Procédures modérées

Les cellules transférées proviennent de lignées de souris génétiquement modifiées mises au point par l'équipe, et sont injectées à des souris immunodéficientes plus exposées aux infections. 210 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation de moins de quatre minutes, deux injections et deux prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse, avant prélèvement de leurs organes lymphoïdes. Sur le remplacement, le porteur écrit en deux lignes qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les étapes de développement des lymphocytes B, sans citer une seule méthode essayée.

Objectifs

Nous avons mis en évidence l’accumulation de cellules exprimant un gène de l’immunité innée à partir des deux chromosomes X dans une population de cellule immunitaire associée à la pathogénie du lupus systémique. Nous avons généré des souris génétiquement modifiées pour comprendre les mécanismes mise en jeux dans l’émergence de ces cellules. L’objectif de ce projet est de montrer que les phénotypes que nous observons sont limités aux cellules lymphoïdes. Pour cela les cellules provenant de nos différents modèles génétiques seront transférées dans des souris immunodéficientes.

Bénéfices attendus

Les maladies auto-immunes comme le lupus érythémateux systémique sont plus fréquentes chez les femmes comparées aux hommes (sexe ratio 9:1). L’hypothèse d’un rôle du dosage des gènes du chromosome X a été évoquée. Ce projet vise à démonter s’il existe un lien direct de causalité entre l'échappement à l’inactivation d’un gène de l’X, conduisant à une plus forte expression de ce gène dans les cellules immunitaires et une réponse fonctionnelle exacerbée responsable du déclenchement du lupus in vivo chez la souris. Les bénéfices de ce projet sont considérables car il permettrait d’établir que la plus grande prédisposition des femmes à la maladie lupique serait d’origine génétique et lié à ce mécanisme. Cela pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques ou à l’utilisation de modulateurs capables de promouvoir ou de renforcer l’inactivation du chromosome X.

Procédures

Les animaux pourront subir : une irradiation légère de moins de 4 minutes ; des injections (durée moins de 1 minute) 2 fois sous anesthésie gazeuse; des prélèvements de sang (1 min) sous anesthésie gazeuse, 2 fois pendant toute la procédure.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes que nous utilisons sont davantage susceptibles de développer des infections. L'irradiation peut entrainer un stress et des troubles cutanés. Les injections peuvent entrainer une douleur modérée et un stress transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de prélever les organes lymphoïdes pour analyses cytométriques et/ou transciptomiques et/ou histologiques.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro pour reproduire les différentes étapes de développement des lymphocytes B dans la moelle et les organes lymphoides, de même toutes le populations de lymphocytes B. Ces différentes étapes ne peuvent être reproduites qu'in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'expériences effectuées nous utilisons un nombre d'animaux suffisant par expérience afin d'obtenir des résultats statistiquement interprétables et de faire des analyses à des temps différents. De manière générale, nous avons estimé que 2 lots expérimentaux devront être produits afin de reproduire les expériences de façon indépendante et que d’après nos données expérimentales un effectif de 5 souris/ groupe serait suffisant. Le calcul d’effectif a été réalisé en utilisant une analyse statistique et en se basant sur des travaux antérieurs.

Raffinement

Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé à l’expérimentation animale. Lors de la réalisation des procédures, des précautions et mesures adptées seront prises pour réduire au mieux le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront observés quotidiennement. Les injections i.v. ainsi que les prélèvements sanguins sous-madibulaires seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Afin de limiter les risques d’infection des animaux immunodéficients ils seront placés dans des cages sur portoirs ventilé et les expérimentateurs seront munis de protection personnelle (combinaison, masque, charlotte, surchaussures, gants). L’environement de toutes les cages sera enrichi (igloo, sizzelnest, rouleau en carton). Les animaux seront manipulés sous hotte. La définition des points limites adaptés à la procédure et les critères d’arrêts sont définis suivant un arbre décisionnel validé par notre comité d'étique.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris comme modèle expérimental pour étudier les mécanismes d’échappement à l’inactivation du chromosome X et les conséquences fonctionnelles car il s’agit d’un modèle approprié proche de ce qui se passe dans l’espèce humaine. Nous avons déjà développé des modèles génétiques uniques et originaux chez la souris pour suivre les cellules immunitaires d’intérêt. Ces modèles ont tous été validés et serviront de source de cellules pour un transfert dans des souris immunodéficientes. Les expériences seront réalisées sur des animaux adultes entre 7-10 semaines comme décrit dans la littérature.

3 060 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux administrations orales espacées de 48 heures, subit un conditionnement par la peur de sept minutes puis une réexposition de cinq minutes, donne deux à trois prélèvements de sang à l'état vigile et finit par une chirurgie sans réveil pour prélèvement du cerveau. Les retombées annoncées pour le stress post-traumatique et la maladie d'Alzheimer sont renvoyées au long terme, l'objet immédiat restant de décrire le rôle des cellules gliales dans la mémorisation. Les souris qui atteignent un point limite sont tuées et servent alors, selon le porteur, à des mises au point expérimentales.

Objectifs

La mémorisation et l’apprentissage reposent sur la "plasticité" des circuits neuronaux, c’est-à-dire la capacité à remodeler, réorganiser, les connexions entre les neurones. Cette plasticité est importante au quotidien, voire pour la survie. En effet, reconnaître des contextes dans lesquels on s’est senti précédemment menacé permet d’avoir un comportement adapté si on y est réexposé. Un défaut de cette mémoire entraîne un risque de s’exposer à des situations dangereuses, mais un excès peut conduire à une anxiété disproportionnée dans un contexte ne ressemblant qu’approximativement à celui où l’on a été en danger (c’est le stress post-traumatique). Inversement, la capacité à mémoriser est altérée dans certaines maladies comme celle d’Alzheimer. Il est donc important de connaître les facteurs régulant la plasticité des circuits neuronaux, afin de comprendre pourquoi elle est perturbée dans des situations pathologiques, et d’imaginer comment le prévenir ou y remédier. L’objectif de ce projet est d’étudier, chez la souris, de nouveaux mécanismes permettant la plasticité et donc la mémorisation. Le rôle des neurones dans la mémoire est bien établi, mais d’autres cellules du cerveau, les cellules gliales, pourraient favoriser la plasticité neuronale, c’est-à-dire les remaniements des connexions qui permettent de mémoriser un événement, une situation. L’hypothèse au cœur de ce projet est que lors de l’apprentissage, les propriétés des cellules gliales changent, ce qui a un impact sur leur interaction avec les neurones et favorise la mémoire. Pour tester cette hypothèse, nous avons besoin d’étudier les modifications des cellules gliales lors de la formation de la mémoire, chez des animaux normaux, et chez des animaux dans lesquels ces cellules gliales sont altérées.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à étudier les mécanismes de la mémoire. Voici les retombées possibles : 1) Nous étudierons comment on mémorise une situation de danger, parfois excessivement. C’est un modèle pour étudier le trouble de stress post-traumatique (TSPT), qui est reconnu comme un problème de santé mentale par les psychiatres. Le TSPT peut toucher des personnes ayant connu des traumatismes dans l’enfance, des catastrophes naturelles, ou des situations violentes et/ou très anxiogènes (la moitié des personnes témoins ou endeuillées par les attentats de 2015 ont présenté un TSPT dans les mois qui ont suivi). Certaines professions (pompiers, soignants, militaires) sont particulièrement à risque à cause d’expositions fréquentes à des situations dramatiques. Les manifestations sont diverses : peur intense, pensées intrusives, hypervigilance... Non pris charge, cela perturbe fortement la qualité de vie des personnes, perturbe leur travail, diminue leur insertion sociale, et peut conduire à des idées suicidaires dans les cas extrêmes. Ce modèle permet aussi d’étudier les processus de mémorisation en général. Les résultats que nous obtiendrons pourront donc aussi servir à long terme pour la recherche sur les troubles de la mémoire dans la maladie d’Alzheimer, qui atteint 1 personne de plus de 75 ans sur 6 en France. 2) Nos expériences vont apporter de nouvelles connaissances sur le rôle des certaines cellules et molécules, qui sont ciblées par des médicaments (anti-dépresseurs, neuroleptiques, psychostimulants…). Nos résultats pourraient donc aussi permettre, à long terme, de mieux comprendre les effets positifs ou indésirables de ces médicaments sur la mémoire, et donc d’améliorer, pour les êtres humains, leur prescription et leur utilisation.

Procédures

Dans ce projet, les animaux doivent recevoir un composé pharmacologique, par voie orale, en 2 prises espacées de 48h. Chaque administration sur animal vigile dure moins de 30 secondes. Au minimum 4 semaines plus tard, les animaux vont être soumis à un test de mémoire. Cela nécessite une phase d’apprentissage qui dure 7 minutes, suivie quelques heures ou jours plus tard (selon les lots), d’une phase de test pendant 5 minutes. Par ailleurs, pour vérifier le niveau de stress chez les animaux, nous devons doser dans le sang des marqueurs comme la corticostérone. Pour ce faire, nous devons prélever quelques gouttes de sang sur les animaux vigiles. Le geste dure moins d’une minute. Les animaux seront prélevés 2 ou 3 fois selon les lots, et les prélèvements sont espacés d’une semaine au minimum. A la fin de l’expérience, une chirurgie sans réveil sous anesthésie et analgésie est réalisée. Ce geste dure moins de 5 minutes.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un composé pharmacologique par voie orale, il y a un stress lié à la contention de l’animal, un risque de blessure de l’animal au niveau de l’œsophage lors des gavages, et un risque mineur de « fausse route ». Pour le test de mémoire, on réalise un conditionnement par la peur, qui génère donc un stress modéré. Ensuite, on réexpose l’animal au même environnement, ce qui induit une anxiété qui se manifeste par une immobilité, et que l’on quantifie pour déterminer le niveau de mémorisation. Lors des prélèvements de sang, il y a un risque d’hématome ou d’hémorragie si l’animal a un problème de coagulation. Lors de l’anesthésie/analgésie, il y a un risque de détresse respiratoire, comme effet secondaire possible des produits employés comme la kétamine.

Devenir

Nous devons euthanasier les animaux à l’issue de la procédure pour pouvoir prélever leurs organes (ici, le cerveau) et réaliser des analyses qui sont nécessaires à la compréhension des mécanismes de mémorisation.

Remplacement

Ce projet vise à étudier les modifications des cellules gliales lors d’un apprentissage. En préparation et en parallèle de ce projet sur l’animal éveillé, nous faisons des expériences sur des cultures primaires de cellules, pour des mises au point ou pour tester des hypothèses. Cependant, l’apprentissage et la mémorisation, comme le test pour déterminer le niveau de mémorisation, reposent sur le comportement de l’animal, qui doit être éveillé et pouvoir bouger ou rester immobile, et se servir de ses sens (vue, toucher…). Au niveau cérébral, il s’agit d’un phénomène complexe faisant intervenir plusieurs types de cellules, ce qu’on ne peut pas modéliser fidèlement ni in vitro ni in silico. Le travail sur l’animal éveillé est donc indispensable pour comprendre comment les processus de mémorisation. De plus, il est nécessaire d'utiliser un modèle animal mammifère afin d’obtenir des résultats transposables à l'Homme car les structures cérébrales impliquées et étudiées (ex : l’hippocampe) ne sont pas présentes chez les invertébrés. La souris représente un modèle de choix car le fonctionnement du cerveau et les tests comportementaux que nous allons utiliser sont bien caractérisés. L’autre avantage du modèle souris est qu’il existe des lignées génétiquement modifiées qui permettent d’invalider ou d’exprimer des gènes pour étudier leur rôle.

Réduction

Afin de déterminer le nombre minimal d’animaux pour obtenir des résultats significatifs et reproductibles, une analyse statistique a été effectuée et a permis d’estimer qu’il faut prévoir une douzaine d’animaux de chaque sexe (soit 24 animaux) par groupe expérimental. Si l’on réduit trop le nombre d’animaux, on perd en « puissance statistique », c’est-à-dire qu’on risque de ne pas pouvoir détecter des différences, et de conclure par erreur à une absence d’effets. De plus, nous devons prévoir des animaux pour ajuster les protocoles, car même si les expériences ont déjà été réalisées au laboratoire précédemment, il est important de refaire des expériences test pour que les nouveaux expérimentateurs amenés à faire l’expérience se familiarisent avec les différentes étapes. Cela permet que les expériences avec les animaux d’intérêt se déroulent au mieux et que les résultats soient fiables, donc au total cela limite les répétitions et le nombre d’animaux utilisés. En tout nous estimons l’utilisation de 3060 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les conditions sont conformes à la réglementation pour l’espèce concernés (température constante entre 20 et 24 degrés avec un éclairage circadien, hébergement en groupes sociaux de 5 individus maximum et présence dans chaque cage d’un à deux enrichissements de nidification). Procédures : Les expérimentateurs sont sensibilisés à l’importance du bien-être animal, à la fois pour les animaux et pour la qualité des résultats. Les manipulations des animaux sont donc réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) la douleur et/ou le stress. Avant chaque geste, l’état général de l’animal est vérifié afin de s’assurer qu’il est compatible avec la poursuite de l’expérimentation. Les administrations et prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. En ce qui concerne la perfusion intracardiaque, afin de réduire les nuisances, les animaux seront injectés avec l’anesthétique et l’analgésique dans une pièce séparée de la salle de perfusion, et apportés dans la salle juste pour la perfusion, après avoir vérifié leur état de sédation par pincement de la patte. Points limites : Le bien-être des animaux sera surveillé quotidiennement conformément aux règlementations, et de manière particulièrement rapprochée après les administrations, les tests comportementaux, et les prélèvements de sang. Des critères d'arrêt sont définis si une souffrance ne peut pas être soulagée. La détection d’une possible souffrance est basée sur un suivi quotidien, de sorte à administrer un traitement adapté si besoin, et à sortir un animal de l’étude en cas d’atteinte des points limites. Notamment, en cas de douleur manifeste ou blessure les animaux seront euthanasiés par une chirurgie sans réveil. Ils ne seront alors pas forcément utilisés pour l’étude en elle-même mais pourront être utilisés pour des mises au point expérimentales.

Choix des espèces

La souris est un organisme modèle de choix pour les études sur le cerveau et la mémoire car en tant que mammifère son système nerveux a des similarités importantes avec l’homme. De plus, elles peuvent apprendre des tâches complexes, et on peut analyser leur comportement finement. Cette espèce est bien connue comme modèle pour étudier la mémoire. De plus, il existe dans cette espèce des lignées modifiées génétiquement, qui permettent d’étudier le rôle de certains gènes et de certaines cellules de manière précise. On peut en effet invalider, muter, des gènes particuliers dans des cellules précises, et à des stades de développement particuliers. Dans notre étude, pour étudier la mémoire, nous étudierons des animaux dont le développement aura été normal, mais dans lesquels on aura induit des modifications à l’âge adulte (4 semaines après la naissance au moins). Cela nous permet d’élever les animaux dans un état où les modifications génétiques sont silencieuses, sans effet, jusqu’au moment de l’expérience.

36 souris Swiss femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent trois injections sous-cutanées d'antibiotique en trois jours consécutifs, puis un gavage oral unique d'une suspension d'Enterococcus faecalis, avant que leur tube digestif soit prélevé pour dénombrement bactérien. Le porteur affirme qu'aucune alternative in vitro ou ex vivo ne reproduit la complexité d'une infection gastro-intestinale, et attend du modèle qu'il éclaire la persistance de la bactérie après une endocardite. L'âge et le sexe des souris sont fixés "à la demande du client", ce qui situe le projet du côté de la prestation.

Objectifs

Les entérocoques sont des bactéries ubiquitaires, naturellement présents dans le microbiote intestinal humain. Parmi eux, Enterococcus faecalis est l'espèce majoritairement responsable des infections humaines. Historiquement considérés comme des bactéries opportunistes, les entérocoques suscitent aujourd’hui une inquiétude croissante en raison de leur capacité à développer une résistance aux antibiotiques et à persister dans des environnements hospitaliers hostiles. E. faecalis est impliqué dans diverses pathologies, telles que les endocardites (infections du cœur), les infections urinaires, les bactériémies, et plus rarement les infections gastro-intestinales. La rechute fréquente de certaines infections laisse supposer une tolérance ou une persistance bactérienne qui échappe aux traitements classiques. Dans ce contexte, le projet vise à développer un modèle d’infection gastro-intestinale permettant d’évaluer le comportement infectieux de deux souches mutées en comparaison d’une souche non mutée. L’objectif est de déterminer si ces mutations influencent la capacité de la bactérie à établir ou maintenir une infection différente de la souche parentale.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle murin standardisé permet de reproduire les conditions d'une colonisation intestinale par Enterococcus faecalis et d'étudier son comportement in vivo, dans un environnement contrôlé et reproductible. En comparant la souche parentale à deux mutants identifiés chez des patients ayant rechuté d’endocardite, le projet permet d’explorer les déterminants bactériens responsables de la persistance, de la tolérance aux antibiotiques, et potentiellement de la rechute infectieuse.

Procédures

- 3 injections sous cutanée (de 10 secondes (aiguille 26G) à raison d’une injection quotidienne 3j consécutifs - 1 administration unique par gavage oral de 10 secondes (0,9 x 25 mm)

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis à différents actes pouvant induire un stress ou une douleur : - La première phase consistera à administrer par voie sous cutanée un antibiotique. La nuisance principale sera liée ici au geste de l’injection sous cutanée. Des expériences de décontamination digestive menées par le passé et utilisant un cocktail de plusieurs antibiotiques n’ont pas montré d’effets secondaires de type intolérance digestive/diarrhée. - Dans la phase 2, les nuisances attendues seront liées à l’administration de l’antibiotique (comme dans l’étape 1) et de la suspension bactérienne par gavage oral. De la même façon, des effets digestifs à type de diarrhée ne sont pas attendus suite l’administration orale de cette bactérie (un protocole similaire a déjà été testé par l’équipe de recherche avec laquelle nous menons ce projet).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de collecter les organes du tube digestif pour dénombrement bactérien

Remplacement

Le recours à un modèle animal, en l’occurrence la souris, se justifie par l’absence d’alternative in vitro ou ex vivo permettant de reproduire de manière réaliste la complexité d’une infection gastro-intestinale impliquant l’interaction dynamique entre le microbiote, la barrière intestinale, le système immunitaire et la bactérie.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été soigneusement calculé pour permettre une analyse statistique robuste (ANOVA) tout en limitant au maximum le nombre de souris par groupe : 6 souris par groupe et 3 pour le groupe véhicule. De plus, une phase de validation est effectuée sur un très petit nombre de souris (n=3), ce qui permet d’optimiser les conditions expérimentales avant le test à plus grande échelle, évitant ainsi des utilisations inutiles d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés à 3 ou 6 par cage dans un environnement adapté et enrichi (jouets). Tous les animaux sont suivis quotidiennement pour détecter tout signe de souffrance ou de détresse. Les antibiotiques sont administrés par voie sous-cutanée ou dans l’eau de boisson pour éviter des manipulations trop invasives et le gavage oral est réalisé avec précaution, par du personnel formé, pour limiter le stress et les complications.

Choix des espèces

La souris Swiss est un modèle de choix répandue dans la greffe d’infection gastro intestinale à Enterococcus faecalis. Des souris femelles âgées de 8 semaines seront utilisées dans cette étude à la demande du client et selon les données de la littérature.

Les 60 souris de ce projet sont immunodéficientes, donc exposées aux infections opportunistes, condition posée pour qu'elles acceptent la greffe de cellules leucémiques humaines. Toutes sont tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules leucémiques puis jusqu'à six prises de sang en trois mois, pendant que la maladie provoque anémie, amaigrissement et grossissement de la rate. Le porteur consacre une longue rubrique aux organoïdes de moelle osseuse, aux cultures en trois dimensions et aux bases de données de patients qui permettraient de se passer d'animaux, avant de conclure que "certaines questions scientifiques nécessitent encore un modèle biologique complet".

Objectifs

Il s’agit d’étudier l’impact de l’absence d’une enzyme sur le développement des leucémies aiguës myéloblastiques.

Bénéfices attendus

Bénéfices attendus du projet Ce projet vise à améliorer la compréhension et le traitement des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM), un type de cancer du sang. 1 - Avancées scientifiques • Mieux comprendre comment l'absence d’une enzyme influence le développement des leucémies. • Étudier l’impact de cette enzyme sur la survie des cellules cancéreuses. • Tester ces découvertes dans un modèle de souris pour confirmer les résultats obtenus en laboratoire. 2 - Développement de nouveaux traitements • Identifier de nouvelles cibles pour des traitements contre la leucémie. • Concevoir des médicaments capables de ralentir la progression de la maladie. 3 - Amélioration du diagnostic et du suivi des patients • Trouver de nouveaux indicateurs permettant de mieux prédire la résistance aux traitements. • Adapter les soins en fonction du profil biologique de chaque patient. 4 - Impact pour les patients • Développer de nouvelles options thérapeutiques pour les patients qui ne répondent pas aux traitements actuels. • Réduire les effets secondaires des chimiothérapies en combinant différents types de traitements. • Mettre en place une meilleure surveillance après le traitement pour éviter les rechutes. • Proposer des soins plus personnalisés et adaptés à chaque patient. 5 - Retombées sociétales et économiques • Faire avancer la recherche sur les leucémies et d'autres cancers. • Réduire les coûts des traitements en diminuant les hospitalisations et en évitant l'utilisation de médicaments inefficaces. Conclusion En résumé, ce projet pourrait permettre de mieux comprendre la leucémie, d'améliorer les traitements actuels et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques plus ciblées.

Procédures

1 - Contention • Les souris seront manipulées avec précaution pour minimiser le stress lors des différentes interventions, en utilisant des techniques adaptées de contention douce. • Une attention particulière sera portée à la durée de la contention afin de limiter son impact sur les animaux. 2 - Greffe de cellules leucémiques • Les souris recevront une injection de cellules leucémiques pour reproduire un modèle de la maladie. • Nombre d’animaux concernés : 60 souris • Durée : une seule injection, environ 1 minute. 3 - Suivi de la maladie • Des prises de sang seront réalisées toutes les deux semaines (jusqu’à 3 mois après l’injection des cellules leucémiques) afin de surveiller l’évolution de la leucémie et d’analyser la réponse immunitaire. Nombre total maximum de prélèvements : 6. • Nombre d’animaux concernés : 60 souris • Durée : environ 1 minute par prise de sang

Impact sur les animaux

Malgré toutes les précautions prises pour assurer leur bien-être, certains effets secondaires sont attendus en raison de la nature de l’étude. Effets liés aux interventions expérimentales • Les traitements administrés avant l’injection des cellules leucémiques peuvent provoquer une fatigue passagère et une légère perte de poids. • Les prises de sang régulières, nécessaires au suivi de la maladie, peuvent entraîner un certain stress. Pour limiter cet inconfort, des techniques adaptées seront utilisées. Effets liés au développement de la maladie • La progression de la leucémie peut causer une anémie (diminution des globules rouges), une perte d’énergie, un amaigrissement et une augmentation de la taille de certains organes comme la rate. Effets liés à l’immunodéficience • Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris immunodéficientes, ce qui les rend particulièrement sensibles aux infections opportunistes.

Devenir

Mise à mort des animaux pour analyses scientifiques Toutes les souris seront mises à mort pour des analyses approfondies qui concernent principalement la moelle osseuse et le sang, éléments essentiels pour comprendre l’évolution de la maladie. • Justification : ces examens sont indispensables pour valider les hypothèses scientifiques du projet et pourraient aider à identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques contre la leucémie. • Méthode : la mise à mort sera réalisée selon des protocoles stricts garantissant une mort rapide et sans douleur, conformément aux réglementations en vigueur sur le bien-être animal.

Remplacement

Stratégies de remplacement de l’expérimentation animale Afin de limiter autant que possible le recours aux animaux, plusieurs méthodes alternatives seront utilisées pour mener cette étude sur la leucémie. 1. Expériences en laboratoire sur des cellules humaines • Des cultures de cellules leucémiques humaines seront utilisées pour observer comment une enzyme influence leur croissance et leur évolution. • Des modèles plus avancés, appelés cultures 3D et organoïdes de moelle osseuse, seront développés pour recréer un environnement proche de celui du corps humain. Cela permettra d’obtenir des résultats plus réalistes sans utiliser d’animaux. 2. Analyses informatiques et exploitation des données existantes • Des bases de données contenant des informations sur des patients atteints de leucémie seront analysées afin de repérer d’éventuels liens entre l’expression d’une enzyme et la progression de la maladie. • Ces approches bioinformatiques permettront de générer des hypothèses solides avant de tester de nouveaux traitements, réduisant ainsi le besoin d’expériences sur des animaux. 3. Études sur des cellules humaines en dehors du corps (ex vivo) • Des cellules souches du sang seront cultivées dans des conditions spécifiques pour étudier le rôle d’une enzyme sans passer par des tests sur des souris. • Des échantillons de moelle osseuse prélevés chez des patients atteints de leucémie permettront de valider les résultats obtenus en laboratoire. Conclusion L’objectif est d’utiliser autant que possible ces alternatives avant d’envisager l’expérimentation animale. Cependant, certaines questions scientifiques nécessitent encore un modèle biologique complet pour être étudiées, ce qui justifie l’utilisation de souris lorsque les autres méthodes ne suffisent pas.

Réduction

Ce projet met en place plusieurs approches pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en garantissant des résultats fiables et exploitables. 1. Optimisation des protocoles expérimentaux • Une planification minutieuse des expériences permettra de réduire le nombre de souris nécessaires tout en obtenant des données statistiquement significatives. • Chaque animal sera utilisé pour plusieurs types d’analyses afin de maximiser les informations obtenues, évitant ainsi d’avoir recours à un plus grand nombre de sujets. 2. Expériences préliminaires avant les tests sur animaux • Des tests seront d’abord réalisés sur des cultures cellulaires (in vitro) et des échantillons biologiques (ex vivo), afin d’identifier les conditions expérimentales les plus pertinentes avant de passer à des essais sur animaux. • Cela permettra d’éviter des expériences inutiles et de limiter le nombre de souris impliquées. 3. Utilisation de méthodes statistiques avancées • Des outils statistiques performants seront employés pour garantir des résultats fiables avec le plus petit nombre d’animaux possible. • Ces méthodes permettent d’optimiser les groupes expérimentaux en veillant à ce que chaque test apporte un maximum d’informations. 4. Partage des ressources et des résultats avec d’autres laboratoires • Une collaboration avec d’autres équipes de recherche permettra d’éviter de répéter des expériences déjà réalisées ailleurs. • L’exploitation de bases de données existantes sur la leucémie permettra d’affiner les hypothèses sans multiplier les tests sur animaux. Conclusion Grâce à ces stratégies, le recours aux animaux sera limité au strict nécessaire. Ces mesures s’inscrivent dans une démarche responsable et éthique, visant à réduire l’impact de l’expérimentation animale tout en poursuivant des avancées scientifiques essentielles pour la lutte contre la leucémie.

Raffinement

Afin de limiter le stress et la souffrance des animaux tout en garantissant des résultats scientifiques fiables, plusieurs mesures seront mises en place. 1. Techniques expérimentales adaptées pour minimiser l’inconfort • Les injections et prélèvements sanguins seront réalisés avec des techniques optimisées pour réduire la douleur et le stress des animaux. • Les expérimentateurs seront spécialement formés pour effectuer ces manipulations rapidement et avec le plus grand soin. 2. Surveillance attentive pour prévenir la souffrance • Les animaux seront observés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de détresse ou de douleur. • Des critères stricts seront appliqués : si un animal montre des signes avancés de souffrance ou de détérioration de son état de santé, il sera mis à mort de manière éthique et sans douleur pour éviter toute souffrance prolongée. 3. Amélioration des conditions de vie • Les souris seront élevées dans un environnement enrichi, comprenant des tunnels, des cachettes et une litière adaptée, afin de favoriser leur bien-être et de réduire leur stress. • Elles seront logées en petits groupes compatibles pour éviter l’isolement et favoriser un comportement naturel. • Les souris utilisées étant immunodéficientes, elles seront hébergées sous couvercle filtrant pour limiter le risque infectieux, qui pourrait altérer leur bien-être ainsi que les résultats expérimentaux. 4. Formation et encadrement des chercheurs • Tous les chercheurs impliqués recevront une formation continue aux meilleures pratiques en expérimentation animale, pour garantir des manipulations respectueuses et éthiques. • Un dialogue constant sera maintenu avec le comité d’éthique et les spécialistes du bien-être animal, afin d’améliorer en permanence les protocoles et de s’assurer qu’ils respectent les dernières recommandations en matière de protection animale. Conclusion Grâce à ces mesures, l’impact des expériences sur les animaux sera réduit au minimum, tout en garantissant des conditions de vie optimales et un suivi rigoureux de leur bien-être.

Choix des espèces

La souris a été choisie pour cette étude car elle représente un modèle particulièrement adapté à la recherche sur la leucémie humaine. Pourquoi utiliser la souris ? • Une grande similarité avec l’humain : le système de production des cellules sanguines (hématopoïèse) chez la souris fonctionne de manière très proche de celui de l’être humain. Cela permet de reproduire fidèlement les mécanismes impliqués dans le développement de la leucémie. • La possibilité de modifier son patrimoine génétique : grâce à des modèles génétiquement modifiés, les chercheurs peuvent étudier avec précision l’effet de l’absence d’une enzyme sur la maladie. • Une expérimentation contrôlée : la souris permet de tester l’évolution de la leucémie dans un organisme vivant, en réalisant des injections de cellules leucémiques, des traitements et des analyses de sang dans des conditions proches de celles utilisées en milieu clinique. • Un modèle rapide et efficace : les souris ont une durée de vie courte et se reproduisent rapidement, ce qui permet d’obtenir des résultats en un temps relativement réduit et d’évaluer l’évolution de la maladie sur plusieurs générations de cellules. Pourquoi utiliser des souris adultes ? Les études seront débutées sur des souris à un âge compris entre 8 et 12 semaines, car : • À cet âge, leur système sanguin est totalement formé et stable, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. • Leur taille et leur maturité physiologique facilitent les procédures expérimentales, comme les prélèvements et injections.

Aucune souris n'est gardée vivante à l'issue, les procédures subies étant jugées incompatibles avec toute conservation. 382 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de trente minutes sous anesthésie générale pour recevoir une injection dans le cerveau, puis vit cinq à neuf semaines avant les analyses. Le porteur ramène les atteintes attendues à une douleur et une perte de poids survenant "dans des cas très rares", et conclut que l'étude in vivo est "indispensable" parce que les cultures cellulaires ne reproduisent pas les interactions entre neurones et astrocytes.

Objectifs

Depuis maintenant plusieurs décennies, de nombreuses études indiquent que l’astrocyte joue un rôle clé au cours de la communication neuronale aussi appelée transmission synaptique. En effet, cette cellule gliale détecte l’information transmise au niveau de la synapse (zone de communication entre deux neurones) et en retour régule la communication neurone-neurone via la libération de transmetteurs. Récemment, de nombreux papiers révèlent également la présence au niveau astrocytaire de molécules d’adhésion cellulaire, qui étaient jusqu’à présent considérées comme étant des molécules uniquement neuronales. L'expression astrocytaire des molécules d'adhésion pourrait expliquer comment les astrocytes forment des interactions étroites avec leurs partenaires synaptiques, et exercent des fonctions importantes, notamment la régulation de l’activité synaptique. Afin d’aller plus loin dans la compréhension du transfert d’information dans l’hippocampe, une région cérébrale jouant un rôle clef dans la mémoire, il est donc nécessaire de déterminer si les molécules d'adhésion astrocytaires interviennent dans la régulation de la transmission synaptique, la plasticité synaptique à long terme, ainsi que la mémoire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes astrocytaires sous-tendant la mémoire et l’apprentissage. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercutions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 2 : - Chirurgie sous anesthésie générale pour injections intra-cérébrale (30 min), - Euthanasie après anesthésie profonde (instantanée).

Impact sur les animaux

Suite aux différentes procédures, une douleur ainsi qu’une perte de poids peuvent survenir dans des cas très rares.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux ne seront pas gardés du fait des techniques/procédures subies et seront de ce fait mis à mort.

Remplacement

Travaillant sur les interactions des cellules neuronales et astrocytaires, il est impossible de recourir à des modèles bioinformatiques ou à des cellules en culture. L’étude in vivo est donc indispensable. De plus, la souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la mémoire. Nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents. Le projet sera réalisé sur des souris mâles et femelles. Si au cours du projet nous observons que les résultats sont similaires entre les mâles et les femelles, nous poolerons les données obtenues ce qui permettra de REDUIRE de moitié le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dispositions d’hébergement : Pour chacune des études, les animaux seront placés dans des cages enrichies, au nombre de 4-5 par cage. Ils seront stabulés dans une animalerie thermorégulée avec hygrométrie contrôlée et cycle de lumière inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau sera ad libitum et un changement de litière effectué chaque semaine. Dispositions visant à réduire la douleur : Si l’animal présente des signes de douleur au cours de l’expérimentation, nous administrerons immédiatement un antalgique. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en cas d’absence d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, il sera mis à mort.

Choix des espèces

Le modèle utilisé est la souris. La souris est classiquement utilisée afin de mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la communication neuronale et la plasticité synaptique à long terme (base cellulaire de la mémoire). Les diverses études seront réalisées 5 à 9 semaines après les injections intracérébrales. Les questions que nous posons concernent le stade adulte, c’est pourquoi les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 12 à 20 semaines.

3 075 souris vont être utilisées, chacune pouvant recevoir jusqu'à trois injections dans l'œil et une lésion du nerf optique, au cours de chirurgies de cinq minutes. Toutes sont tuées pour que leurs tissus soient analysés, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît que ces gestes peuvent enflammer l'œil ou l'endommager, et décrit en deux phrases l'ensemble des atteintes attendues. L'effectif de 3 075 animaux n'est rattaché à aucun calcul dans le RNT, qui mentionne seulement "l'utilisation de tests statistiques optimaux".

Objectifs

Les maladies du système nerveux représentent un défi sociétal majeur. En effet, le glaucome par exemple concerne plus de 10 millions de patients dans le monde. Cette maladie entraine la dégénération du nerf optique, le seul lien entre l’œil et le cerveau ce qui induit une perte définitive de la vue. Une voie de guérison consiste à protéger les neurones de la mort et à faire repousser le nerf optique pour reformer le circuit qui traite l’information visuelle. Ce projet a pour but de comprendre l’impact de l’expression génique dans les cellules sur la neuroprotection et la régénération. Nous allons manipuler chez l’adulte l’expression de ces protéines pour induire la régénération et permettre le retour visuel.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer de nouvelles cibles thérapeutiques permettant la neuroprotection et/ou la régénération du système visuel pour combattre des maladies comme le glaucome où il faut de nouveau connecter l’œil au cerveau.

Procédures

Les souris peuvent subir jusqu'a 3 injections dans l’œil et une lésion du nerf optique. Les chirurgies durent 5 min.

Impact sur les animaux

- L’injection intraoculaire peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil -La lésion du nerf optique chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil

Devenir

les souris sont mises à mort car notre projet nécessite de récupérer les tissus pour des analyses histologiques.

Remplacement

Pour atteindre nos objectifs, les expériences sur les souris sont essentielles et non remplaçables car i) les conséquences d’une lésion du système nerveux chez la souris sont les mêmes que chez l’humain, et ii) les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents types de cellules qui ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Le modèle souris est reconnu pour la recherche sur la régénération du système nerveux central. Il est à noter que tous les candidats d'intérèts seront seront étudiés d’abord sur des cultures cellulaires.

Réduction

Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - tester les candidats identifiés in vitro sur des cultures cellulaires. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Seuls les candidats les plus pertinents in vitro seront utilisées chez la souris.

Raffinement

Les interventions sur l’œil sont des chirurgies et seront réalisées sous anesthésie générale. Les souris recevront une injection d’un médicament antidouleur et antiinflammatoire adapté avant et apres l’opération . Après chaque anesthésie, les souris seront placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil.

Choix des espèces

La régénération du système nerveux est un phénomènes multifactoriels qui permettent la formation d’un circuit neuronal. La modélisation de ces processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les voies moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in vivo pertinent grâce à une grande similitude anatomique avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles tels que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les questions scientifiques que nous nous posons. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris dont le système nerveux est mature. Nous voulons étudier les mécanismes de régénérescence dans le système nerveux central adulte pour être le plus proche possible des lésions chez l’homme.

120 rats non consanguins de six à huit semaines vont être utilisés, tous tués au plus tard quatorze jours après le début de la procédure, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une administration unique du composé, en intraveineuse ou par sonde de gavage, puis subit huit prélèvements sanguins à la veine saphène sous anesthésie. Le protocole se déroule sur des animaux sains et mesure où va la molécule dans l'organisme, combien de temps elle y reste et comment elle en sort. Le porteur situe ce passage chez le rat dans une séquence qu'il décrit comme classique, la première étape sur "organisme entier" avant "d'envisager éventuellement d'autres études plus avancées chez le chien ou le primate".

Objectifs

Les cancers hématologiques comme les leucémies, les myélomes et les lymphomes, sont des cancers qui se développent à partir de cellules du sang. En France chaque année, 33 000 personnes sont touchées par ces pathologies, en particulier les enfants, jeunes adultes et personnes âgées. Ils représentent 7% des cancers. Le traitement des cancers hématologiques repose en grande majorité sur la chimiothérapie à l'heure actuelle. Ces options thérapeutiques entrainent un certain nombre d’effets indésirables et leur efficacité diffère selon les patients. Malgré ces traitements, l’espérance de vie des personnes touchées par ces types de cancer varie de 2 à 5 ans après le diagnostic. Nous nous intéressons dans ce projet à un potentiel nouvel agent anticancéreux : une enzyme en tant que voie prometteuse dans les thérapies alternatives contre le cancer. Cette enzyme offre un avantage unique, sa capacité à cibler sélectivement et à inhiber la croissance des cellules cancéreuses sans nuire aux cellules saines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine à moyen terme. En effet, il y a encore aujourd’hui des patients atteints de cancer hématologiques réfractaires aux traitements sur le marché. L’étude va permettre de développer de manière préliminaire une nouvelle molécule qui permettra au mieux de guérir les patients atteints de ce type de cancers, ou au moins de ralentir la progression tumorale.

Procédures

Administration des traitements : contention et injection des composés en intraveineuse (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes) ou en gavage (une fois unique, geste d'une durée de 30 secondes). Les prélèvements de sang seront effectués à la veine saphène (anesthésie et prélèvement d’une durée de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Lors du traitement, les animaux vont subir un stress à la contention et une douleur de quelques secondes due à l'aiguille lors de l'injection intraveineuse. Les administrations par voie orale avec sonde de gavage génèrent un stress de quelques secondes lors de la contention. Les prélèvements de sang répétés vont générer un stress lors de l’anesthésie et du prélèvement (8 prélèvements au total par animal). Aucun signe de toxicité particulière lors de l'administration du composé aux doses testées dans ce projet n’a été observé chez le rat lors de l'étude préalable de tolérance.

Devenir

Tous les animaux auront été mis à mort au plus tard 14 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai afin de pouvoir réaliser les prélèvements de sang puis d’organes prévus dans la procédure.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, de nombreuses manipulations de caractérisation de notre composé d’intérêt ont été réalisées (études de cytotoxicité) ayant permis de sélectionner les types de cancers sur lesquels il serait le plus efficace. Ensuite, le passage chez le rat a permis l’évaluation de sa tolérance sur un organisme entier. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans l’organisme nécessitent d’être étudiés et définis sur l’organisme vivant sain avant de tester dans de futurs projets son efficacité sur organisme malade. Pour cette raison nous devons effectuer cette étude chez le rat.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de manière fiable sur cette étude préliminaire qui permettra de définir le cheminement du composé dans l'organisme. Pour la comparaison des quantités maximales du composé dans le plasma entre chaque groupe traité, nous utiliserons un test statistique fiable à multiple comparaisons. Pour le choix du nombre de rat par groupe qui nous permettra de pouvoir observer des différences entre les groupes et de choisir la dose ainsi que le mode d'administration les plus adéquats chez le rat, nous avons utilisé des logiciels statistiques reconnus. Les résultats de ce projet seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Avant toute manipulation, les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en les contentionnant une fois par jour pendant 5 jours. Les rats seront observés tous les jours par le personnel de l'animalerie qui remplit une fiche de suivi de l’état général des rats afin de détecter rapidement une souffrance, et 7 jours sur 7 dans le cadre de ce protocole par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé si nécessaire afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. L’état général des rats sera ainsi suivi et annoté dans le cadre de l’expérimentation grâce à une grille de scoring détaillée. Les expérimentateurs sont expérimentés et sont à même de détecter très rapidement le moindre signe de douleur afin d’appliquer les meilleures mesures. Les animaux seront hébergés en groupe de 3 rats par cage et chaque cage présentera des enrichissements (coton de nidation, bâtonnet à ronger, tunnels pour jeux). Pour les groupes dont le composé sera administré par voie orale en gavage, des sondes de gavages en plastique flexibles évitant l'irritation et à usage unique seront utilisées.

Choix des espèces

Afin de plus tard développer cette molécule thérapeutique chez l'Homme, nous devons au préalable observer son devenir dans l'organisme chez l’animal, la première étape sur organisme entier étant classiquement réalisée chez le rat ou la souris avant d’envisager éventuellement d’autres études plus avancées chez le chien ou le primate. Pour ce faire, nous souhaitons étudier les paramètres pharmacocinétiques qui correspondent à : son absorption, sa distribution, sa métabolisation et son élimination en analysant les quantités de celui-ci dans le sang à différents temps après injection, dans les deux sexes chez le rat non consanguin. Les rats non consanguins sont utilisés pour l’évaluation toxicologique et pharmacologique des candidats-médicaments. Ainsi, les rats non consanguins présentent une plus grande diversité génétique, et sont donc plus intéressants pour les études de tolérance. Les animaux seront utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines afin que les animaux soient jeunes et en bonne santé.