Procédures modérées

1 500 rats et 1 000 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie d'entre eux passant trois semaines enfermés dans un caisson à atmosphère appauvrie en oxygène. Les autres reçoivent une injection destinée à déclencher une hypertension pulmonaire en quatre semaines. Viennent ensuite une échographie, une thermodilution, une mesure de pression artérielle pulmonaire et un prélèvement sanguin, tous sous anesthésie, avant le prélèvement du cœur et des poumons. Le porteur indique que les animaux deviennent essoufflés et inactifs mais estime la souffrance modérée puisqu'ils ne seront pas soumis à l'effort, et renvoie les éventuels essais cliniques à un horizon "plus long terme".

Objectifs

L’hypertension pulmonaire (HTP) est une maladie grave, caractérisée par une élévation de la pression artérielle pulmonaire qui conduit à une hypertrophie cardiaque droite, puis à une insuffisance cardiaque droite, à l’origine du décès des patients. Les traitements disponibles actuellement ne sont pas curatifs. La recherche est donc très active dans l’identification de nouvelles cibles afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques à visée curative. Pour cela, des modèles animaux pertinents sont indispensables. L’objectif de ce projet est donc d’utiliser des modèles animaux (rats, souris) d’HTP expérimentale classiquement utilisés dans la littérature et au laboratoire de façon à pouvoir s’appuyer sur de nombreuses données déjà acquises. Il existe différents type d’HTP chez l’Homme et nous allons donc utiliser deux modèles animaux pour étudier d’une part l’HTP associée à une hypoxie chronique (HC) similaire aux HTP associées aux maladies respiratoires hypoxémiantes (asthme, bronchite chronique, fibrose…) et d’autre part, l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) induite par une injection d'une substance pharmacologique pour étudier l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) idiopathique (de cause inconnue). A ce jour aucune lignée cellulaire ne rassemble toutes les caractéristiques pathophysiologiques de l’HTP donc nous avons besoin d’utiliser des animaux notamment pour mieux connaitre les mécanismes de cette pathologie ce qui permettra ensuite de tester de potentiels nouveaux traitements et d’évaluer leurs potentiels effets bénéfiques et/ou effets secondaires.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes associés à la pathologie de l’HTP/HTAP. Cette étude permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs versus curatifs seront mis en évidence ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées de façon à mettre en place un traitement plus efficace avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients et adapté au type d’hypertension pulmonaire HTP et/ou HTAP.

Procédures

Pour obtenir le modèle de rat ou souris hypoxiques chroniques, les animaux sont maintenus dans un environnement où l’air contient moins d’oxygène pour une durée de 3 semaines. Pour le modèle d’HTAP idiopathique chez le rat, une seule injection d’une substance pharmacologique appropriée sur animal vigile va induire au bout de 4 semaines de l’HTAP idiopathique. Le potentiel thérapeutique de substances pharmacologiques sera testé sur animal vigile. La fréquence d’injection et donc le nombre d’injections sera ajustée en fonction de la substance considérée. Lorsque l’HTP/HTAP est installée, des mesures in vivo sont effectuées sur chaque animal : -des mesures échographiques sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 10 minutes) -des mesures de thermodilution sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 15 minutes) -des mesures de pressions artérielles pulmonaires sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 20 minutes) -un prélèvement de sang sous anesthésie (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes) -après euthanasie, prélèvement du cœur et des poumons (1 fois sur chaque animal, durée 5 minutes)

Impact sur les animaux

Chez l’homme, l’HTP/HTAP n’induisent pas de souffrances élevées mais plutôt une gêne respiratoire exacerbée lors d’un effort. Chez l’animal il a été noté une légère dyspnée et les rats/souris sont généralement assez inactifs. Etant donné que les animaux ne seront pas soumis à l’effort, la souffrance est considérée comme modérée dans ce type de protocole d’induction d’une maladie. Bien qu’il n’y ait pas de perte de poids, il y a une prise de poids moindre lors de la mise en place de l’HTP/HTAP chez les animaux. Les points d’injection des substances et solvants peuvent développer une inflammation locale. Ils seront donc contrôlés.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés de façon à récupérer le cœur et le poumon pour faire diverses analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu dans cette maladie afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, et seules des expérimentations in vivo chez l’animal pourront permettre d’atteindre ce but. Il est très difficile d’obtenir du tissu de patient souffrant d’hypertension pulmonaire. De plus, étant donné qu’il existe de nombreux types d’HTP associées à diverses maladies (respiratoires hypoxémiantes notamment), il est très difficile d’obtenir des résultats reproductibles sur ce type de tissu (provenant de patients ayant subis une greffe de poumon). Les cellules en culture nous apportent des informations qui doivent être vérifiées in vivo ou in vitro sur des cellules ou des tissus fraichement isolés car le phénotype des cellules change avec les conditions de culture. De plus, cette pathologie implique plusieurs organes et seul l’animal entier permet les interactions entre ces différents organes.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux : (1) les rats contrôles utilisés seront les mêmes pour les deux type d’HTP, (2) une partie des utilisateurs utiliseront le poumon droit et l’autre partie des utilisateurs utilisera le poumon gauche (dans tous les cas les deux poumons seront utilisés), (3) une planification des expériences sera établie au long de chaque année d’expérimentation pour optimiser au mieux les techniques réalisées sur chaque animal avec utilisation de cellules en culture et enfin, (4) parallèlement à ce protocole, des études seront réalisées sur des cellules d’artères pulmonaires humaines exposées à l’hypoxie et étirées in vitro pour simuler l’HTP hypoxique. Quatre statutaires (et leurs étudiants) travaillent sur ce projet donc l’utilisation des animaux sera optimisée et en concertation avec tous les utilisateurs. Des précautions seront prises pour éviter les biais expérimentaux (travail en aveugle, partage des tissus et/ou cellules issues de ces tissus). L’estimation du nombre d’animaux est basée sur les analyses des études préalablement menées au laboratoire, en accord avec les données de la bibliographie, compte tenu des quantités de tissu nécessaires et de la taille requise des échantillons pour une analyse statistique pertinente dans ce type de recherche.

Raffinement

Des points limites ont été mis en place et seront appliqués. Le caisson hypobare sera ouvert 3 fois par semaine afin de renouveler l’eau et la nourriture, et d’effectuer le change de la litière une fois par semaine. Un système automatisé permet de modifier la pression atmosphérique progressivement et automatiquement pendant 45 minutes pour le retour à la pression atmosphérique normale ou la mise en hypobarie. Le caisson et les cages sont transparents ce qui permet de surveiller les animaux. Les animaux contrôles seront juste placés dans leurs cages habituelles. A l’occasion de l’ouverture du caisson (3 fois par semaine), tous les animaux seront pesés. Si le décès survenait avant la fin du protocole, le protocole serait également modifié ou arrêté. En cas de détection de signe de douleur, dans un premier temps, une administration d’antalgique sera réalisée. Lors de l’anesthésie un tapis chauffant sera utilisé pour le bien-être de l’animal. Le degré d’anesthésie sera surveillé en permanence.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont des espèces classiquement utilisées pour le développement de modèles d’HTP. De plus, le laboratoire utilise ces espèces depuis plusieurs années, et dispose donc de nombreuses données sur lesquelles s’appuie le présent projet. Le choix du rat est également justifié par le fait que le modèle d’HTAP fonctionne difficilement chez la souris. Néanmoins, l’utilisation de la souris permet d’envisager l’utilisation de modèles transgéniques qui sont moins nombreux chez le rat et qui sont nécessaires à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires. L’HTP/HTAP sont des pathologies de l’adulte donc nous utilisons des animaux adultes en fin de protocole.

Ce sont des brebis gestantes au dernier tiers de leur gestation qui sont opérées, à 125 jours pour un terme de 145, parce que la cible réelle de l'étude est leur fœtus. 212 moutons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie d'environ quatre heures sous anesthésie générale, puis une anesthésie loco-régionale destinée uniquement à prélever le sang du fœtus, à raison de huit prélèvements par journée de manipulation. Une même brebis sert à plusieurs expérimentations, ce que le porteur décrit comme une façon d'"optimiser au maximum l'utilisation de l'animal". À la fin du projet, il annonce la mise à mort d'environ 60 brebis gestantes et de leurs fœtus, et une vingtaine de brebis en adoption possible, celles qui auront perdu leur fœtus ou mis bas prématurément.

Objectifs

La majorité des patientes en salle de naissance bénéficie d’une analgésie devant les douleurs entraînées par les contractions utérines lors du travail. Leur mise en place peut provoquer une instabilité de la fréquence cardiaque et de la tension artérielle maternelle transitoire lors de l’injection des médicaments, et entraîner des anomalies du rythme cardiaque fœtal. L’impact d'une césarienne ou d'une anesthésie générale ou d'une péridurale maternelle sur l’hémodynamique fœtale et le retentissement sur le système nerveux autonome reste peu connu, et sa compréhension est nécessaire afin de diminuer la morbi-mortalité fœtale.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à observer une modification des paramètres fœtaux sanguins et cardiaques plus importante en cas d’analgésie type césarienne par rapport aux autres analgésies. L’impact serait en pratique clinique d’adapter l’analgésie maternelle pour diminuer le risque d’hypoxie foetale et ses complications (lésions cérébrales anoxo-ischémiques). Cette étude permettra également de déterminer l’effet sur le coeur et la tension artérielle des sédations foetales lors d’une réanimation à cordon intact afin d’optimiser la prise en charge des nouveaux-nés vulnérables.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à une chirurgie sous anesthésie générale d'une durée d'environ 4 heures, une seconde anesthésie cette fois loco régionale sera réalisée sans objectif d' incision mais uniquement pour les prélèvements sanguins chez le foetus, ces prélèvements serviront pour la vérification des gaz du sang (valeur de pH, quantité d’oxygène et de dioxyde de carbone dans le sang etc), et l’évaluation du retentissement de l’anesthésie effectué. Les quantités prélevées seront de 0,3 ml à raison de 8 prélèvements par journée de manipulation. Chez la brebis ces prélèvements serviront à évaluer le retentissement son état sanguin en comparaison à l'état sanguin de son foetus.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable attendu serait la douleur modérée pendant et suite à la chirurgie de la brebis gestante, dont la prise en charge de la douleur est optimisée pendant les manipulations et par un protocole anti douleur après les manipulations durant 3 jours par Buprénorphine.

Devenir

Après une évaluation de l’état général des brebis à l’issue de la chirurgie par l’expérimentateur (sensibilisé au bien-être animal) et les zootechniciens, les animaux ne seront pas euthanasiés à la fin de la 1ere procédure. Ils seront hébergés dans une animalerie conventionnelle et agréée. A la fin des procédures et du projet, ou en cas de point limite atteint, les animaux seront euthanasiés, soit environ 60 brebis gestantes et leur fœtus. En cas de perte fœtale inopinée (mises bas prématurées ou perte fœtale due à l'anesthésie), nous comptons environ 20 brebis en possible adoption.

Remplacement

L’étude du fœtus humain n’est possible qu’en cas d’expérimentation non invasive et après validation des hypothèses au préalable chez l’animal. En effet d’un point de vue éthique, il n’est pas justifié de réaliser une expérimentation qui comporte un risque de perte fœtale (la réalisation de prélèvements sanguins ou la mesure de façon invasive de la pression artérielle moyenne sur le fœtus par abord cordonal est techniquement possible mais avec un risque de perte fœtale de 3 à 10%). Aucun modèle non animal ne pourrait permettre de réaliser ce projet.

Réduction

Plusieurs procédures expérimentales sont incluses dans ce projet. Les fœtus d’agneau seront leur propre témoin ce qui limitera le nombre d’animaux nécessaires pour le protocole. L’étude consistera à comparer l’état de base des paramètres de fréquence cardiaque et pression artérielle des foetus, de leur signal cérébral et des paramètres sanguins à la réponse obtenue lors d’une analgésie et sédation maternelle et fœtale. Le nombre d'animaux déterminé par une approche statistique est d'environ 8 à 12 animaux par groupe expérimental.

Raffinement

Chaque brebis arrive 10 jours au moins avant la date de la chirurgie afin de s'acclimater à son nouvel environnement. Les brebis sont livrées au minimum par 2 afin de réduire le stress du transport. Les brebis sont hébergées à plusieurs en permanence dans les box et aucune brebis ne sera seule hébergée afin de réduire le stress lié à la solitude. La manipulation sera effectuée sous anesthésie générale avec un protocole spécifique d'anesthésie, d'anti douleur et d'antibiotique préventif. Les expérimentations seront débutées 4 jours après la chirurgie et une même brebis sera utilisée pour plusieurs expérimentations afin d’optimiser au maximum l’utilisation de l’animal. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie générale : Après une pose de Voie veineuse centrale en jugulaire, un remplissage de 1L de Ringer Lactates, ainsi qu’une pré-oxygénation au masque, la sédation se fera par une injection de Kétamine IV 0.5mg/kg suivi de propofol IV 2 à 3mg/kg (titration jusqu’à perte de conscience), et un maintien à l’isoflurane (AErane®) enfin une injection per opératoire IV continue de kétamine à 0.1-0.25mg/kg/h. Les animaux bénéficieront de protocoles antalgiques adaptés (Buprénorphine BUPAQ® (0,04 à 0,06 mL/kg en intramusculaire) lors de la période pré et post-opératoire.

Choix des espèces

Le modèle animal doit avoir des caractéristiques morphologiques et physiologiques proches du modèle humain. C’est le cas de la brebis, qui est un mammifère avec une gestation de singleton ou de jumeaux, dépendante du placenta et de la circulation foeto-placentaire. Le poids et la circulation du fœtus d’agneau sont proches de ceux du fœtus humain. Sa taille est suffisante pour permettre la pose de cathéters vasculaire, en limitant le risque de perte fœtale liée à la chirurgie. Des études sur plusieurs jours sont possibles chez le fœtus d’agneau instrumenté ce qui permet de limiter le nombre d’animaux par projet. Ce modèle est reconnu par la communauté scientifique comme le modèle animal le plus proche pour étudier la physiologie fœtale, ce qui justifie la pertinence de notre choix. Notre protocole de recherche est sur le foetus. Il est donc nécessaire d’utiliser des brebis gestantes. Notre expéri-mentation aura lieu lors du dernier tiers de la gestation (intervention à 125 jours pour un terme de 145 jours). Cet âge gestationnel est nécessaire pour que le fœtus soit suffisamment gros pour la chirurgie, pour la pose de cathé-ters vasculaires (2500 à 3000 g) et pour limiter les risques de perte fœtale per opératoire.

Un cathéter est posé chirurgicalement dans l'estomac de chaque souris, qui passe ensuite onze jours seule en cage avant de recevoir un repas perfusé directement dans l'estomac pendant trois heures. 220 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'étude porte sur la réaction inflammatoire qui suit un repas gras chez "l'individu sain dans un contexte de physiologie normale", alors que les animaux observés sont opérés, isolés et alimentés par sonde. Le sang entier et le cerveau doivent être prélevés, ce qui impose la mise à mort de chaque animal.

Objectifs

L’existence de la réaction inflammatoire après repas (PIR) systémique est maintenant bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme et les mécanismes biologiques sous-jacents induisant la PIR sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Récemment, il a été montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, elle se caractérise par une activation des cellules spécifiques chez l’individu sain en réponse à un repas gras. Cette réponse est visible 3 heures après le début du repas, et elle se produit dans une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. Les médiateurs biologiques qui déclenchent la PIR cérébrale ne sont pas identifiés. Une hypothèse serait que les lipides nutritionnels qui se retrouvent dans la circulation générale après digestion et absorption soient capables de stimuler la réponse des cellules du cerveau cependant d’autres facteurs circulants après un repas pourraient aussi activer la PIR. La stratégie consistera à manipuler la concentration de lipides dans le sang postprandiale et à mesurer la réponse cellulaire cérébrale. La concentration de lipides dans le sang sera suivie par analyse biochimique sanguine, et la réponse cellulaire cérébrale sera mesurée par microscopie sur coupes de cerveau. Nous utiliserons : une solution de nutrition à base d’un régime enrichi en gras, elle sera perfusée dans le tube digestif, ce qui permettra d’élever artificiellement les lipides plasmatiques en l’absence de prise de repas et un agent pharmacologique qui limitera cette élévation des lipides et nous permettra de mettre en évidence une action des autres facteurs sur l’activation de la PIR. Un dosage sanguin des triglycérides au cours du temps sera réalisé aux temps : T0, T1h, T2h, et T3h. Les cerveaux de ces animaux seront étudiés après mise à mort afin d’analyser la réponse cellulaire cérébrale dans différentes conditions. 220 souris seront utilisées dans ce projet.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de mieux comprendre les déterminants de la PIR cérébrale chez l’individu sain, et donnera des informations nouvelles sur l’impact des lipides nutritionnels sur le cerveau. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie qui durera 30 minutes pour la mise en place du cathéter gastrique. De plus, ils seront placés dans des cages individuelles durant 11 jours. Le jour de l’expérience ils recevront un traitement dans l’estomac (temps = 1.5 minutes) puis la perfusion du repas dans l’estomac dure de 0 à 3 heures. La contention des animaux et les injections pour l’anesthésie générale avant la mise à mort représentent des nuisances sur les animaux dans ce projet. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour la mise en place du cathéter gastrique peut provoquer les nuisances suivantes : - Hypothermie transitoire, induite par l’anesthésie générale - Douleurs post-chirurgie transitoires, induites par la chirurgie - Trouble potentiel du comportement alimentaire et du métabolisme, induit par la chirurgie affectant le tube digestif - Stress lié à l’isolement en cage individuelle - Stress lié à la contention des animaux et aux injections d’anesthésique et de sédatifs avant la mise à mort. Ces injections seront réalisées une seule fois par animal

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort, en effet la totalité du sang et le cerveau doivent être prélevés.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier de manière optimale les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux dans l’animalerie, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux. Les animaux seront hébergés dans un environnement calme, enrichi, et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h (cycle inversé permettant d’étudier les animaux pendant leur phase active, avec extinction des lumières à 10h30). L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidification et carrés de coton ainsi que des frisures de papier qui permettent aux animaux de se cacher. Un suivi quotidien sera assuré pour veiller au bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes mâles, âgées de 8 semaines au moins. D’un point de vue scientifique, la PIR se développe uniquement chez les mâles, de plus cet âge correspond à un cerveau mature stabilisé.

Jusqu'à 800 séries de sons par session d'enregistrement, jusqu'à 20 administrations dans la vie de l'animal, deux à dix mois en cage individuelle avec contrôle alimentaire : 400 rats porteurs d'une mutation du gène de l'X fragile vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Chacun subit d'abord une neurochirurgie d'environ une heure sous anesthésie générale, qui laisse un connecteur fixé à son crâne dont la cicatrisation doit être surveillée. Les prélèvements sanguins, jusqu'à trois par semaine, se font sous anesthésie générale quand le protocole l'exige. L'objet est d'évaluer par électroencéphalographie des candidats médicaments en cours de développement, le porteur présentant le recours à un modèle animal comme le moyen d'optimiser un développement pharmaceutique qu'il décrit comme long et coûteux.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer des signaux électroencéphalographiques (EEG) dans un modèle animal de syndrome du chromosome X fragile, qui est une maladie génétique entrainant un déficit intellectuel, des troubles du comportement et des anomalies physiques. Les patients présentant le syndrome de l’X fragile présentent des troubles mentaux approchant ceux du spectre autistique : anxiété sociale, hypersensibilité sensorielle, retard mental. Ce syndrome est causé par la mutation d’un gène unique. Un modèle de rat porteur d’une mutation analogue du même gène est disponible, et ce rat mutant présente des caractéristiques qui rappellent fortement le syndrome de l’X fragile. L'électroencéphalographie est un outil de choix pour aborder l’activité cérébrale, en raison de son caractère transposable entre le rat et l’homme. En effet, les activités cérébrales de base sont largement conservées chez les mammifères. Les observations effectuées chez le rongeur permettent donc de prédire des résultats chez l’homme. Il est donc intéressant d’utiliser ce rat mutant pour évaluer des candidats médicaments en cours de développement et visant à améliorer la qualité de vie des patients victimes du syndrome X fragile. Ces candidats médicaments seront évalués sur le rat mutant, et leurs effets seront évalués à travers l’électroencéphalographie. Des marqueurs biologiques mesurés permettront d’évaluer l’impact sur les rats mutants, et permettront de prédire une efficacité chez le patient. Ces marqueurs biologiques seront de deux types. Des marqueurs spontanés seront évalués : les animaux seront laissés libres, éveillés et dans des conditions calmes, sans intervention dans leur environnement. Les différences spontanées entre les rats mutants et contrôles pourront être comparées, et les effets des candidats médicaments sur ces différences seront évalués. Des marqueurs évoqués seront également évalués : les animaux seront toujours laissés libres et éveillés, et des stimulations sonores leur seront présentées. Ces stimulations sonores induiront des réponses neuronales qui seront mesurées et quantifiées. A nouveau, les différences entre les deux types de rats seront comparées, et les effets des candidats médicaments seront évalués.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux médicaments est très coûteux et prend beaucoup de temps. Afin d’optimiser ce développement et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, l’utilisation d’un modèle animal pertinent est nécessaire. L’utilisation d’une lignée de rats mutants, modélisant le syndrome X fragile humain, permettra de mettre en évidence de nouvelles molécules thérapeutiques susceptibles d’améliorer la qualité de vie des patients victimes de ce syndrome.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores une à deux fois par semaine. Une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal éveillé une à deux fois par semaine. Les pulsations sonores individuelles dureront un maximum de 100 ms à une intensité de 90 dB maximum. Ces pulsations sonores seront regroupées soit en paires avec 1 seconde d’écart entre les 2 sons, soit en train de 2 secondes avec un son toutes les 25 ms. Chacune de ces séries de sons pourront être répétées jusqu’à 800 fois au cours d’une session d’enregistrement : jusqu’à 400 fois avant administration et jusqu’à 400 fois après administration. Lors des tests pharmacologiques le nombre d’administrations (durée d’une minute en moyenne) sera limité à 20 dans la vie de l’animal, avec un minimum de 3 jours entre chaque jour d’administration. Lors des tests pharmacologiques en administrations répétées, les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Différents prélèvements sanguins pourront être faits au cours des procédures expérimentales. Ils seront conduits sous anesthésie générale si nécessaire, en fonction du protocole établi dans chaque étude (durée : moins de 20 min par prélèvement). Le nombre de prélèvements sanguins sera limité à 3 par semaine. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout le long du projet (entre 2 à 10 mois) et seront soumis à un contrôle alimentaire tout au long de leur hébergement (quelques mois).

Impact sur les animaux

Le modèle de rats utilisé ne présente pas d’effets indésirables aboutissant à une mortalité précoce des animaux. La chirurgie aboutira à la présence d’un connecteur attaché au crâne de l’animal. La cicatrisation autour de ce connecteur devra être surveillée et soignée. Des administrations pharmacologiques nécessiteront la manipulation des animaux, induisant un stress. Au point d’injection, des indurations ou des inflammations locales et temporaires pourront apparaître. Les prélèvements sanguins induiront un stress de contention, une douleur brève au point de prélèvement. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Un stress pourra être induit par l’hébergement individuel et le contrôle alimentaire.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes, produit par le cerveau dans son ensemble qui ne peut pas être modélisé par un système plus simple (ex. culture cellulaire ou informatique).

Réduction

Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Il a été estimé selon notre expérience antérieure nous ayant permis d'obtenir un nombre suffisant d’animaux enregistrés pour réaliser les tests statistiques précédents et garantir la prédiction d’effets transposables à l’humain.

Raffinement

Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Le projet prévoit des procédures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins pré et postopératoires comprenant une anesthésie, des antidouleurs, des anti-inflammatoires et une évaluation clinique quotidienne. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication ont été identifiés. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Pour les expériences d’enregistrement EEG en réponse à des stimulations sonores , ces stimulations seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux.

Choix des espèces

Nous utiliserons une lignée de rats mutants, dont la mutation est similaire à celle présente chez les patients du syndrome de l’X fragile. Le choix de l’espèce est donc directement lié à cette similarité : la mutation de ce même gène chez l’homme et le rat induit en effet des troubles similaires dans les deux espèces. Les animaux sont manipulés au minimum à l’âge de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, le cerveau est mature et présente des caractéristiques intéressantes pour reproduire les troubles observés chez le patient humain.

Six échantillons de biomatériau sont implantés sous la peau de chaque rat, ce qui permet de limiter l'effectif à 15 animaux sur trois ans. Ces 15 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour l'analyse histologique des échantillons implantés. L'intervention dorsale dure une trentaine de minutes et peut provoquer une douleur modérée, l'évaluation de cette souffrance étant confiée au personnel de l'animalerie. L'étape sert à vérifier la biocompatibilité de matrices osseuses avant leur implantation en site osseux, le porteur indiquant que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" être testés sur des animaux non-humains avant tout essai clinique.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses représentent un défi en chirurgie orale et orthopédique. En clinique, l'utilisation de greffe où le patient est son propre donneur est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie additionnelle, morbidité du site donneur...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier ces limitations. Ce projet vise à évaluer de nouveaux matériaux réalisé par une technique de fabrication spécifique (moulage dynamique). Cette nouvelle technologie de fabrication permet de créer des matériaux avec plusieurs tailles de porosités (interne et externe) afin de d'améliorer les propriétés de la matrice, et dont le design peut être adapté à l’indication clinique ciblée. L'objectif de cette étude est d'évaluer la biocompatibilité des biomatériaux étudiés grâce au modèle d'implantation sous-cutané chez le rat. Il s'agit d'un modèle animal déjà développé et maîtrisé au sein de notre unité qui a l'avantage d'être facile à mettre en œuvre et reproductible.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à s'assurer de la biocompatibilité de ces nouvelles matrices avant de les implanter en site osseux pour évaluer leur potentiel pour la régénération osseuse. A plus long terme, ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matrices pour la régénération osseuse) dans la perspective d’une utilisation en clinique. La technique de fabrication (par moulage dynamique) pourrait permettre de fabriquer des matériaux sur mesure pour les patients.

Procédures

Les animaux auront une chirurgie cutanée au niveau dorsal. L’intervention a lieu une seule fois et dure environ 30 mn par animal.

Impact sur les animaux

L'implantation en site sous-cutané peut entraîner une douleur modérée. De rares complications post-opératoires sont à envisager. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques des échantillons implantés

Remplacement

L'absence de toxicité cellulaire des matériaux utilisés aura au préalable était évaluée in vitro selon la norme en vigueur. En suivant, les produits destinés à être implantés chez l'humain doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Les matériaux doivent être d'abord testés dans modèle de rat, et si les résultats obtenus sont satisfaisants, d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré une absence de toxicité cellulaire in vitro, et une seule lignée de rats sera utilisée. De plus, afin de réduire le nombre de rat, 6 échantillons seront implantés par animal. Enfin, la même lignée de rats que celle déjà utilisée au sein de notre unité est choisie, afin de diminuer le nombre de conditions à évaluer et d'éviter l'ajout de rats supplémentaires pour cette évaluation.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse : une période d’acclimatation de deux semaines sera respectée avant le début des expérimentations afin d’obtenir une meilleure récupération post-opératoire. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement des animaux pour éviter toutes sources de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'analgésique afin de prévenir toute douleur lors de l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés et placé sur un tapis chauffant. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part pour éviter le contact avec des congénères non anesthésiés. Après le réveil complet, le rat sera réintégré à sa cage d’origine. Les animaux seront ensuite observés sur une semaine. Toutes les modifications de comportement et d’aspect seront consignées dans un fichier informatique par les personnes impliquées directement dans ce projet. Des critères stricts permettront d’évaluer le bien-être des animaux. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères avec présence de litière en copeaux de peupliers et de jouets, ainsi que des bâtons à ronger qui sont régulièrement mis dans les cages.

Choix des espèces

Le Rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses. Le rat permet de valider la biocompatibilité du produit. De plus, il est utilisé dans de nombreuses études. La lignée choisie est d’ailleurs volontairement identique à celle utilisée par d’autres travaux réalisés également au sein de notre unité, permettant la comparaison des résultats ainsi que la diminution du nombre d’animaux nécessaires, par la reprise de données déjà disponibles. En cas de résultats satisfaisant et supérieurs à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, une validation chez le gros animal sera nécessaire. Des rats adultes de 9 à 10 semaines, d'un poids d'environ 350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

La plateforme fabrique des anticorps monoclonaux à la demande d'équipes académiques et industrielles, à raison de deux souris par antigène commandé. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leur rate. Chacune reçoit trois à cinq injections d'une substance immunogène dans l'abdomen, à quinze jours d'intervalle, puis une prise de sang destinée à mesurer sa réponse immunitaire. Le porteur indique qu'un anticorps recombinant est produit in vitro quand c'est possible, juge les banques d'anticorps synthétiques limitées par leur sélection "artificielle et aléatoire", et note que la quasi-totalité des anticorps utilisés chez l'être humain proviennent de l'immunisation d'animaux non-humains.

Objectifs

La génération d'anticorps monoclonaux est la mission de notre plateforme "Ingénierie d'anticorps". Cette mission consiste à générer des anticorps monoclonaux par immunisation de la souris pour les équipes de recherche académiques et industrielles pour leur utilisation en recherche diagnostic et biotechnologie.

Bénéfices attendus

Le projet permet l'obtention d'anticorps monoclonaux hautement spécifiques qui sont des outils indispensables dans la recherche, la biotechnologie, le diagnostic et le développement de traitements thérapeutiques.

Procédures

L'immunisation consiste à injecter un petit volume de substance immunogène dans l'abdomen de souris 3 à 5 fois, à intervalle de deux semaines. Ensuite, un échantillon de sang est prélevé pour évaluer la réponse immunitaire. La souris est ensuite euthanasiée et un prélèvement de la rate est réalisé en vue de la préparation des lymphocytes. Les durées des interventions sur les souris (injections, prélèvement de sang) sont très courtes, de l'ordre de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les injections répétées lors de l'immunisation peuvent provoquer du stress, de la douleur et de l'inconfort. Le prélèvement de sang peut entraîner une douleur et un stress.

Devenir

Les souris immunisées sont euthanasiées puis un prélèvement de la rate est réalisé pour la préparation des lymphocytes.

Remplacement

La génération d'anticorps chez la souris est envisagée lorsqu'il n'existe pas d'anticorps déjà disponible et pouvant répondre au besoin du demandeur. Lorsque cela est possible, un anticorps recombinant est produit in vitro. La production de l'anticorps in vivo chez la souris est remplacée par la production in vitro. Il n'est actuellement pas raisonnable de se passer totalement de l'utilisation des animaux pour la génération des anticorps. Bien que des banques d'anticorps synthétiques existent, la génération d'anticorps monoclonaux par immunisation de souris reste une approche privilégiée. La souris produit des anticorps naturellement optimisés via une réponse immunitaire complète, incluant la maturation d'affinité et la sélection par le système immunitaire. Les banques d’anticorps reposent sur une sélection artificielle et aléatoire ce qui limite la qualité des anticorps. Noter que la quasi-totalité des anticorps utilisés actuellement chez l'homme proviennent de l'immunisation des animaux.

Réduction

Nous réalisons une planification optimisée pour éviter de renouveler les procédures expérimentales. Nous limitons l'immunisation à 2 souris par antigène.

Raffinement

Nos procédures sont réalisées par un personnel expérimenté (plus de 20 ans d'expertise). Les injections et prélèvements moins traumatiques sont privilégiés. Une désinfection locale de la peau est réalisée avant chaque injection ou prélèvement. Les animaux sont suivis quotidiennement tout au long de la procédure et pour minimiser la douleur et l'inconfort, ils reçoivent un traitement analgésique. Les animaux présentant des signes de douleur dépassant le seuil fixé sont sortis du protocole expérimental et euthanasiés.

Choix des espèces

La méthode de génération d'anticorps monoclonaux repose sur la fusion de lymphocytes avec des cellules de myélome. Ces cellules de myélome sont originaires de la souris et n'existent quasiment que pour cette espèce, d'où le choix de la souris pour une question de compatibilité génétique lors la formation d'hybrides cellulaires. Pour l'immunisation, nous utilisons des souris jeunes qui ont un système immunitaire encore en développement, ce qui favorise une meilleure réponse immunitaire.

15 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour l'analyse histologique de leur fémur. Chacun passe environ une heure sous anesthésie gazeuse pour l'implantation, puis trois passages en IRM sous anesthésie, en hébergement individuel. Le porteur indique que les lapins supportent mal l'anesthésie et la chirurgie, qu'ils auront probablement des difficultés à s'en remettre et pourraient perdre leur mobilité. L'étude vise à valider un implant osseux résorbable, le porteur écrivant que les essais sur l'animal sont "indispensables" et que le recours aux animaux non-humains est de toute façon rendu obligatoire par le règlement européen pour obtenir un marquage CE.

Objectifs

Les implants métalliques, bien qu’ils soient largement utilisés dans la reconstruction osseuse, présentent des limitations significatives. Ils ne permettent pas une régénération complète de l’os, nécessitent souvent une seconde intervention chirurgicale pour leur retrait, et peuvent entraîner des complications telles que des infections. Ces contraintes renforcent le besoin urgent de développer des alternatives résorbables et biocompatibles, capables de s’intégrer dans l’organisme tout en évitant ces problématiques. Le projet repose sur l’utilisation d’un implant associant deux matériaux complémentaires. L'un est un polymère biodégradable, offrant un support mécanique temporaire grâce à sa résistance et sa stabilité initiale, tout en se dégradant progressivement pour permettre la régénération osseuse sans résidus toxiques. L'autre quant à lui, est reconnu pour sa bioactivité, favorisant la croissance osseuse grâce à ses propriétés de supportde la repouse osseuse. De plus, son action antibactérienne contribue à limiter les risques d’infections, un avantage notable par rapport aux implants métalliques conventionnels. Le choix du modèle animal repose sur le lapin, dont le métabolisme osseux est proche de celui de l’humain. Il fait partie des modèles animaux préconisés par la norme. Cela garantit une évaluation fiable de la biocompatibilité et de la résorption des implants dans un contexte physiologique pertinent. Le design de l’étude a été établi en conformité avec la norme, qui encadre l’évaluation biologique des dispositifs médicaux dans l’os, notamment les tests sur les effets locaux après implantation. L’imagerie IRM sera utilisée pour suivre l’évolution des implants in vivo, permettant une analyse détaillée et non invasive des performances de l'implant dans le temps. En fin d'étude les animaux seront euthanasiés pour réaliser des études histologiques des os.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour ambition de transformer durablement les pratiques dans le domaine de l’ostéosynthèse en proposant une approche thérapeutique améliorée : un implant bioactif et résorbable, évitant ainsi une seconde intervention et diminuant le risque d’infection. Il permettra également de répondre aux exigences réglementaires concernant les dossiers en vue d’une mise sur le marché, et ainsi assurer la sécurité des patients recevant les produits.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés chimiquement pour la réalisation de la procédure chirurgicale et les IRM. Les injections d'anesthésiques se feront dans le muscle et seront très bref, quelques secondes. Les animaux seront ensuite maintenus anesthésiés grâce à une anesthésie gazeuse. Ils resteront anesthésiés (gazeuse) le temps de réalisation des différents actes, soit 1h environ que ce soit pour la réalisation de la chirurgie ou l'acquisition des images IRM. Il y aura 3 IRM par animal pour toute l'étude

Impact sur les animaux

Les produits développés sont constitués de produits biocompatibles. Il s'agit de composants très bien documentés pour une utilisation chez l'Homme. Ils sont par ailleurs évalués en premier lieu sur des cellules : les effets néfastes attendus chez l'animal après implantation sont donc mineurs, et constitués majoritairement d'inflammation locale légère à modérée. L’hébergement individuel provoquera un inconfort chez l’animal. Les effets attendus sur les animaux peuvent être dus à l’anesthésie (sédation profonde, difficulté de récupération,), ou à la chirurgie (inflammation de la zone opérée.). Les lapins étant très sensibles à l’anesthésie et aux procédures chirurgicales, ils auront probablement des difficultés à s'en remettre avec potentiellement une perte de la mobilité. Les contentions pour les actes techniques (anesthésie) ou quotidiens (pesée) engendreront un stress chez les animaux, les contentions seront de courte durée, quelques minutes par animal. Aucune mise à jeun n’est nécessaire avant les anesthésies.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin d'étude afin de réaliser des analyses sur le fémur.

Remplacement

Les essais de tolérance et de compatibilité avec les tissus sur l'animal sont indispensables en complément des tests sur les cellules, lors de la mise au point d'un dispositif médical. En effet, seule l'implantation dans un organisme complet et vivant permet d'évaluer d'éventuelles réponses immunitaires/inflammatoires, et de caractériser les phénomènes de dégradation et d'intégration des différents produits. Par ailleurs, le recours aux animaux est rendu obligatoire par le Règlement Européen, pour l'élaboration des dossiers pour l'obtention d'un marquage CE (équivalent de l'AMM mais pour les dispositifs médicaux).

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé est basé sur, la norme ISO 10993. Nous utiliserons 5 lapins par étude afin d’avoir le minimum d’observation demandé par la norme. Plusieurs études sont prévues car conformément à la norme ISO 10993, une nouvelle évaluation doit être fait en cas de modification du dispositif médical (modification de l’état de surface ou modification d’un matériau). Nous prévoyons de réaliser une étude par an sur 3 ans soit 15 lapins pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Tout d’abord le premier point de raffinement est l’utilisation de l’IRM. En effet, l'IRM est une technique non invasive, permettant d'obtenir des images internes du corps des animaux sans avoir à recourir à des interventions chirurgicales ou à l'extraction de tissus. Il est possible de suivre l’évolution d’un phénomène biologique ou pathologique dans le temps sans avoir à euthanasier des animaux pour obtenir des échantillons à différents stades de l'étude. Toutes les manipulations des animaux seront réalisées dans un contexte de renforcement positif, basé sur des interactions amicales avec les personnels en charge des soins, afin de permettre des manipulations avec un minimum de stress et de contraintes. Lors de la phase de chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant, de l’ocrygel sera appliqué sur les yeux et les paramètres physiologiques des animaux seront régulièrement suivi. Lors de la période post-opératoire, une surveillance accrue sera mise en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement avec une pesée une fois par semaine dont la fréquence pourra être adaptée. La récupération post-opératoire pourra être améliorée par mise à disposition d’aliment gelifié. Des points limites adaptés au projet et suffisament prédicitif ont étés mis en place.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal repose sur le lapin, dont le métabolisme osseux est proche de celui de l’humain. Cela garantit une évaluation fiable de la biocompatibilité et de la résorption des implants dans un contexte physiologique pertinent. Il fait partie des modèles animaux préconisés par la norme ISO 10993. Nous choisissons des lapins matures pour l’implantation de dispositifs médicaux et le suivi de l’évolution dans l’os car, à cet âge, la matrice osseuse est complètement développée et stabilisée.