Procédures modérées

Gavées chaque jour pendant quatre jours, puis injectées dans l'abdomen, puis saignées une ou deux fois à une semaine d'intervalle, 1 044 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur reconnaît qu'un gavage peut faire passer le liquide dans la trachée ou les poumons et provoquer une détresse respiratoire. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, pour prélever leurs fluides et leurs tissus et poursuivre l'analyse hors de l'organisme. Il écrit que la souris permet d'obtenir assez de "matériel" pour ces analyses et conclut qu'aucune autre espèce ne peut être utilisée.

Objectifs

Les cellules du système immunitaire inné appelées monocytes circulent dans le flux sanguin et peuvent infiltrer les tissus où elles se différencient en différentes sous-populations de cellules appelées macrophages. Ces différentes sous-populations de macrophages peuvent remplir différentes fonctions, en fonction de leur environnement local, telles que le nettoyage des cellules mortes. Le métabolisme des sucres peut jouer un rôle important dans les fonctions des monocytes et des macrophages. Les sucres peuvent notamment être utilisés pour modifier les protéines cellulaires et leurs fonctions. Différents types de sucres peuvent être attachés de différentes manières aux protéines et ainsi modifier leur fonction et celle des cellules dont ils font partis. Les résultats préliminaires suggèrent que ces modifications des sucres sur les protéines sont importantes pour la survie des macrophages. L'objectif du projet proposé est d'étudier l'effet de l'absence de deux enzymes différentes impliquées dans les modifications des sucres des protéines sur les fonctions des monocytes et des macrophages.

Bénéfices attendus

Presque aucune recherche n'a été effectuée pour étudier le rôle des sucres attachés aux protéines sur la fonction des monocytes et des macrophages. Les résultats préliminaires suggèrent que ces processus ont un impact sur la survie des macrophages. Ce projet permettra une première caractérisation du rôle de ces modifications de protéines par les sucres sur la fonction des monocytes et des macrophages. Une meilleure compréhension du rôle de ces processus dans la fonction des monocytes et des macrophages pourrait conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques qui impliquent les monocytes/macrophages dans un contexte de maladie.

Procédures

Au cours de ce projet les interventions réalisées sur animaux vigiles seront les suivantes : des gavages quotidiens pendant 4 jours (la durée de cet acte est de 20 secondes), une injection intrapéritonéale unique (environ 10 secondes), 1 ou 2 prélèvements de sang espacés d’une semaine (moins d'une minute par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des gavages répétés et lors d’un de ceux-ci une introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. Ils recevront également des injections intrapéritonéales et une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection.Ces procédures peuvent être source de stress et les injections et prises de sang peuvent provoquer une légère douleur

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever les fluides et tissus corporels en vue d'une analyse in vitro pour répondre aux objectifs scientifiques définis.

Remplacement

Pour répondre au besoin de remplacement, des études in vitro seront menées sur des lignées de cellules souches hématopoïétiques différenciées en macrophages au lieu de cellules primaires isolées d'animaux. Les données préliminaires qui constituent la base de ce projet ont été obtenues comme ça. Cependant, pour mieux comprendre le rôle des sucres attachés aux protéines sur la fonction des monocytes/macrophages, des études in vivo sont indispensables, car les études in vitro ne peuvent pas reproduire les interactions complexes entre les différents types de cellules présentes dans les différents organes.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, nous utiliserons pour les élevages des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.

Raffinement

Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’une injection intrapéritonéale, nous surveillerons l’aspect du site d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure . Les animaux seront hébergés dans une pièce à température et hygrométrie contrôlées avec un cycle jour/nuit de 12h. Chaque cage contiendra une tige en papier, un igloo et une brique de peuplier.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et d’en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions le rôle de la voie de biosynthèse de l'hexosamine dans le recrutement des monocytes et leur différenciation en macrophages. Des modèles génétiques déficients en différents composants de la voie de biosynthèse de l'hexosamine dans différentes populations de monocytes/macrophages sont disponibles. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée Nous utiliserons des animaux jeunes adultes (entre 6 et 12 semaines d’âge) dans l’ensemble des procédures, de façon à étudier des organismes stables, qui ne sont ni en développement ni en sénescence.

Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Des tumeurs du pancréas sont induites à la demande de chercheurs extérieurs et de clients, par une chirurgie de vingt minutes ou par une injection sous la peau. 1 740 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, certaines immunodéficientes, d'autres transgéniques développant spontanément la tumeur. Pendant quinze semaines, elles subissent jusqu'à deux examens d'imagerie par semaine sous anesthésie, jusqu'à vingt administrations de composés, des mesures au pied à coulisse et des prélèvements de sang sous la mâchoire, avec un risque de métastases hépatiques ou pulmonaires. 480 souris sont tuées à l'issue de la première procédure et 960 à l'issue de la seconde, 30 sont utilisées pour prélever les fragments tumoraux greffés aux suivantes, et 300 souris porteuses de tumeurs sont livrées à des clients qui poursuivent les travaux dans leurs propres locaux.

Objectifs

Ce projet a pour but de mettre en oeuvre, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des modèles de cancer du pancréas sur modèles souris et de les étudier par imagerie in vivo, à des fins de compréhension de mécanismes fondamentaux ou pour l'évaluation de nouveaux médicaments. Ces types de modèles suscitent un intérêt grandissant pour l'étude et la prise en charge du cancer du pancréas. En 2018, le cancer du pancréas était responsable de plus de 95 000 décès chaque année dans l’UE. La maladie est à présent la troisième cause de décès par cancer dans l’UE, derrière le cancer du poumon et le cancer colorectal. Seuls 3 % des patients diagnostiqués d’un cancer du pancréas survivent cinq années. Il s’agit du seul cancer pour lequel aucune amélioration n’a été constatée concernant la survie en 40 ans.

Bénéfices attendus

Le projet représente un ensemble d’études types qui pourront viser à comprendre des mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou à évaluer l'efficacité thérapeutique de nouveaux traitements.

Procédures

Induction de cancer pancréatique : 1 acte par animal soit par chirurgie (20 minutes max d’intervention sous anesthésie gazeuse) soit sans chirurgie : injection sous cutanée (quelques secondes sous anesthésie gazeuse). Suivi des animaux : Pesée 1 fois/semaine minimum (30 seconde /animal vigile) pendant 15 semaines maximum. Mesure au pied à coulisse pour le modèle sous-cutanée : 3 fois/semaine maximum (30 seconde /animal) pendant 15 semaines maximum sur souris anesthésiée (anesthésie gazeuse). Suivi par imagerie : au maximum 2 examens non invasifs par semaine pendant 15 semaines sous anesthésie gazeuse. Injection d’antalgique et d’anti inflammatoire en sous cutané : 4 injections sur souris vigile en 24h max. Pour un traitement : au maximum 5 administrations par semaine ou 20 administrations sur 15 semaines sur souris vigile par voie orale ou, intrapéritonéale ou voie sous cutanée ou voie intraveineuse. Prélèvement de sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire en 3 fois sur 24h ou en 1fois/jour sur 5 jours.

Impact sur les animaux

Les dommages attendus sont liés en premier lieu à l‘induction des tumeurs soit en sous-cutanée (nuisance légère) soit en orthotopique par chirurgie (nuisance modérée). Puis ils sont dus au développement d'une tumeur cancéreuse soit en sous cutanée (Nuisance légère) soit au niveau du pancréas (nuisance modérée avec éventuellement à l'apparition de foyers tumoraux secondaires (métastases hépatiques ou pulmonaires)). La douleur lors de l’administration des réactifs pour l'imagerie et les traitements, correspond à celle d’une piqûre d’aiguille (nuisance légère). Les potentiels effets indésirables d’une nouvelle molécule seront connus car elle doit être testée pour sa tolérance ou doit déjà être utilisée dans la littérature. Dans certains cas il sera nécessaire d'utiliser des souris immunodéficientes qui sont à phénotype dommageable. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entraineraient leur décès. Nous pourrons également être amené à utiliser des souris transgéniques à phénotype dommageable. (Nuisance légère car tumeur très petite au niveau du pancréas.

Devenir

Procédure 1 : 480 souris seront mise à mort à l'issue de cette procédure et 30 souris serviront de souris donneuses de tumeur pour la procédure 2: greffe de fragment. Les autres souris ne peuvent pas être réutilisées car les tumeurs et organes pourront être prélevés pour des analyses histologiques. Procédure 2 : 960 animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure, car elles ne peuvent pas être réutilisées pour une autre étude car les tumeurs et organes pourront être prélevés pour des analyses histologiques et 300 seront en utilisation continue car elles seront uniquement induites pour obtenir des tumeurs pancréatiques et hébergés dans nos locaux pendant 1 semaine minimum, le temps de leur récupération complète. Il n’y aura aucun acte d’imagerie pour ces 300 souris dans nos locaux. Elles seront ensuite être fournies à des clients demandeurs de ce modèle pour des travaux expérimentaux réalisés dans leurs locaux.

Remplacement

Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer pancréatique en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en oeuvre des techniques d’imagerie (bioluminescence, échographie, scanner, photoacoustique, imagerie radioisotopique, imagerie par résonnance magnétique, imagerie de fluorescence) qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Cette approche permet de réduire de façon notable le nombre d’animaux nécessaires à 10 par groupe pour réaliser des tests statistiques pertinents.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement et des points limites prédictifs (perte de poids, détérioration de l'aspect général, de la physiologie clinique ou de la locomotion) nous permettrons de prendre les mesures nécessaires afin de limiter la souffrance au maximum au cours de l’expérimentation. Durant l'induction des modèles tumoraux et durant les examens d'imagerie, les souris seront anesthésiées. La douleur liée à la chirurgie sera également prise en charge par l'utilisation d'analgésiques locaux et généraux avant la chirurgie, au réveil puis 24h après l'intervention. Les symptômes potentiels liés aux traitements sont principalement une légère perte de poids. Si une douleur apparaissait, elle serait prise en charge par l'administration d’antalgique pendant 72h et si, passé ce délai, aucune amélioration n’était visible, l’animal serait mis à mort. Enfin, les souris auront 1 semaine minimum d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Les cages seront en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Les souris immunocompétentes seront également hébergées en portoir ventilé. Les cages sont enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid et des granulés pour ronger et jouer avec ses congénères. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. Par ailleurs il existe des souris immunodéficientes bien adaptées pour les implantations de cellules d'origine humaine. Les animaux « receveurs » seront utilisés à l’age de 6 – 8 semaines sur la base de nos précédents travaux et publications. Sur des animaux plus âgés, de par notre expérience, nous avons observé une prise de greffe moindre. Les souris transgéniques développant spontanément un cancer du pancréas seront âgées de 6 à 16 semaines environs afin qu’elles aient une tumeur du pancréas suffisamment développée pour faire 10 fragments de 1mm3 qui seront utilisés dans le modèle orthotopique par greffe de tumeur.

Un infarctus du myocarde est provoqué chirurgicalement sur des souris adultes en trente minutes et sur des souriceaux en quinze, quand d'autres subissent la ligature ou l'excision d'un segment d'artère fémorale, une injection quotidienne de toxine ou une blessure du muscle par anse refroidie. 7 110 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées lors d'une chirurgie terminale pour prélever leurs organes. Le porteur annonce l'étude des mécanismes cellulaires des maladies du muscle squelettique et cardiaque, dont l'infarctus, les myopathies et le défaut d'irrigation des membres inférieurs. Les bénéfices attendus pour les patients ne sont énoncés nulle part, le porteur reprenant à leur place la liste des douleurs et des stress infligés aux souris.

Objectifs

Le projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs. Ce projet a pour objectif de caractériser les mécanismes cellulaires impliqués dans les pathologies affectant le muscle squelettique et cardiaque, y compris les pathologies cardiovasculaires comme l’infarctus du myocarde, les myopathies et les blessures chroniques du muscle squelettique. Par ailleurs, le manque d’irrigation locale des membres inférieurs sont fréquentes dans différentes pathologies chroniques y compris le diabète. Malgré le succès de certains traitements, ces maladies chroniques restent encore aujourd’hui fréquentes et très peu soignables, elles ont donc un impact majeur sur la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de répondre à un sujet de santé publique et de besoins scientifiques et cliniques afin d’améliorer la compréhension de ces pathologies affectant le muscle et le traitement des patients.

Bénéfices attendus

Effets indésirables liés aux procédures: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur aux points d'injections. Effets de la chirurgie cardiaque : douleur modérée post-opératoire de quelques jours. Effets de la chirurgie des membres inférieurs : Douleur, inconfort léger de courte durée liés à la ligature de l’artère fémorale et au point d’injection. Stress lié au transport des souris vers le site n°2 pour les échocardiographies et la réalisation de l’imagerie (anesthésie et manipulation).

Procédures

- Infarctus du myocarde chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 30 minutes. Réalisé par EU1 - Infarctus du myocarde chez le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Échocardiographie chez la souris et le souriceau anesthésié (1x par souris) durée = 15 minutes ainsi que le stress lié au transport vers le site n°2 pour l’échocardiographie. Réalisé par EU2 - Constriction puis excision d’un segment d’artère fémorale sur souris adulte anesthésiée = 15 minutes. Réalisé par EU1. - Ligature de l’artère fémorale chez la souris adulte anesthésiée (1x par souris) durée = 15 minutes. Réalisé par EU1 - Dans certaines expériences, injection de toxine: quotidien, 10 secondes. Réalisé par EU1 - Blessure localisée du muscle par anse refroidie (1x par souris) = 3x 15 secondes. Réalisé par EU1 - Ligature de l’artère fémorale et injection de toxine chez la souris adulte anesthésiée = 15minutes. Réalisé par EU1 - Chirurgie terminale sous anesthésie pour prélèvement d’organes. Réalisé par EU1.

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés aux procédures : inconfort lié à la préhension des animaux, douleur aux points d'injections. Effets de la chirurgie cardiaque : douleur modérée post-opératoire de quelques jours. Effets de la chirurgie des membres inférieurs : Douleur, inconfort léger de courte durée liés à la ligature de l’artère fémorale et au point d’injection. Stress lié au transport des souris vers l'EU n°2 pour les échocardiographies. L’induction de l’anesthésie gazeuse pour la réalisation de l’échocardiographie est stressant pour l’animale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour analyse des organes.

Remplacement

Notre projet s’intéresse à l’interaction de différents types de cellules du microenvironnement musculaire, y compris les cellules immunitaires, stromales et endothéliales. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire, inflammation, régimes), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui a un système immunitaire similaire à l’homme.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expériences le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation. Un grand nombre de données de transcriptomiques étant déjà disponible pour la communauté scientifique, des analyses informatiques pilotes ont déjà été performées pour étayer nos hypothèses.

Raffinement

La souffrance animale sera réduite au maximum par le raffinement des méthodes expérimentales et la mise en place de points limites spécifiques et précoces. Pour l’ensemble des procédures chirurgicales, une supplémentation hydrique par injection sera effectuée en pré et post opératoire. Une analgésie pré et post opératoire sera réalisée le cas échéant. Pour la procédure d’infarctus du myocarde, le maintien au chaud de la cage sera effectué sur les 48h per-opératoire. Un renforcement de l’enrichissement par de la litière douce (cellulose) et du gel hydrique sera apporté. Le transport des animaux vers le site numéro 2 pour les échocardiographies sera effectué par un transporteur agrée. Les animaux seront dans des boites de transport contenant des croquettes, de l’hydrogel et du coton (ainsi que de la litière).

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies musculaires, car des modèles sont bien établis et récapitulent les pathologies chez l’homme. Le choix de l'espèce murine nous permet également d’avoir accès à des animaux génétiquement modifiés cruciaux dans l’étude précise des cellules d’intérêt de ce projet. La consanguinité des modèles utilisés permet une reproductibilité des résultats et une réduction du nombre d’animaux utilisés. Les souris seront âgées de 1 jour à 30 semaines, car nous étudierons ces pathologies chez le souriceau et à l’âge adulte.

Une partie des souris de ce projet est immunodéficiente, et d'autres reçoivent une irradiation du corps entier qui élimine leurs défenses immunitaires. 5 490 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, porteuses de tumeurs implantées sous la peau ou dans la graisse mammaire. Chacune peut recevoir jusqu'à six examens d'imagerie sous anesthésie de près d'une heure, jusqu'à deux injections intraveineuses par semaine pendant trois semaines et des trajets de deux heures entre deux établissements, celles mises sous estradiol pouvant développer des calculs rénaux et la progression tumorale une cachexie. Toutes sont tuées en fin d'étude, les mesures de radioactivité étant faites sur les organes prélevés après la mort.

Objectifs

Le cancer est désormais la première cause de mortalité dans les pays développés, devant les pathologies cardiovasculaires. Dans ce contexte, l’objectif de nos projets est le développement de nouvelles thérapies utilisant la radiothérapie interne vectorisée (RIV). Cette dernière repose sur le principe suivant : « attacher » une molécule radioactive à une molécule biologique qui joue le rôle de transporteur et va reconnaitre spécifiquement les cellules tumorales. Pour la thérapie, on utilise de la radioactivité Beta- ou Alpha qui est très vite arrêtée par la matière mais possède une grande énergie. Elle va ainsi détruire les cellules à proximité immédiate de l’endroit où elle est transportée. Pour que le traitement par RIV soit efficace, il faut d’abord s’assurer qu’il se lie bien aux cellules tumorales, c’est pourquoi le développement de ces nouveaux traitements est souvent associé au développement d’un examen diagnostique (qui fait l’objet d’une autre DAP). Il est également nécessaire de bien valider que le traitement ne va pas se fixer et endommager les organes sains et qu’il exerce une action antitumorale. Nos objectifs sont donc doubles : * Evaluer l’efficacité antitumorale de traitements RIV visant la même cible. * Evaluer précisément les doses de radioactivité reçues à la tumeur mais également aux autres organes pour les extrapoler à l’homme lors de travaux nommés études dosimétriques afin de s’assurer que le traitement sera efficace sur la tumeur et sans danger sur les organes sains. Ce projet est un projet multisite entre deux Etablissements Utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de caractériser précisément des nouveaux composés de RIV pour proposer un traitement parfaitement personnalisé aux patients en utilisant la radiothérapie interne vectorisée, modalité thérapeutique actuellement en plein essor.

Procédures

*Induction tumorale : Sous anesthésie

Impact sur les animaux

- Certaines souris seront immunodéficientes et pourraient développer des pathologies du fait de leur manque de défenses immunitaires si elles n’étaient pas hébergées dans des conditions sanitaires protégées. - L’irradiation corps entier chez certains animaux va éliminer les défenses immunitaires et fragiliser l’animal qui pourrait développer des infections s’il n’était pas maintenu sous des conditions sanitaires protégées. - L’implantation sous cutanée ou dans la graisse mammaire de cellules tumorales ou des fragments de tumeurs va mener à une masse sous cutanée qui pourrait si elle est menée trop loin, gêner l’animal dans ses mouvements et impacter son état général. De plus, des nécroses peuvent apparaitre. Il est aussi possible, que la progression tumorale entraîne une cachexie constatée par une perte de poids. - Pour les études sur modèles hormonodépendants, les animaux pourront être mis sous estradiol qui peut induire des calculs rénaux. - Afin d’observer des effets de composé sur l’évolution de la tumeur, les animaux recevront des traitements de composés dans différents schémas d’administration qui pourront induire un stress léger. - La contention des souris pour manipulation lors de la mesure de la taille des tumeurs et de la mise sous anesthésie pourrait provoquer un léger stress. - A la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress de 1 à 2 jours. - L’injection intraveineuse pourrait également provoquer un léger inconfort et des lésions locales. - Les produits administrés pour la thérapie peuvent provoquer une perte de poids transitoire.

Devenir

Différentes mesures de radioactivité et analyses complémentaires réalisées sur les organes prélevés post-mortem sont nécessaires pour atteindre les objectifs scientifiques de nos études. La totalité des animaux seront donc euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

Pour étudier le devenir d’une molécule dans l’organisme et évaluer l’efficacité d’un traitement anticancéreux, il n’est pas possible de se passer d’un organisme entier avec ses fonctions physiologiques intactes et donc d’études sur animaux. Des études préliminaires réalisées in vitro nous permettrons néanmoins de valider que la molécule étudiée atteint bien sa cible et que le traitement envisagé est bien efficace sur la lignée étudiée.

Réduction

Une sélection des composés avec la meilleure activité sera réalisée in vitro en amont de toute utilisation in vivo et permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaire à son strict minimum. L’effectif d’animaux dans les groupes expérimentaux a été adapté pour chaque type d’étude afin de mener à des résultats scientifiquement pertinents tout en réduisant l’effectif à son maximum. Par expérience, les groupes de n=10 souris sont suffisamment robustes pour les études d’efficacité pour prendre en compte les variabilités de réponse au traitement et de pousse tumorale sur le long terme. Enfin, les 1ères données obtenues sur les études dosimétriques permettent d’optimiser les groupes avec n=7 souris pour s’assurer l’obtention de résultats interprétables. Enfin, la bonne connaissance de la pousse tumorale pour chaque modèle, permet d’optimiser le nombre d’animaux pour chaque étude et d’implanter uniquement le nombre d’animaux nécessaires pour obtenir des groupes porteurs de tumeurs de tailles homogènes.

Raffinement

La majorité des procédures (injection intraveineuse, intratumorale, et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit / plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. La fréquence de mesure des volumes tumoraux sera adaptée à la vitesse de croissance du modèle. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Les animaux sont observés quotidiennement. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître tout signe de souffrance. La SBEA (Structure chargée du Bien Être des Animaux) de l’établissement a mis en place une grille détaillée de suivi des animaux et identification des signes de douleur / souffrance permettant d’identifier au plus tôt les signes et de les prendre en charge. Les animaux seront hébergés par groupes de 2 à 10 individus en fonction de la taille des cages et du nombre d’animaux par groupes. L’eau et la nourriture seront données ad libitum. Au minimum une sorte d’enrichissement sera placé dans chaque cage (sizzle-dry ou tubes en polycarbonate ou bâton de bois). La greffe de tumeur est réalisée sous anesthésie générale gazeuse. Lorsque l’implantation nécessite l’incision de la peau (cas de l’implantation des fragments de tumeurs ou dans la graisse mammaire), la chirurgie est réalisée de façon aseptique et les animaux reçoivent une injection de buprénorphine, des soins opératoires (maintien de la température), surveillance post opératoire et soins post opératoires adaptés si nécessaires. Le transport vers la plateforme d’irradiation sera réalisé par un transporteur agréé, et le trajet ne dépassera pas 2h. Les animaux seront irradiés directement dans leur cage et leur environnement (cage, litière, enrichissement et nourriture) ne sera pas modifié. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur retour dans l’animalerie, les animaux seront changés de cages. Les animaux seront transportés par un transporteur agréé de l’EU1 vers l’EU2 (environ 1km de trajet) dans des cages avec litière, enrichissement et nourriture. Les biberons seront remplacés par de l’eau gélifiée déposée dans leur cage. A leur arrivée dans l’animalerie de l’EU2, les animaux seront changés de cages.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle de choix en pharmacologie car leurs génomes sont connus et leurs grandes fonctions physiologiques sont comparables à l’Homme (fonction rénale, hépatique). Enfin, elles sont compatibles avec nos systèmes d’imagerie utilisés pour la caractérisation préalable des traceurs eux-mêmes très proches des appareillages humains d’imagerie, facilitant par là même le transfert à la clinique (recherche translationnelle). Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans les études d’oncologie. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant une assez bonne reproductibilité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Les molécules étudiées ont pour but d’aider le diagnostic ou le traitement de cancers retrouvés chez les patients adultes. Il est donc justifié de travailler sur des animaux adultes possédant des fonctions physiologiques proches de la future cible humaine

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une injection de cellules cancéreuses sous la peau leur fait développer une tumeur des voies biliaires, puis elles reçoivent un anticorps par injection chaque semaine et un composé par gavage chaque jour pendant six semaines. Le porteur indique que la tumeur peut s'ulcérer, ce qui entraîne une douleur moyenne au long terme, et que le gavage irrite l'œsophage au point de gêner la prise de nourriture. Il écrit que l'approche a déjà été validée in vitro et sur des tissus de patients, et qu'elle exige maintenant une validation sur "animal entier", au nom d'un "besoin urgent" de traitements contre ce cancer.

Objectifs

Ce projet vise trois objectifs principaux. Le premier est de comprendre le rôle d'une protéine particulière dans un cancer du foie appelé cholangiocarcinome (CCA), un cancer agressif qui se développe à partir des cellules des voies biliaires. Le deuxième objectif est d'étudier comment un anticorps, spécialement conçu pour cibler cette protéine, agit contre ce cancer. Enfin, le troisième objectif est de voir si cet anticorps, utilisé en combinaison avec d'autres traitements, peut améliorer les résultats chez les patients atteints de ce cancer. Le cholangiocarcinome est un cancer très agressif avec peu d'options de traitement efficaces, ce qui rend la recherche de nouvelles thérapies cruciale. Notre protéine d'intérêt, située à la surface des cellules, est impliquée dans plusieurs types de cancers, dont celui du foie. Des études chez la souris ont montré que lorsque cette protéine est surexprimée, elle favorise la croissance des tumeurs et réduit la survie, ce qui indique qu'elle joue un rôle important dans le développement du CCA. Nous avons également mis au point un anticorps capable de reconnaître spécifiquement cette protéine et de ralentir la croissance des cellules cancéreuses humaines transplantées chez des souris. Le but du projet est de confirmer l'importance de cette protéine en observant si sa présence ou absence dans des lignées cellulaires affecte la croissance des tumeurs. Nous allons aussi étudier comment cet anticorps fonctionne en suivant l'effet du traitement sur la croissance tumorale à différents stades. De plus, nous testerons si la combinaison de cet anticorps avec d'autres traitements, ciblant des voies de signalisation spécifiques, offre de meilleurs résultats que l'anticorps seul. Ces études seront menées sur des souris pour créer des modèles de cancer réalistes et évaluer les différentes approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à valider le rôle pro-tumorigène d’une protéine dans le contexte du cholangiocarcinome. Elle vise aussi à étudier le mécanisme d’action d’anticorps ciblant cette protéine, ainsi que l’efficacité d’une combinaison de cet anticorps avec des inhibiteurs ciblant des voies de signalisation fortement activées dans le contexte du CCA. Certains anticorps ciblant la protéine d’intérêt sont déjà admis par le Food and Drug Administration (FDA) pour un essai clinique de phase I en cours de réalisation dans le cadre du traitement des cancer de la tête et du cou. Nous sommes convaincus que le ciblage de cette protéine par cet anticorps peut avoir un intérêt thérapeutique pour le traitement du cholangiocarcinome. A noter qu’il existe un besoin urgent de nouveaux traitements novateurs contre le CCA vu que le taux de survie est bas et les options de traitement offertes sont très limitées. De plus, dans la plupart des cas, le cancer des voies biliaires est généralement diagnostiqué au stade 4, lorsqu’une intervention chirurgicale n’est plus une option et qu’une chimiothérapie peut prolonger la durée de la vie, mais en réduisant beaucoup la qualité de celle-ci. Cette étude doit permettre de faire un nouveau pas vers le développement clinique de nouvelles thérapies et ainsi contribuer à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Procédures

Les animaux de ce projet seront soumis à une injection unique sous la peau de cellules cancéreuses. Cette injection prend environ une minute à être réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux recevront des traitements 1 fois par semaine pendant 6 semaines maximum par injection réalisée sur animaux anesthésies (par suite de la mesure des tumeurs) et prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux recevront également un traitement oral par un composé quotidiennement pendant 6 semaines (gavage). Les traitements sont réalisés sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisé. Les animaux de ce projet seront soumis à des mesures de tumeurs à l’aide d’un pied de coulisse qui seraient réalisées en environ 1 minute. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Pour les procédures 2-6, la manipulation et la contention peut engendrer un stress physique de courte durée lors de la manipulation. Pour les procédures 2-6, la croissance de la tumeur peut entrainer l’apparition d’une ulcération cutanée, ce qui peut engendrer une douleur moyenne au long terme. Pour les procédures 5 et 6, le gavage peut entrainer principalement une irritation/inflammation de l’œsophage avec pour conséquence un inconfort de la souris pour se nourrir au moyen terme et donc une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. L’anesthésie va être utilisée pour les gestes invasifs.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Il est préférable de greffer les cellules sur des animaux adultes afin que les tumeurs grandissantes entravent le moins possible leur capacité de mouvement.

Greffées d'une tumeur sous la peau en état vigile, mesurées trois fois par semaine, traitées par injection dans la veine de la queue puis mises à mort quand la tumeur atteint 1 500 mm3 ou se nécrose, 4 644 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie est immunodéprimée pour éviter le rejet des cellules tumorales humaines. Le porteur affirme que les preuves d'efficacité hors organisme vivant ont déjà été obtenues et qu'aucune alternative ne peut se substituer à la souris, les candidats médicaments visant une cible commune à la souris et à l'être humain. 928 souris sont réutilisées dans une autre procédure, et celles qui n'entrent pas en protocole sont réformées pour l'entraînement aux gestes techniques avant d'être tuées.

Objectifs

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats d’efficacité permettront de désigner le meilleur candidat ainsi que sa dose minimale efficace et les meilleures fréquences d’administration. Ce projet est articulé en trois procédures consécutives et dépendantes les unes des autres : # La Procédure-1 permettra mettre au point différents modèles tumoraux d’intérêt (tumeur/ souris) et d’effectuer un premier tri parmi ceux-ci. # La procédure-2 consiste en une étude Pilote d’efficacité antitumorale en utilisant un/des médicament/s contrôle de référence sur les meilleurs modèles de procédure-1. # La Procédure-3 permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales en utilisant le/les meilleurs modèles sélectionnés dans les Procédures 1 et 2.

Bénéfices attendus

Ce projet dans son ensemble consite à développer et analyser l'efficacité de nouvelles thérapies "ciblées" à visée thérapeutique humaine de type conjugué-drogue-anticorps (ADC). Ces thérapies de rupture permettent de cibler spécifiquement les cancers habituellement de très mauvais pronostiques, tout en diminuant drastiquement les effets secondaires. Elle représentent ainsi l’un des meilleurs espoirs depuis l’avènement des immunothérapies anticancéreuses. Les données d’efficacité (combinées avec les données de tolérance), permettent de choisir les candidat médicaments ayant la meilleur fenêtre thérapeutique chez les patients (c'est à dire la meilleur efficacité pour le moins d'effets indésirables). Ainsi, ces études permettront de définir quels seront les meilleurs candidats médicaments contre les cancers ciblés et de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser lors des premières études cliniques chez l’Homme. La première et la seconde procédure permettront de sélectionner et caractériser le/les meilleurs modèles tumoraux. La troisième procédure permettra de déterminer quels sont les meilleurs candidats médicaments, ainsi que leur dose et fréquences d’injections optimales (en vue d’une phase clinique chez l’Homme), en utilisant le/les modèles sélectionnés dans les procédures précédentes.

Procédures

# Greffe tumorale sur souris vigile en sous-cutané (2-3 minutes). # Les prises de mesure seront effectuées trois fois par semaine et quotidiennement en cas d'approche des points limites. # Traitement des animaux par les différents médicaments par voie intraveineuse sur souris vigiles (2-3 minutes). # Les animaux atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mis à mort.

Impact sur les animaux

# Les animaux subiront un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : change, pesée, contention et anesthésie. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de la greffe tumorale sur animal vigile par injection souscutanée ainsi que lors (2) de l’injection par intraveineuse dans la veine de la queue sur souris vigiles des candidats médicaments. # Pour les groupes traités, une diminution de la croissance tumorale est attendue.

Devenir

Pour chacune des trois procédures: Tous les animaux ayant atteint les points limites ou en fin d’étude seront euthanasiés. De même, les souris non entrées en protocole seront réformés pour l’entrainement aux gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien Etre Animal (SBEA), assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Remplacement

Les preuves de concept d’efficacité de ces candidats médicaments anticancéreux hors organisme vivant (dits in- vitro et ex-vivo), ont déjà été effectuées avec succès. A présent, seul un modèle physiologique complexe (organisme vivant) est nécessaire pour permettre de poser les bases d’une étude clinique afin d’obtenir des résultats représentatifs en terme de doses et de fréquences. De plus, les candidats médicaments étudiés dans ce projet étant cross-réactif (cible anticancéreuse comparables entre l’Homme et la Souris), aucune alternative ne peux se substituer à un modèle Souris.

Réduction

La procédure-1 et 2 permettent de mettre au point les modèles, de les caractériser au mieux et de diminuer les nombres d'animaux utilisés en procédure-3. Elles sont toutes deux effectuées sur un nombre limité d’animaux (sans toutefois mettre en péril l’interprétation des résultats). En effet, seul(s) le(s) modèle(s) ayant donné satisfaction lors des procédures 1 et 2 seront utilisés pour la procédure-3 avec un nombre d'animaux optimisé par rapport à chaque modèle. Par ailleurs dans les procédures 2 et 3, le fait de tester une dose en injection unique ou répétée une à deux fois en fonction des résultats obtenus au fil de l’eau, permet de diminuer drastiquement le nombre de groupes utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger).Il est à noter que les enrichissements de type nid ou rouleaux en cartons seront proscris à partir de la greffe tumorale afin d'éviter toute plaie sur les tumeurs et seront compensés par une augmentation des quantités de balles de coton et de bâtons à ronger. Avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées (période de stabulation) pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et éviter au mieux toute souffrance animale. La surveillance des animaux sera quotidienne et les prises de mesure effectuées trois fois par semaine avec une analyse scorée des critères physiques et comportementaux, du poids corporel et du volume tumoral et de la qualité de la tumeur (homogénéité, permettant la mobilité de l’animal…). Le point limite du volume tumoral sera de 1500mm3. La nécrose ou la gêne à la mobilité due à la tumeur constitueront également des points limites. Un système de surveillance est mis en place au sein de l'Etablissement Utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le weekend et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score mais n’atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins conservateurs adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement, isolement...). Les souris atteignant les points limites ou en fin d’expérience seront mises à mort. Les souris non entrées en protocole seront réformées pour entraiment des gestes techniques avant d’être mises à mort. La Structure Bien-Etre Animal (SBEA) assurera le suivi des animaux réformés afin de garantir les conditions d’utilisation en formation et la conformité avec le présent projet.

Choix des espèces

# S’agissant d’analyses d’efficacité in-vivo par voie intraveineuse, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. Pour les modèles modèles de tumeurs humaines, des animaux immunodéprimés sont nécessaires afin d’éviter tout rejet des cellules humaines par le système immunitaire. Dans le cas des tumeurs de souris, l’utilisation de la souches consanguine dont sont issues les cellules cancéreuses est indispensable. # La souris est une espèce animale à la fois petite et parfaitement caractérisée pour ces études (avec des données permettant de transposer les résultats chez l’Homme). En plus, les données de tolérances et de pharmacologie seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux la fenêtre thérapeutique de ces candidats médicaments. # Les animaux seront livrés entre 7 et 8 semaines de développement et inclus en expérience entre 8 et 9 semaines (après 7 jours d’acclimatation dans l’établissement utilisateur). A cet âge-là, les animaux sont adultes avec des organes matures permettant leur comparaison avec les patients humains. Pour les animaux non-immunodéprimés, leur système immunitaire sera complètement mature et adulte. # Il est à noter que le phénotype « immunodéprimé » ne sera pas un phénotype dommageable dans nos condition d’hébergement et d’expérimentation (statut sanitaire sans pathogènes ni opportunistes et expérimentation en condition stérile).

Les souris blanches sont retenues pour leur capacité à supporter des parasitémies de 50 à 60 % tout en affichant un tableau clinique facile à suivre. 114 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, infectées par une souche léthale de paludisme murin, avec un risque de mort que le porteur reconnaît en cas d'inefficacité du traitement. Chaque jour, elles reçoivent le candidat médicament par gavage ou par injection dans le ventre, sont maintenues contentionnées jusqu'à vingt minutes et subissent une piqûre à la queue pour un frottis, deux d'entre elles étant saignées à l'œil sous anesthésie. Toutes sont ensuite tuées après sédation, pour récupérer leurs organes et notamment le cerveau à l'état frais.

Objectifs

L’objectif de ce projet consiste à confirmer ou non l'activité antipaludique d'un candidat dans un modèle de paludisme murin. Ce candidat antipaludique a déjà été testé sur des cultures cellulaires pour déterminer ses différentes caractéristiques biologiques. Il s'agit également de savoir si ce candidat antipaludique améliore l'activité d'un antipaludique déjà connu et servant de référence. La voie d'administration et la fréquence seront également testées afin d'analyser l'effet de la molécule sur la parasitémie. Ce projet est l'étape consécutive aux différents tests réalisés sans animaux tels que la sélection des composés les plus efficaces parmi les différentes molécules produites.

Bénéfices attendus

Le bénéfice espéré reste toujours le même : celui de trouver un nouveau candidat antipaludique ou une nouvelle famille chimique candidate à développer dans un contexte ou l'espèce pathogène responsable du paludisme développe de plus en plus vite des résistances au traitements actuels et devient également moins facile à détecter en raison de modifications génétiques, tout en se propageant dans des zones où il avait soit disparu soit n’existait pas.

Procédures

Les interventions de ce modèle sont les suivantes : l'infection des souris par l'injection au niveau du ventre d'une souche léthale de paludisme murin (1 fois, moins de 2 min). Le prélèvement de sang au niveau de l'oeil, sous anesthésie pour 2 souris (8 min en moyenne sous anesthésie un seul prélèvement). La manipulation et à la contention (inférieure à 20 min par souris par jour pendant 4 jours et 10 min par souris et par jour tous les jours à partir du 5ème jour), La prise de médicament sous contrainte (inférieur à 5 min, par souris par jour hors temps d'observation après la prise, pendant 4 jours), l'injection du médicament au niveau du ventre (3 minutes par souris par jour, pendant 4 jours). La piqure nécessaire à la réalisation de frottis une fois par jour au niveau de la veine de la queue (moins de 2 minutes, sur animal vigile, 1 fois par jour pendant 4 jours puis tous les 2 jours après les 4 jours de traitement). Les injections au niveau de la peau, ou de l'abdomen pour les analgésies et anesthésies et enfin la pesée sur balance (moins de 2 minutes, sur animal vigile, 1 fois par jour pendant 4 jours puis tous les 2 jours après les 4 jours de traitement)

Impact sur les animaux

Nous choisissons une combinaison entre la souris et le pathogène où l'infection se réalise à bas bruit et de façon continue. Les effets vont de la perte d’appétit entrainant une perte de poids et des phases de prostration transitoires. Les souris auront le dos rond et en fonction de la parasitémies l’apparition de poils hérissés. Les souris seront infectées par une souche léthale du paludisme murin, il y a donc un risque de mort en cas d'inefficacité du traitement. Il y a la réalisation de frottis par prélèvement d'une goutte de sang à la queue. Ce prélèvement n'est pas indolore mais équivaut au test de glycémie chez l'adulte diabétiques et il est réalisé sans contention pour la souris.

Devenir

Conformément à l'Annexe IV de l'Arrêté du 1er février 2013 les souris seront toutes euthanasiées après sédation afin de récupérer tous les organes et notamment le cerveau dans un état frais et correct pour les lots expérimentaux.

Remplacement

Cette procédure permet de poursuivre nos travaux à la suite des différentes expériences déjà réalisés in vitro. En absence de système complet permettant de reproduire l'infection et le métabolisme des médicaments nous nous tournons vers le modèle animal. Les Organes sur puces et Organoïdes ne sont pas encore complets concernant les maladies infectieuses de façon générale et plus précisément dans le cas du paludisme, où toutes les formes et étapes du cycle ne sont pas reproduites ou assurées.

Réduction

Notre projet utilise le nombre minimal mais significativement déterminant pour conclure sur l'efficacité ou non de notre candidat. Notre demande est en revanche complété par une démarche de publication où l'expérience doit être reproduite 3 fois (triplicate) dans un Journal repondant au standart des recommandations ARRIVE. Mâles et femelles sont utilisées dans cette étude mais le sexe est pris en compte comme facteur non bloquant et il n'est donc pas nécessaire d'augmenter les effectifs.

Raffinement

Il s'agit d'un test d'efficacité antipaludique in vivo où seule compte l'activité antipaludique du médicament. L'ensemble des mesures permettant de raffiner les différentes procédures expérimentales seront prises. La nourriture et l'eau seront disposées à volonté, de la nourriture hydratée mais aussi des tétines plus longues seront mises à disposition lors des phases de prostration précédemment définies. L'utilisation de coussin chauffé est préconisée dans notre unité permettant de chauffer non seulement la cage investiguée mais aussi l'ensemble de l'armoire ventilée. En cas de douleur chez les animaux des analgésiques et des soins particuliers permettant d’atténuer la douleur seront mis en place. Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Ils bénéficieront d’une période de repos de 5 jours après livraison dans l’animalerie de l’établissement utilisateur, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. Les médicaments anti-douleur seront utilisés afin de limiter l'inconfort des souris suivant les différentes procédures. Systématiquement, nous utiliserons un analgésique si les sites d’injection deviennent sensibles pour les souris. Les sites d'injection sont sensibles quand la souris montre une agitation même après avoir été saisie pour l'injection au niveau du ventre, la peau s'est épaissie (car la souris s'est grattée). Enfin les injections au niveau de l'abdomen et les prélèvements au niveau de l'œil seront atténués par l'ajout d'analgésique et d'anesthésiant.

Choix des espèces

Le modèle murin est choisi car il est un support idéal pour l'infection par le parasite murin du paludisme. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris blanches pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 50 à 60%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. La simplicité et l'efficacité du modèle en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique. Ce modèle existe depuis plus de 60 ans et il a permis la protection d'animaux sauvages, initialement capturés pour de la recherche antipaludique. Les souris blanches seront des animaux adultes âgés de 6 à 7 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 8 à 9 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond également à la maturité sexuelle (adulte) mais aussi à la maturité du système immunitaire.