Procédures modérées

Les souris utilisées portent une altération ciblée des cellules souches du poil, censée désorganiser le follicule, rompre la barrière de la peau et déclencher une inflammation cutanée. 1 113 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont épilées sous anesthésie, reçoivent pendant trois jours l'application cutanée d'un inducteur de recombinaison génétique, puis des injections dans l'abdomen, des prises de sang et un régime hypercalorique pendant cinq semaines que le porteur présente comme sans complications métaboliques notables. Toutes sont tuées pour suivre l'évolution de la réponse immunitaire sur l'ensemble de l'expérience, dont l'objet est de reproduire les premières étapes de l'hidradénite suppurée.

Objectifs

L’hidradénite suppurée est une maladie inflammatoire chronique de la peau, qui touche environ 1 % de la population. Elle se manifeste par des nodules douloureux, des abcès profonds, des fistules et des cicatrices, principalement localisés dans les zones de pli (aisselles, aine, régions anogénitales). La maladie évolue souvent vers une inflammation chronique, accompagnée de lésions malodorantes, de cicatrices rétractiles et de fibrose de la peau. Le diagnostic est souvent tardif, avec un délai moyen de plus de 7 ans entre les premiers symptômes et la prise en charge. L’hidradénite suppurée a un impact majeur sur la qualité de vie des patients, comparable à celui d’autres maladies chroniques sévères. Elle est associée à un risque accru de dépression, d’anxiété, de douleurs chroniques, de surpoids et de difficultés professionnelles. De façon préoccupante, les taux de suicide sont significativement plus élevés chez les personnes atteintes d'hidradénite suppurée que dans d’autres maladies de peau comme le psoriasis. L’hidradénite suppurée reste à ce jour une maladie difficile à traiter, et constitue un besoin médical non satisfait en l’absence d’options thérapeutiques réellement efficaces. Le développement de traitements ciblés est freiné par deux obstacles majeurs : d’une part, la méconnaissance des mécanismes physiopathologiques impliqués, accentuée par l’hétérogénéité des formes cliniques de la maladie ; d’autre part, l’absence de modèle animal fiable permettant de reproduire les caractéristiques clés de la maladie humaine et de tester de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le développement de ce nouveau modèle murin a pour objectif principal de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques à l’origine de l’hidradénite suppurée, notamment le lien entre dysfonction des cellules souches folliculaires, altération de la barrière épithéliale et inflammation cutanée. À court terme, ce modèle permettra de valider des hypothèses mécanistiques et d’identifier de nouvelles cibles moléculaires impliquées dans l’initiation et la chronicisation de la maladie. À moyen terme, il servira à tester des candidats thérapeutiques (anti-inflammatoires, anticorps monoclonaux) dans un système physiologiquement pertinent. À plus long terme, l’ambition est de contribuer au développement de traitements ciblés pour les patients atteints d’hidradénite suppurée, une maladie encore sans solution curative.

Procédures

Les souris seront épilées sous anesthésie (durée de l’intervention : environ 5 minutes) afin d’assurer une application homogène des traitements topiques. L’application cutanée d’un inducteur de recombinaison génétique ou de son solvant (type solvant organique hydrophobe) sera réalisée pendant 3 jours consécutifs. Des prélèvements sanguins seront réalisés à intervalles réguliers au cours de l’expérimentation. Chaque prélèvement durera moins de 20 secondes, afin de minimiser le stress animal. L’administration des substances expérimentales sera effectuée par voie intrapéritonéale, avec des injections réalisées en moins de 20 secondes, de manière à limiter l’inconfort des animaux. La bactérie utilisée dans ce protocole ne provoque pas d’infections cutanées chez la souris, garantissant une exposition sans risque infectieux significatif. Enfin, l’introduction d’un régime alimentaire hypercalorique sur une période de 5 semaines ne génère pas de complications métaboliques notables dans notre modèle, assurant le maintien du bien-être animal tout au long de l’expérimentation.

Impact sur les animaux

L’administration d’un inducteur de recombinaison génétique pourrait entraîner des effets secondaires transitoires tels qu’une légère perte de poids, une réduction de l’activité locomotrice ou des modifications du métabolisme hépatique. Notre modèle cible spécifiquement les cellules souches du follicule pileux, considérées comme l’un des éléments déclencheurs de la maladie. Leur altération pourrait entraîner une désorganisation de la structure folliculaire, une rupture de la barrière épithéliale et une inflammation cutanée localisée

Devenir

L'ensemble des animaux est mis à mort afin de déterminer l'évolution de la réponse immunitaire sur la totalité de la cinétique expérimentale.

Remplacement

Plusieurs modèles in vitro ont été évalués, comme les cultures cellulaires ou les systèmes de type organoïdes. Toutefois, l’hidradénite suppurée est une maladie inflammatoire complexe, impliquant des interactions entre les cellules de la peau, le microbiote cutané et le système immunitaire. À ce jour, aucun modèle in vitro ne permet de reproduire fidèlement cette complexité. Les systèmes actuels permettent d'étudier certains mécanismes isolés, mais ils ne permettent ni d’observer l’infiltration de cellules immunitaires, ni de modéliser les interactions dynamiques entre les différents compartiments cellulaires de la peau. C’est pourquoi nous avons recours à un modèle animal spécifique, permettant de mieux comprendre les premières étapes de la maladie. Ce modèle permettra également de tester des stratégies thérapeutiques dans un environnement physiologique pertinent. En parallèle, nous poursuivons le développement de modèles alternatifs non animaux, dans l’objectif de réduire au maximum le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

Nous avons optimisé notre approche expérimentale afin de limiter autant que possible le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la fiabilité scientifique de nos résultats. Des calculs de puissance statistique ont été réalisés en amont afin de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats significatifs tout en évitant une surutilisation. Nous utilisons aussi des approches multimodales sur un même animal, ce qui permet d’exploiter pleinement chaque individu et d’éviter la nécessité de cohortes supplémentaires pour différentes analyses. Des modèles in vitro, en amont, nous permettent également d’affiner nos hypothèses expérimentales et d’orienter nos analyses in vivo, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis

Raffinement

Les animaux sont suivis quotidiennement par un personnel formé afin de détecter précocement tout signe de souffrance : lésions cutanées, altération du pelage, changements de comportement ou de posture, perte de poids, ou automutilation. Ils sont hébergés en cages collectives enrichies, avec litière douce, matériaux de nidification (neslets), abris (dômes ou tubes en carton) et accès à l’alimentation et à l’eau ad libitum. L’environnement est contrôlé (température, humidité, cycle lumière/obscurité) pour garantir des conditions de vie optimales tout au long de l’expérimentation. Nous collaborons avec les vétérinaires référents afin d'assurer un raffinement constant des procédures, notamment par l’adaptation des soins ou l’euthanasie anticipée dès l’apparition de signes cliniques dépassant les seuils définis.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle bien établi pour l’étude des maladies humaines. Ce modèle présente plusieurs avantages : 1. De nombreuses souches sont disponibles et bien caractérisées sur le plan génétique, ce qui permet de cibler précisément certaines populations cellulaires impliquées dans la maladie étudiée. 2. La petite taille de l’animal, sa facilité d’élevage, et la courte durée de sa gestation permettent de conduire des études dans des délais raisonnables. 3. Il existe aujourd’hui des outils permettant d’activer ou de désactiver certains gènes de façon localisée ou temporaire, ce qui est essentiel pour étudier les mécanismes biologiques complexes de la maladie.

1 543 souris génétiquement modifiées pour exprimer une protéine humaine vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à six injections hebdomadaires d'un candidat vaccin, des prises de sang hebdomadaires et, pour une partie, une greffe de cellules tumorales. Pour ces dernières, le porteur décrit une nécrose, une ulcération, des saignements de la tumeur, une difficulté à se déplacer et, en cas d'échappement métastatique, une cachexie et un isolement social. Il conclut que le modèle murin reste un "élément incontournable" du projet, seul à permettre d'étudier l'infiltration immunitaire dans les tumeurs.

Objectifs

Cette étude s’inscrit dans le cadre d’un projet de recherche fondamentale visant à développer et à mettre en place un protocole optimal de vaccination contre le cancer de la prostate. Le modèle murin de cancer permet de simuler le contexte de la réponse immunitaire, tout en offrant une certaine assurance que les effets observés pourraient, au moins partiellement, être transposables à l'humain. La stratégie vaccinale sera optimisée en explorant plusieurs aspects : 1) L’utilisation potentielle d’adjuvants pour renforcer la réponse immunitaire ; 2) La combinaison avec d’autres traitements immunothérapeutiques ; 3) L’optimisation de la fréquence et du calendrier des injections. Par ailleurs, l’efficacité de la vaccination sera évaluée dans deux contextes : a) Prophylactique : pour prévenir l’apparition du cancer ; b) Thérapeutique : pour traiter une maladie déjà installée.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche a pour objectif d’améliorer les stratégies thérapeutiques actuelles contre le cancer de la prostate. À l’aide d’un candidat vaccin, nous visons à induire une réponse immunitaire capable d’accroître l’infiltration des cellules effectrices dans les tumeurs, de surmonter les mécanismes de résistance aux immunothérapies actuelles et de transformer des tumeurs initialement réfractaires en tumeurs sensibles à ces traitements. Ce projet pourrait révolutionner les traitements des cancers solides en apportant de nouvelles perspectives pour dépasser les limitations des approches thérapeutiques actuelles, tout en ouvrant la voie à des traitements personnalisés plus efficaces.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux sous anesthésie consisteront en des injections hebdomadaires pendant une durée maximale de six semaines, ainsi qu’en des prélèvements sanguins périodiques (hebdomadaires entre la sixième et la huitième semaine) après la vaccination. Chaque intervention durera entre 1 et 2 minutes sur des animaux anesthésiés. Les animaux anesthésiés pourront également recevoir une injection unique de cellules tumorales pour la greffe. Par ailleurs, des injections de cellules immunitaires pourront également être réalisées sous anesthésie.

Impact sur les animaux

Les animaux recevront un maximum de six injections de vaccin, à un intervalle d'une semaine (provoquant une nuisance légère au moment de l'injection), ainsi que des prélèvements sanguins réguliers, également à un intervalle hebdomadaire (nuisance légère au moment du prélèvement). La réponse immunitaire générée est sans conséquence pour l’animal tout au long de la cinétique expérimentale. En revanche, pour les animaux impliqués dans la greffe tumorale, des nuisances et effets indésirables sont attendus, principalement liés à la croissance tumorale. Tous les traitements administrés aux animaux ont été publiés dans la littérature comme étant bien tolérés dans les lignées de souris utilisées. Ainsi, hormis quelques nuisances sporadiques parfois observées chez les animaux sains, l’apparition des effets indésirables possibles se produit dès le début des expériences et peut donc être surveillée rapidement. Le mal-être des animaux en cas d’échappement métastatique constitue le principal risque d’effets graves, avec la formation de métastases dans les organes internes, pouvant entraîner des altérations physiologiques telles que la perte d’appétit (sans autres signes cliniques évidents), la cachexie, ainsi que des modifications comportementales comme l’agressivité et l’isolement social. Les nuisances liées à la croissance tumorale comprennent : nécrose, ulcération, saignements tumoraux, difficulté à la locomotion, perte de tonicité générale aux stades avancés de la maladie, ainsi qu'une perte de poids.

Devenir

Tous les les animaux seront mis à mort en raison des nombreux prélèvements d’organes effectués pour déterminer la réponse immunitaire.

Remplacement

Dès qu’il est possible de remplacer un modèle murin par une approche in vitro, comme la culture cellulaire ou la création d'organoïdes en 3D, nous opterons pour cette solution, comme nous l'avons déjà fait par le passé. Les candidats à vaccin seront systématiquement soumises à une validation in vitro avant toute autre étape que permettre de cribler laquelle sera utiliser sur étape suivante. Cependant, il est important de noter que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent actuellement d'étudier de manière exhaustive l'infiltration des cellules immunitaires au sein des tumeurs ainsi que les réponses immunitaires anti- tumorales qu'elles déclenchent. Par conséquent, le modèle murin demeure un élément incontournable de ce projet, puisqu'il est le seul à permettre l'étude approfondie de l'infiltration immunitaire au sein des tumeurs et des réponses anti-tumorales qu'elle engendre. L'utilisation de souris s'avère essentielle pour tester de nouvelles thérapies anti- cancéreuses qui réactivent le système immunitaire, ouvrant ainsi la voie à des avancées significatives dans le domaine de la lutte contre le cancer.

Réduction

Nous avons développé des méthodes permettant l'analyse d'un nombre élevé de paramètres immunologiques dans différents organes. Ces protocoles permettent de réduire le nombre d’animaux impliqués dans les expériences en augmentant le nombre de données par animaux. Les expériences de croissance de tumeurs seront effectuées conformément aux calculs de puissances statistiques.

Raffinement

Les animaux sont élevés avec soin et respect, en présence d’éléments d’enrichissements (bandelette de coton, neslets, tubes de carton) afin de réduire au maximum la souffrance animale qu’elle soit physique ou psychique. De plus, pour éviter des lésions sur les tumeurs palpables, de la litière à base de cellulose sera utilisée dans les cages, dès que la taille ou l’aspect de la tumeur le nécessitera. Du Diet Gel et/ou des réhydratations en sous- cutanée seront donnés aux animaux ayant du mal à se nourrir, s’abreuver ou avec des poils hérissés (signe d’un défaut d’alimentation). Nous avons créé une grille regroupant les symptômes caractéristiques et spécifiques de ce modèle tumoral. Cette grille nous permet comprend l'évaluation de signes cliniques et prend en compte des points limites pour bien agir ou anticiper la souffrance. L’animal sera surveillé sur la base de cette grille à partir du septième jour (quand la tumeur sera mesurable) après la greffe tumorale sachant que les symptômes décrits dans la grille ne doivent pas apparaitre sur l’ensemble de la cinétique expérimentale. La surveillance se fera tous les 2-3 jours, jusqu’à la mise à mort.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris, car notre projet nécessite l’étude des réponses immunitaires chez des animaux génétiquement modifiés pour exprimer un gène humain dans un type cellulaire spécifique. En effet, certains de nos vaccins sont constitués d’anticorps associés à de petits fragments de protéines cibles. Ces anticorps reconnaissent des protéines humaines exprimées à la surface de cellules clés impliquées dans l’activation du système immunitaire. Pour tester ces vaccins, il est donc nécessaire d’utiliser des animaux génétiquement modifiés exprimant ces protéines humaines, ce qui est réalisable chez la souris. Par ailleurs, les modèles murins de vaccination ainsi que les modèles tumoraux murins sont déjà bien établis et largement décrits dans la littérature. Toutes les expériences sont faites sur des souris adultes de 7 à 15 semaines, afin de limiter la variabilité liée à l’âge qui nécessiterait d’utiliser plus d’animaux. Cet âge constitue un compromis adéquat entre une maturité suffisante du système immunitaire et une mise en expérimentation à partir de 7-8 semaines de vie.

Pour évaluer la digestibilité de nouvelles matières premières destinées à l'alimentation des volailles, 2 400 poulets de chair vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever le contenu de leur tube digestif. Chacun passe neuf jours seul en cage, de 17 à 25 jours d'âge, et subit deux jeûnes de dix-sept heures. L'enrichissement consommable est exclu pour ne pas biaiser la mesure, les cages recevant des chaînettes et des perchoirs. Douze animaux par régime suffisent selon le porteur, ce qui rapporte les 2 400 poulets annoncés à environ deux cents régimes testés sur la durée du projet.

Objectifs

La viande de volaille représente une source de protéine animale importante et est en augmentation dans l'alimentation humaine. La production française se fait avec du tourteau de soja importé (3,5 millions de tonnes, majoritairement OGM) et des céréales. L'alimentation animale représente trois quart du coût de production et doit faire face à des enjeux sociétaux majeurs : réduction des gaspillages, bien être animal, valorisation de nouvelles ressources, OGM, diminution de l'importation de certaines matières premières, sécurité du consommateur. Dans ce contexte, le projet vise à caractériser de nouvelles ressources alimentaires pour l'alimentation animale, en diversifiant les sources de matières premières tout en limitant la concurrence avec l'alimentation humaine et de développer de nouveaux programmes alimentaires dont l'objectif est d'optimiser l'efficience des rations en réduisant, à la source, les rejets d'azote en mettant l'accent sur les stratégies nutritionnelles. Pour cela, des "bilans digestif" seront réalisés, en mesurant de façon précise, les nutriments digérés par le poulet de chair et ceux rejetés dans les fientes. Un bilan permet donc de quantifier le pourcentage de chaque nutriment réellement disponible pour le maintien, la croissance ou la production de l’animal. Le bilan est réalisé selon une méthode de référence standardisée, afin de fournir à la filière des tables d'alimentation précises et complètes, sur la valeur nutritionnelle des matières premières.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet concernent : 1) Les éleveurs et fabricants d’aliments : le projet permettra de leur fournir des données sur de nouvelles matières premières ou des matières premières issus de nouveaux process afin de limiter le gaspillage et les rejets, de choisir des matières premières non importées ou non utilisables directement par l’homme, l’ensemble contribuant à préserver l’environnement. 2 ) L'alimentation de l'homme : trouver des alternatives aux solvants issus du pétrole (hexane par exemple) utilisés dans la fabrication d’aliments pour volailles (tourteaux par exemple), améliorer la qualité des produits animaux. 3) L'alimentation des animaux : utiliser des aliments mieux digérés par les animaux, accompagner l'élevage vers l'alimentation de précision.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à une procédure de bilan digestif en cage individuelle d'une durée de 9 jours, de 17 à 25 jours d’âge et avec perception visuelle, auditive et olfactive entre congénères. Ils sont également soumis à deux mises à jeun (sans restriction hydrique) de 17h chacune, la nuit, afin de vider le tube digestif.

Impact sur les animaux

Les effets négatifs sur les animaux sont liés, d'une part au stress léger lié à l'isolement en cage individuelle de 9 jours (sans isolement visuel et olfactif) et d'autre part liés à la légère sensation de faim que pourraient avoir les animaux lors de la mise à jeun réalisée pendant 17h, sur la période de nuit principalement (sans restriction hydrique).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation à des fins de prélèvements des contenus digestifs dans le but d'analyses chimiques pour les mesures de digestibilité.

Remplacement

Il n'existe, actuellement, aucune méthode pour reproduire in silico, le tube digestif d'une volaille. Quant aux méthodes in vitro, elles sont en développement mais ne sont actuellement pas encore opérationnelles pour permettre ces études de digestion. L'étude du microbiote et des processus de digestion nécessitent donc le recours à des animaux.

Réduction

La réduction du nombre d'animaux est basée sur deux principes : 1) Grouper au maximum les régimes à tester pour n'avoir qu'un seul régime témoin (régime standard). 2) Disposer de 12 animaux par régime est nécessaire et suffisant pour avoir des résultats robustes malgré la variabilité individuelle importante.

Raffinement

Avant leur mise en cage à 17 jours, les animaux sont hébergés tous ensemble, en groupe, au sol et sur copeaux. Les animaux sont mis en cage à 17 jours d'âge, ce qui correspond à l'âge à partir duquel le tube digestif et leur microbiote sont pleinement fonctionnels. La durée du séjour en cage individuelle est réduite au maximum. Les cages sont disposées de manière à procurer aux poulets une perception visuelle, auditive et olfactive entre congénères. La période de mise à jeun de 17h a été définie la nuit, moment où les animaux ne consomment, naturellement, pas d'aliment. Afin d’éviter d’induire un biais expérimental, il n'est pas possible d'enrichir le milieu avec des matériaux consommables ; les cages seront néanmoins enrichies de chaînettes et de perchoirs. Les aliments distribués aux animaux permettent de couvrir les besoins physiologiques sans carence ou excès. L'eau est maintenue à volonté. La température de la salle est augmentée de 2 degrés par rapport à un programme classique d'élevage pour améliorer le confort thermique des animaux. Une grille d’évaluation du bien-être des animaux, basée sur leur comportement et leur état de santé, est complétée quotidiennement par le personnel animalier afin de détecter toute altération de leur état de bien-être. Pour chaque paramètre d’atteinte au bien-être, nous avons défini plusieurs niveaux d’action.

Choix des espèces

Les objectifs du projet portent sur la nutrition des volailles, avec un objectif de valorisation par les filières avicoles. Le poulet de chair représente l'espèce majeure concernant la production de viande de volailles. Les bilans digestifs sont réalisés entre 17 et 25 jours d'âge, ce quicorrespond à l'âge à partir duquel le tube digestif et son microbiote sont pleinement fonctionnels. Aussi, à ce stade, les animaux sont suffisamment développés pour s'adapter à une période de 9 jours en cage et sont en pleine croissance, ce qui permet une réponse physiologique maximale.

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre injections espacées de deux semaines et subissent trois prises de sang, avec un risque d'accumulation de liquide dans l'abdomen qui peut gêner l'alimentation et les déplacements. Leur rate est prélevée après la mise à mort pour fabriquer des anticorps monoclonaux. Ces anticorps alimentent des kits de détection des maladies des plantes destinés aux agriculteurs et aux viticulteurs.

Objectifs

Nous avons recours à l’immunisation de souris pour fabriquer des anticorps spécifiques monoclonaux capables de reconnaitre des pathogènes végétaux afin d’établir de nouveaux outils de phytodiagnostic pour détecter rapidement et efficacement les maladies des plantes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à développer des kits de phytodiagnostic permettant de détecter de manière rapide et précoce les maladies des plantes, qui peuvent entraîner des retards de croissance, des pertes de récoltes significatives et des conséquences économiques importantes pour les agriculteurs, viticulteurs, etc. Les kits de phytodiagnostics permettent de réduire la propagation des maladies grâce à une détection rapide avant que la maladie ne se propage et évitent donc la perte de grandes superficies de culture. Ils permettent également de cibler les traitements grâce à un diagnostic précis, à l’aide des anticorps monoclonaux, et de réduire l’usage inutile de produits phytosanitaires. Les bénéfices de ce projet sont donc d’ordres environnemental et économique (moins de pertes de récoltes et de traitements non appropriés). Du coté scientifique, ce projet permet d’obtenir des anticorps monoclonaux qui pourront être par la suite produit in vitro grâce à l’obtention d’hybridomes, ce qui permet de limiter l’utilisation des animaux à des fins scientifiques.

Procédures

4 injections espacées de 2 semaines. 3 prélèvements sanguins espacés de 3 à 4 semaines.

Impact sur les animaux

Il existe un risque de production d’ascite (accumulation anormale de liquide dans l’abdomen) suite aux injections pouvant entrainer des difficultés pour l’animal à se nourrir ainsi qu’une gêne pour se déplacer. Les animaux peuvent ressentir du stress lors des manipulations et une douleur modérée suite aux injections tel que des rougeurs au point d’injection et des courbatures.

Devenir

A l’issue de chaque programme les animaux serons mis à mort afin de récupérer la rate pour réaliser la production d’anticorps monoclonaux.

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune méthode ou technique in vitro permettant de produire de nouveaux anticorps monoclonaux murins. L’induction d’une réponse immunitaire chez l’animal est nécessaire afin de pouvoir fusionner la rate contenant les cellules productrices d’anticorps avec des cellules cancéreuses pour obtenir des hybridomes permettant par la suite, la production d’anticorps monoclonaux in vitro. Une fois la production réalisée, il ne sera donc plus nécessaire de renouveler le protocole d’immunisation et donc d’utiliser les animaux à des fins scientifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum afin d’obtenir dès le 1er projet une quantité suffisante d’anticorps monoclonaux pour ne pas avoir besoin de réitérer les productions.

Raffinement

Pour réduire au maximum les sources de souffrance, les animaux seront anesthésiés avant les prélèvements. Les souris seront hébergées en communauté, avec enrichissement du milieu, et dans des conditions appropriées afin de préserver leur bonne santé et leur bien-être. Les aiguilles utilisées pour les immunisations seront adaptées au point d’injection et les plus fines possibles afin de limiter la douleur. Une période d’acclamation de 7 jours sera respectée avant les manipulations. Les souris seront manipulées précautionneusement et déplacée à l’aide des enrichissements et dans la paume de la main autant que possible afin de s’habituer au manipulateur. Les gestes techniques seront réalisés par du personnel formé. Les souris seront surveillées quotidiennement après les injections afin de réagir rapidement en cas de production d’ascite. Si une gêne dans la mobilité est détectée, l’accès à la nourriture et à la boisson seront facilités.

Choix des espèces

L’utilisation de souris permet d’obtenir à la fois des cellules qui fabriquent des anticorps et des cellules qui peuvent se multiplier facilement, compatibles entre elles pour l’étape suivante, la fusion. Les souris utilisées ont un organisme qui contient peu d’anticorps naturels, elles permettent ainsi une bonne réponse de leurs système immunitaire donc une production d’anticorps hautement spécifique à l’antigène. Les souris seront âgées de minimum 6 semaines car c’est à ce stade qu’elles permettent une bonne réponse immunitaire à une stimulation antigénique.

Les rats utilisés portent une mutation qui affaiblit leur système immunitaire pour éviter le rejet du greffon, ce qui leur vaut une perte de poils, des poils qui s'accumulent sous les paupières et une sensibilité accrue aux infections. 180 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur rétine est lésée au laser ou par injection d'un composé chimique, puis un fragment de rétine cultivé à partir de cellules souches humaines est greffé sous la rétine au cours d'une opération de quinze à vingt minutes, suivie d'imageries hebdomadaires et d'électrorétinogrammes sous anesthésie générale. Tous sont tués à la fin pour analyser la rétine et le devenir des cellules greffées, et tout signe d'infection de l'œil entraîne une mise à mort anticipée.

Objectifs

Les maladies choroïdiennes héréditaires et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), sont des pathologies qui entraînent une perte de la vision pouvant conduire jusqu’à la cécité. Elles affectent des millions de personnes dans le monde, et dans la plupart des cas aucun traitement disponible. Ce projet a pour objectif de démontrer que l'on peut rétablir la vue avec la transplantation d’un morceau de rétine fabriqué en laboratoire à partir de cellules souches humaines. Les transplantations seront réalisées dans un modèle de rats porteur d'une mutation qui altère le système immunitaire (pour éviter les mécanismes de rejet du greffon). Afin de mimer les pathologies humaines, la rétine des animaux sera lésée avec le laser ou avec l’injection d’un composé chimique. Le potentiel thérapeutique des greffons sera évalué par des approches comportementales et électrophysiologiques (sensibilité de la rétine à la lumière).

Bénéfices attendus

Il n'existe peu ou pas de traitement pour soigner les dystrophies rétiniennes (prévalence de 1 sur 3000) et la dégénérescence maculaire liée à l'âge (8 pourcent de la population française) ou pour restaurer la vision quand celle-ci est perdue. L 'objectif est de développer des approches de thérapie cellulaire à base de morceaux de rétine obtenus à partir de cellules souches humaines. Cette thérapie aura pour objectif de restaurer la vision dans ces maladies.

Procédures

Pour cette étude une lignée de rats immunodéprimés sera transplantée avec des cellules humaines. Afin de mimer la pathologie humaine, deux techniques seront testées : lésion de la rétine avec le laser (moins d'une minute) ou injections d’un composé chimique (injections d’une durée de quelques secondes) : 1 injection pour les animaux concernés. Chirurgie: Une procédure chirurgicale sous anesthésie générale sera réalisée chez les rats. De plus, la chirurgie sera réalisée sous analgésie en complément de l’anesthésie. La procédure chirurgicale consiste en une transplantation intraoculaire (sous la rétine) d’un tissus rétinien fabriqué en laboratoire. Cette opération dure 15 à 20 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. Tous les animaux feront l’objet de 3 types d’examen : 1/Un examen par imagerie permettant l’observation de l’anatomie et la structure de la rétine (tomographie par cohérence optique); cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale ; Les examens d’imagerie ont une durée de 10 à 15 minutes. Cet examen sera réalisé une fois par semaine pendant 2 mois pour mettre en place le modèle par injection de composé chimique (maximum 8 fois) ou 1 fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux greffés et gardés le plus longtemps). 2/ Un examen électrophysiologique (Electrorétinogramme) qui permettent l’étude de la fonction de ce tissu. Cet examen qui nécessite l’immobilité de l’animal se fera sous anesthésie générale. L’électrorétinogramme a une durée de 30 minutes environ. Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). 3/ Un test comportemental à l’état vigil sans contrainte particulière (maximum de 3 fois pour les animaux gardés le plus longtemps). Ces tests de la fonction visuelle sont rapides (5 à 10 minutes environ). Cet examen sera réalisé une fois par mois (maximum de 3 fois). Analgésies et antidote anesthésie (injections d’une durée de quelques secondes): maximum 11 fois par animal au cours de l’étude qui dure jusqu'à 3 mois. Les rats seront euthanasiés à la fin de l'étude par une méthode réglementaire en vue d'une analyse histologique de l'œil.

Impact sur les animaux

Le phénotype immunodéprimé entraine une perte de poils à 3 ou 4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s’accumuler dans l’œil sous les paupières et cela nécessite donc un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Les animaux sont plus susceptibles de développer des infections opportunistes du fait de leur statuts immunodéficient. Un léger stress et une brève douleur localisée au moment de l’introduction de l’aiguille peuvent être induits par les injections des différents médicaments en intrapéritonéale ou sous cutané. L’anesthésie peut entrainer un risque cardio-respiratoire et d’hypothermie. La photocoagulation au laser et les greffes sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Une douleur et/ou un risque infectieux peuvent survenir pendant ou après les greffes. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme).

Devenir

A la fin de chacune des procédures, les animaux sont euthanasiés par une méthode réglementaire pour permettre des analyses histologiques ou fonctionnelles (électrophysiologies) des tissus (rétine). Ces explorations sont nécessaires pour évaluer le bénéfice de la transplantation au cœur du projet et le devenir des cellules transplantées (intégration aux tissus de l’hôte, etc…).

Remplacement

Le projet consiste à évaluer la capacité d’une greffe de cellules à permettre une préservation de la fonction visuelle. Cette évaluation ne peut donc pas être faite par des approches in vitro. Les approches in vitro ne permettent d’évaluer que des paramètres isolés de culture et non pas des interactions avec une rétine. Il n’est ainsi pas possible de démontrer la fonctionnalité d’un produit de thérapie cellulaire de la rétine autrement que in vivo. Ce projet ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, les transplantations seront réalisées dans un seul œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle évitant d’utiliser d’autres animaux dans ce but. Par ailleurs, la majorité des actes peuvent être réalisés sur les mêmes animaux permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Nous avons réduit le nombre d’animaux par groupe au minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables en tenant compte de la variabilité plus importantes des mesures effectuées (en raison d’un taux d’échec évalué à 20-30 pour cent (chirurgie, rejet de greffe, opacification du cristallin, etc..). Le nombre a été calculé sur la base des données de la littérature pour des approches similaires et en fonction du devenir post-mortem des animaux. Pour limiter le nombre d’animaux, les résultats seront analysés à l’aide de tests statistiques non-paramétriques adaptes aux petits effectifs. Au final, 180 animaux seront utilisés dans le projet.

Raffinement

Les animaux seront examinés quotidiennement par les expérimentateurs et/ou le personnel qualifié de l’animalerie et seront hébergés avec enrichissement de nourriture et boisson à volonté. Les animaux utilisés dans ce projet ont une perte de poils dans la 3-4 semaines avec une réapparition par touffes au cours de la vie du rongeur. Ces poils peuvent s'accumuler dans l'œil sous les paupières nécessiter un soin particulier pour éliminer cette accumulation. Pour les expérimentations qui le nécessitent, les rats bénéficieront d’une anesthésie générale. Le risque de douleur généré par la transplantation de tissus est géré en pré-opératoire et post-opératoire par l’injection d’analgésiques. Les animaux feront l’objet d’une surveillance plus accrue pendant les 24h suivant les différents actes (réveil post-anesthésie, état de la surface oculaire après les électrorétinogrammes, signe d’inflammation, etc…). Tout signe d’inflammation ou d’infection de l’œil entrainera l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

Les rats sont couramment utilisés dans les études précliniques. La taille de l’animal rend le geste technique (transplantation sous-rétinienne) moins difficile que chez la souris par exemple, ce qui réduira significativement le risque d’échec de la procédure et donc le nombre d’animaux nécessaire à l’étude. Rats immunodéficients : Ces rats possèdent une modification génétique qui affaibli le système immunitaire (pour prévenir le rejet de greffe). Les différentes analyses seront réalisées chez le rat adulte sur une durée maximum de 3 mois après greffe, le stade le plus tardif prévu per l’étude. Le choix de l'âge adulte est lié au fait que les greffes sont plus aisées à réaliser dans l'oeil adulte (plus grand) de même que les traitements lasers. De plus , la DMLA est une maladie qui touche les adultes.

3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à différents points de la cinétique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection par jour pendant cinq jours pour inactiver un gène, puis jusqu'à trois prises de sang au cours de leur vie, et développent des lésions précancéreuses de la prostate qui peuvent évoluer vers des tumeurs de taille importante. Le projet vise à cartographier cette progression et à repérer des biomarqueurs sanguins et urinaires d'un diagnostic précoce du cancer de la prostate. Deux seuils déclenchent la mise à mort avant terme, une perte de poids supérieure à 20 % et un volume de prostate qui gêne la miction.

Objectifs

Le cancer de la prostate (CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'Homme. L'objectif de ce protocole, qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, est le suivi et la caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera surveillée pendant une période suffisante afin de détecter l'apparition de formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 1 injection quotidienne réalisés pendant 5 jours successifs, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ces injections seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après inactivation du gène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris.

Impact sur les animaux

Suite à l'injection, une infection peut se développer dans les journées qui suivent. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur, vérifiée par palpation abdominale, sera donc un point limite clé. Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement. les injections et les prélèvements de sang entrainent une légère douleur de courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate gêne une miction naturelle, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes les plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

Une grille de cotation de la douleur fixe le seuil au-delà duquel un rat sera mis à mort avant terme. 80 rats porteurs d'une mutation analogue à celle de la maladie de Huntington vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit une neurochirurgie d'environ une heure pour implanter des électrodes non amovibles, puis des enregistrements de douze à quarante-huit heures deux fois par mois pendant dix mois, des stimulations sonores mensuelles, et vit seul en cage pendant neuf mois avec un accès à la nourriture contrôlé. L'objet déclaré est de trouver des marqueurs électriques cérébraux transposables entre le rat et le patient, pour servir de test dans la mise au point de médicaments.

Objectifs

Les patients atteints de la maladie de Huntington, souffrent, en plus des symptômes moteurs et d'une altération de certaines capacités intellectuelles, de troubles du cycle veille-sommeil, ces perturbations du sommeil pouvant déjà être présentes au stade précoce (présence de symptômes avant-coureurs) de la pathologie. L'électroencéphalographie (EE) représente un outil de choix lors des tests précliniques en raison de son caractère transposable entre le rat et l’Homme car les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères ce qui permet donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Un modèle de rat porteur d’une mutation analogue à celle identifiée chez les patients atteints de la pathologie est disponible et a été caractérisé d’un point de vue comportemental. Il présente des troubles moteurs proches de ceux décrits chez l’Homme. Il est donc pertinent d’explorer les autres caractéristiques de la maladie décrites chez le patient afin de confirmer la pertinence de ce modèle dans l’étude de la maladie et la recherche de nouvelles solutions thérapeutiques. Dans ce projet, nous étudierons donc les phases de veille-sommeil et les oscillations cérébrales spontanées et évoquées dans un modèle de la maladie de Huntington.

Bénéfices attendus

La découverte et l’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d’identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des rats modélisant la maladie de Huntington et chercherons à mettre en évidence des marqueurs de la maladie qui pourront par la suite être applicables à l’Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront tous soumis à des enregistrements longs (12 à 48 heures) qui seront réalisés sur l’animal éveillé de façon bimensuelle avec un intervalle minimum d’une semaine, sur une durée de 10 mois maximum. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal éveillé une fois par mois (durée de quelques heures) sur une durée de 10 mois maximum (entre l’âge de 6 mois et de 15mois). Les stimulations sonores intermittentes dureront au maximum 2h. Les animaux sont hébergés de façon individuelle sur la totalité du projet à partir de la chirurgie (9 mois maximum). L’accès à la nourriture est contrôlé pendant la totalité du projet à l’exception des 2 semaines suivant la chirurgie.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux. Après implantation des électrodes, les animaux seront hébergés en cages individuelles, avec un contact social réduit (plusieurs semaines) ce qui peut engendrer du stress. Des troubles de la démarche et de la coordination sont décrits dans la littérature sur cette lignée.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles. De plus, des analyses des tissus cérébraux sont nécessaires pour compléter la caractérisation du modèle et vérifier le positionnement des électrodes les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle étudie des mécanismes physiopathologiques complexes, comme le sommeil, qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Les études sur le long terme présentent un avantage significatif en permettant à chaque animal de servir de contrôle pour lui-même, réduisant considérablement le nombre d'animaux nécessaires par groupe. Cette approche méthodologique nous a permis de déterminer le nombre d'animaux de manière à minimiser celui-ci, tout en veillant à préserver la validité scientifique et la fiabilité des résultats des expériences menées. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à nos études, les protocoles combineront un ensemble de recueil de mesures permettant de faire un suivi et d’obtenir plusieurs informations chez le même rat.

Raffinement

Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Les rats qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Les animaux seront regroupés dans une grande enceinte lors d’une session hebdomadaire afin de favoriser les contacts. Le projet prévoit des recueils des mesures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins post-opératoires comprenant une évaluation clinique quotidienne, des antidouleurs et des anti-inflammatoires. Une échelle de cotation de douleur basée sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. De plus, nous appliquerons des actes expérimentaux les moins invasifs possibles aux rats testés comme le choix d’une anesthésie gazeuse (par rapport à une injection). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La prise en compte de ces points permettra de juger du bien-être et d'éviter l'inconfort des animaux au cours de l'expérimentation de manière à garantir la qualité des résultats. Les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable.

Choix des espèces

Nous utiliserons une lignée de rats dont la mutation est similaire à celle présente chez les patients de la maladie de Huntington. Le choix de l’espèce est donc directement lié à cette similarité : la mutation de ce même gène chez l’homme et le rat induit en effet des troubles similaires dans les deux espèces. Les animaux sont manipulés au minimum à l’âge de 6 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 15 mois maximum. A ce stade, le cerveau est mature et présente des caractéristiques intéressantes pour reproduire les troubles observés chez le patient humain.

Derrière l'étude d'une mycotoxine des céréales, l'enjeu affiché est économique, la contamination dégradant les performances de reproduction des truies et coûtant à la filière porcine. 48 jeunes femelles porcines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis abattues en abattoir commercial pour prélèvement d'organes. Elles sont exposées deux mois à des doses inférieures aux limites réglementaires européennes, logées seules pendant cette période, et subissent cinq à sept séries de prises de sang, d'urine, de fèces et de salive, plus des échographies. Le porteur reconnaît que le logement individuel stresse cette espèce sociable et que la contention au lasso provoque douleur et stress, et annonce des essais de prélèvement sans contention avec du jus de pommes.

Objectifs

La mycotoxine étudiée est un contaminant important des céréales, avec un impact économique non négligeable pour la filière porcine, avec à la fois une dégradation des performances de reproduction conduisant à une réduction du nombre de porcs produits par truie et un investissement important dans des produits capables de capter ces mycotoxines dans l'aliment lorsque celui-ci est reconnu comme contaminé. Les effets sur la reproduction affectent les animaux de tous âges, et plus particulièrement les futures reproductrices. L’objectif est de vérifier si une exposition in vivo pendant deux mois à des niveaux de cette mycotoxine inférieurs aux valeurs réglementaires peut impacter la reproduction des jeunes femelles encore impubères. On évaluera l’apparition de la puberté pendant l’exposition, les conséquences sur les cycles ultérieurs, la fertilité, le démarrage de la gestation et les anomalies de reproduction éventuelles. Les perturbations de la reproduction liées à cette mycotoxine dépendent en effet des doses, stades physiologiques et durées d’exposition. Dans cette étude, des femelles péri pubères seront exposées de manière chronique à des concentrations en mycotoxine inférieures aux limites maximales recommandées par l'UE.

Bénéfices attendus

La mycotoxine étudiée est l'une des mycotoxines produites par les champignons du genre Fusarium, qui contaminent les aliments à base de céréales ainsi que les aliments destinés aux animaux. Nos résultats devraient fournir des données clés pour évaluer l’impact de la perturbation de la reproduction induite par cette mycotoxine sur la santé et les performances des porcs. De plus, les analyses issues des prélèvements permettront d’identifier des biomarqueurs utiles pour bien diagnostiquer l'exposition à cette mycotoxine en élevage porcin et envisager des solutions. Enfin, la réalisation de prélèvements alternatifs aux prélèvements de sang devrait permettre, à terme, de pouvoir s'affranchir des tests sanguins.

Procédures

Les animaux seront soumis à 5 prélèvements de sang, d'urine, de fécès et de salive pour toutes les femelles et 7 prélèvements pour celles qui ne seraient pas venues en chaleurs après la synchronisation. Une échographie sera effectuée aux mêmes moments, ainsi que vers 4 semaine de gestation. Au total, il y aura entre 6 et 8 interventions. Les prélèvements d'urine ne nécessitent pas de contact avec les animaux. Les prélèvements de fécès durent moins de 30 secondes. La durée de mastication de la salivette par l'animal pour le recueil de la salive varie de 30 secondes à 1 minute. La durée des prises de sang est limitée à 30 secondes. L'échographie dure moins de 1 minute. Les animaux sont logés individuellement pendant 2 mois pour contrôler l'ingestion d'aliment. Les cloisons ajourées permettent aux animaux de se voir, de se sentir, de s'entendre, et aux porcs de deux cases voisines de se toucher. Ils sont ensuite logés en groupes.

Impact sur les animaux

L'élevage individuel pendant les 2 mois d'exposition à la mycotoxine peut constituer un stress pour cette espèce sociable qu'est le porc. Pour en réduire les effets, des cloisons ajourées permettent aux animaux de se voir, de se sentir, de s'entendre, et aux porcs de deux cases voisines de se toucher. Les prélèvements sanguins constituent également une source de stress et de douleur du fait de la contention. Pour cela, des essais de prélèvement sans contention seront tentés, en habituant les animaux à l'intervention et au contact des aiguilles avec une distribution concommintente de jus de pommes. Une attention sera portée à la durée des prises de sang et aux conditions de prélèvement. Le prélèvement de fèces peut entrainer un léger inconfort qui est limité par l’utilisation de paraffine. Une attention particulière sera portée à la relation humain-animal afin de faciliter les approches et les interactions avec les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront abattus en abattoir commercial en fin de procédure. Plusieurs organes seront prélevés afin d'évaluer l'impact de l'exposition chronique à de faibles de doses de mycotoxine sur le développement de la puberté, la mise en place de la reproduction et le métabolisme des femelles incluses dans l'étude.

Remplacement

Le porc est l'espèce cible de ce projet qui vise à mieux comprendre les effets de la mycotoxine étudiée sur la mise en place des cycles, leurs caractéristiques, la fertilité et les anomalies de reproduction. L'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour rendre compte de processus biologiques dynamiques et sujets à une large variabilité entre individus. Le remplacement n'est pas possible car l'utilisation d'animaux est inhérente à ce type d'étude.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum en tenant compte des mesures effectuées. Le nombre total de 48 femelles (24 par traitement) a été déterminé par une approche statistique pour bien tester l’effet sur la principale variable d’intérêt, la puberté.

Raffinement

L'élevage individuel pendant les 2 mois d'exposition à la mycotoxine peut constituer un stress pour cette espèce sociable qu'est le porc. La salle est organisée en deux rangées de 12 cases de 2,9 m², séparées par des cloisons ajourées qui permettent aux animaux de se voir, de se sentir, de s'entendre, et aux porcs de deux cases voisines de se toucher pour maintenir une variété d'interactions sociales. Les prélèvements sanguins constituent également une source de stress et de douleur par la contention au lasso et la manipulation. Pour cela, des essais de prélèvement sans contention seront tentés, avec proposition de jus de pommes avec une seringue sans aiguille aidant à l'immobilité des animaux le temps du prélèvement. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera contrôlée, et les animaux suivis dans les minutes ou heures qui suivent. En cas de souci de santé, le vétérinaire en charge du suivi de l’élevage expérimental sera consulté et les animaux traités en conséquence.

Choix des espèces

Le porc ne peut pas être remplacé par une espèce modèle compte tenu de la spécificité de ses réponses physiologiques à l'exposition à la mycotoxine étudiée. Nous avons choisi de travailler sur la femelle péri pubère car c'est à ce stade de développement que nous souhaitons évaluer les effets de cette mycotoxine sur la mise en place des cycles, leurs caractéristiques, la fertilité et les anomalies de reproduction.

En élevage, le rationnement sévère des truies gestantes peut provoquer des comportements stéréotypés, et ce projet évalue une ration plus fibreuse, où de l'ensilage de maïs remplace une partie des céréales, avec ou sans enzyme. 6 porcs, des truies reproductrices non gestantes, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyés dans le troupeau de truies expérimentales. À chaque période de 30 jours, les truies passent 11 jours dans une case individuelle de 80 sur 200 cm, "ce qui leur permet de ne pas se retourner", écrit le porteur, avec une sonde urinaire posée pendant toute la collecte. Leur cycle ovarien est bloqué par trois injections d'Improvac. Le porteur affirme que le porc "ne peut pas être remplacé par une espèce modèle", et présente l'essai comme une étape vers une étude plus large sur les "performances de la truie et ses porcelets".

Objectifs

L'un des objectifs majeurs de la conduite alimentaire en gestation est d'adapter les apports alimentaires en fonction de l'état de la truie souhaité en maternité. Le défi consiste à obtenir, en fin de gestation, un niveau de réserves corporelles suffisant tout en évitant une prise de poids trop importante, ce qui peut entraîner des problèmes de locomotion ainsi que des syndromes de dysgalacties post-partum, des répercussions négatives sur le taux de survie des porcelets et la longévité du troupeau. La maîtrise de l’état corporel de la truie passe par un rationnement alimentaire sévère qui peut se traduire par l’apparition de comportements stéréotypés. En favorisant le rassasiement des truies, les rations riches en matières premières fibreuses permettent de réduire l’apparition de ces problèmes comportementaux. L'utilisation d'enzymes externes dans l'alimentation des monogastriques est une pratique courante pour améliorer l'efficacité digestive et optimiser la valeur nutritionnelle des aliments. Cette pratique permet d’utiliser des ingrédients alternatifs ou des coproduits de manière plus efficace, qui, sans enzymes, seraient peu digestibles pour l’animal. Parmi ces enzymes, les xylanases sont des enzymes dégradant les polymères de xylose, qui sont des composants importants des fibres des plantes. L’action des xylanases sur l’amélioration de la digestibilité des nutriments est liée à une réduction de la viscosité des digesta, avec des effets positifs sur le transit, mais également à une modulation du microbiote intestinal, une augmentation de la production d’acides gras à chaîne courte, le tout conduisant à des effets positifs sur la santé du tube digestif. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’intérêt nutritionnel du remplacement d’une partie des céréales (blé, orge, maïs) par de l’ensilage de maïs, combiné avec l’utilisation d’une xylanase. Cette évaluation sera réalisée sur la base d’une mesure de la digestibilité fécale des aliments. Cette étude est une première étape pour valider une ration qui sera utilisée dans une étude de plus grande ampleur pour évaluer les effets à long terme sur les performances de la truie et ses porcelets

Bénéfices attendus

L'évaluation de la valeur nutritionnelle de régime intégrant de l'ensilage de maïs et supllémenté ou pas avec de la xylanase est un prérequit pour mettre au point des stratégies nutritionnelles pour réduire le mal être des truies tout en assurant une bonne valarisation de l'aliment.

Procédures

Les collectes de fèces et d'urines sont obtenues par défécation et miction naturelles ; aucun autre prélèvement n'est prévu. Les animaux seront équipés d'une sonde urinaire pour faciliter la collecte des urines et éviter la contamination des fèces par de l'urine. Pour chaque période de 30 jours, la sonde urinaire sera maintenue pendant 11 jours lors de la période de collecte. La mesure de la digestibilité est très sensible à toute variation de la prise alimentaire. Pour éviter les effets d'une chute de l'appétit sur la qualité de la collecte, le cycle ovarien de la truie sera bloqué immunologiquement pendant la durée de l'essai.

Impact sur les animaux

Conditions de logement : Dans le cadre de la mesure de la digestibilité, les truies doivent être logées dans des cases individuelles de dimensions 80x200 cm, ce qui leur permet de ne pas se retourner et de dissocier correctement les fèces et les urines. Toutefois, la réduction de la possibilité de mouvement peut entraîner des risques pour leur bien-être. Collecte des urines : Les particularités anatomiques des femelles rendent difficile la collecte séparée des urines et des fèces. Pour contourner ce problème, les truies seront équipées de sondes urinaires de la veille du début de la période de collecte à la fin de cette période (soit une durée de 11 jours). Bien que la sonde soit posée et entretenue dans des conditions d'hygiène rigoureuses, en respectant les protocoles de soins vétérinaires, on ne peut pas totalement exclure un risque d'infections urinaires. Blocage du cycle ovarien de la truie : Les fluctuations hormonales liées au cycle reproductif peuvent influencer les mesures de digestibilité, notamment en agissant sur l'appétit des truies. Pendant la durée de l’essai, la fonction ovarienne sera temporairement bloquée par l’injection d’un analogue synthétique du GnRF (Improvac). Ce traitement constitue une alternative à l’ovariectomie chirurgicale. Les injections (3 fois 2 mL; une deux semaines avant le début de l'essai et deux autres espacées de 9 semaines) peuvent entraîner possiblement des gonflements ou inflammations au point d'injection.

Devenir

L'ensemble des animaux réintègre le troupeau de truies expérimentales à la fin de la procédure

Remplacement

Le porc est l'espèce cible de ce projet. Compte tenu des spécificités inhérentes au stade physiologique (truie reproductrice), à sa conduite alimentaire et aux conséquences sur l'utilisation digestive des aliments, il n'est pas possible de travailler sur des animaux d'un autre stade physiologique. L'utilisation d'animaux vivants est nécessaire pour rendre compte de processus digestifs extrêmement complexes et soumis à une large variabilité entre individus. Le remplacement n'est, pour l'instant, pas possible, car l'utilisation d'animaux est inhérente au type d'étude.

Réduction

L'utilisation d'un plan expérimental en carré latin 4*4 complet permet de contrôler notre principale source de variation (effet animal), tout en testant plusieurs traitements alimentaires. Chaque traitement est testé exactement une fois par ligne et par colonne, ce qui signifie que chaque animal et chaque période reçoivent une seule fois chaque traitement. Cela permet de : 1/ maximiser la précision des résultats en neutralisant les effets liés à l'animal ; 2/ réduire le nombre d’animaux nécessaires, car chaque animal sert de contrôle pour lui-même à travers plusieurs périodes ; et 3/ limiter la variabilité interindividuelle, ce qui est crucial dans ce type d'essai pour la mesure de la digestibilité

Raffinement

Conditions de logement : Pour limiter les risques sur le bien-être des truies, la durée de mise en case individuelle est strictement limitée à 11 jours pour chaque période expérimentale, incluant 1 jour d'adaptation et 10 jours de collecte. Les cages sont équipées de barreaux et placées dans la même pièce, par groupe de 4, afin de permettre aux animaux de maintenir un contact visuel, tactile, olfactif et auditif. Le reste du temps, les truies sont placées en case collective (16 m²), avec des systèmes permettant une distribution individuelle de la ration et un enrichissement adapté (jouets et toile de jute). Pose de sonde urinaire et risque de cystites : Pendant la période de collecte, la présence éventuelle d’infection urinaire sera contrôlée au moment de la miction à l'aide de bandelettes urinaires. En cas d'infection avérée, l'animal sera soigné avec un traitement adapté. Risques d'infection localisée au site d'injection d'un analogue de synthèse du GnRF : Bien que les réactions soient généralement temporaires, des gonflements ou inflammations au point d'injection peuvent survenir. Le cas échéant, l’animal sera traité avec le traitement préconisé par le vétérinaire en charge du suivi des animaux..

Choix des espèces

- Le porc (truie) ne peut pas être remplacé par une espèce modèle compte tenu de la spécificité anatomique de son tube digestif et de sa conduite alimentaire Nous avons choisi de travailler sur la truie reproductrice non-gravide car ce stade est spécifiquement visé par la stratégie alimentaire que nous voulons tester. Nous travaillerons sur des truies en 3ème ou 4ème portées ce qui correspond à la parité moyenne des truies en élevage commercial.

Jusqu'à vingt-six mesures d'audition sous anesthésie générale, de deux heures chacune, et treize injections à travers le tympan sur cent quatre-vingts jours : 560 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet teste des candidats médicaments contre la perte d'audition liée à l'âge chez des lignées qui développent une pathologie proche de la maladie d'Alzheimer, pour vérifier si traiter l'oreille ralentit le déclin cognitif. Chez ces souris, le porteur décrit des agressions plus fréquentes entre congénères, une baisse des interactions sociales et une masse corporelle réduite dès cinq à six mois. Toutes sont tuées en fin de procédure pour prélever le cerveau et l'oreille interne, et parce que leur modification génétique interdit, selon lui, tout replacement ou réutilisation.

Objectifs

Des pertes d’audition même modérées ou légères peuvent augmenter à long terme un déclin cognitif et accélérer l’évolution négative des maladies neurodégénératives. Ceci est particulièrement vrai pour les cas de démences. A ce jour on estime que 4 millions des 50 millions de cas de démences dans le monde peuvent être en relation avec une perte d’audition liée à l’âge non traitée. Les différents mécanismes qui vont entrer en interaction entre les pertes d’audition liés à l’âge et le déclin cognitif vont être les suivants : - des dysfonctionnements du métabolisme énergétique des cellules nerveuses et de certaines voies de signalisation. - la privation sensorielle prolongée qui va avoir un impact sur diverses région cérébrales et accélérer le déclin cognitif. - une occupation des ressources cognitives plus importante pour traiter l’information auditive afin de compenser la dégradation de l’audition. Ce qui va réduire la ressource disponible pour les autres fonctions cognitives supérieures. - des modifications dans la relation structure/fonction de certaines zones du cerveau. Ainsi l’activité de certaines zones du cerveau sera modifiée du fait de la perte d’audition. Or certaines des zones qui seront modifiées sont des zones qui sont importante dans le traitement de la mémoire. Donc ces modifications pourront dégrader le traitement de la mémoire car les neurones disponibles dans ces zones seront affectés au traitement de l’information auditive. Dans le cadre de ce projet nous souhaitons évaluer l’efficacité de candidats médicament des pertes d’audition dans le contexte d’une maladie neurodégénérative qui est la maladie d’Alzheimer. Nous souhaitons donc traiter les animaux contre les pertes d’audition liées à l’âge suivre l’audition des animaux sur une période de 6 mois et enfin évaluer le stade de développement de la maladie ainsi que l’efficacité du traitement sur les pertes d’audition. Ce travail sera réalisé sur plusieurs lignées génétiquement modifiées. Les différentes lignées ont été choisies car celle-ci ont déjà fait l’objet de travaux de recherche dans l’audition.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de déterminer si un traitement des pertes d’audition liées à l’âge peut permettre d’améliorer le stade de développement d’une pathologie neurodégénérative. En validant cette stratégie thérapeutique sur des modèles animaux nous pourrons poursuivre le développement de ce projet chez l’homme. L’objectif étant de ralentir le développement de cette pathologie afin d’améliorer la durée de vie en bonne santé des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : -Anesthésie injectable pour réaliser les mesures d’audition chaque semaine depuis l’inclusion jusqu’à la fin de la procédure sur les 80 animaux inclus dans cette procédure. -Mesure d’audition sous anesthésie générale au maximum 26 fois sur une période de 180 jours. -Chaque mesure d’audition dure environ 2h. -Euthanasie des 80 animaux en fin de procédure. -Anesthésie injectable pour réaliser les mesures d’auditions chaque semaine depuis l’inclusion jusqu’à la fin de la procédure sur les 480 animaux inclus dans cette procédure. -Mesure d’audition sous anesthésie générale au maximum 26 fois sur une période de 180 jours. Chaque mesure d’audition dure au maximum 2h. -Traitement transtympanique sous anesthésie générale gazeuse chaque 15 jours depuis l’inclusion jusqu’à la fin de la procédure sur les 480 animaux inclus dans cette procédure. Cela représente un maximum de 13 injections sur une période de 180 jours. Chaque injection dure au maximum 45min. -Euthanasie des 480 animaux en fin de procédure.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui sont attendus pour ce projet : Les animaux qui vont développer la pathologie de démence vont être atteint des symptômes suivants : Des pertes d’audition liées à l’âge. Des comportements d’agression plus fréquent envers leurs congénères chez les deux sexes et une diminution des interaction sociales. Une masse corporelle réduite par rapport aux animaux contrôle à partir de 5 à 6 mois d’âge.

Devenir

A la fin de chacune des procédure les animaux sont euthanasiés. Tout d’abord afin de collecter les tissus du cerveau et de l’oreille interne afin de réaliser des analyses pour évaluer l’efficacité du traitement et pour évaluer le stade de développement de la maladie d’Alzheimer. De plus cette euthanasie est justifiée car les animaux sont génétiquement modifiés donc ils ne peuvent pas faire l’objet d’un replacement ou d’une réutilisation dans un autre projet.

Remplacement

Le recourt à l’animal de laboratoire est nécessaire dans ce projet car nous souhaitons évaluer le bénéfice d’un traitement de l’audition dans le développement d’une maladie neurodégénérative. Ceci ne peut pas être réalisé sur des culture de cellules ou d’explant puisque nous étudions la synergie entre deux pathologies. Toutefois les candidats médicaments que nous allons tester ont été préalablement sélectionné par rapport à leurs effets positifs dans des modèles vitro, ex-vivo voir même in vivo.

Réduction

Afin de limiter les effectifs un calcul d’effectif est réalisé en amont. Ce calcul d’effectif a été en considérant le seuil d’audition comme variable principale. Ce calcul a été fait pour rechercher l’effectif nécessaire par groupe pour une amélioration de 20 décibels ou plus (en fonction de la fréquence) du seuil d’audition par rapport aux groupes contrôles.

Raffinement

Le contenu de ces études intègre les impératifs éthiques tels que : les modalités d’administration et de prélèvement, d’hébergement et d’enrichissement du milieu spécifique pour chaque espèce étudiée. Mais aussi la prévention de toute douleur, détresse ou inconfort chez l’animal. Lors des procédures d’anesthésie de plus de 15minutes les animaux sont placés sur des tapis chauffants. Une hydratation par administration de sérum physiologique est mise en place après les anesthésies qui vont avoir une durée supérieure à 30 minutes. Des protocoles d’analgésie adaptés sont mis en place lorsque nécessaire par exemple pour les exsanguinations sous anesthésie générale avec laparotomie. Pour la réalisation des injections transtympaniques nous utilisons des endoscopes de très petite taille avec des aiguilles de très petite taille de diamètre afin de limiter la taille de la perforation du tympan. De plus lors de ces administrations répétées nous allons pouvoir vérifier l’apparition d’une inflammation de l’oreille externe ou le développement d’une otite de l’oreille moyenne. Mise en place de points limites précoces et adaptés. comme par exemple :l’absence prolongée de toilettage, tremblements, perte de poids …

Choix des espèces

Les lignées génétiquement altérées qui développent la pathologie neurodégénérative qui concernent ce projet n’existent que chez la souris. Les animaux seront tous des jeunes adultes ceci afin de démarrer les procédures avant le développement de la pathologie neurodégénérative. En fin d’expérimentation les animaux auront 8 mois d’âge afin d’arriver au stade précoce ou médian de développement de la maladie d’Alzheimer chez ces souches de souris.