagés.
Procédures
-Prélèvement à l'oreille (génotypage). Durée du prélèvement à l'oreille : 1 seconde. -Trois injections intrapéritonéales (marquage des cellules souches des podocytes). Durée des injections intrapéritonéales : environ 3 secondes. -Alimentation enrichie (croquettes) avec le composé pendant 3 semaines permettant de marquer les cellules souches associée à un supplément appétant dans l’eau de boisson. -Traitement oral (eau de boisson) de 15 à 20 jours pour stimuler la régénération. -Collectes d’urines (suivi de la fonction rénale) par une méthode non-invasive, à savoir par miction spontanée lors de la préhension des souris.
Impact sur les animaux
Le traitement oral permettant de stimuler la régénération va entrainer une perturbation de la fonction rénale qui peut avoir des conséquences sur l’état de santé général des souris. Toutefois, ce traitement sera interrompu dès détection d’une protéinurie. Les trois injections intrapéritonéales peuvent occasionner une gêne et une inflammation au niveau du site d’injection. Les contentions pour injection et prélèvement d’urine peuvent occasionner un stress. Le prélèvement à l'oreille peut entrainer une nuissance légère.
Devenir
Etude 1 : élevage de souris pour la production des animaux nécessaires aux études 2/3 et génotypage, 12,5% des souris seront incluses en étude 2 ou 3 et le reste des animaux, ne comportant pas le génotype adéquat pour l’étude, sera euthanasié, directement après génotypage ou à la fin de la phase de reproduction. Etudes 2 et 3 : tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques et moléculaires de leurs reins.
Remplacement
La complexité des processus responsable de la régénération des podocytes rénaux ne peut être étudiée que dans un modèle in vivo intégrant tous ces facteurs. La réalisation de ce projet nécessite donc le recours à l’expérimentation animale afin de comprendre les dynamiques de régénération et ainsi de permettre d’envisager des stratégies thérapeutiques innovantes transposables sur l’être humain.
Réduction
Pour cette étude nous avons dimensionné les groupes d’animaux en utilisant un plan d’expérimentation permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et ainsi de garantir l’obtention de résultats pertinents biologiquement tout en minimisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Notre expérience sur le modèle nous a permis d’adapter la fréquence de suivi et de préciser les différents points d’observation clinique qui caractérisent de manière précoce et prédictive les points limites. Nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement des animaux. Les urines, collectées après miction spontanée lors de la préhension des souris pendant les examens cliniques, seront analysée afin de suivre l'évolution de la fonction rénale. Les animaux sont hébergés dans un milieu enrichi en portoirs ventilés avec un suivi journalier.
Choix des espèces
Le but de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes régulant la régénération des podocytes dans le rein adulte. La souris apparait comme un excellent modèle pour répondre à cette question car elle présente de grandes similitudes avec l’être humain. En effet, le rein des souris est histologiquement et physiologiquement similaire à celui des humains. Dans ce projet, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, les animaux de cette tranche d’âge ont un fonctionnement rénal optimal associé à une régénération efficace des podocytes.
Evaluation préliminaire d’un nouveau traceur pour le diagnostic de tumeurs cérébrales en imagerie TEP.
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 6
Une injection de cellules tumorales sous l'omoplate, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie dont une de deux heures : six souris ouvrent ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Viennent ensuite six rats, opérés une heure sous anesthésie pour qu'on leur greffe une tumeur dans le cerveau, puis passés trois fois à l'imagerie. Les douze animaux, tous immunodéficients pour accepter les cellules humaines, sont tués à la fin pour vérifier où le traceur radioactif s'est fixé dans leur corps. Le porteur annonce commencer par trois mâles et n'inclure les trois femelles, puis la phase chez le rat, que si les résultats sont concluants, ce qui pourrait ramener le total à trois animaux.
Objectifs
Les glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus graves chez l’adulte. Ils sont très difficiles à soigner, car certaines cellules résistent aux traitements et provoquent souvent des rechutes. Pour mieux lutter contre ces cellules résistantes, il est nécessaire de les repérer plus précisément. Une des méthodes actuelles utilise des anticorps, qui sont des composés capables de reconnaître les cellules cancéreuses. Mais ces anticorps sont souvent trop gros pour passer la barrière naturelle qui protège le cerveau. Cela limite leur efficacité. Ce projet s’intéresse à une version plus petite de ces anticorps, appelée fragment d’anticorps, qui pourrait mieux atteindre les cellules malades. En y ajoutant un élément radioactif, ces fragments peuvent être utilisés pour les rendre visibles grâce à une technique d’imagerie médicale appelée TEP (Tomographie par Émission de Positons). L’objectif est de tester ce nouveau fragment pour voir s’il permet de mieux détecter les cellules cancéreuses résistantes dans les glioblastomes. Si cela fonctionne, cela pourrait aider les médecins à suivre plus précisément l’évolution de la maladie et à adapter les traitements à chaque patient. À long terme, cela pourrait améliorer la prise en charge et les chances de survie des personnes atteintes de ce cancer.
Bénéfices attendus
En permettant une détection plus précoce et plus précise des cellules cancéreuses résistantes, les agents d’imagerie développés en amont de ce projet pourraient aider à mieux évaluer la progression de la maladie et à adapter les traitements de manière plus ciblée. À terme, cela pourrait contribuer à une prise en charge plus personnalisée des patients et à une amélioration de leur pronostic.
Procédures
Une injection sous-cutanée de cellules tumorale pour les souris (5min). Une chirurgie de greffe tumorale intracérébrale pour les rats (1h). / 2 examens d'imageries de 10min et 2h pour chaque souris et 3 examens d'imagerie de 15min, 20min et 2h pour chaque rat, sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Chez la souris, la tumeur implantée sur l’omoplate peut gêner légèrement la locomotion. La mesure de la taille de la tumeur sur animal vigile peut induire un stress modéré. Le jeûne avant l'esamen d'imagerie peut entraîner une hypoglycémie. Les examens d’imagerie nécessitent des anesthésies répétées, de durée variable selon le protocole. Chez le rat, l'implantation de la tumeur peut entraîner des effets secondaires, notamment neurologiques. Les anesthésies seront également répétées et plus longues que chez la souris. Chez les deux espèces, les injections répétées dans la veine caudale peuvent provoquer une inflammation locale, une douleur transitoire.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés afin d'évaluer la fixation du fragment d'anticorps radioactif (diagnostic) dans le corps entier de l'animal.
Remplacement
Des études de biologie cellulaire en laboratoire ont été réalisées au laboratoire et ont montré des résultats prometteurs, néanmoins l’évaluation dans l'organisme du devenir du fragment d'anticorps reste indispensable. En effet, les modèles cellulaires actuellement disponibles ne reflètent pas fidèlement la distribution observée dans un organisme entier. Il est crucial de vérifier que ce produit se fixe bien sur la tumeur, sans accumulation dans d’autres organes, à l’exception de ceux impliqués dans son élimination (comme les reins). Par ailleurs, nos modèles de cellules sont enrichis en cellules souches cancéreuses. Cependant, la proportion de ces cellules varie considérablement d’une tumeur à l’autre. Ainsi, seule une évaluation dans un organisme vivant permet de juger de manière fiable le comportement et la spécificité du composé. De plus, pour savoir si le composé expérimental peut traverser la barrière protectrice du cerveau, il est indispensable d’utiliser un modèle animal de tumeur intracérébrale.
Réduction
Cette étude est conçue comme une étude exploratoire, en 2 phases, visant à évaluer le potentiel de fixation du fragment d'anticorps radioactif au niveau de la tumeur sous-cutanée puis intra-cérébrale. Phase 1 : Tumeur sous-cutanée chez la souris. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six souris nude (trois mâles et trois femelles). Toutefois, seuls les mâles seront utilisés dans un premier temps (car le glioblastome a une prévalence masculine). Si les résultats obtenus sur les mâles sont concluants, les femelles seront incluses. Dans le cas contraire, les femelles ne seront pas testées et l'étude s'arrêtera, réduisant le nombre d’animaux à 3 au lieu de 6. Phase 2 : Tumeur intracérébrale chez le rat. Le nombre d’animaux a été strictement limité à six rats (trois mâles et trois femelles). Cependant, l’utilisation de ces animaux dépendra des résultats obtenus durant la phase 1. Si les résultats de la phase 1 ne sont pas concluants, la phase 2 ne sera pas initiée et les 6 rats nude ne seront donc pas utilisés. Cette approche progressive,permet de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés, tout en obtenant des données préliminaires essentielles pour orienter les étapes expérimentales ultérieures. Chaque animal sera son propre contrôle car le côté controlatéral pourra être utilisé comme référence de tissu sain.
Raffinement
Le transport des rats entre l’animalerie et le site d’imagerie, situé à proximité de la plateforme, sans passage à l’extérieur, sera réalisé en maintenant une température optimale par l’intermédiaire de bouillotes chauffantes placées sous les cages. Un suivi quotidien sera assuré pour tous les animaux, avec une attention particulière portée à l’état général, au comportement, à la mobilité et à l’alimentation-hydratation ainsi qu’à la vérification du bon état de la plaie. Des points limites précoces ont été fixés (perte de poids et problèmes de motricité essentiellement), afin d’anticiper toute souffrance ou dégradation de l’état général liée à la tumeur. Toute altération du bien-être entraînera une prise en charge adaptée ou une euthanasie anticipée si nécessaire. Toutes les manipulations potentiellement stressantes ou douloureuses (injection du composé radioactif, imageries) seront réalisées sous anesthésie générale, garantissant l’absence de douleur et de stress. Les animaux seront sous anesthésie générale de l’injection du composé radioactif et lors des examens d'imagerie, les animaux sont placés dans un lit chauffant avec surveillance respiratoire et cardiaque et le niveau d’anesthésie sera surveillé et adapté si besoin pour garantir un état stable et sécurisé des animaux. Leur réveil se fera dans un environnement calme et sous surveillance. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel qualifié et expérimenté.
Choix des espèces
Souris : Au cours de projet, il est indispensable de travailler avec des souris immunodéficientes pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Rats : Il est indispensable de travailler avec des rats immunodéficients pour éviter le rejet de greffes des cellules cancéreuses humaines. Ce choix est également motivé par la limite de la résolution des appareils d'imagerie, qui ne permettrait pas d’obtenir une qualité d’image suffisante, pour analyser correctement les lésions tumorales intracérébrales (la tumeur ayant un volume plus réduit en intracérébral) sur des animaux plus petits comme les souris. Phase 1 : Des souris de 6 semaines (stade adulte) à leur arrivée seront utilisées. Elles auront 7 semaines lors de l’implantation des cellules tumorales et entre 8-9 semaines au moment des imageries. Phase 2 : Des rats âgés de 7 semaines au moment de la greffe (6 semaines à la réception) seront utilisées à un stade où la croissance crânienne est achevée.
Etude du rôle du microbiote intestinal dans la colonisation bactérienne chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Un gavage par jour pendant huit semaines, jusqu'à trois prélèvements sanguins, des antibiotiques dans l'eau de boisson et deux mois d'isolement en cage individuelle : 1 872 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées pour qu'on analyse la répartition du microbiote dans leur intestin. L'objectif déclaré est de comprendre comment les bactéries colonisent l'intestin selon le profil du microbiote, avec l'espoir affiché de pouvoir un jour manipuler le microbiote humain. Le résumé tient en quelques lignes sur les procédures comme sur le raffinement, et ne détaille ni les points limites qu'il dit "stricts", ni le calcul qui mène à 1 872 animaux.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans la colonisation des bactéries. Les souris seront utilisées comme modèle pour divers profils de microbiotes intestinaux qui seront colonisés par des bactéries. Des thérapies distinctes seront également utilisées pour étudier les dynamiques de colonisation en réponse à ces thérapies. Ce projet fournira des informations essentielles sur le rôle du microbiote intestinal dans la colonisation bactérienne et la réussite des thérapies.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront non seulement d'améliorer la compréhension fondamentale des interactions entre l'hôte et les bactéries, mais aussi d'obtenir des informations mécanistiques essentielles qui pourront être exploitées pour manipuler le microbiote intestinal humain de manière à promouvoir et à préserver la santé humaine.
Procédures
Gavage: durée 5s ; un seul gavage ou un gavage par jour pendant 8 semaines en fonction de la procédure. Prélevement du sang: durée 30s ; fréquence 3 fois max pour 8 semaines. Antibiotique: ajouté une fois à l'eau de boisson tous les trois jours pour une durée allant de 1 à 5 jours. Hébergement individuel: une fois pour 2 mois.
Impact sur les animaux
La contention cause un stress de courte durée. Prélèvement de sang et gavages causent un stress et des douleurs légères de courte durée. Certains antibiotiques peuvent causer des perturbations intestinales. L'isolement des animaux peut causer du stress.
Devenir
1872 souris seront mises à mort pour analyser la composition spatiale du microbiote intestinal.
Remplacement
Des modèles de microbiote in vitro ont été utilisés pour étudier les interactions au sein des communautés bactériennes. Cependant, certains aspects de ces interactions complexes impliquant des cellules immunitaires et non immunitaires ne peuvent être étudiés que chez l'animal.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe pour assurer la reproductibilité des expériences et appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Les effectifs sont déterminés et les résultats analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des points limites stricts, spécifiques au projet, seront appliqués.
Choix des espèces
Dans l'étude des interactions hôte / microbiote, la souris est un modèle de choix, notamment car cette espèce est la plus facile à manipuler génétiquement et à obtenir en conditions germ-free (animaux sans microbiote). L'ensemble du project utilisera des souris après sevrage et âgées de 4 à 20 semaines,chez lesquelles le système digestif est arrivé à maturité.
IMPLICATION DES CANAUX IONIQUES DANS LE DEVELOPPEMENT TUMORAL ET LA MISE EN PLACE DE LA DOULEUR DANS LE CANCER DE LA PROSTATE, DU PANCREAS ET DANS LEUR TRAITEMENT
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Quatorze injections et deux chirurgies pour un même animal en deux à trois mois : 4 210 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Les expérimentateurs leur injectent des cellules cancéreuses sous la peau, dans le cœur, dans une veine, dans le tibia ou dans le pancréas, et certaines développent des tumeurs pendant sept mois. Le porteur décrit des douleurs abdominales, une lyse osseuse en cas de métastases et une hypersensibilité thermique et mécanique aux pattes et à la bouche provoquée par les chimiothérapies, hypersensibilité que le projet cherche précisément à reproduire pour en comprendre le mécanisme. Il emploie des souris nude de cinq semaines, immunodéficientes pour accepter les cellules humaines, et précise que les tumeurs prennent mal chez des animaux plus âgés.
Objectifs
Ce projet à pour objet l’amélioration des traitements des cancers pancréatique et prostatique. Trois objectifs distincts sont définis : (1) l’amélioration d’un traitement existant, (2) la compréhension des mécanismes de résistance aux chimiothérapies, et (3) l’identification des interactions potentielles entre effet secondaires des chimiothérapies et développement du cancer. (1) Nous avons précédemment montré le rôle in vivo de la protéine TRPV6 dans le développement tumoral et métastatique du cancer de la prostate. De plus, nous avons développé un anticorps capable de cibler spécifiquement cette protéine afin d'inhiber son activité et réduire ainsi significativement la croissance tumorale. Enfin, nous avons montré in vitro que l'inhibition simultanée de TRPV6 et d’un récepteur membranaire impliqué dans la métastase permettait de potentialiser la réduction de la croissance cellulaire de manière synergique. L’objectif de cet axe est de déterminer si l’inhibition conjointe de ces deux protéines augmente l’efficacité de notre anticorps à réduire la croissance tumorale. (2) Malgré l'efficacité des chimiothérapies actuelles, certaines cellules cancéreuses survivent et provoquent la récidive tumorale chez le patient. Un des objectifs du projet est de préciser le rôle de protéines clés dans la mise en place de cette résistance afin de pouvoir les cibler pour augmenter la réponse aux traitements. (3) Certains composés utilisés en chimiothérapie ont aussi comme effet secondaire le développement d’une neuropathie périphérique. La manière dont la chimiothérapie interagit avec le contexte cancéreux pour déclencher des douleurs neuropathiques est inconnu. L’objectif principal de cet axe est de préciser les mécanismes reliant certaines protéines connues pour être impliquées dans la thermoception et la nociception aux hypersensibilités thermiques déclenchées par la chimiothérapie dans le cadre du cancer du pancréas.
Bénéfices attendus
(1) Cet axe permettra potentiellement une amélioration significative de l'efficacité d'un traitement du cancer de la prostate par anticorps. Ces études sont cruciales pour potentialiser les effets de ce traitement sur le développement tumoral et métastatique. (2) Démontrer le rôle et l’implication de certaines protéines clés dans les mécanismes induisant la chimiorésistance dans le cancer du pancréas permettra de corréler la présence de ces protéines et de les proposer comme potentiel outil en clinique. (3) La neuropathie périphérique qui résulte des chimiothérapies d’intérêt mène chez certains patients à l’arrêt du traitement. A long terme, la prévention de ces symptômes pourrait donc permettre une meilleure prise en charge de la tumeur et une meilleure observance du traitement, menant à un taux d’échec moins important. Enfin, déterminer les mécanismes à l’origine des hypersensibilités douloureuses induites par la chimiothérapie dans un contexte de cancer permettra une meilleure sélection des molécules candidates à l’établissement de traitements visant à réduire ces douleurs chez le patient.
Procédures
Les animaux se verront injecter des cellules cancéreuses (voie souscutanée, intracardiaque, intraveineuse, intratibiale ou intrapancréatique) sous anesthésie gazeuse (environ 2-3 minutes d'anesthésie gazeuse avant l'injection des cellules qui prendra quelques secondes) afin de créer différents modèles permettant de visualiser le développement tumoral à tous les stades de la maladie. Les animaux seront par la suite traités (quelques secondes seront nécessaires pour les injections intrapéritonéales, 2 fois par semaine) avec divers composés ciblant des protéines clés afin de mesurer l'impact de ces composés sur le développement tumoral, et/ou avec des composés utilisés en chimiothérapie. Certains animaux seront injectés avec un traceur (quelques secondes nécessaires pour l'injection sous-cutanée) permettant de localiser les cellules d’intérêt. Enfin, une partie des animaux passeront des tests comportementaux d’hypersensibilité (qui peuvent durer jusque 2-3min maximum). Dans certains cas, ces 5 interventions auront lieu chez un même animal. La durée des expérimentations peut varier suivant la vitesse de développement tumoral allant jusque 3 mois maximum pour les animaux greffés directement avec des cellules cancéreuses et jusque 7 mois pour les animaux développant spontanément des tumeurs pour mimer au plus près ce qui se passe chez le patient. Au maximum, un même animal recevra 14 injections et 2 chirurgies en 2 à 3 mois.
Impact sur les animaux
Les animaux développeront des tumeurs, ce qui peut engendrer des signes de stress tels qu’une prostration ou une perte de poids. De plus, les animaux modèles de cancer du pancréas peuvent présenter des douleurs abdominales liées à ce type de tumeurs. Dans certaines procédures, ces tumeurs seront prises en charge par des chimiothérapies induisant une hypersensibilité thermique et mécanique (retrouvée principalement au niveau des pattes et de la bouche), ce qui peut constituer une autre nuisance pour l’animal. Dans le cas où des métastases osseuses apparaissent, il peut également y avoir une lyse osseuse. L’anesthésie gazeuse ne constitue qu’une nuisance légère, les souris se réveillant en quelques dizaines de secondes.
Devenir
Afin de mettre fin à la souffrance des animaux qui présenteront des tumeurs, à la fin de chaque protocole, les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. L’utilisation d’animaux d‘expérimentation est particulièrement pertinente dans le cadre de recherche en cancérologie reflétant ce qui se produit dans la pathologie humaine. De plus, le guidage et l’installation des cellules cancéreuses vers un organe cible comme l'os au niveau d’un organisme entier n’est pas reproductible in vitro. Enfin, il est obligatoire pour une partie du projet de regarder l'effet d'une hypersensibilité induite par des chimiothérapies dont aucun modèle n'existe in vitro.
Réduction
Un logiciel statistique a été utilisé afin de déterminer la taille des groupes nécessaires à la génération de données fiables. Afin d’observer une différence statistiquement significative entre deux groupes, entre 10 et 20 souris par groupe expérimental seront nécessaires pour ce type d’étude. Des expériences préalables ont été effectuées dans le but de déterminer la dose optimale des anticorps, ne permettant pas de réduire le nombre d’animaux. Dans certains cas, certaines souris pourront être réutilisés (notamment les souris de groupes contrôles) pour limiter le nombre d'animaux utilisés et suivant les résultats obtenus (si négatifs notamment), certains groupes ne seront pas réalisés. Egalement, pour certains protocoles nécessitant des gestes techniques précis, des entrainements seront réalisés sur des souris ayant été euthanasiés dans d'autres protocoles pour limiter le taux d'échec au moment des injections.
Raffinement
Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans un environnement enrichi avec tunnel en papier, bâton à ronger, papier kraft et coton pour réduire le stress des animaux et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L’état de bien être des souris sera évalué quotidiennement par l’observation des signes physiologiques. Afin de réduire le stress des animaux, seules les manipulations nécessaires aux différentes procédures seront réalisées par des expérimentateurs formés et expérimentés à la manipulation des animaux. La durée des manipulations ainsi que leurs fréquences seront réduites au strict minimum afin de limiter le stress associé. Des mesures spécifiques comme une surveillance accrue, des soins postopératoires ainsi que la gestion de la douleur seront prises en relation avec les procédures pour minimiser les effets indésirables sur le bien-être des animaux . Pour cela, dans les différentes procédures, une grille d’évaluation du bien-être, des points limites adaptés, un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance sont mis en place. Pendant toute la durée des procédures, des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés afin d’éviter la douleur pendant mais aussi après les procédures. En cas de signes graves de stress associé à un de nos points limites, les animaux seront euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris nude sont couramment utilisées en oncologie. Elles sont immuno-déficientes, ce qui permet l’injection de cellules tumorales humaines et ainsi reproduire les tumeurs humaines in vivo. Elles ne possèdent pas de lymphocytes T (permettant d'éviter le rejet de greffe), mais les autres cellules du système immunitaire (lymphocytes B, macrophages, cellules dendritiques, cellules NK) sont présentes et ne sont pas affectées dans leurs fonctions. Les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 5 semaines, le développement des tumeurs humaines étant très faible chez les animaux plus âgés.
THERAPIE GENIQUE DANS UN MODELE MURIN DE LA MALADIE DE GAUCHER
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles nerveux
Tester une thérapie génique contre les formes neurologiques de la maladie de Gaucher : 488 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse de leurs organes. Les unes servent de donneuses et reçoivent cinq injections quotidiennes destinées à enrichir leur moelle en cellules souches sanguines. Les autres en reçoivent quinze, réparties en trois séries de cinq jours, plus une greffe sous anesthésie et jusqu'à trois prélèvements sanguins à l'œil. Le porteur décrit une fatigue et une perte de poids qui durent de quinze jours à trois semaines, et précise que les souris porteuses de la mutation "restent en bonne santé et ne présentent pas de troubles neurologiques graves", précisément ce que le projet vise à traiter.
Objectifs
La maladie de Gaucher est la plus fréquente des maladies dites "lysosomales". Elle touche environ une personne sur 50 000 dans le monde. Ces maladies se caractérisent par un problème dans le fonctionnement de cellules, qui n’arrivent plus à éliminer certaines substances. Ces substances s’accumulent alors et peuvent provoquer des dégâts, en particulier dans des organes comme le foie, la rate ou les os. Dans la maladie de Gaucher, ce dysfonctionnement est causé par la mutation du gène responsable de la fabrication d’une enzyme impliquée dans la dégradation des lipides. Quand cette enzyme ne fonctionne pas bien, les lipides s’accumulent dans certaines cellules. Il existe plusieurs formes de la maladie. La forme la plus courante, le type 1, touche surtout les organes internes et les os. D’autres formes, plus rares, comme les types 2 et 3, affectent aussi le cerveau. Le type 2 provoque des troubles neurologiques graves dès la naissance, et le type 3 entraîne des problèmes progressifs chez l’enfant ou l’adulte. Malheureusement, les traitements actuels ne parviennent pas à soigner ces troubles du cerveau. Ce projet vise à tester dans un modèle murin, un nouveau traitement pour les formes neurologiques de la maladie, en particulier la forme de type 3. L’idée est d’utiliser une approche de thérapie génique : on prélève des cellules souches du sang, on les modifie en laboratoire pour qu’elles produisent une version efficace de l’enzyme, puis on les réinjecte dans l’organisme. Les cellules corrigées pourront se rendre jusque dans le cerveau et y apporter l’enzyme manquante. Cela permettrait non seulement de traiter les symptômes dans les organes et les os, mais aussi d’agir sur les atteintes du cerveau.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de la thérapie génique à corriger les défauts neuronaux dans la maladie de Gaucher en restaurant l’activité enzymatique déficiente dans les cellules cérébrales. Cette approche thérapeutique pourra être ensuite appliqués à l’Humain.
Procédures
Animaux donneurs des cellules souches sanguines : - Injection en vigile (souris éveillée) une fois par jour (quelques secondes) durant 5 jours d’une molécule permettant d’enrichir la moelle en cellules souches sanguines. Animaux receveurs des greffes de cellules souches sanguines : - Injection (quelques secondes) en vigile une fois par jour pendant cinq jours d’une molécule permettant une bonne prise de greffe des cellules souches sanguines. - Greffe des cellules souches du sang : 1 injection qui ne dure que quelques secondes et qui est réalisée sous anesthésie et analgésie. - Injection (quelques secondes) en vigile une fois par jour pendant cinq jours d’une molécule permettant une bonne colonisation du système nerveux central par les cellules greffées. - 3 prélèvements sanguins maximum (quelques secondes)
Impact sur les animaux
Injections nécessaires à une bonne prise de greffe et une bonne colonisation du système nerveux central : ces injections provoquent une brève douleur ainsi qu’un stress dû à la manipulation des animaux. Par ailleurs, ils peuvent entrainer une perte de poids et provoquer une fatigue des animaux entre15 jours et 3 semaines après l’injection. Intervention pour enrichir la moelle en cellules souches sanguines: L’injection durant 4 jours provoque du stress et une douleur au moment de l’injection (quelques secondes). Injection des cellules souches sanguines : L’injection intra-veineuse de cellules souches du sang dure quelques secondes, et se fait sous anesthésie générale. Cependant, il y a un risque d’infection. Expression de l’enzyme : l’expression de l’enzyme devrait avoir un effet bénéfique. En revanche, on ne peut exclure qu’elle produise des effets secondaires non prévisibles. Prélèvement sanguin : Le prélèvement sanguin entraine un stress dû à la contention, une brève douleur à l’œil ainsi qu’un risque d’infection.
Devenir
Il est prévu d’euthanasier tous les animaux afin de pouvoir analyser différents organes et quantifier l’activité de l’enzyme étudiée et de ses substrats.
Remplacement
La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines ainsi que la colonisation du cerveau par certaines cellules transplantées sont des phénomènes complexes. Il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer ces phénomènes et les processus physiologiques mis en jeu lors de l’’implantation, de la survie, de la différenciation et de la colonisation des cellules. La transplantation chez un modèle animal est la seule façon aujourd’hui d’évaluer la capacité des cellules souches sanguines modifiées à se loger dans la moelle osseuse, reconstituer le système sanguin à long terme, atteindre le cerveau des receveurs et exprimer la molécule thérapeutique.
Réduction
Afin de réduire au mieux le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des vecteurs de thérapie génique exprimant l’enzyme étudiée dans des systèmes de culture in vitro. Seuls les vecteurs permettant la sécrétion par les cellules modifiées de cette enzyme capable d’être réabsorbée par des neurones et ne générant pas de toxicité cellulaire seront évalués in vivo. Afin que les résultats soient statistiquement significatifs tout en réduisant au mieux le nombre d’animaux utilisés pour répondre à la question scientifique posée, les logiciels ainsi que notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines montre que le nombre d’animaux minimum requis est de 8 par groupe.
Raffinement
Pour limiter au maximum les nuisances sur les animaux, la greffe de cellules souches du sang sera réalisée sous anesthésie et analgésie. Suite aux injections nécessaires à une bonne prise de greffe et une bonne colonisation du système nerveux central et à la greffe cellulaire, les souris seront examinées quotidiennement et une grille de d’évaluation sera remplie. Des points limites adaptés ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Au bout d’un mois, les souris continueront d’être observées une fois par semaine en plus de la visite journalière des animaliers afin de continuer à remplir la grille d’évaluation et de pouvoir intervenir en cas d’effet inattendu.
Choix des espèces
Les souris ont un système sanguin très proche de celui de l’être humain. C’est pourquoi elles sont souvent utilisées pour tester des greffes de cellules souches sanguines et pour évaluer l’efficacité de nouvelles approches de thérapie génique. Dans ce projet, on utilise des souris porteuses d’une mutation qui imite la maladie de Gaucher. Elles ont un déficit de l’enzyme, comme les patients, mais elles restent en bonne santé et ne présentent pas de troubles neurologiques graves. Elles nous permettront d’évaluer si les vecteurs de thérapie génique permettent aux cellules modifiées de produire suffisamment d’enzyme, vérifier si elle est bien sécrétée, et voir si cela permet de diminuer les substances anormales qui s’accumulent dans le cerveau et les autres organes. Les expériences seront faites chez de jeunes souris adultes, afin d’être dans des conditions où la prise de greffe est optimale.
Sécurité des Thérapies cellulaires par transfert de gène : preuve de concept dans des modèles cancer chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
4 038 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales par voie sous-cutanée, intraveineuse, intracardiaque ou directement dans un organe après ouverture chirurgicale, puis sept à dix séances d'imagerie sous anesthésie, cinq à huit prélèvements sanguins après quatre à six heures de jeûne, et des pesées quotidiennes. Une partie est immunodéficiente, donc vulnérable aux infections, et le porteur prévoit une perte de poids pouvant dépasser 15 %. Les bénéfices annoncés pour les patients, une immunothérapie plus sûre et modulable, restent au conditionnel, quand le porteur écrit que la nature des prélèvements d'organes "ne permet pas la survie des animaux".
Objectifs
Les thérapies géniques et cellulaires représentent une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies, notamment les cancers. Grâce à des technologies innovantes comme les cellules génétiquement modifiées, il devient possible de modifier certaines cellules pour qu’elles reconnaissent et éliminent des cellules malades dans l’organisme. Après des résultats prometteurs dans les cancers diffus, notamment certaines leucémies, ces approches sont désormais autorisées pour le traitement de cancers solides tels que le mélanome. Elles marquent ainsi une véritable révolution en immunothérapie. Malgré leur efficacité, ces thérapies ne sont pas sans risques. Leur action prolongée dans l’organisme et leur caractères difficilement réversible peuvent entrainer des effets secondaires graves. Le plus fréquent est une réaction immunitaire excessive, pouvant provoquer des troubles neurologiques voire dans de rares cas la formation de cancers secondaires liés aux cellules modifiées. Pour faire face à ces risques, des systèmes de sécurité sont actuellement en cours de développement. L’objectif est de pouvoir activer ou désactiver précisément ces traitements de façon ciblée dans le temps et dans le corps. Ces systèmes permettraient de mieux contrôler l’effet des thérapies géniques et cellulaires afin d’offrir des thérapies plus sûres aux patients.
Bénéfices attendus
L’immunothérapie représente une avancée majeure dans le traitement de nombreuses maladies graves, notamment certains cancers et maladies auto-immunes. Mais ce type de traitement n’est pas sans risque. En stimulant fortement les défenses du corps, il peut entrainer des réactions indésirables parfois sévères. Il devient donc essentiel de pouvoir en contrôler précisément l’intensité et la durée. Des stratégies récentes cherchent à rendre l’immunothérapie plus sûre et plus modulable. L’une d’entre elles repose sur la thérapie génique. Elle consiste à insérer un gène dans les cellules du patient à l’aide de transporteurs, appelés vecteurs souvent des virus modifiés. Ce gène agit comme un interrupteur, permettant ainsi d’activer ou de d’arrêter le traitement si des effets secondaires apparaissent. Ces systèmes offrent un véritable progrès en matière de sécurité. Avant d’être utilisés chez l’Humain, ces dispositifs doivent être testés sur des modèles biologiques complets comme la souris. Cela permet de vérifier à la fois leur efficacité et l’absence d’effets indésirables majeurs dans un organisme vivant. A terme, ce type d’approche pourrait améliorer la prise en charge de nombreux patients pour lesquels les traitements actuels restent insuffisants. C’est le cas de certains cancers très résistants, comme le cas du cancer du foie dont le taux de survie à 5 ans est d’environ 18 pour cent. En rendant ces traitements plus contrôlables, ces avancées ouvrent la voie à une immunothérapie plus personnalisée, mieux tolérée et potentiellement accessible à un plus grand nombre de patients.
Procédures
Dans ce projet de recherche, des souris sont utilisées pour évaluer l'efficacité, la distribution et la tolérance de traitements innovants dans l'organisme en conditions saines ou pathologiques. Les animaux suivent différentes étapes expérimentales. Certains reçoivent une seule injection d'un des deux produits thérapeutiques sur souris soit vigile soit anesthésiées d'une durée inférieure à 30 secondes. Pour créer des modèles tumoraux, plusieurs méthodes sont utilisées: une injection unique de cellules tumorales disséminées (sous anesthésie, 30 secondes), injection de cellules tumorales solides (1 fois, sous anesthésie, 45 secondes) ou injection directe dans un organe (1 chirurgie par souris, moins de 20 minutes, sous anesthésie générale avec une analgésie préventive et post opératoire pendant 3 jours). Les traitements expérimentaux comprennent l'injection de cellules thérapeutiques (1 fois, sous anesthésie, 30 secondes), de vecteurs viraux (1 fois, sur souris vigile, 30 secondes) et de médicaments complémentaires (1 fois par jour pendant 3 à 5 jours, sur animal vigile, 30 secondes). Le suivi de la tumeur repose sur des mesures manuelles (1 à 2 fois par semaines, 2 minutes sur animal vigile), de l'imagerie par bioluminescence (1 à 2 fois par semaine pendant 4 à 8 semaines, soit 7 à 10 fois par animal, anesthésie légère 10 minutes accompagné de l'injection d'un agent de contraste 30 secondes et de l'échographie (1 fois, 15 minutes, sous anesthésie). Les souris subissent aussi des prélèvements sanguins hebdomadaires (5 à 8 fois sur animal vigile à jeun 4 à 6heures, 30 secondes, une pesée quotidienne (contention 30 secondes) réalisée à la suite de l'implantation tumorale (de J0 à J4 soit 4 pesées) puis tous les 2 à 3 jours (soit 2 à 3 pesées par semaine) dont la fréquence est réaugmentée à un rythme quotidien si l'état général des animaux le justifie. Une observation clinique quotidienne est également maintenue tout au long du protocole. A la fin de l'étude, les animaux reçoivent une anesthésie avec une analgésie préventive (1 injection de 30 secondes, 30 minutes avant l'anesthésie) puis le prélèvement sanguin suivi de l'euthanasie est réalisé sous anesthésie en 10 minutes. Toutes les interventions sont réalisées par du personnel formé dans le respect de la réglementation avec une prise en compte du bien-être de l'animal à chaque étape.
Impact sur les animaux
(i)Nuisance physiologique. Une mise à jeun de 4 à 6 heures peut être appliquée dans le cadre des modèles développés dans ce projet et est susceptible de provoquer une sensation de faim légère. L’induction des vecteurs ainsi que la progression tumorale dans certains modèles peut entrainer une perte de poids réelle supérieure à 15%. (ii)Nuisance comportementale. Les phases de contention (pesée, injection, prélevement sanguin, mesure du volume tumoral) peuvent générer un stress ponctuel ainsi qu'une douleur légère et transitoire généralement inférieur de 30 secondes. L'anesthésie gazeuse utilisée dans certaines procédures peuvent accentuer l'anxiété et provoquer une perte transitoire de chaleur corporelle. (iii)Nuisance liée au statut immunodéficient. Les souris immunodéficientes présentent une vulnérabilité accrue aux infections. (iv)Nuisance liée au développement tumoral. Le développement tumoral peut conduire à l'apparition de lésions cutanées au point d'injection ainsi qu'à des altérations du bien-être notamment au niveau du toilettage, la mobilité ou l'alimentation. (v)Nuisance liée aux interventions chirurgicales. L'anesthésie gazeuse prolongée utilisée dans certaines procédures peut entrainer une perte transitoire de chaleur corporelle. La suture peut occasionner une réaction inflammatoire locale transitoire au niveau de la cicatrice.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures expérimentales sont euthanasiés en fin d’étude. Cette euthanasie est scientifiquement indispensable car elle permet la réalisation de prélèvements d’organes et de tissus nécessaires à l’atteinte des objectifs du projet. Plus précisément, les tumeurs sont prélevées pour des analyses histopathologiques. Le sang et la rate sont recueillis pour l’analyse phénotypique des cellules thérapeutiques administrées. Les organes sont prélevés dans leur totalité afin de permettre la validation du ciblage tissulaire spécifique des vecteurs de thérapie génique. La nature des prélèvements ne permet pas la survie des animaux. Ainsi aucun animal n’est conservé après les procédures, l’ensemble des animaux est euthanasié de manière programmée et encadrée conformément aux règles en vigueur.
Remplacement
Les thérapies géniques et cellulaires offrent des pistes très prometteuses pour soigner certaines maladies, mais elles doivent être rigoureusement contrôlées avant de pouvoir être utilisées chez l’humain. Il est notamment essentiel de vérifier si elles ciblent bien la zone souhaitée comme une tumeur ou un organe précis et de s’assurer qu’elles n’agissent pas par erreur sur d’autres parties du corps. Des premiers tests ont déjà été réalisés en laboratoire sur des cellules. Ces expérimentations ont permis d’évaluer l’expression du transgène, la viabilité cellulaire. Elles fournissent des données essentielles pour comprendre le fonctionnement initial du traitement. Cependant, ces vérifications ne peuvent pas se limiter aux expériences sur cellules. Les études réalisées chez l’animal sont indispensables pour observer la diffusion et l’action du traitement dans un organisme complet et ainsi recueillir les informations nécessaires pour juger de sa sécurité et de son efficacité avant toute application chez l’humain.
Réduction
Conformément au principe des 3R, ce projet repose sur plusieurs approches concrètes visant à réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la robustesse scientifique. Trois principaux leviers sont mobilisés pour optimiser la conception expérimentale et limiter l’impact sur les animaux. L’étude prend en compte les 2 sexes (mâles et femelles) afin d’inclure la variable sexe dans le plan expérimental, ce qui augmente la portée statistique et réduit les biais d’interprétation. Ne pas considérer cette variable peut conduire à des résultats non reproductibles ou non généralisables. Les différences de pharmacocinétique entre les mâles et les femelles peuvent également fausser des conclusions lorsqu’elles sont extrapolées d’un sexe à l’autre. Bien que cela soit contre intuitif, l’intégration des 2 sexes apporte une valeur scientifique renforcée aux données recueillies. Grâce à l’imagerie in vivo, chaque animal est utilisé de façon optimale afin d’obtenir un maximum d’informations. Les groupes expérimentaux sont conduits en parallèle, ce qui limite le recours aux groupes témoins. Chaque individu fait l’objet d’un protocole d’analyse complet permettant de rassembler un grand nombre de données tout en réduisant le nombre total d’animaux mobilisés. Ainsi 4038 animaux sont utilisés dans le cadre de ce projet.
Raffinement
Des mesures précises et rigoureuses seront mises en œuvre pour assurer le bien-être des animaux. (i) Les points limites sont définis suivant une observation de signes cliniques dictant un arbre décisionnel. Les signes cliniques sont ceux altérant l’apparence physique, le poids et le comportement qui dictent l’intervention à tenir allant du soin à l’euthanasie. (ii) La gestion de la douleur se fait par administration d’analgésiques en cas de souffrance détectée. (iii) Le suivi rigoureux et proactif des animaux se fait par une surveillance quotidienne des animaux par un personnel qualifié, formé aux procédures, qui prend en charge conformément aux protocoles établis et à la grille de suivi garantissant une réponse rapide et adaptée. (iv) Dans un environnement enrichi, l’hébergement (de 2 à 5 individus par cage) en groupes sociaux compatibles des animaux favorise les comportements exploratoires et réduit ainsi le stress avec une période d’acclimatation de 10 jours avant les procédures. (v) L'anesthésie gazeuse utilisée pour certaines procédures provoque une perte transitoire de chaleur corporelle compensée par l'installation de l'animal sur un plateau chauffant pendant l'intervention puis par un réveil en cage thermostatée. (vi) Les souris immunodéficientes sont maintenues dans des conditions strictes d'hébergement et de manipulation afin de limiter les risques d'exposition aux agents infectieux.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour étudier la formation tumorale grâce son taux élevé de prise de greffe et à sa petite taille qui facilite la manipulation. La disponibilité de diverses lignées immunodéficientes permet d’utiliser des greffes d'une autre espèce sans risque de rejet tandis que les lignées dépourvues de poils facilitent le suivi visuel de la croissance tumorale. De plus, le vaste éventail de modèles génétiquement modifiés et la connaissance approfondie du génome murin permettent d’étudier en détail les mécanismes moléculaires du cancer. Le cycle de vie court de la souris favorise la constitution de cohortes pour garantir une bonne puissance statistique, et l’existence de nombreux protocoles standardisés simplifie la comparaison des résultats entre études. Enfin le comportement bien documenté des souris permet d’identifier rapidement les signes de souffrance évaluable assurant ainsi une prise en charge efficace. Les souris utilisées seront des jeunes adultes sexuellement matures âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix correspond à une période où les fonctions physiologiques, notamment immunitaires et métaboliques, sont pleinement développées, tout en restant stables et homogènes d’un individu à l’autre. A cet âge, les animaux présentent également un comportement plus stable, ce qui réduit la variabilité expérimentale et les réactions excessives liées au stress. L’utilisation de cette tranche d’âge permet donc à la fois de garantir la maturité biologique, de limiter les biais comportementaux liés à l’anxiété et de favoriser la robustesse des résultats.
Evaluation non-invasive par Résonance Magnétique Nucléaire des altérations histopathologiques des muscles squelettiques dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Les expérimentateurs provoquent une lésion musculaire sur une patte arrière des souris d'un lot, et posent chez celles d'un autre lot un plâtre laissé jusqu'à un mois sur ce même membre. 120 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, chacune passant deux à trois examens d'IRM d'environ deux heures sous anesthésie générale. Le porteur qualifie cet examen de "totalement indolore et non invasif", et décrit par ailleurs une douleur de quatre à sept jours après la lésion, une atrophie musculaire sous le plâtre, des irritations cutanées et un stress lié à la restriction des mouvements. Toutes sont tuées à la fin du dernier examen pour que leurs muscles postérieurs soient prélevés.
Objectifs
Ce projet répond à un besoin critique en médecine : disposer de mesures objectives pour suivre la progression des maladies neuromusculaires (NMDs) et fournir des indicateurs fiables pour les essais cliniques. Bien que les biopsies musculaires soient largement utilisées pour la caractérisation des NMDs, elles sont invasives, non répétables en clinique et limitées par l’hétérogénéité de l’atteinte musculaire dans ces maladies. Dans ce contexte, l’imagerie par résonance magnétique (IRM) offre un moyen non invasif d’évaluer régulièrement l’état des muscles dans leur ensemble. Plus spécifiquement, pour les études cliniques, l’IRM de la fraction de graisse est devenue un biomarqueur incontournable pour caractériser l’évolution de la dégénérescence musculaire et son remplacement par du tissu graisseux. Cependant, il existe un besoin urgent de développer une mesure plus anticipative, capable d’évaluer les modifications tissulaires précoces précédant le remplacement graisseux.
Bénéfices attendus
Les maladies neuromusculaires (NMDs) et la sarcopénie sont des affections gravement débilitantes qui impactent profondément la qualité de vie des patients et de leurs proches, tout en imposant un lourd fardeau au système de santé publique. L'absence de mesures objectives permettant de suivre la progression naturelle de ces maladies et de fournir des indicateurs fiables pour les essais cliniques freine le développement thérapeutique. Le développement d'une méthode alternative à la biopsie musculaire, capable de caractériser les altérations microstructurales des muscles dans leur intégralité et de manière répétée, représenterait une avancée significative. Une telle approche améliorerait considérablement la compréhension de la progression des maladies et renforcerait notre capacité à évaluer l'efficacité des traitements. Cette innovation mènerait à une meilleure compréhension des mécanismes sous-jacents au développement des maladies, à des stratégies thérapeutiques optimisées et, in fine, à une amélioration notable des soins et de la qualité de vie des patients.
Procédures
Trois lots de souris subiront plusieurs examens identiques d’IRM des membres postérieurs. Chaque examen a une durée maximale d’environ 2 heures. Au terme de leur dernier examen, chaque animal sera euthanasié afin de permettre des prélèvements histologiques musculaires sur les membres postérieurs. Le premier lot servira à établir les valeurs de référence et la précision des différentes métriques d’IRM et d’histologie. Les souris de ce lot subiront trois examens d’IRM espacés d’au moins une semaine. Pendant chaque examen, les souris seront anesthésiées avec un gaz afin d’éviter tout stress ou mouvement, et de garantir leur confort. Leur respiration sera surveillée en continu, et des soins seront apportés pour éviter tout dessèchement oculaire lié à l’anesthésie. Les animaux seront installés confortablement sur le dos, les pattes maintenues délicatement pour assurer des images de bonne qualité. L’examen est totalement indolore et non invasif. Il permet de collecter des données précises sur les muscles des pattes arrière, sans aucune chirurgie. Le deuxième lot de souris, réparties en six groupes, subira deux examens d’IRM. Après le premier examen, qui servira de valeur de référence (Baseline), une lésion musculaire localisée sera induite, sous anesthésie, sur l’un des membres postérieurs. Cette intervention dure moins de 15 minutes. Un analgésique prophylactique sera administré avant la lésion afin de minimiser la douleur et l’inconfort des animaux après l’intervention. Ensuite, chacun des six groupes subira le deuxième examen d’IRM à un intervalle différent après lésion (24 heures, 48 heures, 4 jours, 7 jours, 12 jours et 1 mois). Le troisième lot de souris, réparties en cinq groupes, subira également deux examens d’IRM. Après le premier examen de référence, un des membres postérieurs de chaque souris sera immobilisé à l’aide d’un plâtre, sous anesthésie. Cette intervention dure moins de 20 minutes. Ensuite, chacun des cinq groupes subira le deuxième examen d’IRM à un intervalle post-immobilisation différent (4 jours, 7 jours, 10 jours, 14 jours et 21 jours). Le plâtre sera retiré avant l’examen. De manière générale, pour les groupes soumis à une immobilisation prolongée, le plâtre sera retiré périodiquement, sous anesthésie, pour inspection, hygiène et, si nécessaire, soins du membre immobilisé, puis remis immédiatement. En cas de signes de douleur, un analgésique sera administré une fois par jour.
Impact sur les animaux
Un examen d’imagerie par resonance magnétique (IRM) in vivo nécessite l’immobilisation du sujet pendant la durée de l’examen. Dans ce projet, cela est accompli en réalisant les examens sous anesthésie générale. Cet examen est non-invasif, atraumatique et sans douleurs. La seule nuisance associée à cette procédure une légère diminution du rythme respiratoire, accompagnée d’une légère baisse de la température corporelle pendant la durée de l’examen (moins de 2 heures), attribuable à l’anesthésie. Dans un lot de souris, une lésion musculaire unilatérale sera induite sous anesthésie dans un des membres postérieurs des animaux. Cette lésion peut provoquer de la douleur et une légère réduction de la mobilité pendant les 4-7 jours suivant la lésion, avec un pic inflammatoire observé autour du 4ᵉ jour. Une régénération complète du muscle est prévue un mois après la lésion. Dans un autre lot de souris, l’immobilisation d’un des membres postérieurs à l’aide d’un plâtre entraînera une diminution modérée de la mobilité. Cette immobilisation sera réalisée sous anesthésie générale et induira un processus d’atrophie musculaire dans le membre concerné. Les souris pourraient également ressentir du stress en raison de l’inconfort causé par le plâtre et par la restriction de leurs mouvements naturels. De plus, une irritation cutanée sous le plâtre pourrait survenir.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure expérimentale afin de permettre des prélèvements musculaires sur les membres postérieurs pour des analyses histologiques.
Remplacement
Les techniques développées dans ce projet ont pour objectif final l’imagerie quantitative in vivo. Des processus physiologiques tels que les échanges compartimentaux (intracellulaire, interstitiel, vasculaire) et la perfusion tissulaire influencent significativement le signal de RMN et, par conséquent, le modèle biophysique à établir. À ce jour, aucun substitut synthétique ne permet de reproduire fidèlement les caractéristiques du tissu musculaire vivant, ce qui nous contraint à recourir à l’expérimentation animale dans le cadre de ce projet.
Réduction
L’imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir de nombreuses informations différentes sur les muscles, à partir d’un seul examen. Comme cet examen est non invasif et sans douleur, il peut être répété plusieurs fois sur le même animal sans effet nocif. Cela permet de suivre l’évolution des tissus dans le temps tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. Pour cette étude, un total de 120 animaux sera utilisé, répartis en 12 groupes de 10 souris. Ce nombre a été déterminé grâce à un calcul préalable (calcul de puissance) afin de garantir que les résultats obtenus soient fiables et statistiquement significatifs. En effet, il est important d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour pouvoir identifier clairement les effets étudiés, tout en respectant le principe de réduction du nombre d’animaux utilisés. Des analyses statistiques seront nécessaires pour interpréter correctement les résultats. Elles permettront notamment d’évaluer la fiabilité des mesures IRM, de déterminer si les changements observés dans les muscles sont significatifs, et de comparer les résultats obtenus par IRM avec ceux observés au microscope après prélèvement.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées, de fond plat avec de la litière de contact et bénéficiant d’un environnement enrichi avec du papier absorbant et des tubes en carton pour la construction de nids. Les animaux bénéficiéront également d’une période d’acclimatation d’au moins 10 jours. Les examens IRM se dérouleront sous anesthésie générale afin de garantir l’immobilité des animaux pendant les acquisitions et de minimiser leur stress. Afin de prévenir le dessèchement de la cornée et d’assurer le bien-être des animaux pendant les examens prolongés sous anesthésie, un gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des souris dès l’induction de l’anesthésie. La température corporelle sera maintenue à environ 38 degrés Celsius à l’aide d’un tapis chauffant, et la fréquence respiratoire surveillée en continu. Pour le lot de souris subissant une lésion musculaire localisé, un analgésique prophylactique sera administré pour minimiser la douleur et l’inconfort post-lésion. Les animaux dont un membre postérieur est immobilisé par un plâtre seront surveillés quotidiennement. Le plâtre sera conçu de manière à laisser les orteils de la patte immobilisée visibles, permettant ainsi de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de complication. Une attention particulière sera portée aux signes tels qu’un grattage excessif du membre immobilisé, des irritations cutanées, des blessures dans la partie proximale du membre, ou une coloration anormale des orteils. Le plâtre sera retiré au moins une fois à chaque 7 jours, sous anesthésie, afin de garantir l’hygiène de la patte et d’évaluer son état. En cas de blessure superficielle, la zone sera désinfectée et un pansement appliqué. Si des signes de douleur sont observés, un analgésique sera administré. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié. Toute modification significative et persistante du comportement, qui puisse suggérer un signe de douleur excessive constituera un critère d’arrêt de l’expérimentation. Dans ce cas, l’euthanasie de l’animal sera réalisée conformément aux protocoles éthiques en vigueur.
Choix des espèces
En raison de leur petite taille et de la facilité avec laquelle elles peuvent être hébergées, les souris constituent un modèle animal pratique à manipuler. Le modèle murin est largement utilisé dans la recherche biomédicale et a été développé pour étudier un large éventail de pathologies humaines, en particulier les maladies Neuromusculaires. Par ailleurs, notre laboratoire a développé de nombreux outils dédiés à l’imagerie et à la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire, spécifiquement adaptés à l’étude du muscle squelettique chez les souris. Du point de vue technique, la petite taille des souris est aussi compatible à l’étude par RMN dans des machines d’IRM considérablement plus petites et moins couteuses, même si à haut champ magnétique. Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux adultes jeunes (12 à 16 semaines). Ce choix permet de s’affranchir des variations liées au développement/maturation tissulaire qui peuvent avoir un impact significatif sur les mesures. Cet intervalle d’âges inclut les différents points temporels décrits dans les procédures expérimentales.
Impact des médiateurs lipidiques de la résolution de l’inflammation (SPM) sur l’inflammation pulmonaire.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, cessent de se toiletter ou bougent à peine seront mises à mort. 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs poumons. Elles reçoivent des traitements par gavage, par injection dans la veine de la queue et par instillation de gouttes dans le nez sous anesthésie, ainsi qu'une molécule bactérienne qui déclenche une inflammation pulmonaire. Une partie appartient à la lignée Scnn1b, modifiée pour reproduire l'atteinte pulmonaire de la mucoviscidose. Le porteur écrit n'attendre "aucune douleur importante ou stress fort", et renvoie au long terme les retombées annoncées pour les patients.
Objectifs
La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une vulnérabilité à l’infection par les microbes de l’environnement qui induit une forte inflammation des poumons, dégradant progressivement cet organe et conduisant à l’insuffisance respiratoire. Une des raisons pouvant participer à la gravité de la réponse inflammatoire est une mauvaise production par ces patients de lipides aidant à résoudre l’inflammation, aussi appelés SPMs. A l’heure actuelle, nous ne comprenons pas encore pourquoi les patients produisent moins de SPMs. Nous étudierons la production de ces SPMs en mimant une infection du poumon. Nous évaluerons aussi si les SPMs peuvent être utilisés pour traiter l’inflammation. Le projet sera utilisé pour définir les protocoles permettant l’étude de ces SPMs dans le contexte d’une inflammation du poumon. Nous utiliserons ici des souris qui reproduisent des symptômes proches des patients vivant avec la mucoviscidose au niveau du poumon pour que notre modèle soit réaliste. Nous nous intéresserons aussi aux différences d’inflammation et de production des SPMs chez les souris mâles et femelles car il existe des différences de l’atteinte respiratoire entre patients et patientes encore inexpliquées. A terme ce projet servira aussi à étudier l’inflammation du poumon après avoir été exposé à la pollution de l’air.
Bénéfices attendus
Les bénéfices à court terme de ce projet sont : - le développement d’un modèle plus simple, moins contraignant et moins douloureux pour étudier l’inflammation des poumons chez la souris - l’identification de la meilleure façon d’utiliser les SPM pour traiter l’inflammation des poumons. - la compréhension du rôle du système immunitaire et des raisons pour lesquelles les souris atteintes d’une forme proche de la mucoviscidose ne produisent pas assez de SPM. - La description des différences entre animaux mâles et femelles l’inflammation du poumon - L’utilisation des connaissances collectées pour un projet de plus grande ampleur sur l’impact de la pollution de l’air sur la santé du poumon. A long terme, les résultats de cette étude pourront être utilisés pour développer de nouveau traitement de l’inflammation des poumons chez les patients vivant avec la mucoviscidose.
Procédures
Les animaux seront soumis à des administrations de traitement en solution soit par gavage, soit par injection dans la veine de la queue soit par aspiration de gouttes par le nez. Conformément aux normes éthiques en vigueur, les deux premiers traitements seront administrés sur souris éveillées, pour le dernier, les souris seront anesthésiées. Ces administrations durent moins de 30 secondes pour le gavage et l'injection dans la veine de la queue et autour de 30 secondes (moins d'une minute) pour l'aspiration de gouttes par le nez.
Impact sur les animaux
Les SPM sont des molécules produites par notre corps de façon naturelle. Elles ne sont pas toxiques et, à ce jour, aucun effet secondaire n’a été observé chez les souris quand elles en ont reçues. Nous ne prévoyons donc pas d’effets indésirables suite à l’utilisation de SPM. De plus, certaines études montrent que les SPM pourraient avoir un effet anti-douleur. Pour provoquer l’inflammation des poumons, nous administrons une solution d’une molécule produite par les bactéries. Cette molécule ne peut pas causer d’infection du poumon mais elle agit comme un signal qui alerte les défenses du corps. Le résultat est une réaction inflammatoire dans le poumon. Cela peut entraîner une perte de poids chez la souris ainsi qu’un inconfort temporaire et une diminution de l’activité. Cependant, aucune douleur importante ou stress fort n’est attendu. Les animaux seront tout de même suivis quotidiennement pour s’assurer de l’absence d’effet néfaste inattendu. Ils seront pesés et observés chaque jour pour détecter tout signe de malaise. Si nécessaire, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage des souris pour faciliter leur alimentation et leur hydratation. Si un animal se trouve dans un état grave imprévu, celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Devenir
Les animaux utilisés ici seront mis à mort à la fin des protocoles pour un prélèvement des organes et une analyse de la réponse inflammatoire dans le poumon.
Remplacement
Nous étudions ici un modèle complexe qui repose sur l’interaction entre plusieurs types de cellules, entre différents organes, et le déplacement de cellules d’un organe à un autre. Nous voulons aussi regarder des différences entre mâles et femelles. Malheureusement, à l’heure actuelle seule l’expérimentation sur des animaux vivants permet l’étude de ces différents éléments.
Réduction
Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, nous avons lu les études préexistantes et pris en compte leurs résultats pour construire notre projet. Un certain nombre d’expériences ont aussi été effectuées au préalable sur des modèles de cellules pour sélectionner un nombre réduit de SPM à tester dans notre projet sur la souris. Enfin, une étude statistique a été menée pour choisir le nombre minimal de souris à utiliser tout en étant sûr de pouvoir observer toute différence relevante entre nos groupes de souris.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans un environnement adapté où elles disposeront de nourriture et eau à volonté. Les éléments nécessaires pour former un nid et une maisonnette seront fourni dans la cage pour assurer le bien-être des souris. Autant que possible, les souris seront au contact d’une seule personne pour leur permettre de s’habituer à elle et de diminuer leur stress. Le personnel qui manipule les souris est formé pour assurer leur bien-être et leur éviter toute souffrance. Les animaux seront anesthésiés lorsqu'il devront recevoir des traitements par dépot de gouttes sur le nez. Au cours des expériences, les souris seront pesées et observées pour détecter tout mal-être le plus tôt possible et agir en conséquence. Ces observations sur le poids, le comportement et la mobilité des souris, permettront le calcul d'un score clinique spécifique au projet présenté en Annexe 1. Si ce score clinique est élevé les souris des mesure spécifiques au projet seront mises en oeuvre : - Si besoin (faible diminution de la mobilité, perte de poids supérieure à 10%, manque de toilettage) de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans la cage de la souris - Si un animal se trouve dans un état grave imprévu (perte de poids supérieure à 20%, forte diminution de la mobilité, absence de toilettage) , celui-ci sera mis à mort pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi pour plusieurs raisons : 1. Les souris se reproduisent rapidement, ce qui permet d’avoir assez d’animaux pour l’étude en peu de temps. 2. Le fonctionnement des poumons et du système immunitaire chez la souris est proche de celui de l’humain, ce qui rend les résultats plus utiles pour la recherche médicale. 3. Notre équipe est déjà formée et expérimentée dans le travail avec les souris de laboratoire. 4. C’est l’animal pour lequel on dispose du plus grand nombre d’outils scientifiques pour étudier les tissus, l’inflammation et les SPMs. 5. Cette lignée de souris génétiquement modifiées (appelée Scnn1b) est la seule à reproduire le phénotype pulmonaire des personnes atteintes de mucoviscidose. 6. L'utilisation d'animaux de 8 semaines dans ce projet permet de s'assurer que les défenses immunitaires de l'animal sont complètement développées.