Procédures modérées

Quatre tests comportementaux d'une semaine chacun, séparés par une semaine de repos, attendent les souris adultes de ce projet. 804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, les nouveau-nés subissant d'abord une contention d'une minute pour une biopsie de la queue. L'objet déclaré est de mesurer le rôle d'une protéine dans le développement de la maladie d'Alzheimer, les tests étant censés évaluer les capacités mémorielles, sans que le porteur précise lesquels sont employés. Le choix de la souris tient à la disponibilité commerciale de lignées transgéniques d'Alzheimer, aux outils déjà validés chez cette espèce et à une durée de vie que le porteur juge adaptée au projet.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle d'une protéine d'intérêt dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs notés EU1 et EU2.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue sera prélevée. Les animaux adultes seront soumis à quatres tests comportementaux qui durent chacun environ 1 semaines. Les animaux seront mis au repos pendant une semaine entre chaque test. Ces tests permettent de mesurer les capacités mémorielles des animaux et seront réalisés dans l'EU2. Les élevages se dérouleront dans l'EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront développer une légère douleur lors des biopsies pour le génotypage et des effets indésirables au cours des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indésirables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Des effets indésirables liés aux troubles cognitifs se développant à partir de 4 mois peuvent aussi apparaitre.

Devenir

Les animaux sans génotypes d’intérêt pour le projet sont mis à mort. Les animaux ayant les bons génotypes seront mis à mort après les tests comportementaux, à l'age de 8 mois au plus tard, pour éviter les souffrances liées à leur phénotype dommageable exprimé à partir de 12 mois.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle d'une protéine inhibitrice de protéase dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Des tests statistiques précis permettront de s'assurer de la significativité des résultats et un calcul de puissance a permis de dimensionner les groupes expérimentaux.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé durant les biopsies pour génotypage et les phases d'expérimentation. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Durant le transfert des animaux entre les deux EU, les animaux seront transportés dans des boites de transports du type safebox contenant litière et enrichissement, elles-mêmes placées dans des sacs opaques à la lumière pour limiter le stress des animaux.

Choix des espèces

Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie, tests comportementaux). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 mois seront utilisées. A cet âge, les souris ont des défauts cognitifs détectables par des tests comportementaux et qui seront eventuellement modulés par l'absence ou la surexpression de notre protéine d'intérêt.

Les femelles superovulées sont tuées pour qu'on récupère leurs embryons, les femelles porteuses le sont après le sevrage des petits. 16 625 animaux non-humains vont être utilisés, 15 950 souris et 675 rats, 12 625 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 4 000 un niveau modéré. Ils reçoivent jusqu'à deux injections d'hormones puis une à deux injections supplémentaires, et subissent une chirurgie utérine de trente minutes sous anesthésie, avec gêne et grattage possibles les deux à trois jours suivant le réveil. Le projet couvre l'activité d'un plateau technique qui crée, décontamine et archive des lignées génétiquement modifiées pour d'autres équipes, sans question scientifique propre à ces 16 625 animaux.

Objectifs

Notre demande d’autorisation de projet comprend l’ensemble des activités de notre plateau : - La création de modèles souris et rats génétiquement modifiés. - La décontamination de lignées en utilisant la réimplantation d'une cellule fécondée dans des mères porteuses saines par microchirugie sous anesthésie générale. - L’archivage de lignées de souris et de rats congelés pour assurer leur pérennité au bénéfice de la communauté scientifique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de pouvoir développer de nouveaux modèles de souris et de rats génétiquement modifiés reproduisant les pathologies humaines et de sauvegarder les modèles déjà créés dans les projets de recherche utilisant l’expérimentation animale afin de réduire le nombre d'animaux vivants et de permettre les échanges de modèles entre les chercheurs.

Procédures

Au maximum, injections intrapéritonéales d'hormones 2 fois de moins de 1 minutes chaque. Injections sous cutanées et intrapéritonéale de moins de 1 minutes chaque 1 à 2 fois et chirurgie utérine (30 min) 1 fois .

Impact sur les animaux

Un léger stress et une douleur légère de courte durée pourraient être ressentis lors de l'injection intrapéritonéale d'anesthésique. Douleur légère liée à l’injection d'antiinflammatoire et d'anesthésique et stress léger lié à l’anesthésie gazeuse et l’hypothermie induite. Les animaux après le réveil de la chirurgie et dans les 2-3 jours suivant pourraient présenter une gêne ou grattage post opératoire. L'animal étant isolé pourrait ressentir du stress au réveil.

Devenir

> Les femelles donneuses superovulées et les femelles receveuses après le sevrage des petits seront mises à mort.

Remplacement

Le transfert d'embryons utilisé pour les différents axes de ce projet ne peut être substitué par des méthodes alternatives. Avant d'envisager une création de lignée les chercheurs seront encouragés à trouver des modèles cellulaires ou modèles animaux déjà existants.

Réduction

Compte tenu de notre expérience et de celle des collègues du domaine, le nombre de femelles superovulées et mises à mort sera réduit au maximum pour l'obtention du nombre d'embryons précoces attendus : 6 à 8 femelles souris, 2 à 4 rattes par lignée. Le nombre de femelles porteuses dépendra du nombre d'embryons obtenus entre 1 et 3 femelles réimplantées par lignée. La congélation des lignées en embryons notamment en lots expérimentaux quand cela est possible permettra d'optimiser le nombre d'accouplements nécessaires à la production d'animaux vivants

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans les cages de surface réglementaire selon l'espèce avec les enrichissement disponibles et avec des congénères. L'intervention chirurgicale se fait sous anesthésie générale avec injection d'un antidouleur en pré et post opératoire. Après la chirurgie ou durant les premières semaines de vie des souris et rats pouvant présenter des phénotypes dommageables potentiels, une surveillance sera mise en place avec des points limites précis, des arbres décisionnels et des critères d’arrêt des souffrances.

Choix des espèces

Un grand nombre de modèles animaux reproduisant les mutations des maladie humaines sont disponibles chez la souris et de plus en plus chez le rat. Les techniques de transfert d'embryons, congélation et manipulation génétiques dans ce cadre doivent donc se faire dans ces espèces. Les femelles donneuses d'embryons seront stimulées par des hormones ovariennes. Selon notre expérience et celle de nos collègues dans le domaine, les hormones sont plus efficaces si on utilise des femelles donneuses d'embryons à l'âge prépubère (4 à 6 semaines) pour les souris et à l'âge pubère (2 à 3 mois) pour les rattes. Les femelles reçeveuses seront en âge de procréer soit 2 à 5 mois pour les 2 espèces.

Une injection quotidienne du cinquième au vingt et unième jour de vie, puis une injection de facteur inflammatoire dans une patte arrière: c'est le sort de chacune des 3 200 souris expérimentales de ce projet sur le syndrome de l'X fragile, auxquelles s'ajoutent 350 reproductrices amputées du bout de la queue pour génotypage. Toutes sont tuées à l'issue, 3 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 350 un niveau léger. S'y ajoutent des tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique provoquant une douleur qui peut durer jusqu'à une heure, et 72 heures d'isolement visuel et olfactif pour mesurer l'activité jour-nuit. Le porteur prévoit de tuer sur le champ tout animal montrant paralysie, vocalisations ou convulsions, et explique qu'analgésiques et anesthésiques restent exclus d'un protocole dont la douleur est l'objet d'étude.

Objectifs

Le syndrome X fragile (FXS) est une maladie neurodéveloppementale, cause la plus fréquente (1/4 000 hommes et 1/7 000 femmes) de l'autisme avec retard mental héréditaire. Il est dû à une mutation sur le chromosome X qui entraîne l’absence de la protéine FMRP qui contrôle de nombreuses fonctions dont la quantité et la localisation de nombreuses protéines cellulaires dans les neurones. En clinique humaine, comme dans la souris génétiquement modifiée modèle de la pathologie, le FXS est associé à des troubles des comportements socio-cognitifs et sensori-moteurs, et à des défauts cellulaires de morphologie et de plasticité synaptique des neurones. Selon le génotype, on pourra distinguer des individus atteints (hommes et les femmes), mais aussi des femmes porteuses faiblement ou non symptomatiques. In vivo, l'inhibition pharmacologique d'enzymes particulières produit un phénomène de "sauvetage" des défauts sociaux-cognitifs des souris transgénique modèles de la pathologie humaine. Dans une perspective thérapeutique chez l'humain, ce projet a pour objectif de tester l'efficacité d'un traitement chronique précoce par des inhibiteurs pharmacologiques de ces enzymes dans l'enfance des souris modèle du FXS, sur les troubles sensori-moteurs caractéristiques de la pathologie et associés aux troubles socio-cognitifs. Quatre inhibiteurs seront testés, dont certains développés en collaboration, présentant des propriétés pharmacologiques différentes et ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Sur le plan de la recherche fondamentale, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes neuronaux moléculaires et les voies de transduction dans les fonctions sensorielles et sensori-motrices. Sur le plan de la recherche appliquée et clinique, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les symptômes associés au syndrome X Fragile et de proposer une nouvelle cibles thérapeutiques. Avant de proposer de tester de nouveaux composés chez l'homme, il faut en valider les effets sur un modèle de souris génétiquement modifié qui reproduit fidèlement les symptômes comportementaux et neuro-anatomiques des individus atteints de FXS.

Procédures

Les souris reproductrices (350 souris) subiront une ablation du bout de queue pour génotypage. Toutes les souris expérimentales (3200 souris) subiront un traitement chronique P5-P21 (de 5 à 21 jours après la naissance) par injection quotidienne (30 sec /souris/jour pendant 15 jours), ainsi qu'un prélèvement sanguin par veine caudale sous contention (5 min), une injection intraplantaire (30") dans une patte arrière et pour la moitié une anesthésie chimique (5 min), un prélèvement sanguin sous anesthésie (1 min) avant euthanasie (5 min), alors que l'autre moitié subira une anesthésie gazeuse avant euthanasie (5 min).

Impact sur les animaux

Bien que rares, des inflammations ou infections pourront se développer aux points de prélèvements (queue) et d’injections. Le traitement chronique sur les souriceaux (P5-P21) peut entrainer une dégradation de l'état général qui constituera un point limite. Les gestes de contention et les tests d'interaction sociale, les tests sensori-moteurs et les tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique non invasifs peuvent induire du stress, qui sera néanmoins réduit (nuisance modérée) par l’habituation préalable. Un isolement visuel et olfactif relatif de 72h sera nécessaire pour mesurer les variations d’activité durant le cycle jour-nuit. Pendant les tests comportementaux de sensibilité cutanée, une douleur cutanée transitoire ou prolongée (max 1h) sera ressentie sur la queue ou une patte arrière.

Devenir

Les souris sont génétiquement modifiées et ne peuvent être disséminées dans la nature pour adoption. De plus, elles ont subi un traitement pharmacologique, ainsi que des tests comportementaux invasifs avec injections de facteurs inflammatoires. Elles ne peuvent donc pas être conservés pour une réutilisation. Elles seront donc mises à mort en fin de protocole et permettront des prélèvements sanguins et tissulaires nécessaires aux résultats expérimentaux.

Remplacement

Les expériences de comportement et de pharmacologie chez la souris sont nécessaires pour avoir accès à la complexité physiopathologique de l'intégration du message douloureux et des processus sensori-moteurs. Elles permettent aussi d'utiliser des souris génétiquement modifiées, transposition directe de la pathologie humaine chez l'animal. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques.

Réduction

L‘objectif de Réduction a été pris en compte car le nombre total de souris (3200) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (15 souris/condition + une sécurité optionnelle de 5 souris/lot pour compenser l’exclusion de certains animaux en cours d’étude selon les points limites prévus). Toute expérience rendue inutile par des résultats obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique mondiale permanente) ne sera pas conduite. En fonction de leur génotype, de leur sexe et de leur traitement pharmacologique les lots de souris seront comparés grâce à des tests statistiques adaptés à la distribution statistique des données et au type de comparaison choisies (comparaison sur le même animal ou sur des animaux différents). Le design des méthodes de reproduction a été optimisé pour pouvoir produire sur les 5 ans de la durée du projet les souriceaux les deux génotypes mâles et des trois génotypes femelles (dont des animaux normaux) qui devront être comparés (la pathologie X-Fragile est causé par une mutation sur le chromosome X). Le projet s’étalant sur 5 ans, le nombre réel des reproductions et des animaux reproducteurs pourra être réduit en fonction des portées (nombre des bébés, sexes et génotypes) déjà produits et étudiées auparavant. Les animaux reproducteurs pourront être aussi utilisés pour produire des souris dans le cadre d’autres projets du laboratoire, ou pour renouveler les lots de reproducteurs, et seront mis à mort à la fin de leur période de reproduction pour permettre des prélèvements de tissus post-mortem.

Raffinement

Pendant les expériences, un suivi quotidien sera réalisé par contrôle visuel de l'état de l'animal et de ses sites d'injection ou de prélèvement, ainsi qu’un contrôle expérimental (comportement mesuré par le test). Le poids de chaque souriceau sera relevé et, en cas de stagnation ou de décroissance de la prise de poids sur deux jours, le souriceau sera euthanasié. Les risques de rejet et de cannibalisme liés à la manipulation des souriceaux sera limité en mettant les souriceaux en contact avec l’urine de la mère avant d’être remis dans le nid. Dans le cadre de la prise en compte de leur souffrance, les animaux adultes seront habitués aux tests préalablement afin de réduire leur stress. Chaque test/intervention sera séparé au minimum d’une semaine du suivant. Si un animal est blessé ou présente des signes d’infection au site d’injection ou de prélèvement, nous l'isolerons et le soignerons jusqu'à guérison (si après une semaine l'animal est encore blessé, il sera mis à mort). Tout animal qui présenterait des signes de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement anormal (prostration, apathie…) ou d‘une pathologie quelconque serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans les protocoles qui ont pour objet d’étude la douleur.

Choix des espèces

Travailler avec des souris permet de comparer le comportement « normal » ("sauvage") avec le modèle transgénique du FXS (souris Fmr1-KO), et d'étudier les défauts de comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensori-moteurs que l'on peut retrouver chez les patients. D'autre part, de nombreux modèles comportementaux de douleur et de motricité font actuellement référence chez la souris dans le type d’étude que nous souhaitons mener. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques. Le traitement pharmacologique chronique sera réalisé de P5 à P21 (de 5 à 21 jours après la naissance), correspondant à l'enfance chez la souris, où le processus neurodéveloppemental est crucial. Les tests sensori-moteurs et sociaux seront conduits à 1 mois à l’adolescence, une période clé du développement de l’autisme, puis de 8 à 20 semaines afin d'évaluer le bénéfice du traitement pharmacologique précoce à l’âge adulte.

Injectées d'un virus adéno-associé dès l'âge de deux à quatre jours, 300 souris grandissent jusqu'à la maturité musculaire, passent trois jours d'habituation à la course puis une heure de course continue. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 250 d'entre elles et modéré pour 50. La force de contraction du muscle est ensuite mesurée in situ, geste invasif pratiqué sous anesthésie générale, pour étudier deux gènes exprimés dans la zone qui relie le muscle au tendon. Les souris ne se réveillent pas de cette anesthésie et sont tuées pour que leurs muscles soient prélevés, le porteur écrivant qu'il ne les réutilisera pas, ne les remplacera pas et ne les fera pas adopter.

Objectifs

La jonction myotendineuse (JMT) est un élément essentiel du muscle squelettique qui relie le muscle au tendon. Un dysfonctionnement de la jonction myotendineuse peut endommager le tissu musculaire. Cependant, la compréhension de la JTM reste très limitée. Nous étudions ici le rôle de 2 gènes cibles, dont nous avons découvert précédemment qu'il n'était exprimé que dans les noyaux musculaires au niveau de la JMT.

Bénéfices attendus

Cette recherche permettra d'approfondir notre compréhension de la JMT et de la biologie musculaire. Jusqu'à présent, nous savons que les noyaux musculaires au niveau de la JMT expriment des groupes distincts de gènes, qui jouent un rôle important dans son établissement. Cependant, on ne sait pas si les processus qui contrôlent la stabilité de l'ARN messager ou les taux de synthèse des protéines sont également importants. Il a été démontré que nos 2 gènes cibles sont importants pour de tels processus dans d'autres organismes et tissus. Par conséquent, nos résultats impliquent que la stabilité de l'ARN messager et la synthèse des protéines sont également contrôlées de manière critique dans la zone de la JMT.

Procédures

1. Injection intrapéritonéale de MyoAAV (Virus adeno associés musculaires): Il s'agit d'interventions très rapides. L'injection ne dure que quelques secondes et l'intervention sur chaque souris ne prendra que quelques minutes. Ensuite, elles retourneront dans leur cage d'origine. 2.Le programme d’exercice est réalisé une seule fois, il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation suivi d’un jour de course de 60 min. 3.La mesure de la force de contraction musculaire in situ est un test invasif réalisé sous anesthésie générale. Après la procédure, les souris encore sous anesthésie seront euthanasiées.

Impact sur les animaux

L'injection intrapéritonéale (IP) est une technique largement utilisée et n'entraîne qu'une douleur liée à l'aiguille. L'AAV (virus adeno-associé) est un outil largement utilisé pour la délivrance de gènes et présente très peu d'effets secondaires. Il est important de noter que nous utilisons un AAV sélectif pour le muscle squelettique et qui présente donc moins de toxicité que d'autres types d’AAV. La délétion de nos 2 gènes cibles pourrait entraîner des faiblesses musculaires, que nous ne pouvons pas prédire pour le moment. Nous serons donc particulièrement attentifs à l’apparition de phénotypes chez les animaux injectés avec les AAV, et les traiteront en conséquence.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

La JMT ne peut pas être reproduite dans des cellules en culture car elle nécessite la présence de muscles et de tendons matures. Par conséquent, l'expérimentation animale est essentielle et ne peut être évitée.

Réduction

Nous effectuerons l'injection de virus adeno-associés (AAV) à des nouveau-nés âgés de 2 à 4 jours et évaluerons longitudinalement la fonction musculaire jusqu'à l’âge d’efficacité optimale de l’infection, ce qui réduit considérablement le nombre d'animaux utilisés. De même, l'utilisation d'AAV au lieu de modèles génétiques réduit le nombre total d'animaux utilisés pendant la durée du projet. Avant d'introduire nos séquences cibles grâce aux AAV chez les animaux in vivo, nous confirmerons leur efficacité dans des cellules en culture. Plusieurs tests fonctionnels seront effectués chez la même souris. La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes. Il a été déterminé que le nombre optimal de souris par groupe est de 20 (10 x 2 sexes) pour les expériences de forces de préhension et la mesure de la force contractile in situ (Aurora), de 10 (5 x 2 sexes) pour l’histologie et de 10 (5 x 2 sexes) pour l’exercice excentrique afin d'obtenir une différence statistiquement significative lorsqu'un phénotype apparaît. Les tests statistiques appropriés seront utilisés pour analyser les résultats et pour comparer les différents groupes.

Raffinement

Après les procédures expérimentales, les souris seront suivies quotidiennement. Le suivi de nos souris comprend une observation visuelle du comportement général (perte de poids, apathie, yeux fermés) et de l’apparition d’éventuels problèmes de locomotion. Au cours de notre projet, tout signe de douleur sera pris en charge par des mesures appropriées en fonction du niveau de douleur observé (0 à 3). Si une douleur est présente, elle sera traitée soit par l’administration d’un analgésique, soit par l’euthanasie prématurée des animaux concernés. Niveau 0 : aucune douleur, aucun inconfort détecté. Niveau 1 : douleur légère ou inconfort au niveau d’un membre traité dans ce cas les souris seront contrôlées quotidiennement. Niveau 2 : la douleur est présente dans ce cas un analgésique sera administré à la souris. Niveau 3 : douleur intense, dans ce cas un analgésique plus puissant sera administré toutes les 12 heures et les animaux seront euthanasiés prématurément si nécessaire pour éviter une douleur chronique. Pour les souris qui ont des difficultés à manger de la nourriture solide (croquettes), de la nourriture en gel sera placée dans la litière de la cage. La mesure de la force contractile in situ sera effectuée sous anesthésie générale afin d'éviter toute gêne ou douleur durant l’expérience. Les souris anesthésiées seront placées sur une plaque chauffante pour éviter l'hypothermie et un gel sera appliqué pour éviter toute sécheresse oculaire. Les animaux seront euthanasiés avant leur réveil.

Choix des espèces

De récents travaux in vitro de notre équipe ont permis d’identifier 2 gènes cibles comme marqueurs de la JMT. Cette jonction ne peut pas être reproduite dans des cellules en culture car elle nécessite la présence de muscles et de tendons matures. La création de lignées mutantes grâce à l’utilisation d’AAV spécifique du muscle est bien établi chez la souris et permet d’utiliser moins d’animaux que l’établissement de lignées par les méthodes de manipulations génétiques classiques. La souris est donc le choix le plus approprié. Pour administrer efficacement l'AAV à l'ensemble du corps au stade le plus précoce, il faut utiliser des nouveau-nés âgés de 2 à 4 jours. Cette méthode est bien établie dans le domaine de la thérapie génique. Les tests seront effectués après la fin de la maturation musculaire, c’est-à-dire après l’âge de 8 semaine. Une étude pilote (procédure 1) permettra de déterminer cet âge avec précision, âge auquel l’infection de l’AAV muscle spécifique, et donc de la délétion de nos 2 gènes cibles, sera optimale. Les souris mâles et femelles ont des mesures par défaut différentes dans nos essais. Nous utiliserons donc les deux sexes. En outre, en raison de notre conception expérimentale consistant à injecter les AAV à des nouveau-nés de 2 à 4 jours, nous ne pouvons pas distinguer le sexe à ce stade.

Six mesures de glycémie sur une goutte de sang obtenue en coupant un millimètre du bout de la queue au scalpel: 50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 42 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 8 un niveau léger. Une maladie rénale chronique est induite chez 36 d'entre elles par un régime enrichi en adénine pendant quatre semaines, avec des gavages cinq jours sur sept qui peuvent irriter l'œsophage si l'eau de boisson se révèle inappétente, et vingt-quatre heures passées à deux en cage métabolique. Le projet cherche à mesurer la toxicité rénale de deux molécules issues de la dégradation des acides aminés, jamais testées jusqu'ici dans ce contexte. Le porteur reconnaît que la souris a "certaines limites par rapport à la physiologie humaine" avant de la retenir quand même, l'âge de huit semaines étant choisi pour sa bonne tolérance au régime à l'adénine.

Objectifs

La maladie rénale chronique (MRC) touche environ 3 millions de Français. Elle se manifeste par un mauvais fonctionnement des reins, ce qui entraîne l'accumulation de substances dans le corps qui ne sont plus éliminées correctement. Ces substances peuvent être toxiques et contribuer à divers problèmes de santé associés à la maladie. Une attention particulière est portée à certaines molécules issues de la dégradation des acides aminés. Des études récentes chez les humains ont montré que ces molécules sont liées à la progression de la MRC. Cependant, leur effet direct sur le fonctionnement des reins n’a jamais été étudié. L'objectif de ce projet est d’évaluer la toxicité de deux molécules (appelées molécules 1 et 2) sur les reins de souris. Le projet sera divisé en deux parties : (1) La première partie vérifiera si les molécules 1 et 2 peuvent être administrées via l’eau de boisson des souris, ce qui permettrait d’éviter les gavages ; (2) La seconde partie mesurera la toxicité de ces molécules chez des souris atteintes de MRC. Plusieurs paramètres seront analysés pour évaluer leur impact sur le fonctionnement rénal et le métabolisme général.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à mieux comprendre comment les molécules issues de la dégradation des acides aminés affectent la progression de la maladie rénale. Si ces molécules sont liées à une aggravation des problèmes rénaux, il serait possible d'utiliser des inhibiteurs pour réduire leur production. Cela pourrait offrir de nouvelles options de traitement pour ralentir la progression de la maladie chez les humains.

Procédures

Première partie : Les 8 souris recevront de l’eau normale pendant 3 jours, suivis de 3 jours d’eau contenant les molécules à tester. Pendant ces 6 jours, toutes les souris seront pesées quotidiennement. Si la consommation d'eau diminue en présence des molécules, un nouveau test sera effectué : les 8 souris recevront de l’eau normale pendant 3 jours, puis de l’eau avec un édulcorant et les molécules pendant 3 jours. Elles seront pesées tous les jours durant cette période. Deuxième partie: Pour induire la maladie rénale, 36 souris recevront une nourriture riche en adénine pendant 4 semaines, avec des pauses chaque week-end où elles recevront des croquettes normales. Les 6 autres souris auront une alimentation normale pendant cette période. Pendant 4 semaines, 18 souris auront de l’eau du robinet, 12 souris recevront de l’eau du robinet supplémentée avec la molécule 1, et 12 souris recevront de l’eau du robinet avec la molécule 2. Si les résultats de la 1ère partie montrent que les molécules 1 et 2 ne peuvent pas être administrées via le biberon, elles seront administrées par gavage. Dans ce cas, pendant 3 semaines (5 jours/semaine), 18 souris recevront de l’eau du robinet par gavage, 12 souris recevront la molécule 1 par gavage, et 12 souris recevront la molécule 2 par gavage. Chaque administration sera faite sur un animal vigile et durera 30 secondes, y compris la contention. Tous les 42 animaux subiront un test de tolérance au glucose. Le matin à 8h, ils seront mis à jeun pendant 6 heures pour mesurer la glycémie à jeun (les 6 heures de jeune permettent d’équilibrer les glycémies et de mesurer correctement la réponse de l’organisme au glucose). Une incision de - de 1 mm sera réalisée à l’extrémité de la queue avec un scalpel, et une goutte de sang sera déposée sur une bandelette pour mesurer la concentration de glucose. Ensuite, une injection de glucose sera faite dans l’abdomen, et la glycémie sera mesurée en prélevant une goutte de sang à la queue à différents moments après l’injection (15, 30, 45, 60 et 90 min). Les 42 souris seront également placées, 2 par 2, dans des cages métaboliques pendant 24h pour recueillir leurs urines et leurs fèces. À la fin du traitement, les 42 souris seront anesthésiées par une injection dans l’abdomen (durée : 15 sec, contention incluse) pour effectuer un dernier prélèvement sanguin (20 sec). Les souris anesthésiées seront immédiatement mises à mort après le prélèvement (2 sec).

Impact sur les animaux

La première partie du projet pourrait causer des nuisances légères. Ajouter des métabolites dans l’eau de boisson peut réduire la consommation d'eau, entraînant une légère déshydratation et un inconfort pour les animaux. De plus, les pesées quotidiennes peuvent provoquer du stress. La seconde partie pourrait entraîner des nuisances modérées. Une alimentation riche en adénine peut diminuer la consommation de nourriture et ralentir la prise de poids des souris pendant les 4 semaines d'induction de la maladie rénale chronique (MRC). Si les métabolites doivent être administrés par gavage, cela nécessitera une contention des animaux chaque jour pendant 3 semaines (sauf samedi et dimanche), ce qui peut être stressant, même si la manipulation dure moins d'une minute. Les gavages répétés peuvent irriter l'œsophage et causer une douleur. Pour le test de tolérance au glucose, une petite incision à la queue sera faite pour prélever une goutte de sang afin de mesurer la glycémie. Cette incision sera réalisée une seule fois au début du test, suivie de six prélèvements de sang à différents moments. Une injection de glucose sera également faite ce qui peut causer du stress et une douleur. Pour recueillir les urines sur 24 heures, les souris seront placées par deux dans des cages métaboliques, ce qui peut également les stresser. Avant le prélèvement final de sang, les souris recevront une injection d'anesthésiques, qui peut provoquer de la douleur. Il est important de noter qu’aucun comportement anormal n’a été observé lors de protocoles similaires.

Devenir

Les 50 animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus et répondre aux questions scientifiques.

Remplacement

Les mécanismes de toxicité des molécules issues de la dégradation des acides aminés sont complexes et impliquent plusieurs organes. Ni la modélisation informatique ni les études en laboratoire ne peuvent répondre à cette question. Une étude chez l'Homme est impossible à ce stade, car il n'existe pas de moyens non invasifs pour étudier en détail la fonction rénale et le métabolisme. L'utilisation d'un modèle animal est donc actuellement indispensable pour étudier l'impact de ces molécules sur la progression de la MRC.

Réduction

Les molécules étudiées dans ce projet n’ont jamais été testées dans le cadre de la MRC. Première partie du projet : Le nombre de souris a été réduit au minimum pour tester l’appétence de l’eau contenant les molécules, avec 4 souris par molécule. Chaque groupe est son propre contrôle pour éviter de multiplier les groupes inutilement. Étant donné le caractère exploratoire de cette phase, un calcul formel de l’effectif n’est pas possible. Deuxième partie du projet : Le nombre de souris par groupe a été déterminé à l'aide d'un logiciel, basé sur des données de précédents protocoles avec des souris atteintes de MRC. Un effectif de 12 souris par groupe est nécessaire pour obtenir des résultats significatifs, tandis que 6 souris suffisent pour le groupe contrôle non malade. Un maximum de tissus sera collecté lors de la mise à mort et conservé, afin de répondre à d'éventuelles nouvelles questions et d'éviter de répéter inutilement l'expérience. Ces échantillons pourront également être partagés avec d'autres équipes.

Raffinement

Première partie du projet : Pour éviter l'administration des molécules par gavage, cette phase testera leur administration via l’eau de boisson. Les animaux seront surveillés quotidiennement, avec un suivi de leur prise d’eau et de leur poids. Si nécessaire, un édulcorant sera ajouté à l’eau pour améliorer l’appétence et garantir une hydratation optimale. Deuxième partie du projet : Une méthode non chirurgicale sera utilisée pour induire la MRC, évitant ainsi l’anesthésie et les douleurs. Le régime riche en adénine sera interrompu chaque week-end pour limiter la perte de poids et assurer le bien-être des animaux. Si le gavage est nécessaire (selon les résultats de la première phase), la durée du traitement sera réduite d’une semaine et le gavage se fera uniquement en semaine pour minimiser le stress et les irritations œsophagiennes. Les concentrations des solutions seront optimisées pour limiter les volumes administrés. Pour la collecte d’urine, les souris seront placées par paires dans des cages métaboliques pour limiter le stress. Une période d’habituation de 15 minutes sera prévue un ou deux jours avant. Concernant le test de sensibilité au glucose, une seule petite incision sera faite au bout de la queue pour recueillir une goutte de sang. Les souris resteront dans leur cage d'origine, et la glycémie sera surveillée jusqu'à son retour à la normale. Les animaux seront observés trois fois par semaine pendant l'induction de la MRC, deux fois par semaine pendant le retour à un régime normal, et cinq jours par semaine lors des administrations de molécules. Ils seront pesés deux fois par semaine tout au long de cette phase. Le prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie, et tous les gestes seront effectués par une personne expérimentée pour minimiser le stress. Des point limites prédéfinis, prédictifs et précoces ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Lors de protocoles précédents similaires, aucun signe de mal-être, douleur ou souffrance n’a été observé.

Choix des espèces

Bien que la souris ait certaines limites par rapport à la physiologie humaine, elle reste un excellent modèle pour étudier la maladie rénale et la toxicité de certaines molécules associées. Sa physiologie est proche de celle de l'humain, ce qui permet de reproduire les altérations de la fonction rénale observées chez les patients. Des souris de 8 semaines seront utilisées, car à cet âge, elles tolèrent bien le régime riche en adénine, qui permet le développement d'une maladie rénale modérée.

Entre dix et quinze injections en deux à trois semaines, deux prélèvements sanguins de trois minutes puis un troisième sous anesthésie générale, telle est la part de chaque souris dans ce projet. 1 400 souris vont être utilisées, 1 040 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 360 un niveau modéré, toutes tuées pour prélèvements sanguins et tissulaires. L'objet déclaré est de suivre les premières étapes de la réponse immunitaire dans le tube digestif après une infection, en vue de définir de nouvelles stratégies de vaccination orale. Les substances injectées, censées mimer des infections virales, bactériennes ou parasitaires, ne sont jamais nommées, et le porteur se borne à écrire qu'elles ne sont pas décrites comme ayant des effets douloureux.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de comprendre quelles sont les premières étapes de mise en place d’une réponse immunitaire adéquate au sein du tube digestif après infection par des agents pathogènes tels que des virus, des bactéries ou des parasites. Pour répondre à cette question, nous utiliserons des modèles murins qui seront traités avec des substances capables de mimer de telles infections, afin de mesurer l’efficacité de la mise en place des réponses immunitaires. Les données obtenues seront par la suite exploitées pour définir de nouvelles stratégies vaccinales.

Bénéfices attendus

Nous attendons des résultats prometteurs, permettant une meilleure compréhension des toutes premières étapes de la mise en place d'une réponse immune adaptée à différents agents pathogènes, dont certains sont impliqués dans le développement des cancers de l’estomac. De plus, nos données pourraient permettre de définir une nouvelle stratégie de vaccination orale, ciblant de manière plus spécifique certaines cellules du tube digestif.

Procédures

Les animaux recevront entre 10 et 15 injections de substances sur 2 à 3 semaines (l’injection durant moins d’une minute), 2 prélèvements sanguins de 3 minutes, un prélèvement sanguin sous anesthésie générale (d’une durée de 5 min).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis aux nuisances suivantes : contention lors des phases injection de substances et prélèvement sanguin, générant un stress et une douleur de manière ponctuelle équivalente à une piqure d’aiguille, administration de molécule via une sonde gastrique. Les traitements appliqués ne sont pas décrits comme ayant des effets douloureux.

Devenir

Les individus seront euthanasiés pour prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Les questions posées dans le cadre de ce projet (interactions entre types cellulaires et organes différents) impliquent l’utilisation de modèles murins reflétant au mieux la physiologie d’un point de vue intégrée. La réponse aux questions soulevées dans ce projet ne peut en aucun cas être abordée par un seul modèle de substitution.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en nous appuyant sur les résultats précédemment obtenus, afin de nous permettre d’obtenir des données interprétables. Notre stratégie pour réduire le nombre d’animaux consistera à engager de petits groupes d’individus, nous permettant de valider ou d’invalider nos hypothèses de travail le plus rapidement possible. Si une de nos pistes de travail ne s’avère plus pertinente, les expériences associées seront abandonnées, réduisant de fait le nombre d’animaux engagés en procédures.

Raffinement

Notre stratégie expérimentale consiste en un suivi des individus engagés dès le début des phases d’expériences, sous le contrôle des zootechniciens et de la cellule du bien-être animal. Des points limites suffisamment prédictifs ont été définis et associés à une grille de score objective. Toutes augmentations de ce score entraineront un suivi accru des individus en question, et l’atteinte du score maximal l’arrêt immédiat de l’expérimentation. Les animaux seront élevés dans un milieu enrichi, en respectant les groupes sociaux, et seront traités avec des anesthésiques et des analgésiques lors des phases de prélèvement sanguin.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, puisque disposant d’un système digestif et immunitaire présentant de nombreuses similitudes avec l’homme. De plus, il existe un grand nombre de lignée de souris génétiquement modifiées nous permettant de comprendre quels rôles peuvent avoir certains gènes d’intérêts. Les animaux seront étudiés entre 6 et 24 semaines d'âge, dès lors que le système digestif est mature.

Injectées de cellules tumorales dans les deux flancs sous anesthésie, ou dans une veine de la queue pour les cellules leucémiques, 1 980 souris portent ensuite des tumeurs pendant deux à trois semaines. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour 720 d'entre elles et modéré pour 1 260, et toutes sont tuées pour que les tumeurs soient disséquées. S'y ajoutent jusqu'à huit traitements par injection intrapéritonéale ou gavage, dans un criblage CRISPR qui cherche les gènes de réparation de l'ADN rendant une tumeur sensible à l'immunothérapie. Le porteur qualifie l'injection sous anesthésie d'indolore et affirme que la croissance tumorale ne provoque que peu d'inconfort, tout en fixant comme point limite la souffrance manifeste, poil ébouriffé, prostration et isolement.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de déterminer précisément quels gènes de réparation de l’ADN impactent la sensibilité des tumeurs aux immunothérapies. Ces gènes seront ensuite étudiés pour comprendre comment ils impactent la sensibilité de la cellule tumorale à l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet devrait permettre d’améliorer l’utilisation des immunothérapies chez l’humain de deux façons : 1) en identifiant des marqueurs permettant de prédire la sensibilité des tumeurs à ces traitements pour mieux cibler les patients pouvant en bénéficier 2) en identifiant des potentielles cibles thérapeutiques permettant de rendre sensibles des tumeurs qui seraient naturellement résistantes à ces traitements.

Procédures

Les animaux subiront 2 injections sous cutanées dans les flancs sous anesthésie générale ou une injection intraveineuse sans anesthésie le premier jour puis certains animaux recevront des traitements en injection intraperitonéale (durée de quelques secondes) ou gavage oral au maximum 8 fois au cours de l’expérience.

Impact sur les animaux

Le projet nécessite d’injecter des cellules tumorales aux souris et d’autoriser la croissance de tumeurs pendant deux à trois semaines. Pour les cellules de tumeurs solides, les tumeurs seront injectées par voie sous cutanée de façon bilatérale dans les flancs des souris. L’injection se fera sur des animaux sous anesthésie générale et est donc indolore. La croissance tumorale au niveau des flancs ne provoque que peu d’inconfort chez les animaux qui ne présentent en général aucun signe de souffrance ou modification du comportement. Pour les cellules leucémiques, les cellules seront injectées par voie intraveineuse dans une veine de la queue sur des souris maintenues dans une cage de contention prévue à cet effet. La piqure pour l’injection entraine une douleur légère de courte durée. Dans le délai prévu avant la mise à mort des souris dans notre projet (2-3 semaines) les souris ne présentent en général pas de signes de souffrance (poil ébouriffé, isolement, prostration). L’injection des traitements se fera par injection intrapéritonéale et sera répétée à trois reprises pour chaque souris au cours de l’expérience. Cette intervention entraine une douleur légère de courte durée au moment de l’injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de pouvoir disséquer les tumeurs dans le but de les analyser.

Remplacement

Les immunothérapies étudiées dans ce projet ont un mode de fonctionnement complexe nécessitant un système immunitaire complet et fonctionnel ce qui ne peut pas être reproduit in vitro, justifiant l’utilisation d’animaux vivants. Certaines méthodes alternatives existent dont la mise en place de cribles génétiques in vitro en modèle cellulaire ou l’utilisation de modèles de type organoïde; cependant aucune de ces méthodes ne permet de prendre en compte la complexité du système immunitaire et de son action antitumorale telle qu’elle existe in vivo. Dès que possible les hypothèses seront testées au préalable in vitro à l’aide de techniques de biologie moléculaire ou de culture cellulaire afin de limiter l’utilisation d’animaux au strict nécessaire.

Réduction

Le criblage génétique mis en place dans ce projet nécessite d’injecter un nombre important de cellules tumorales. Par des expériences préalables nous avons optimisé le nombre de cellules tumorales à injecter par souris afin de pouvoir utiliser le minimum d’animaux possible. Pour chaque expérience de validation, nous nous baserons sur notre expertise ainsi que des raisonnements statistiques afin de déterminer le minimum d’animaux par groupe nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Dès que possible, de multiples paramètres seront testés sur les mêmes animaux afin d’en réduire le nombre utilisé.

Raffinement

Le délai de pousse tumorale avant mise à mort des animaux a été optimisé de manière à ce que les animaux ne montrent pas de signes de souffrance. Les animaux seront néanmoins suivis régulièrement et les animaux ayant atteints les points limites suivant seront mis à mort : - Souffrance manifeste (poil ébouriffé, prostration, isolement) - Taille de la tumeur atteignant le point limite Si besoin, des mesures supplémentaires permettant de limiter l’inconfort des animaux telles que la supplémentation avec du gel hydrique et l’utilisation de litière douce seront mises en place.

Choix des espèces

Le système immunitaire de la souris est très proche du système immunitaire humain et est bien caractérisé car c’est un modèle très fréquemment utilisé dans la recherche en immunologie. Il existe par ailleurs dans ce modèle de nombreuses souches génétiquement modifiées pour être immunodéprimées dont les souris qui seront utilisées dans notre projet. Les souris sont l’espèce la plus appropriée pour nous éclairer sur les mécanismes d’action des immunothérapies pour le traitement des cancers chez l’humain. Les animaux utilisés seront des animaux adultes ayant entre 6 et 10 semaines d’âge. Utiliser de jeunes adultes permet de s’assurer que le système immunitaire soit mature et fonctionnel.