Procédures modérées

Implantés d'électrodes d'électroencéphalogramme dès l'âge de 14 jours, puis porteurs de mini-pompes osmotiques remplacées chaque mois, 200 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. S'y ajoutent trois ponctions lombaires, trois examens par résonance magnétique sous anesthésie et un test de dépression associé à une restriction alimentaire. Il s'agit de tester des esters de cétones et du lactate comme substituts au régime cétogène chez un modèle de déficit en GLUT1, maladie rare dont un quart des patients ne répond pas à ce régime. Le porteur retient le rat plutôt que la souris parce que le modèle murin ne fait pas de crises d'épilepsie et parce que l'imagerie par résonance magnétique gagne en résolution sur un animal plus gros.

Objectifs

La diffusion du glucose à travers les barrières tissulaires est facilitée par une famille de protéines dont le transporteur de glucose de type 1 (GLUT1). Le syndrome de déficience en GLUT1 est un syndrome de défaillance énergétique cérébrale causée par une altération du transport du glucose à travers les barrières du tissu cérébral. Cette maladie rare est caractérisée par une épilepsie pédiatrique résistante aux traitements, un retard de développement et des troubles moteurs complexes. Les patients sont traités efficacement avec des thérapies diététiques cétogènes (régime riche en graisses) qui fournissent un carburant supplémentaire, à savoir des corps cétoniques (composés produits par le foie lors de la dégradation des acides gras), pour le métabolisme énergétique du cerveau. Cette thérapie est inefficace pour 1/4 des patients. Le projet vise à tester l'efficacité de l'apport de nouvelles sources énergétiques : des esters de cétones (permettant une cétose (brulûage des graisses pour produire de l'énergie) thérapeutique plus rapide que le régime cétogène) et le lactate, sur un modèle de rat génétiquement réprimé pour GLUT1.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une neuroprotection de l'administration des esters de cétones ou du lactate, permettant de s'affranchir du régime cétogène. En effet, ce régime contraignant est souvent mal vécu par les patients. Si ces stratégies s'avèrent neuroprotectrice et peuvent remplacer ce régime, des études plus approfondies pourraient permettre la mise en place d'un protocole d'administration d'esters de cétones ou de lactate, améliorant la qualité de vie de ces patients.

Procédures

Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement EEG, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 20 min - implantation des mini-pompes osmotiques permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 10 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes - ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - examens par résonance magnétique nucléaire : examen non-invasif sous anesthésie gazeuse , réalisé 3 fois, durée : 45 min. gavage pré-IRM, réalisé 2 fois, durée 30 sec. La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours).

Impact sur les animaux

La biopsie de la queue réalisée pour le génotypage entraînera une douleur légère de courte durée. L'implantation des mini-pompes osmotiques pourra entraîner une douleur modérée. Les prélèvements pour les mesures biologiques pourraient entraîner une nuisance légère. Les anesthésies (pose EEG et examens IRM) pourraient induire une détresse cardio-respiratoire, mesurée grâce à un capteur placé sous l'animal, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. Une anesthésie prolongée pourrait mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération, la plaie suturée pourrait s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser (risque faible). Les différents tests comportementaux pourraient induire stress et anxiété pour les animaux. Lors du test de comportement de dépression, la nécessité d'une restriction alimentaire pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux (nuisance modérée).

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 200)

Remplacement

Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.

Réduction

Une réduction des animaux est rendue possible par le fait que l'imagerie par résonance magnétique est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.

Raffinement

Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement d'électroencéphalogramme, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les imageries par résonance magnétique sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.

Choix des espèces

Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'imagerie par résonance magnétique est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris. Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 125 jours. Les dispositifs d'enregistrement d'électroencéphalogramme seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 125 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.

Une incision entre l'œil et l'oreille, l'os du crâne dégagé pour poser une sonde laser-Doppler, et l'artère cérébrale moyenne obstruée pour provoquer un accident vasculaire : 186 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la substance testée pendant les sept jours précédant l'opération, ou au moment où le sang est rétabli. Toutes sont tuées pour récupérer leur sang et leur cerveau. Le porteur écrit que "la chirurgie en soi n'induit pas de douleur ou de souffrance" et ne signale qu'une perte de poids d'environ 10 % dans les 48 heures, pour une intervention qui consiste à provoquer un infarctus cérébral.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la deuxième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aiguë d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation) pour restaurer le flux sanguin. A ce jour, il n’y a pas de traitement approuvé pour protéger le tissu cérébral. Cette étude s’inscrit dans le cadre de développement de stratégies neuroprotectrices après un accident vasculaire cérébral ischémique . Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un traitement par un estrogène naturel modulateur des récepteurs des oestrogènes qui affecte de manière minime les paramètres de coagulation, dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral. Le mode d’action unique de cet estrogène se traduit par un profil bénéfice/risque amélioré par rapport aux autres œstrogènes. Nous évaluerons l’impact du traitement sur le volume de la lésion cérébrale, de la perte des cellules neurales et des troubles neurologiques et moteurs. Nous utiliserons un modèle expérimental d’ischémie cérébrale par occlusion de l’artère cérébrale moyenne suivi de reperfusion .

Bénéfices attendus

Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un eostrogène naturel dans un contexte d’accident vasculaire cérébral. Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances précliniques qui pourront être à la base d’une proposition de nouvelles stratégies neuroprotectrices susceptible de réduire le dommage ischémique cérébral et corriger les déficits neurologiques et moteurs après la survenue d’un accident vasculaire cérébral (AVC).

Procédures

Les souris subiront une chirurgie au niveau du cou qui dure moins de 20 min pour induire une ischémie cérébrale suivie de reperfusion.. Une substance susceptible de réduire les effets délétaires de l'ischémie ou son solvant sont injectés aux souris soit avant la chirurgie pendant 7 jours ( effet neuroprotecteur) soit après la chirurgie à la reperfusion (effet thérapeutique) La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale. Une incision de la peau est effectuée entre l’oeil et l’oreille gauches et l’os ducrâne est dégagé, pour poser une sonde de laser-Doppler sur la boîte crânienne afin de mesurer le débit sanguin cérébral dans le territoire de l’artère cérébrale moyenne. La peau est refermée après la pose de la sonde.

Impact sur les animaux

La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale . La chirurgie en soi n’induit pas de douleur ou de souffrance. Une perte de poids d’environ 10% peut survenir dans les 48h qui suivent la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés pour récupérer le sang et le cerveau afin de faire des analyses.

Remplacement

Ces études nécessitent des expériences in vivo utilisant des animaux. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Le projet a pour but d’étudier l’effet dans le contexte de l’ischémie cérébrale, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier (système nerveux, système vasculaire et la connexion entre les organes). Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Les AVC ont des impacts au niveau de différentes structures du cerveau ainsi que des conséquences physiologiques sur l’ensemble de l’organisme. Le modèle expérimental d’ischémie cérébrale in vivo permet de reproduire une grande partie des signes cliniques observés chez lles patients après AVC et d’évaluer in vivo les effets sur le cerveau et sur la récupération fonctionnelle (score neurologique, coordination motrice). Actuellement, Il n’existe aucun modèle in silico ou in vitro permettant de mimer les impacts d’un AVC ou d’étudier les effets d’un traitement. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas d’étudier l’efficacité d’un traitement visant à limiter la taille des lésions cérébrales et les déficits sensori-moteurs. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable.

Réduction

Le nombre minimal et suffisant d’animaux à utiliser a été déterminé en tenant compte de la sensibilité des techniques utilisées et de la variabilité attendue du modèle sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature. Le nombre d’animaux par série expérimentale a été estimé au plus juste et est réduit au minimum, de façon à mettre en évidence des différences statistiques avec un risque d’erreur moins que 5%, sur la base de notre expérience de ce modèle et de nos études antérieures.. Nous avons optimisé les techniques de façons à évaluer le maximum de paramètres sur les mêmes groupes d’animaux (tests de comportement, taille de l’infarctus, et études immunohistochimiques au niveau du cerveau sont évalués sur les même lots d’animaux.

Raffinement

Les conditions de travail pour l’utilisation des souris ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Les expériences sont réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Une attention particulaire est portée pendant la chirurgie en particulier le maintien de la température corporelle grâce à une couverture chauffante. lLs souris sont observées régulièrement (à 6h et quotidiennement après l’ischémie) - les souris sont pesées avant et quotidiennement après ischémie pour évaluer la perte de poids. Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées tout le long de l’étude jusqu’à la mise à mort de l’animal. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont bien établis et maitrisés. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Souris adultes (8-12 semaines) pour lesquels le modèle d’ischémie cérébrale est bien validé

Toutes tuées à l'issue pour des analyses sur les tissus prélevés, 328 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, jusqu'à deux injections d'un virus modifié ou de solution salée, et deux séances d'imagerie de seize minutes sur cinq semaines. Le virus retenu se fixe 210 fois plus sélectivement sur les cellules cancéreuses que sa version d'origine, selon des essais menés en culture cellulaire. Parmi les bénéfices attendus, le porteur annonce une régression tumorale "sans perte de poids ou effet secondaire notable", alors que la liste des effets indésirables qu'il prévoit comprend la perte de poids, une nécrose au point d'injection et une encéphalite provoquée par le virus.

Objectifs

Malgré les traitements existants, les tumeurs cérébrales restent parmi les cancers ayant les plus mauvais pronostiques à court terme. La chirurgie n’est pas toujours possible, et même lorsqu’elle l’est, cette solution n’est souvent pas suffisante, comme en témoigne l’émergence de récidives dans la majorité des cas. La radiothérapie et la chimiothérapie ne sont pas plus efficaces, car elles engendrent rapidement une sélection des population cellulaires résistantes responsable des récidives. Ces aspects limitent l’espérance de vie des patients à 1 ou 2 années malgré la prise en charge thérapeutique. L’échec de ces thérapies est généralement lié à la récidive tumorale engendrée par des cellules résistantes aux traitements conventionnels surexprimant un marqueur tumoral spécifique. Le projet vise à développer un protocole complémentaire aux thérapies traditionnelles basé sur l’utilisation de virus capables d’éliminer les cellules cancéreuses. A ce jour le test le plus avancé pour l’utilisation de ce type de virus dans le cadre des glioblastomes repose sur l’injection d’un adénovirus directement dans la tumeur. Toutefois cet adénovirus n’est pas sélectif des cellules cancéreuses. Même s’il les élimine moins efficacement que les cellules cancéreuses, il est aussi capable d’infecter les cellules saines. Cette non sélectivité induit une perte d’efficacité de la thérapie, des effets secondaires et complique son administration aux patients. Afin d’éliminer ces problèmes, nous utiliserons un virus innovant, capable de sélectionner préférentiellement les cellules résistantes exprimant le marqueur spécifique. La modification principale du virus consiste modifier une protéine de surface permettant d’obtenir un virus ciblant spécifiquement les cellules tumorales porteuse du marqueur spécifique. Il a été montré, en culture de cellules, que cette ce virus modifié se réplique préférentiellement sur les cellules tumorales par rapport aux cellules non tumorales.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : la mise en évidence d’une régression tumorale suite à l’injection du virus (en mono ou bi injection) sans perte de poids ou effet secondaire notable ainsi que la possibilité d’administrer le virus par voie intraveineuse tout en conservant son efficacité

Procédures

Dans la procédure 1 : Chaque animal recevra au maximum 3 injections sous anesthésie gazeuse de 3 minutes chacune soit 9 minutes maximum. Pas de prélèvement sur animal vigile. Dans la procédure 2 : Chaque animal aura : - 1 anesthésie de 3 minutes pour injection de cellules tumorales à J0 - 2 anesthésies de 3 minutes pour injection de virus ou solution saline - 2 anesthésies de 16 minutes pour les séances d'imagerie . Total 50 minutes maximum sur 5 semaines

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - hématome transitoire au niveau du site d'injection intraveineux caudale (72h maximum) , - nécrose transitoire des tissus au niveau du site d'injection intratumoral, - perte de poids de l'animal, - développement de tumeur suite à l'injection de cellules tumorales, - encéphalite induite par le virus

Devenir

a la fin de chaque procédure, les animaux sont mis à mort pour des études complémentaires ex vivo sur les tissus et organes prélevés.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux testés, la spécificité des virus a déjà été étudiée en culture cellulaire in vitro. Le Sindbis (virus non modifié) n’a pas montré de sélectivité particulière pour les cellules tumoralespar rapport aux cellules non tumorales , alors que le virus Sinerpedoxx (virus modifié ciblant les intégrines) permet une infection 210 fois plus sélective (que le variant Sindbis) des cellules cancéreuses par rapport aux cellules non tumorales. La capacité des virus Sindbis et Sinerpedoxx à générer la mort cellulaire des modèles cellulaires tumorales a aussi été démontrée dans des expériences préliminaires (ainsi que dans la littérature). Il est maintenant indispensable de tester l’effet antitumoral de l’administration du virus sur un modèle animal de glioblastome. En effet, le modèle cellulaire ne peut pas recréer le micro-environnement tumoral ni les interactions avec le système immunitaire ainsi que l’impact de la voie d’administration (intraveineuse ou intratumorale) sur l’effet thérapeutique.

Réduction

L’imagerie TEP est peu invasive qui permet ainsi le suivi longitudinal des animaux. Chaque animal devenant son propre témoin, il est possible de réduire le nombre d’animaux par groupe. Nous utiliserons ainsi 10 souris par radiotraceur à l'inclusion afin d’avoir des statistiques sur les résultats obtenus. Cet effectif est suffisant pour s'affranchir des effets de variabilité et des sorties d'étude en raison d’atteinte de point limite. Le test statistique utilisé est adapté pour les petits effectifs.

Raffinement

Les animaux sont placés à plusieurs par cage, ont accès à l' eau et à la nourriture à volonté, et leur environnement est enrichi (tunnel en PVC, frisure, ouate de cellulose, bâtons de bois) afin de respecter les interactions sociales et permettre une activité motrice. La frisure de papier kraft est un enrichissement qui diminue le stress de l’animal et facilite sa thermorégulation ; elle permet également de créer des nids simulant ainsi l’activité naturelle. Une période d’acclimatation d’une dizaine de jours est respectée. Par ailleurs, les animaux sont observés quotidiennement par du personnel qualifié et formé à l’observation des animaux. Ainsi, un score clinique est attribué et une grille de points limites a été mise en place pour identifier la souffrance animale.

Choix des espèces

Des tests cellulaires in vitro ont déjà été réalisés. Cependant, le modèle animal est indispensable pour évaluer l’effet thérapeutique des virus dans des modèles tumoraux, en l’occurrence le glioblastome. La souris est l’espèce la plus adaptée pour répondre à cette question. De plus par sa taille, elle permet de réduire les quantités de radioactivité injectées à l’animal et donc les effets secondaires. Nous utiliserons des souris adultes de 7 ou 8 semaines conformément à la littérature et à notre expérience

Perte de poids, dégradation de l'état général et perte de mobilité déclenchent la mise à mort avant le terme prévu. 3 255 souris immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour des analyses post mortem. Chacune reçoit une greffe de cellules leucémiques humaines directement dans le tibia sous anesthésie, puis des traitements oraux, intrapéritonéaux ou intraveineux quotidiens ou bi-quotidiens, et des prélèvements de sang à la patte sur animal vigile atteignant 15 % de son volume sanguin sur 28 jours, pendant 60 à 120 jours d'étude. L'établissement présente ce modèle comme un outil à intégrer dans son processus de sélection de candidats médicaments, plus fidèle que la greffe sous la peau qu'il reconnaît pourtant moins invasive.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM ou AML en anglais) est un cancer hématologique relativement rare dont le besoin thérapeutique reste important. Elle représente environ 1,2 % de l'ensemble des cancers diagnostiqués chaque année dans le monde. L’AML est une pathologie agressive qui se développe rapidement et nécessite une prise en charge rapide. Le pronostic des patients atteints d’AML reste sombre malgré les progrès réalisés ces dernières années. Le taux de survie globale à 5 ans pour l’AML est d'environ 25 % chez les adultes, mais il chute considérablement avec l'âge, atteignant moins de 10 % chez les patients de plus de 65 ans. L’AML peut également toucher les enfants, elle représente 15 à 20% des leucémies pédiatriques. L'arsenal thérapeutique contre l’AML se compose principalement de la chimiothérapie intensive, des thérapies ciblées pour certaines mutations, et de la transplantation de cellules souches hématopoïétiques. Cependant, ces traitements présentent des limites importantes : une toxicité élevée, une résistance des tumeurs aux thérapies ciblées et surtout des options limitées pour les rechutes. Les AML se développent au sein de la moelle osseuse, puis se disséminent dans le système sanguin ou lymphatique. C'est dans cet environnement propice à la croissance et à la différenciation des cellules sanguines que les cancers des cellules hématopoïétiques prennent leur origine et se développent en premier. L’objectif de ce projet consiste à mettre en place et à intégrer dans nos études sur la souris immunodéprimée (sans système immunitaire, permettant la greffe de tumeur humaine), la greffe orthotopique (qui est située à son emplacement anatomique habituel) des leucémies, via une injection de cellules tumorales dans l’espace intra-tibial, l’un des sièges de la moelle osseuse qui présente l’intérêt d’être facile d’accès. Ce modèle présente un intérêt particulier pour l’étude de la pathologie humaine. En effet, il y a une diffusion des cellules tumorales dans le système sanguin avec pour résultante le développement de signes cliniques similaires à ceux rencontrés chez le patient. Cette approche vise à mieux reproduire les conditions de développement pathologique chez le patient, rendant ainsi les observations et les conclusions obtenues chez la souris plus pertinentes pour les futures applications cliniques.

Bénéfices attendus

Actuellement, parmi les modèles de recherche préclinique utilisés pour étudier les cancers, l’évaluation de l’efficacité et de la pharmacodynamie (vérification de l’atteinte de la cible thérapeutique) des thérapies candidates s’effectue sur des cellules tumorales greffées sous la peau de la souris avec mesure au pied à coulisse de la taille des tumeurs. Cependant cette approche ne récapitule pas l’ensemble des conditions environnementales et pathologiques des maladies du sang chez l’Homme (telles que la leucémie). Les greffes en intra-veineuse (IV) quant à elles miment la propagation de la maladie chez l’Homme dans le sang ou la lymphe, mais le micro-environnement initial n’est pas le même. Le modèle de greffe intra-tibiale, est quant à lui plus représentatif de la physiopathologie chez le patient. Il permet de sélectionner les futurs candidats médicaments dans un contexte de propagation tumorale qui reproduit plus fidèlement le contexte environnemental et pathologique du patient lors du développement de leucémies. Ce modèle vise à être intégré dans notre processus de sélection et de caractérisation de candidats thérapeutiques dans les pathologies de leucémies en complément de la greffe IV qui reste cependant moins invasive que la greffe intra-tibiale. Le choix de l’un ou l’autre de ces modèles dépendra de nombreux paramètres, tel que l’indication finale d’application du candidat médicament, la question posée ou l’objectif de l’expérience par exemple. En outre, certaines formes de cancer hématologique ne peuvent pas être reproduites chez la souris par greffe sous-cutanée ou intraveineuse, car le microenvironnement n'est pas adapté à leur développement. La greffe intra-tibiale favorise la croissance de ces tumeurs, car elle reproduit le microenvironnement propice à leur développement. Contrairement à la greffe en sous-cutanée qui permet un taux de prise de la greffe oscillant entre 70% et 90%, la greffe intra-tibiale permet un taux de prise proche de 100% ainsi que des tumeurs plus homogènes (selon sources bibliographiques). Ce modèle nous permettra donc d’évaluer l’efficacité de nos candidats médicaments pour le traitement de l’AML.

Procédures

- Analgésie préalable à la greffe : injection sous cutanée 20 à 30 minutes avant la greffe (10 secondes/souris) - Greffe intra-tibiale pour l’implantation des cellules tumorales : cette procédure prendra moins de 5 minutes et sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale gazeuse de quelques minutes. - Prélèvements de sang au niveau des membres inférieurs sur animal vigile, à raison de 15% du volume total de sang sur 28 jours (pour le suivi de l’envahissement tumoral ou le suivi pharmacocinétique) (environ 20 secondes par prélèvement par souris). Réitération toutes les 3 semaines. - Traitements sur animal vigile : administrations aigues orales, intra-péritonéales ou intra-veineuses de candidats médicaments (10 à 15 secondes par souris). Traitements sur plusieurs semaines, en quotidien ou bi-quotidien. Dans le respect des limites éthiques.

Impact sur les animaux

Dans de rares cas, gonflement ou hématome au niveau du genou, provoquant une douleur modérée. Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la patte doivent être effectués une fois par semaine et ce toutes les 3 semaines jusqu’à la fin de l’expérimentation (60 jours s’il n’y a pas d’envahissement tumoral ou 120 jours lors des études d’efficacité avec des candidats médicaments qui provoquent la disparition des cellules tumorales) : - Piqûre au niveau de la veine saphène et prélèvement du sang qui provoque une douleur légère. Ce geste dure au maximum 1 minute par animal. L’envahissement tumoral des leucémies dans la moelle osseuse et dans le sang peut provoquer une perte de poids ainsi que l’apparition de divers signes cliniques : détériorations de l’état général et altération de la mobilité.

Devenir

Chaque animal sera euthanasié en fin d'étude (ou cours d'étude en cas d’apparition de signes cliniques limites) pour réalisation d'études post-mortem.

Remplacement

L’identification de candidats médicaments est réalisée selon différentes étapes. Les premières études réalisées in vitro permettent de caractériser les composés candidats et de ne sélectionner que les molécules les plus efficaces en amont des études in vivo. Mais à l’heure actuelle, il est impossible de reconstituer in vitro la complexité d’une tumeur et ses interactions avec le microenvironnement, et c’est encore plus complexe pour des maladies du sang. Aussi les études in vivo demeurent indispensables pour étudier les effets pharmacologiques d’un candidat médicament, ses potentiels effets secondaires et prédire ses effets potentiels chez l’homme. La greffe intra-tibiale représente un modèle d’intérêt pour la recherche de produits anti-cancéreux dans le cadre du traitement des AMLs puisque ce modèle se développe dans le tissu d’origine, qu’il récapitule de nombreuses caractéristiques de la pathologie humaine et qu’il reconstitue les interactions entre les cellules tumorales et leur micro-environnement. Ainsi à ce jour, il n’y a pas de méthode substitutive. De plus, le modèle sera utilisé dans des phases avancées de développement des candidats médicaments, lorsque l’on se rapproche des phases cliniques chez le patient. Il visera à évaluer un nombre restreint de candidats médicaments dans ce modèle complexe et translationnel.

Réduction

Un des intérêts majeurs dans la mise en place de cette approche expérimentale, en plus du fait qu’elle reproduise très finement la complexité environnementale du contexte pathologique qui existe chez le patient, est qu’elle permet un taux de réussite de greffe chez la souris proche de 100%, soit la quasi-totalité des souris greffées qui pourront être incluses dans les études. Les candidats médicaments testés dans ce projet sont issus d’une présélection drastique in silico et in vitro incluant de nombreux modèles substitutifs à l’utilisation de l’animal. Les candidats médicaments sont également évalués en amont pour les aspects de sécurité non clinique et pour définir des doses non toxiques à administrer aux souris. Selon les besoins, une évaluation pharmacocinétique (permettant d’apprécier la distribution des candidats médicaments dans le système sanguin) sera intégrée au sein des études d’efficacité thérapeutique, permettant ainsi de ne pas réaliser deux études indépendantes et ainsi réduire le nombre d’animaux. Pour les prélèvements de sang de cette partie pharmacocinétique, la technique de prélèvement à la veine du membre inférieur, sera privilégiée, donnant la possibilité de réaliser des prélèvements répétés sur le même animal, dans le respect des limites physiologiques et des préconisations applicables au bien-être animal. Le nombre d’animaux par groupe pour la première phase dédiée à la détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale est déterminé sur la base bibliographique de chaque lignée tumorale à étudier, et en respect des volumes de sang prélevables recommandés par la SBEA. Des études statistiques pour cette première étape seront focalisées sur la différence entre mâles et femelles. Nous réaliserons ensuite des études statistiques et nous prendrons en compte l’avancement du développement des candidats médicaments afin de réduire le nombre de groupe par étude si possible : une approche statistique basée sur les données de détermination des conditions de greffe et de croissance tumorale permettra potentiellement d’affiner le nombre d’animaux par groupe ou le nombre de groupe/étude pour l’étude de l’efficacité des composés.

Raffinement

• Les souris sont maintenues en groupes sociaux tout au long de l’étude. L’habitat des souris est enrichi de matériel adapté pour leur permettre d’exprimer leurs instincts naturels comme ronger ou nidifier (tube ou dôme, cocoon, sizzle dry) et de l’aliment est distribué dans la cage pour favoriser le comportement de fouissage. • Un scoring individuel (axé sur l’activité et le comportement en complément des points limites standards et spécifiques au modèle sont mis en place afin de pouvoir suivre le bien-être animal et limiter toute souffrance). • Pour des prélèvements de sang, la technique de prélèvement de sang à la veine latérale du membre inférieur, sera privilégiée. Le volume total de prélèvement est conforme aux recommandations de la structure de bien-être animal afin de respecter la volémie physiologique et le bien-être animal. Cette technique est peu invasive. • Pour la greffe en elle-même, les animaux seront anesthésiés et sous analgésie, protégés de l’hypothermie par l’utilisation de tapis chauffant. Un gel oculaire sera appliqué pour prévenir la sécheresse oculaire et une administration sous cutanée de sérum physiologique sera réalisée pour prévenir la déshydratation. • À la suite de la greffe, il sera nécessaire de comprimer la zone d’injection par des gestes sûrs et acquis auprès d’un expert formateur afin d’éviter les risques de complications post injection. Les candidats médicaments sont également préalablement évalués pour les aspects de sécurité non clinique et les doses administrées dans ce modèle sont déterminées comme non toxiques pour le rongeur.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique : ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.

288 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie profonde pour prélever un volume important de sang. Chacune reçoit une injection sous-cutanée sur animal vigile de cellules coliques humaines exposées pendant plusieurs mois à trois pesticides, puis un prélèvement dans le sinus rétro-orbital. La question posée consiste à savoir si ces cellules, déjà transformées en culture par les pesticides, forment une tumeur une fois greffées. Le porteur justifie ce passage à l'animal par le fait que ces pesticides sont commercialisés depuis trop peu de temps pour qu'une étude épidémiologique soit possible chez l'être humain.

Objectifs

Le cancer colorectal, au niveau mondial, est le 3ème cancer le plus diagnostiqué après le cancer du poumon et du sein (plus de 1,8 million de nouveaux cas par an) et le 2ème cancer le plus mortel après le cancer du poumon (plus de 900 000 décès par an). Selon les estimations, ces chiffres devraient encore augmenter et atteindre plus de 2,2 millions de nouveaux cas et 1,1 million de décès par an d'ici 2030. Au cours de ces dernières années, certains facteurs environnementaux sont apparus comme une cause possible de l'augmentation de la prévalence de maladies chroniques, y compris certains cancers. In vitro nous avons observé qu’une exposition chronique de cellules non tumorales coliques pendant plusieurs mois à trois pesticides, seuls ou en cocktail provoque des changements importants et irréversibles (persistant après la levée de l’exposition). Notre objectif est de déterminer si ces altérations reflètent un mécanisme de cancérisation des cellules et si cette exposition chronique aux pesticides peut favoriser ou non le développement tumoral.

Bénéfices attendus

L’objectif est de déterminer si l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales à trois pesticides fréquemment détectés dans notre alimentation favorise ou non le développement tumoral. La mise sur le marché de ces composés est en effet encore trop récente pour permettre de mener des études épidémiologiques chez l’homme et estimer le risque que peut représenter une exposition chronique à ces composés sur la santé humaine. L’étude permettra également de valider des biomarqueurs tumoraux sanguins destinés, à terme, à améliorer le diagnostic et suivi des patients atteints de cancers

Procédures

La procédure implique au maximum une injection sous-cutanée sur animal vigile en début d’expérience (moins d'1 minute) et un prélèvement sanguin sur animal anesthésié en cours d’expérience (1-2 minutes maximum).

Impact sur les animaux

On peut s’attendre à une légère douleur de courte durée lors des injections de cellules chez l’animal vigile. On peut également s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux. Nous n'attendons pas d'autres nuisances ou effets indésirables majeurs sauf peut-être de très rares cas de détérioration de l’état général des animaux (perte de poids, par exemple) ou de nécrose de la tumeur. Un prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbital au cours du suivi du développement tumoral chez l’animal anesthésié ne devrait pas non plus occasionner de nuisance particulière, si ce n’est peut-être une légère douleur ou inconfort au réveil.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie profonde (sans réveil) et sous analgésie pour permettre le prélèvement d’un volume de sang important.

Remplacement

Nos résultats in vitro démontrent que l’exposition chronique de cellules coliques non tumorales aux pesticides provoque des changements morphologiques importants et irréversibles. La question que nous posons est de savoir si ces cellules ont acquis la capacité de développer une tumeur, une question qui ne peut être résolue qu’in vivo, dans un microenvironnement complexe. Il n’y a, en effet, pas de systèmes alternatifs pour évaluer de façon fiable le processus d’initiation tumorale.

Réduction

Pour tester l’hypothèse selon laquelle l’exposition aux pesticides in vitro pourrait conférer à nos cellules une capacité à former des tumeurs lorsqu’elles sont xenogreffées chez la souris nude, nous avons évalué, à l’aide du logiciel G-Power, le nombre minimum requis de souris par groupe à 8 pour obtenir des données statistiquement valides.

Raffinement

La procédure a été optimisée au cours d’études similaires précédentes, dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis et la surveillance de l’état clinique des animaux se fera au quotidien, y compris les week-ends et jours fériés afin de détecter le moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. Les observations et l’évolution de l’état général des animaux conditionneront les prises de décisions (injection d’analgésique et si nécessaire, euthanasie).

Choix des espèces

La souris est l’espèce la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence (y compris les nôtres) dans le domaine de la cancérologie sont nombreuses, bien documentées et bien validées. En particulier, les modèles de souris immunodéprimées sont idéaux pour la recherche sur les greffes de cellules cancéreuses et sont classiquement utilisés pour analyser la réponse tumorale. Après 1 semaine d’acclimatation en zone d’hébergement, les souris agées de 6 semaines seront réparties de manière homogène entre les lots à raison de 8 souris/lot. Les souris adultes offrent en effet un modèle expérimental plus robuste, stable et pertinent pour les études de xénogreffe tumorale (plus grande facilité de manipulation, meilleure tolérance des procédures, croissance tumorale plus prévisible et plus uniforme, pertinence par rapport à la tumorigenèse humaine qui est plus fréquente chez les adultes).

Les souris de ce projet développent une maladie auto-immune, spontanément pour certaines lignées ou après induction, avec perte de poids, gonflement des ganglions et inflammation de la peau ou des articulations. 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour analyser leur sang et leurs organes. Elles reçoivent deux injections par semaine pendant huit à douze semaines, une irradiation du corps entier sur animal vigile, et jusqu'à sept prélèvements sanguins mensuels. Les anticorps testés disposent déjà d'une autorisation de mise sur le marché chez l'être humain contre certains cancers du sang, ce qui permet au porteur d'annoncer une translation "extrêmement rapide" tout en qualifiant ces données murines d'"incontournables".

Objectifs

Les maladies auto-immunes (MAI) systémiques sont des maladies rares caractérisées par l’attaque du système immunitaire sur son hôte, responsable de douleurs et de lésion d’organe altérant significativement la qualité de vie des malades. Les traitements actuels reposent sur des immunosuppresseurs qui permettent d’améliorer les symptômes sans toutefois assurer de guérison, au prix d’une augmentation du risque infectieux et de maladies cardiovasculaires (infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral). De nouveaux traitements pourraient révolutionner la prise en charge des MAI. Parmis eux, de nouvelle thérapie permettant cibler les cellules responsables de la production d’anticorps pathogènes sont particulièrement interessantes. Il s’agit d’approches utilisant thérapie cellulaire par reprogrammation des globules blanc . Ces approchent semblent efficaces dans plusieurs maladies auto-immunes chez la souris et chez l’homme. Toutefois, il s’agit d’une technique couteuse, difficile à mettre en place, et qui pourrait être responsable de complications graves à long terme (cancer du sang). Ainsi, les anticorps thérapeutiques pourraient remplacer les CAR-T cells mais leur efficacité dans les maladies auto-immune n’a pas été étudiée. En outre, des traitements ciblant les interactions entre les plaquettes sanguines et cellules immunitaires, pourraient améliorer les symptômes tout en diminuant le risque cardiovasculaire et sans favoriser les infections. Ainsi, ces nouvelles thérapies pourraient répondre à des besoins urgents dans la prise en charge des patients atteints de maladie auto-immunes. Objectif global : identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les maladies auto-immunes (MAI).

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’apporter des données pré-cliniques solides visant à promouvoir l’utilisation de nouvelles thérapies à anticorps chez les patients atteints de maladies auto-immunes systémique sévère. Ces traitements ont déjà une Autorisation de Mise sur le Marché chez l’Homme dans d’autres maladies (pour traiter certains cancers du sang). De ce fait, si ce projet est concluant, la translation des résultats (évaluation de ces traitements) chez l’Homme pourra être extremement rapide, avec un bénéfice attendu majeur chez les patients atteints de maladie auto-immunes.

Procédures

→ Deux injections sous anesthésie, Durée de deux fois cinq minute comprenant l’anesthésie ou deux injections par semaine pendant 8 à 12 semaine durant 1 minute chacune → Une irradiation corps entier chez un animal vigile pour une durée de moins de trois minutes. → Un prélèvements sanguin sous anesthésie générale une fois pa rmois jusqu’à la fin de l’expérimentation (7 prélèvements maximum).

Impact sur les animaux

Le projet utilise des modèles souris spontanés ou induits caractérisés par le développement progressif d’une maladie autoimmune, responsable d’une perte de poids et d’un développement de ganglions. Les animaux subiront : > Stress due aux manipulations de la souris. > Inflammation de la peau ou des articulations due à la maladie auto-immune. > Douleur transitoire aigue et de courte durée suite aux injections de traitement et aux prélèvements

Devenir

A la fin de l'expérimentations, les animaux seront mis à mort dans l’objectif d’étudier l’impact des traitements sur la maladie auto-immune (étude du sang et des organes).

Remplacement

Les nouvelles stratégies thérapeutiques testées ici ont déjà été testées in vitro et on démontré leur efficacité sur leur mécanisme d'action. L'objectif du projet est d'étudier l'impact de ces traitement à l'échelle de l'organisme et notamment au sein des tissus affectés par la maladie auto-immune. Ces données pré-cliniques sont les dernières à acquérir avant d'envisager un traitement de patients atteints de maladie auto-immune, elles sont donc incontournables.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été déterminée en amont. Le nombre de souris nécessaire a été calculé à l’aide d’outil mathématiques pour chaque question posée afin d’obtenir des résultats statistiquement robustes et fiables.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements de leur environnement permettant d’améliorer le confort des souris (papier kraft, dome, tunnels). L’état de santé des animaux sera examiné de façon hebdomadaire. Des points limites ont été définis afin de soustraire les animaux à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites spécifiques. Les injections et les prélèvements seront réalisées sous anesthésie générale pour diminuer l’inconfort. Une analgésie sera mise en place lorsque nécessaire. Les souris seront acclimatées pendant minimum 7 jours à l’utilisation pour réduire le stress des manipulations. Une habituation des animaux à leur manipulation sera faite préalablement au début de l’expérimentation.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'autoimmunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations auront un âge de 2 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 8 à 18 mois (âge moyen pour lequel les points limites apparaissent, selon la lignée étudiée).

Gavées une fois par jour pendant douze semaines, soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes et à une incision du bout de la queue pour un prélèvement de sang, 5 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes. L'objet du projet consiste à reproduire chez la souris des anomalies de comportement et de transit intestinal associées à l'autisme, en administrant des métabolites bactériens à des animaux dès l'âge de quatre semaines. Le porteur annonce des batteries de tests évaluant le comportement social, les comportements répétitifs et l'anxiété, avec des durées allant de quatre minutes trente à soixante-douze heures, sans nommer un seul de ces tests.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un partenaire crucial pour la santé humaine. Des études récentes montrent l’existence d’un axe de communication microbiote-intestin-cerveau par lequel le microbiote peut influencer le comportement. L'autisme, avec une prévalence de 1% s'accompagne de troubles comportementaux (déficits d'intéraction sociale, stéréotypies) et de comorbidités (anxiété, dépression, hyperactivité). Aussi les patients autistes ont fréquemment des symptômes gastro-intestinaux (constipation, diarrhée, douleurs abdominales, ballonnements) associés à des altérations des abondances de certaines bactéries de leur microbiote intestinal et des petites molécules qu’elles produisent, les métabolites microbiens. Ces anomalies sont aussi reproduites dans des modèles souris d’autisme. Les causes de l’autisme sont encore méconnues, mais des dérégulations de l’axe cerveau-intestin-microbiote semblent y jouer un rôle. Cela suggère que des thérapies ciblant les bactéries du microbiote ou bien les métabolites qu’elles produisent pourraient être bénéfiques, comme par exemple le transfert de microbiote, les probiotiques et les prébiotiques. Leur efficacité reste cependant à démontrer. Des métabolites issus de la dégradation de l’alimentation par les bactéries du microbiote présentent des niveaux anormalement élevés ou bas dans l'urine, le plasma et les selles de patients autistes. Les bactéries productrices et consommatrices de ces métabolites sont aussi fréquemment dérégulées chez les patients autistes. Dans ce projet de recherche, nous allons identifier parmi ces métabolites microbiens et ces bactéries ceux et celles capables d'induire chez la souris des anomalies comportementales et/ou gastro-intestinales. Aussi, nous identifierons leur mode d'action en utilisant des approches pharmacologiques. Également, nous identifierons des métabolites et des traitements probiotiques capables de restaurer les anomalies du comportement et les troubles gastro-intestinaux dans des modèles d’autisme. Ce projet ouvrira la voie à une meilleure compréhension de l’autisme et à de nouvelles thérapies.

Bénéfices attendus

Cette étude présente un intérêt translationnel car l'étude apportera des connaissances sur les mécanismes physiologiques et neurobiologiques fondamentaux responsables des troubles du spectre de l’autisme et de l’implication du microbiote intestinal. Ce projet permettra de faire avancer les connaissances sur l'étiologie de l'autisme et pourra contribuer à valider pré cliniquement dans des modèles animaux des stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote pour les troubles du spectre de l'autisme.

Procédures

• Identification par injection sous-cutanée de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement de sang de 100µL après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 12 semaines en fonction de la procédure. • Injections intrapéritonéales : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 10 jours en fonction de la procédure. • Anesthésie à l’isoflurane et imagerie sur animal anesthésié : durée 10 min ; fréquence 5 fois sur 48h en fonction de la procédure.

Impact sur les animaux

Ce projet obéit à la règle des 3R. Cependant, certains des traitements proposés pourraient impacter le métabolisme, le comportement et\ou la physiologie intestinale des groupes d’animaux traités par rapport aux groupes témoins. Pour détecter ces changements, un suivi au moins 2 fois par semaine du poids des animaux, de leur consommation en eau et nourriture permettra d’évaluer l’état physiologique global de l’animal en réponse au traitement. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée et qui n’induisent pas de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). De plus, l’inconfort sera limité à la durée du test. Concernant l’évaluation de la physiologie intestinale, les tests provoqueront un inconfort mais limité à la durée du test. Un prélèvement sanguin sera réalisé lors du test de perméabilité intestinale, cependant un volume faible de sang sera prélevé et l’inconfort sera limité au temps nécessaire au prélèvement. Dans le cas du traitement administré par voie intrapéritonéale, une attention particulière sera portée à l’état du site d’injection (gonflement, rougeur).

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses biologiques, indispensable pour une meilleure comprehension des mécanismes associés à notre contexte d'étude.

Remplacement

La littérature scientifique sur notre sujet a permis de sélectionner les métabolites microbiens, les bactéries et les substances pharmacologiques les plus pertinents, ainsi que les quantités et concentrations utilisées respectant un contexte physiologique. Avant les expérimentations sur l’animal, des expériences in vitro ont été et seront réalisées sur des cultures bactériennes permettant de mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Cependant, pour évaluer l'impact du traitement avec des métabolites microbiens, des probiotiques et une substance pharmacologique à l'échelle de l'organisme entier au niveau gastro-intestinal et comportemental, le recours à l'animal sera nécessaire. En effet, l’étude du comportement animal fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et des processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car ce n'est pas modélisable in vitro pour l'instant.

Réduction

Pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, nous utiliserons des tailles d’échantillon garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse des résultats comportementaux, le nombre de souris ayant été réduit autant que possible. Des calculs réalisés avec un logiciel dédié ont permis de déterminer les effectifs de groupe nécessaires pour observer des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus pertinents. Les résultats seront analysés avec un logiciel dédié. Un total de 5832 animaux est requis pour ce projet.

Raffinement

Les paramètres suivants basés sur l'expérience de l'expérimentateur seront suivis pour nous permettre d'assurer le suivi du bien-être animal : le poids corporel, l'apparence physique, des signes cliniques objectifs tel qu’un changement de température corporelle suite à une alerte sur un animal, des comportements anormaux ou non provoqués, des réponses comportementales à des stimuli spécifiques ainsi que l'état général du site d'injection et un suivi de l’aspect des fèces indiquant ou non la présence de diarrhée. Nos conditions d’élevage comprennent une stabulation par groupes d'au moins quatre animaux, un enrichissement de l'environnement (coton pour nidifier, maison), ainsi qu'un contrôle strict de la température et de l'humidité. Un suivi quotidien des animaux est également assuré par le personnel animalier et par nous même dans le cadre des expérimentations. La majorité des procédures induiront un inconfort faible et de courte durée, sans causer de dommages. Pour les procédures affectant potentiellement le bien-être des animaux, un suivi basé sur une grille de score pourra être établi et permettra de détecter toute souffrance et de décider de la suite à donner, notamment en appliquant des points limites précoces et adaptés.

Choix des espèces

L'autisme cause des anomalies du comportement handicapantes. Toutes ces anomalies sont modélisables chez la souris à l’aide de batteries de tests de comportement réalisables chez la jeune souris ou l’adulte. Aussi, la physiologie intestinale de la souris (perméabilité, motilité intestinale et colonique) ne peut être appréciée que chez l'animal vivant. Les études précliniques sur l'autisme imposent donc des études in vivo, chez l’animal, afin d'identifier des mécanismes difficilement modélisables in vitro et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Puisque nous nous intéressons aux conséquences neurodéveloppementales de l’exposition aux métabolites Microbiens, nous préférons travailler dans une fenêtre où le système nerveux est encore capable d’une certaine plasticité (adolescence 4 semaines). Pour les procédures 1 et 2, nous recevrons les animaux à l'âge de 3 semaines, juste après le sevrage. Nous commencerons le traitement dans la 4ème semaine et évaluerons le comportement et le tractus GI après 4 semaines de traitement, soit lorsque les animaux auront entre 8 et 10 semaines. Pour les procédures impliquant un traitement pour restaurer les phénotypes induits par les métabolites microbiens (procédure 3), les animaux seront suivis jusqu'à l'âge de 14-16 semaines.