Procédures modérées

Pour savoir si des cellules sanguines mutées aggravent les lésions cérébrales après un accident vasculaire cérébral, 1 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux irradiations de la patte arrière espacées de 17 heures, puis une greffe de moelle osseuse par injection, un gavage de cinq jours pour activer la mutation, et des prises de sang répétées pendant deux mois. Le porteur décrit une perte de poids courante après l'irradiation et la greffe, une baisse d'activité et une réduction des interactions avec les autres souris. Aucune n'est tuée sur place au terme de ces procédures, toutes doivent être exportées vers des collaborateurs allemands qui leur infligeront les accidents vasculaires cérébraux.

Objectifs

Ce projet vise à explorer le lien possible entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et l'hématopoïèse dite clonale, une condition liée à l'âge où les cellules souches hématopoïétiques (à l’origine de toutes les cellules du sang) subissent des mutations et prolifèrent de manière déséquilibrée. Les personnes atteintes d'hématopoïèse clonale présentent un risque accru de développer des tumeurs, des AVC ou des crises cardiaques. Il reste cependant incertain que ces cellules sanguines mutées pénètrent dans le cerveau et y causent des dégâts après un accident vasculaire cérébral. Chaque année, environ 12 millions de nouveaux cas d'AVC sont recensés dans le monde, avec, au total, environ 103 millions de survivants qui doivent vivre avec les séquelles de cette affection. Dans une étude récente, 41 % des patients ayant subi un premier AVC présentaient des mutations dans leurs cellules souches hématopoïétiques, augmentant leur risque de subir un deuxième AVC ou d'autres événements vasculaires dans les trois ans suivants. Pour examiner cette hypothèse, nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées pour le gène appelé TET2 codant pour une enzyme importante pour la stabilité de l’hématopoïèse. Nous transplanterons la moelle osseuse de ces souris dans des souris receveuses localement irradiées sur le membre postérieur au préalable afin d’étudier la progression de l’hématopoïèse clonale à partir du site d’implantation du greffon comme pour modéliser le départ d’une hématopoïèse clonale chez l’Homme. Ces souris seront ensuite envoyées à nos collaborateurs en Allemagne pour modéliser l'AVC dont les conséquences seront graduées par gravité en fonction de la proportion de cellules clonales TET2. Les études sur les souris nous permettront de mieux comprendre les mécanismes des lésions cérébrales post-AVC, notamment l'impact des traitements sur la motricité fine, la démarche, l'équilibre, et la restauration des fonctions motrices, ainsi que sur la possibilité de traiter l'inflammation cardiaque. L'objectif global de ce projet est donc de déterminer si l'hématopoïèse clonale contribue à la gravité des AVC et de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents, ce qui pourrait ouvrir la voie à de nouveaux traitements pour améliorer la qualité de vie des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet présente plusieurs bénéfices potentiels significatifs pour la compréhension et le traitement des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et des conditions liées à l'hématopoïèse clonale. 1. Amélioration de la compréhension des AVC: En explorant les liens entre l'hématopoïèse clonale et les AVC, nous pourrons mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’aggravation des conséquences post-AVC et comment ceci est influencé par la présence de mutations sur un gène connu comme responsable de dérégulations de l’hématopoïèse (TET2). 2. Développement de nouveaux traitements: La recherche sur les souris génétiquement modifiées pour ce gène TET2 permettra d'évaluer l'impact des mutations sur les lésions cérébrales après un AVC. Ces études peuvent révéler si la taille du clone muté aggrave les conséquences de l'AVC, ce qui ouvrirait la voie à de nouveaux traitements ciblés, notamment des thérapies anti-inflammatoires adaptées aux patients présentant une proportion importante de cellules mutées pour le gène TET2.. 3. Amélioration de la prise en charge des patients: Pour les patients atteints d'hématopoïèse clonale, comprendre le rôle des cellules mutées dans les tissus cérébraux après un AVC peut améliorer les stratégies de traitement. Par exemple, en mesurant la taille des clones mutés, les médecins pourraient mieux orienter les traitements pour réduire l'inflammation et améliorer la récupération des fonctions motrices et cognitives après un AVC. 4. Contributions à la recherche sur le cancer: Étant donné que la mutation de TET2 est également courante dans les cancers de la moelle osseuse, ce projet pourrait avoir des implications pour la recherche oncologique. Les découvertes faites ici pourraient aider à développer des traitements qui ciblent non seulement les AVC mais aussi les cancers liés à ces mutations génétiques.

Procédures

Dans ce projet, nous réaliserons plusieurs interventions sur des souris pour comprendre les effets de certaines cellules sur les accidents vasculaires cérébraux (AVC). Les souris seront d'abord endormies (15min) avec une injection pour les préparer à une procédure. Elles recevront ensuite deux courtes doses d’irradiation (5min) , espacées de 17 heures, pour préparer leur moelle osseuse à recevoir la greffe de nouvelles cellules. Après chaque dose de rayons, les souris seront réveillées. Deux heures après la deuxième irradiation, les souris seront brièvement endormies pour que nous puissions injecter (30 secondes par injection) les nouvelles cellules mutées pour le gène TET2. Cette méthode permet de s'assurer que ces cellules atteignent bien leur destination et commencent à se développer correctement dans la moelle osseuse des souris. Deux mois après cette intervention, nous donnerons un médicament par gavage (1 minute) aux souris pendant cinq jours pour activer la mutation de ces nouvelles cellules TET2. Nous surveillerons ensuite les souris pendant deux mois supplémentaires pour vérifier que ces cellules se développent comme prévu. Pendant cette période, nous prélèverons régulièrement de petites quantités de sang pour suivre l'évolution des cellules et vérifier l'état de santé général des souris.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées pour comprendre les effets de certaines cellules mutées sur les AVC pourraient éprouver divers désagréments et effets secondaires. Les procédures que les souris subiront, comme l'irradiation et la greffe de moelle osseuse, peuvent provoquer des douleurs temporaires et un stress. L'irradiation peut entraîner une gêne temporaire dans la zone traitée. De plus, le traitement avec un médicament peut aussi causer des douleurs passagères, et le fait de donner ce médicament aux souris peut les stresser. Après l'irradiation et la greffe, il est courant que les souris perdent un peu de poids en réaction à ces procédures. Cette perte de poids est généralement temporaire, mais nous devons surveiller les souris de près pour nous assurer qu'elles restent en bonne santé. Les souris pourraient également être moins actives et bouger moins que d'habitude pendant un certain temps après ces interventions. Elles pourraient réduire leurs activités quotidiennes, explorer moins leur environnement et interagir moins avec les autres souris. Il existe aussi des risques de complications, comme des infections ou des réactions du système immunitaire, bien que ces problèmes soient rares si les procédures sont bien contrôlées. En résumé, les souris pourraient ressentir des douleurs, du stress, une perte de poids et une diminution de leur activité pendant un certain temps en raison des interventions nécessaires pour cette étude. Nous veillerons à surveiller attentivement leur bien-être tout au long du processus.

Devenir

Tous les animaux sont prévus pour être exportés en Allemagne à nos collaborateurs pour les expériences d’AVC dans le cadre du projet européen.

Remplacement

Ce projet a pour but de comprendre le lien entre l'accident vasculaire cérébral (AVC) et un phénomène complexe appelé hématopoïèse clonale. Il explore comment certaines cellules sanguines, qui ont subi des mutations, interagissent avec le cerveau lors d'un AVC. A ce jour, les méthodes sans animaux ne peuvent pas reproduire ces interactions complexes. Les cultures cellulaires et les organoïdes (mini-organes cultivés en laboratoire) ne parviennent pas à imiter toutes les interactions entre les différentes parties du corps. Elles ne peuvent donc pas nous donner une vue complète des effets de l'hématopoïèse clonale sur les AVC. Les simulations informatiques et les modèles mathématiques peuvent aider à comprendre certains aspects de cette recherche. Toutefois, ces outils dépendent de données préexistantes et ne peuvent pas prédire de manière fiable les interactions biologiques complexes qui se produisent dans un organisme vivant. Par conséquent, ils ne sont pas suffisants pour répondre à nos questions de recherche. Pour vraiment comprendre comment l'hématopoïèse clonale influence la progression et les conséquences des AVC, nous devons observer ces processus dans un organisme entier. Les souris TET2 présentent des mutations génétiques spécifiques et sont essentielles pour cette étude. Elles nous permettent de modéliser les mutations et de voir leurs effets sur l'ensemble du corps, y compris le cerveau. Ces modèles animaux nous offrent une vue intégrée des interactions entre les cellules sanguines mutées et les tissus cérébraux touchés par un AVC. Cette compréhension est cruciale pour développer des stratégies thérapeutiques efficaces. En résumé, bien que nous ayons envisagé des alternatives non animales, elles ne peuvent pas fournir les informations nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous avons pris plusieurs mesures pour réduire le nombre d'animaux nécessaires, tout en garantissant des résultats fiables et pertinents. D'abord, nous avons effectué des expériences préliminaires pour déterminer combien de souris sont nécessaires pour obtenir des résultats significatifs. Ces expériences nous ont aidés à établir des sous-groupes d'au moins 8 à 10 souris, ce qui est crucial pour assurer la validité des résultats. Pour chaque condition expérimentale, nous avons besoin d'un minimum de 60 souris. Cela inclut 30 souris greffées avec des cellules souches mutantes TET2 et 30 avec des cellules souches non mutantes, réparties en trois sous-groupes en fonction de la réponse biologique observée. Pour réduire encore le nombre d'animaux, nous avons optimisé nos protocoles expérimentaux. Cela signifie que nous avons standardisé les procédures pour maximiser les données obtenues sur chaque souris. Nous suivons chaque animal à plusieurs moments clés au cours de l'étude. Cette approche longitudinale permet d'obtenir plus d'informations de chaque souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux nécessaires. Nous avons aussi pris en compte la variabilité biologique inhérente à ce type d'étude, ce qui signifie que nous avons ajusté nos chiffres pour compenser les éventuelles variations biologiques. Ces mesures permettront de garantir des résultats fiables tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans cette recherche.

Raffinement

Pour minimiser les nuisances sur le bien-être des animaux dans les procédures expérimentales de ce projet, nous mettrons en place plusieurs mesure, basées sur les meilleures pratiques en matière de soin et d’éthique animale. Les animaux seront surveillés de manière régulière, surtout après les interventions critiques telles que l'irradiation et la transplantation de moelle osseuse. Des observations fréquentes seront réalisées pour détecter rapidement tout signe de douleur, de stress ou de comportement anormal ou des aspects tels que la perte de poids, l’inactivité, les signes de douleur et d’autres indicateurs de bien-être. Immédiatement après les interventions, les animaux bénéficieront de soins post-opératoires complets. Cela inclut la mise en place de conditions environnementales optimales (température, humidité, nourriture et eau) pour favoriser une récupération rapide et confortable. Toutes les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale pour minimiser la douleur et le stress. Les paramètres vitaux des animaux seront surveillés tout au long de l’anesthésie pour s’assurer qu’ils restent dans des plages sécuritaires. Les cages des souris seront enrichies pour fournir un environnement stimulant et réduire le stress. Cela inclut l’ajout de matériaux de nidification et de cachettes (tube carton) pour favoriser une activité physique et mentale. Un environnement enrichi contribue au bien-être général des animaux et à leur récupération post-intervention. Des points limites ont été définis pour limiter ou arrêter la douleur et une analgésie sera mise en place si nécessaire

Choix des espèces

Pour ce projet, nous avons choisi d'utiliser des souris adultes consanguines. Ces souris sont les mieux caractérisées et les plus couramment utilisées dans les études sur le système hématopoïétique car leur consanguinité permet d’éviter les rejets lorsqu’on les greffe entre-elles et de limiter les variabilités expérimentales. Elles ont la particularité de pouvoir exprimer deux protéines distinctes , ce qui permet de reconnaître le greffon de l’hôte greffé. Les souris TET2 expriment le CD45.1 et sont greffées dans des souris CD45.2, ce qui permet de les suivre dans l’organisme. Nous utilisons également des lignées spéciales de souris TET2 qui portent des mutations génétiques spécifiques muettes que l’on rend fonctionnelles après la transplantation, grâce à un traitement avec un médicament appelé tamoxifène. Cela nous permettra d’étudier comment ces mutations affectent les cellules sanguines de l’hôte et leur interaction avec le cerveau. Les souris que nous utiliserons pour les greffes et les expériences seront toutes des adultes, âgées de 8 à 12 semaines. Ce choix d'âge est crucial car les processus biologiques que nous étudions, tels que l'hématopoïèse (la formation des cellules sanguines), sont plus stables et prévisibles chez les souris adultes. De plus, étant donné que nos expériences peuvent durer 2 à 3 mois, il est important que les souris ne soient pas trop âgées, afin d'assurer que les résultats soient cohérents et fiables.

Opérées sous anesthésie générale pendant une heure à une heure et demie pour recevoir des vis en titane dans la hanche et dans la mâchoire, 140 brebis vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont tuées à la fin du projet pour prélever les os de la mâchoire et de la hanche. Les implants testés sont des produits orthopédiques ou dentaires en cours de développement ou déjà développés mais pas encore commercialisés, et leur nombre est fixé par la norme ISO 10993. Le porteur annonce une intervention unique sans autre nuisance que le stress de contention, puis énumère œdèmes, hématomes, hémorragies mineures, toux d'irritation jusqu'à la pneumonie, douleurs postopératoires avec boiteries ou difficultés à mastiquer, et fractures au niveau des trous de forage.

Objectifs

Le développement de biomatériaux implantables destinés à l’usage médical chez l’Homme passe par une évaluation de leur compatibilité tissulaire conforme à la norme iso 10993 et de leur efficacité. Les matériaux évalués dans ce projet sont des implants osseux à usage orthopédique ou en dentisterie, soit en cours de développement soit déjà développés mais non encore commercialisés. L'objectif primaire du projet est d'évaluer la stabilisation osseuse obtenue suite à l'utilisation de ces implants dans un modèle chirurgical ovin. L'objectif secondaire est de démontrer l'efficacité de la réponse osseuse/tissulaire suite au placement de ces implants dans des os de densités différentes (donc à différentes localisations), à différents temps de la guérison osseuse. Ces implants sont généralement différents types de vis en titane.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont le développement de nouveaux implants orthopédiques ou dentaires (ou leur validation pour mise sur le marché) permettant une cicatrisation osseuse plus rapide ou plus efficace chez l'Homme, lors de la prise en charge de fractures par exemple ou de chirurgie maxillo-faciale/dentaire.

Procédures

En dehors du stress lié à la contention, les brebis seront soumises à une unique procédure chirurgicale sous anesthésie générale consistant en l'insertion d'implants chirurgicaux (vis) dans la hanche et la machoire. La procédure chirurgicale dure de 1h à 1h30.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus incluent : - le stress lié à la manipulation et la contention, ainsi qu'au réveil de l'anesthésie générale, - des oedèmes, des hématomes ou des hémorragies mineures liés à l'intervention chirugicale (fréquents), - des problèmes respiratoires (de la toux d'irritation-peu fréquent- jusqu'à la pneumonie- rare-) liés à l'intubation et la ventilation lors de l'anesthésie, - des douleurs post-opératoires se manifestant soit par des boiteries, une difficulté à se déplacer (quand intervention sur les membres) ou des difficultés à mastiquer (quand intervention sur la machoire), occasionnellement - des infections de plaies, bien que rares - une fracture à partir des trous de forage des vis ou un bris d'implant bien que très rares.

Devenir

Les brebis sont mises à mort à la fin du projet afin de prélever les tissus osseux d'intérêt (machoire et hanche) pour analyses.

Remplacement

Les implants ont préalablement subi des tests biomécaniques (comme la résistance à la rupture, la dureté, l'élasticité...) in vitro. Cependant, la résistance à la corrosion et la biocompatibilité ne peuvent être évalués que dans un organisme entier. De plus, même lorsque le risque pour les patients est pressenti comme faible, cette évaluation d'efficacité et de sécurité préalable ne peut pas règlementairement être remplacée par des essais ex vivo.

Réduction

Le nombre d’implants à placer est défini par la norme ISO 10993 ou sa version américaine intitulée "FDAGLP biomaterials testing". Afin de répondre à cette norme tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires, nous nous sommes basés sur la littérature et des tests statistiques. Ces éléments nous ont conduit à considérer le nombre maximal de 7 individus par temps d'étude pour obtenir des résultats exploitables tout en prenant en compte le risque d'exclusion de certains animaux en raison de variations anatomiques ou de descellement d'implant.

Raffinement

Les animaux sont hébergés selon les standards de leur espèce dans une animalerie dont les paramètres d'ambiance sont contrôlés. Les brebis sont hébergées en groupes sociaux de 7 à 10 individus sur litière de copeaux de pin avec distribution de foin à volonté et pierres à sel à disposition. Une période d'acclimatation de minimum 7 jours est respectée et mise à contribution pour l'habituation des animaux à la présence et au contat de l'Homme lors du change des animaux et par la distirbution de granulés. Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale volatile (dont les paramètres sont surveillés pendant toute la durée de la chirurgie), avec administration d'un antalgique de niveau 3. Cet antalgique est associé à un anti-inflammatoire. Les animaux sont installés sur un tapis chauffant tout au long de la procédure chirurgicale. Un traitement antibiotique est également effectué afin de limiter les risques d'infection aux sites chirurgicaux. Les animaux font l'objet d'une évaluation de leur comportement, de leur confort et des sites chirurgicaux a minima deux fois par jour pendant la période post-opératoire. Des points-limites précoces et adaptés ont été définis à la fois pour la période per-opératoire (suivi anesthésique et des événements chirurgicaux) et pour la période post-opératoire (état général, activité, éventuelle boiterie ou difficulté à s'alimenter ou à se déplacer) et seront appliqués.

Choix des espèces

L'espèce animale utilisée dans ce projet est celle recommandée par la norme iso 10-993 et les critères de choix des espèces sont les suivants : les ovins sont utilisés dans de nombreuses procédures impliquant une cicatrisation très longue ou des techniques chirurgicales identiques à celles utilisées chez l’Homme lorsque ces dernières ne peuvent être mises en œuvre chez le lapin. Les brebis utilisées doivent avoir un poids d'environ 70 kg pour mimer les contraintes rencontrées chez l'Homme, pour un âge moyen de 3-4 ans (adulte). Les brebis âgées de plus de 7 ans sont exclues afin d'éviter la variabilité/le biais d'une cicatrisation retardée en raison de l'âge.

Une minipompe implantée sous la peau en quinze minutes, un régime alimentaire modifié, puis des séjours en cage à métabolisme de huit heures répétés trois fois et un de vingt-quatre heures : 336 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Cinq jours de suite, un ballonnet gonflable serré sur la queue mesure leur pression artérielle pendant un quart d'heure. Le porteur attend une perte de poids, une augmentation de la diurèse, des douleurs et un risque d'infection après l'opération, et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l'anesthésie. Tous sont tués en fin de protocole pour le prélèvement du sang et des organes, l'objectif étant de comparer un nouvel inhibiteur de l'aldostérone synthase à un traitement existant.

Objectifs

L'hypertension arterielle et ses complications cardiovasculaires et rénales a une très forte prévalence en Europe et augmente avec l'age pour atteindre près de 50 pour cent après 60 ans . L'hypertension arterielle participe au cercle vicieux liant insuffisance rénale chronique (IRC) et pathologies cardiovasculaires. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre vaisseaux, rein et coeur et d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités. Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’aldostérone, une hormone produite par les glandes surénales, joue un rôle important et induit inflammation et fibrose tissulaire, ce qui joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l'hypertension artérielle. L'aldostérone a également un role crucial dans la balance hydrosodée, régulant l'excretion rénale de sodium et potassium. Les objectifs du projet sont d'étudier les conséquences de l'inhibition de la synthèse d'aldostérone par un nouvel inhibiteur spécifique de l'aldostérone synthase sur la balance hydrosodée et la pression artérielle, en comparaison avec celle d'un inhibiteur du récepteur de l'aldostérone.

Bénéfices attendus

L’insuffisance rénale chronique (IRC) dont la prévalence est d’environ 10 pour cent en europe, selon les pays, a des conséquences cardiovasculaires majeures avec une morbidité et mortalité importantes ce qui représente un cout sociétal considérable. Le nombre de décès liés à l’IRC est estimé à 1,5 million dans le monde et est la 5ieme cause de perte d’année de vie. La proportion de sujets en France ayant une qualité de vie altérée variait de 20 à 50 pour cent dans les dimensions à composante physique selon le degré d’IRC. Le but du projet est de tester l'effet d'un nouvel inhibiteur pharmacologique de l'adosterone synthase, ces résultats permettront de proposer des alternatives thérapeutiques aux patients souffrant de l'IRC.

Procédures

Les animaux sous soumis à diverses interventions. Une minipompe délivrant un produit sera implantée sous anesthésie et analgésie (1 fois, 15 min). Certains animaux seront mis sous régimes spéciaux (animal vigile). Pour le recueil des urines (3 fois pendant 8h, une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Elle consiste à placer un ballonnet gonflable sur la queue de l’animal puis à mesurer la pression du ballonnet à laquelle le pouls est de nouveau perçu. L’euthanasie est réalisée selon une méthode réglementaire en fin de période expérimentale après prélèvement sanguin sous analgésie et anesthésie (1 fois, quelques minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables notoires seront 1) la baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (implantation de la minipompe) 2) la douleur et les risques d’infection suite à l’intervention chirurgicale, 3) les conséquences de l'hypertension artérielle (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 4) le régime alimentaire spécial et les traitements peuvent entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux, 5) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress social mais les animaux seront dans la même pièce que leur congénères 6) le stress lié à la manipulation et la contention durant la prise de pression artérielle 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.

Remplacement

Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde par l'aldostérone et de la signalisation sous-jacente dans l'hypertension et le syndrome cardiorénal. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.

Réduction

Le nombre total d’animaux sera de 336 rats. Ce nombre a été calculé pour s'assurer de la faisabilité du projet pour mettre en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique: les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après: carré de lanière kraft et batonnet en bois. Un enrichissement pour se cacher et grimper pourra être ajouté (tunnel, hutte ou équivalent en PVC ou autre). Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, certaines analyses cardiovasculaires seront réalisées après habituation, afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis. Pour réduire les nuisances, les actions suivantes seront réalisées: Lors de l’anesthésie, la température interne est suivie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour limiter l’hypothermie, et une attention particulière est portée pour la période de réveil pour s’assurer de la bonne récupération des animaux, une analgésie est réalisée avant-pendant-après la pose de minipompe, le stress sera minimisé par une habituation, de la nourriture molle/hydratée sera ajoutée dans la cage si perte de poids et de mobilité, le comportement des animaux sera surveillé attentivement, en référence à une grille de scoring de l’animalerie

Choix des espèces

L'espèce rat a été choisie car c'est un modèle établi pour le développement de maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons d'un modèle de rats génétiquement modifiés qui permet de remplacer la séquence codante d’un gène de rat par celle de l’homme. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Une plaie nécrosée, purulente ou suintante déclenche la mise à mort immédiate, tout comme une perte de plus de 20 % du poids maintenue trois jours ou une hypothermie persistante. 600 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements de tissus. Une inflammation de l'oreille leur est provoquée par injections répétées d'interleukine 23, puis elles reçoivent une à deux administrations par jour pendant seize jours, avec des mesures d'épaisseur de peau tous les deux jours et une prise de sang hebdomadaire. Les molécules testées appartiennent à des clients de l'établissement, dont le porteur écrit ne pas connaître la composition, et le choix de la souris tient notamment à ses "faibles coûts", à sa croissance rapide et à sa facilité de transport.

Objectifs

La dermatite atopique, encore appelée eczéma atopique, est une des maladies les plus fréquentes de l'enfant qui peut apparaître dès les premiers mois de la vie. L’origine de cette pathologie est principalement allergique. Il n’existe pas de traitement curatif efficace à ce jour. Les traitements utilisés sont symptomatiques et permettent de réduire les signes cliniques. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique pertinent permettant de tester l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). De ce fait, il est important d’avoir un modèle préclinique prédictif de la dermatite atopique afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques) qui permettront dans un futur proche d'apporter au patient plus de confort au quotidien.

Bénéfices attendus

Ces études permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traiements contre la dermatite atopique. Si une molécule se révélait efficace, elle permettrait d'améliorer la prise en charge des patients atteints de cette pathologie.

Procédures

Les interventions réalisées au cours de l'étude sont les suivantes: manipulation quotidienne (1 minute), contention pour administrations (une ou deux fois par jour pendant seize jours, durée d'environ trente secondes), anesthésie gazeuse pour l'induction et mesures au pied à coulisse ou par imagerie non invasive par tomographie de cohérence optique ou OCT (à huit occasions, tous les deux jours, environ 5 minutes), prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (une fois par semaine maximum, durée d'environ trois minutes).

Impact sur les animaux

L'injection répétée d'IL23 (interleukine 23) induit une inflammation locale au niveau de l'oreille. Il est possible également que des effets indésirables liés aux molécules testées apparaissent, mais ceux-ci sont difficiles à anticiper car il s'agit des molécules de nos clients dont nous n'avons pas connaissance. Le suivi clinique et la mise en place d'un scoring permettra de les détecter le plus précocément possible et d'adapter les traitements (dose, fréquence...) en conséquence.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés pour analyses.

Remplacement

L'utilisation du modèle animal de dermatite atopique ne sera utilisé qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro de dermatite atopique pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme)

Réduction

La stratégie d’expérimentation sera une expérimentation en mesures répétées (étude longitudinale) par observation répétée avec ou sans procédure d’imagerie. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées (seuil de significativité alpha de 5% dont le critère principal sera l'épaisseur de la peau du dos et des oreilles en fonction du temps) et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle car une observation est réalisée avant d’initier les phases de traitement. Le nombre d’animaux sera de 8 répartis en 5 groupes (un groupe induit mais non traité, un groupe induit et traité avec une molécule de référence, un groupe induit traité avec l'excipient de la molécule à tester, 2 groupes d’animaux devant recevoir la molécule à tester à deux différentes doses ou recevant 2 molécules à tester). Des analyses post mortem sur les tissus seront réalisées afin d’obtenir le plus d’informations possibles relatives à l’efficacité des molécules administrées sur les animaux. L'utilisation d'imagerie OCT permet également de réduire le nombre d'animaux utilisés de 50% du fait du suivi longitudinal de chaque animal. Une procédure d’évaluation de la dermatite atopique en imagerie est prévue et cette approche permettra de réduire le nombre d’animaux de 50 %. Dans le cadre d’une approche classique (approche en groupes parallèles, sans utilisation d’imagerie et sans application d’un plan en mesures répétées), le nombre d’animaux par groupe de traitement serait supérieur dans le cas où l'on voudrait suivre l'évolution de la pathologie au cours du temps (au moins 16 animaux par groupe, par exemple 8 animaux mis à mort à un temps intermédiaire et 8 animaux mis à mort à la fin de l'expérimentation dans le cas où une approche histologique classique serait envisagée).

Raffinement

Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites au niveau des oreilles et de la peau du dos...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation - Perte de poids >20 % du poids normal maintenue sur 72h - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si un de ces points limites est atteint, les animaux seront mis à mort immédiatement.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans ce projet (souris immunocompétentes) sont d’excellents modèles de dermatite atopique. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l’évaluation de la dermatite atopique induite dans ces espèces. De plus, ces animaux développent des symptômes de dermatite atopique très semblables à ceux observés chez l’humain. Ils présentent aussi certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~8-12 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants (maturité). Tous les animaux auront le même âge.

Des aiguilles plantées dans le muscle, suivies d'une décharge électrique qui perce la membrane des cellules : 433 souris Swiss femelles subissent une électroporation intramusculaire dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement des muscles injectés. Chaque animal peut recevoir jusqu'à huit anesthésies et sept injections intrapéritonéales, et passe chaque jour un test de réflexe, le "Digit Abduction Score". Le projet compare dix candidats myorelaxants à ARN messager destinés à traiter la dystonie et la spasticité chez l'humain. Le porteur classe le stress lié à ce test quotidien parmi les seules nuisances attendues, et le décrit ailleurs comme bref, indolore et peu stressant.

Objectifs

Cette étude a pour objectif dans un premier temps, de développer un modèle d’administration par électroporation (une brève impulsion électrique perce la membrane, permettant ainsi la délivrance de substances thérapeutiques à l'intérieur des cellules) de nos candidats médicaments pour le traitement des maladies la contraction musculaire, puis dans un deuxième temps, les comparer par dose réponse pour le traitement des maladies la contraction musculaire. Au final, l’ensemble de ces données de caractérisation serviront de base à la conception d’essai clinique chez l’homme. Nous démontrerons les bénéfices de nos produits face aux produits de référence utilisés en clinique. Ce projet expérimental d’optimisation concerne 10 produits d’intérêt identifiés suite à nos travaux précédents.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont donc un impact sociétal important. La dystonie, par exemple, est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entraîner des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques (ayant un effet sur tout l'organisme) comportent cependant tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après administration, et dont les effets seraient durables. Ainsi, ce projet apportera les bénéfices suivants : - Traitement efficace plus rapidement. - Traitement efficace sur du long terme.

Procédures

Anesthesies pour injection, mesure bioluminescence et éléctroporation, au maximum 8 anasthesie de 10-15 min. 1 injection intramusuclaire (durant anesthesie) : 30 sec pendant l'anesthesie. 7 injections intraperitoneale maximum : 30 sec 1 éléctroporation (injection d'aiguilles en intramusculaire, suivi d'une onde éléctrique) : 30 sec pendant l'anesthesie. Mesure du "Digit Abduction Score" tous les jours, 30 secondes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les seules nuisances attendues sont : - les douleurs associés aux injections (dans ce projet une injection intra-musculaire puis maximum 7 intrapéritonéal) - Stress associé au test du « Digit Abduction Score» - Stress lié aux anesthésies multiples

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront mis à mort. En effet, il n’est malheureusement pas possible de les réutiliser dans une nouvelle série d’expériences. De plus, dans ce projet, les muscles injectés seront prélevés pour des analyses ultérieurs.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (processus par lequel un médicament ou une substance active se déplace à travers les différentes phases du corps qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés. Le test "Digit Abduction Score" nous permet au contraire de mesurer l’activité myorelaxante tout en prenant en compte ce paramètre.

Réduction

Pour la réduction, les études précédemment réalisées nous ont donné un certain recul sur la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs ; Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 5 animaux par groupe. Nous réaliserons lors la première section, des expérience sur seulement 3 animaux, afin de vérifier la bonne tolérance et la validité des constructions réalisées.

Raffinement

Concernant le raffinement, les animaux seront hébergés en groupe de 5 avec enrichissement du milieu, et surveillés quotidiennement. Nos études précédentes nous ont permis un raffinement du modèle "Digit Abduction Score" chez la souris : l’injection intramusculaire dans le membre inférieur est réalisée sous anesthésie par un expérimentateur entraîné, et les mesures de "Digit Abduction Score" sont brèves, indolores et peu stressantes pour les animaux. De plus, pour les étapes d’imagerie, les animaux seront également anesthésiés. Observation quotidienne des animaux (apparence, consommation aliment et eau, comportement), pesée des animaux tout au long de la procédure (jour 0, 2, 4, 7 et 14 puis une fois par semaine si l’étude est plus longue). Pour chaque animal et donc chaque injection l’aiguille sera changée, nous utilisons ici des aiguilles stériles. Les points limites sont décrits dans chacune des procédures. De plus, tout autre signe clinique observé, indépendamment des procédures (pendant la période d’acclimatation par exemple), fera l’objet de soins tels que définis en accord avec le vétérinaire.

Choix des espèces

Souris swiss femelles âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (20g) et 8-9 semaines maximum en fin d’expérimentation (35-40g). La souris à été choisi dans ce projet car elles expriment les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire il existe une limite de diffusion dans les tissus. Le test du "digit abduction score" chez la souris, déjà éprouvé lors d'études précédentes, est au contraire un test reconnu pour sa pertinence pour étudier les myorelaxants. Des animaux juvéniles seront choisis pour leur capacité à exhiber un réflexe lors des tests "Digit Abduction Score". Les animaux âgés peuvent effectivement répondre de manière moins spontanée aux stimulations. Ils sont également plus légers, donc plus facile à stimuler.

Les souris de cette lignée portent une mutation qui les prive d'une partie de leurs défenses immunitaires et vaut à certaines une maladie proche du lupus humain, avec insuffisance rénale, dermite, dépilation, plaies et douleurs articulaires. 895 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, avec une croissance ralentie et une mortalité qui augmente à partir de six mois. Les souriceaux sont prélevés à l'oreille pour être génotypés, puis chaque animal subit trois à huit prélèvements de sang et d'urine, sans anesthésie, le porteur estimant les gestes assez rapides pour s'en passer. Les souris destinées aux expériences sont tuées pour le prélèvement des organes, celles qui atteignent un point limite le sont également, et les reproducteurs restent en vie pour entretenir la lignée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes d’une mutation génétique impactant les fonctions des lymphocytes (cellules incluses dans les globules blancs et impliquées dans la réponse du système immunitaire) ce qui conduit à induire un déficit immunitaire (baisse de la fonction d’une partie au moins des cellules du système immunitaire) chez les souris. Cette demande concerne le maintien de la lignée de souris portant cette mutation ainsi que l’identification de la mutation par analyse génétique pour identifier les animaux.

Bénéfices attendus

Les souris porteuse de la mutation étudiée dans ce projet présentent une baisse du taux de lymphocytes (phénotype de déficit immunitaire) et une inflammation pulmonaire, dont nous souhaitons comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par l’étude des cellules immunitaires des souris, et de leur production d’anticorps. La mutation gain étudiée a été décrite chez des patients atteints d’une maladie inflammatoire appelée SAVI, ainsi les mécanismes qui seront décrits grâce à l’étude des souris mutantes pourront permettre une meilleure compréhension de la maladie et une meilleure prise en charge des patients.

Procédures

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire. Un prélèvement tissulaire et plusieurs prélèvements sanguins et urinaires (prélèvements sanguins et urinaires mensuels avec un total de 3 ou 8 selon les groupes) pour seront réalisés sur chaque animal vigile pour une durée de 2 minutes environ pour chaque geste.

Impact sur les animaux

Les souris portant la mutation génétique étudiée dans ce projet développent un déficit immunitaire à phénotype dommageable avec une croissance moins importante et une mortalité accrue à partir de l’âge de 6 mois. Les souriceaux seront prélevés à l’oreille pour le génotypage, et un prélèvement sanguin sera réalisé sur chaque animal adulte utilisé dans les expériences, juste avant la mise à mort. Ces gestes peuvent générer de la douleur, cependant les gestes réalisés sont des gestes de base, rapides (moins de 2 minute par geste), pour lesquels nous sommes expérimentés, donc ils ne nécessitent pas d'anesthésie. De plus les animaux sont habitués à la contention réalisés pendant ces gestes, ce qui réduit leur stress. Une partie des animaux est susceptible de développer une maladie proche du lupus humain, qui peut causer une perte d'appétit et donc une perte de poids, une insuffissance rénale. De plus, les animaux peuvent développer un gonflement des ganlgions associé à une dermite, entrainant une dépilation et le développement de plaies. Le lupus peut également se matérialiser par des douleurs articulaires induisant des difficultés de déplacement.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle in vivo afin d'étudier les réponses immunes qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la moelle osseuse, le thymus et la rate. Pour ces raisons, nous ne pouvons avoir recours à des modèles in vitro. En ce qui concerne les modèles in vivo, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire, car les connaissances chez la souris sont très développées dans le domaine de l'immunité.

Réduction

Le nombre total d‘animaux comprend les animaux pour accouplements et les animaux issus des accouplements et nécessaires pour l’expérimentation pour le projet scientifique associé. La production des animaux sera planifiée afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage. Les croisements seront arrêtés dès l'obtention des lots expérimentaux afin d'éviter la surproduction.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Chaque animal sera mis à mort dès que le score correspondant au point limite est atteint. La production des animaux sera planifiée et suivie par l'expérimentateur et les zootechniciens de l’établissement utilisateur afin de limiter le nombre des animaux générés au strict nécessaire pour les besoins expérimentaux et l’élevage.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'immunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer (entre 2-3 mois d'âge et 8 mois) pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations compris entre 2-3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et 8 mois.

120 macaques crabiers vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, et pour 96 d'entre eux le protocole prévoit une quarantaine d'anesthésies par animal. S'y ajoutent, toujours par individu, une quarantaine de prises de sang, sept ponctions de moelle osseuse, neuf biopsies, vingt-huit écouvillonnages, douze lavages broncho-alvéolaires et l'implantation d'une puce de télémétrie. Infectés par la grippe une ou deux fois, ils sont isolés en cage individuelle jusqu'à huit semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress et d'ennui. 38 macaques sont tués pour le prélèvement de leurs organes, les 82 autres restent en vie afin d'être réutilisés dans d'autres projets.

Objectifs

La grippe est une maladie infectieuse et contagieuse causée par un virus influenza, affectant principalement le système respiratoire. La transmission interhumaine du virus se fait majoritairement par voie aéroportée par l’excrétion de gouttelettes dans l’air (toux, éternuement, parole, respiration). Il existe 3 catégories de virus influenza infectant l’Homme : A, B et C. Les classes A et B du virus sont responsables des épidémies saisonnières. Les infections causées par un virus de la classe C induisent des symptômes plus faibles, s’apparentant à un rhume. Lors de la pandémie de 2009, le virus H1N1 a infecté entre 700 millions et 1,9 milliard d’individus dont environ 300 000 n’ont pas survécu. A ce jour, des traitements antiviraux administrés en prophylaxie ou en thérapeutique permettent de diminuer la sévérité des symptômes et la durée de la maladie. De plus, des campagnes de vaccination, fortement recommandée chez les personnes à risque, sont mises en place chaque année afin de limiter la propagation du virus et les formes graves de l’infection en réduisant les complications et leur incidence. En France, on estime sauver en moyenne 2 000 personnes âgées de 65 ans et plus par an grâce à la vaccination. Malgré l’application de traitements antiviraux et la vaccination, qui reste le moyen le plus efficace de se prémunir de la maladie, les épidémies saisonnières actuelles touchent encore 2 à 6 millions de personnes en France chaque année et sont responsables d’environ 10 000 décès. La constante évolution du virus rend, certaines années, l’efficacité de la vaccination insuffisante et nous oblige à ajuster la composition du vaccin en fonction des modifications génétiques identifiées. L’amélioration des vaccins, notamment en ciblant les parties conservées du virus, permettrait de cibler un spectre plus large de virus et de protéger contre les différents variants. Dans ce projet, nous prévoyons d’établir de nouveaux modèles de primates non humains d’infection pour tester de nouvelles stratégies vaccinales, .

Bénéfices attendus

Les nouveaux modèles d’infection qui auront été développés permettront d’avoir un modèle plus proche de l’infection humaine. Les candidats vaccins qui auront montré des résultats satisfaisants chez les modèles primates non-humains pourront à court terme être utilisés lors d’essai cliniques chez l’Homme. Ils pourront, à long terme, recevoir une autorisation de mise sur le marché pour être utilisés à grande échelle et ainsi protéger la population mondiale contre la grippe saisonnière.

Procédures

Les différentes interventions prévues dans ce projet sont : - Anesthésie des animaux (20 fois environ (24 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Immunisation avec des candidats vaccins (3 fois environ, 5 minutes, 96 animaux) - Infection par le virus influenza (1 fois si naïfs ; 2 fois si convalescents, 15 minutes, 112 animaux) - Prélèvement de sang (20 fois environ (24 animaux) ; 41 fois environ (96 animaux), 5 minutes) - Prélèvement de moelle osseuse (3 fois environ (24 animaux) ; 7 fois environ (96 animaux), 10 minutes) - Biopsie (5 fois environ (24 animaux) ; 9 fois environ (96 animaux), 30 minutes) - Ecouvillonnage mucosal (19 fois environ (24 animaux) ; 28 fois environ (96 animaux), 2 minutes) - Lavage broncho-alvéolaire (7 fois environ (24 animaux) ; 12 fois environ (96 animaux), 20 minutes) - Implantation d’une puce de télémétrie (1 fois, 30 minutes, 120 animaux) - Imagerie in vivo (7 fois environ (24 animaux) ; 22 fois environ (96 animaux), 45 minutes) - Pléthysmographie (7 fois environ (24 animaux) ; 19 fois environ (96 animaux), 10 minutes) - Hébergement individuel (1 fois si naïfs ; 2 fois si convalescents, 8 semaines maximum, 112 animaux)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, des nuisances ou effets indésirables pourront être observés selon les interventions : Nuisances liées aux injections de vaccin (peu attendues) : Réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur dans les heures/jours suivant l’injection. Nuisances liées à l’infection par le virus influenza : Fatigue, difficultés respiratoires, fièvre, déshydratation, (dysorexie) troubles de l’appétit. Ces symptômes se résolvent spontanément dans les deux premières semaines qui suivent l’infection. Les nuisances sont peu attendues chez les animaux vaccinés. Nuisances liées aux anesthésies répétées, prélèvements de sang, moelle osseuse et biopsies : Trouble de l’appétit avec plus ou moins de perte de poids mineure, anémie transitoire (légère à modérée), hématome au niveau du site de prélèvement, infection cutanée dans les jours qui suivent le prélèvement. Nuisances liées à l’implantation de puces de télémétrie : Réaction locale au site d’incision : gonflement, suintement de la plaie (rare), démangeaisons, durée de 1 à 5 jours. Nuisances liées à l’hébergement individuel : L’hébergement individuel peut entrainer un stress ou de l’ennui.

Devenir

Certains animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d’intérêt dans le but de réaliser des analyses d’histopathologie. L’accès à ces prélèvements permet d’analyser en profondeur l’impact de la vaccination ou de l’exposition sur les organes, ce qui ne serait pas possible en clinique. Les animaux qui seront gardés en vie pourront être réutilisés, sur avis vétérinaire, dans de nouveaux projets compatibles avec leur historique afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, l’utilisation de l’animal de laboratoire est nécessaire pour reproduire la physiopathologie observée chez l’être humain suite à l’infection par le virus influenza, notamment la réponse à l’infection et l’immunité induite par la vaccination et par l’infection dans un organisme entier, ce qui n’est pas réalisable avec les modèles ne recourant pas à l’animal de laboratoire (in vitro, in silico et ex vivo). Enfin, le primate non humain étant proche physiologiquement de l’Homme, son utilisation permet une transposition plus optimale des résultats, ce qui serait moins adapté avec une autre espèce animale.

Réduction

Le nombre d’animaux dans chaque groupe est réduit au minimum nécessaire. Afin de sélectionner le meilleur modèle d’infection, des groupes de 2 individus seront utilisés. Afin de tester l’efficacité des candidats vaccins, le nombre d’animaux a été établi à 6 animaux par groupe expérimental permettant une analyse statistique des résultats par des tests non paramétriques adaptés aux petits effectifs. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés en recherche, les animaux utilisés dans les groupes non exposés permettant l’analyse métrologique du système d’inoculation, pourront être réutilisés dans les groupes exposés au pathogène. De même que les animaux convalescents pourront provenir des groupes déjà exposés dans le projet.

Raffinement

Les interventions et prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Un maximum de prélèvements et interventions seront regroupés afin de réduire le nombre d’anesthésies. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une diminution de l’appétit, une diversification et complémentation de l’alimentation pourra être instaurée par l’apport de fruits secs, fruits frais additionnels, compléments nutritionnels Une grille de scoring a été mise au point pour évaluation de l’état de santé. Des points limites ont été définis afin de limiter l’angoisse et la souffrance. Si ces points limites sont atteints, un traitement symptomatique pourra être administré et une euthanasie sera envisagée. Les prélèvements de sang, moelle osseuse et les biopsies pouvant entrainer l’apparition d’une réaction locale, un traitement symptomatique pourra être mis en place (désinfection, analgésie locale). Une analgésie est systématiquement appliquée lors de la ponction de moelle osseuse. L’implantation de puce permettant un suivi régulier de paramètres physiologiques peut induire une réaction au site d’incision (gonflement, suintement de la plaie). Un signalement au vétérinaire sera effectué qui pourra appliquer un traitement symptomatique (désinfection, analgésie locale). Un traitement analgésique est appliqué en peropératoire. Les animaux seront hébergés individuellement suite à l’exposition virale pour empêcher une surinfection liée à une contamination croisée, ce qui peut générer un stress ou de l’ennui. Le programme d’enrichissement pourra être étendu par ajout de dispositifs alimentaires, jouets, renforcement du contact positif. La durée de l’hébergement individuel, validée par la structure chargée du bien-être des animaux, pourra être réduite lorsque le virus ne sera plus détecté dans les fluides mucosaux. L’injection des vaccins pouvant entrainer une réaction locale (démangeaisons, douleurs) une désinfection et une analgésie locale pourront être appliquées sur décision du vétérinaire. Si la réaction locale est exacerbée (nécrose, suppuration) (pas attendu dans ce projet), l’euthanasie de l’animal sera envisagée. L’exposition au virus influenza peut conduire à l’apparition de difficultés respiratoires, fièvre, dysorexie, déshydratation et fatigue. En cas d’apparition de ces symptômes, un signalement au vétérinaire sera réalisé. En cas d’aggravation de l’état de santé des animaux (léthargie sévère, état moribond), l’euthanasie de l’animal sera envisagée.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus a été particulièrement choisi pour sa proximité phylogénétique de l’Homme, rendant la transposition des résultats plus optimale. En effet, les symptômes induits par l’infection influenza et les réponses immunitaires induites par la vaccination sont similaires à ceux qui sont observés chez l’Homme. Enfin, les outils permettant les analyses immunologiques sont développés et éprouvés. La grippe infectant des personnes de tout âge en clinique, nous pouvons réaliser les procédures sur des animaux ayant un panel d’âge étendu. Cependant, les nouveaux nés n’ayant pas un système immunitaire complètement développé, nous nous focaliserons sur des animaux sevrés et ayant un système immunitaire mature, donc au minimum âgés de 2 ans. Enfin, les candidats vaccins pourront être évalués chez des adultes lors des essais cliniques, donc il est plus pertinent d’utiliser des animaux ayant un système immunitaire similaire.

8 macaques crabiers vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit deux perfusions d'un anticorps couplé à un agent cytotoxique, sanglé quarante minutes sur une chaise de contention, et subit quinze prélèvements sanguins avant un prélèvement de moelle osseuse dont il ne se réveillera pas. Le porteur attend des diarrhées, des hématomes et des poussées de fièvre, et prévoit de projeter aux animaux un documentaire ou un dessin animé sur tablette pendant les contentions. Le projet sert à choisir laquelle de deux formulations passera l'étude réglementaire suivante, étape qualifiée d'"indispensable" dans le développement du candidat médicament.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir de deux formulations composés d’anticorps conjugués à des agents toxiques administrées à deux doses différentes de manière répétée (x2) en intra-veineux chez le singe cynomolgus (Macaca fascicularis) dans le cadre du développement d’un traitement anti-cancéreux chez l’homme. L’étude permettra de sélectionner la formulation et la dose maximale tolérée pour une future étude de toxicité réglementaire. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement et de selection du candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’un anticorps capable de cibler les tumeurs de manière très spécifique, couplé à un agent cytotoxique capable d’éliminer les cellules tumorales. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à deux reprises un candidat médicament par voie intra-veineuse. L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos de deux semaines entre les 2 administrations. Quinze prélèvements sanguins de 1 à 5ml par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Une sédation sera envisagée en cas de besoin. Un prélèvement de moelle osseuse par animal sera réalisé (sous anesthésie générale et analgésie). Le prélèvement durera environ 30 minutes (anesthésie comprise) Les animaux ne seront pas réveillés après le prélèvement. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions).

Impact sur les animaux

Sur la base du mode d’action des anticorps et de leur possible cible gastro-intestinale, des selles molles et/ou des diarrhée pourront être observées. Aussi, des réactions locales du type hématomes léger au niveau des sites d'administration et une réaction de type fièvre peuvent éventuellement apparaître les jours suivant les administrations. La réalisation de prélèvements sanguins et les administrations par voie intraveineuse pourront également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou oedème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction ou d'injection. Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la toxicité des candidats médicaments.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de sécurité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de : - déterminer la biodisponibilité de candidats médicaments; - étudier les relations dose-concentration et/ou dose-effet ; - prédire la voie et la dose d’administration chez l'Homme; - déterminer la forme galénique à utiliser. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 8 primates répartis en 4 lots de 2. Il a été réduit au minimum afin de tout de même obtenir des résultats fiables interprétables.

Raffinement

Un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie comprenant: - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de 27 jours sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (prise de sang, de température rectale, chaise à contention). Durant les administrations, les animaux seront assis sur des chaises à contention. Pour limiter leur stress et l’ennui, un personnel formé veillera à interagir avec les animaux, leur distribuer des friandises ou encore leur projeter un documentaire/dessin animé sur une tablette électronique par exemple. Des points limites seront mis en place afin de detecter précocément tout signe de stress ou de douleur.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain (PNH) a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle du système immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de cette molécule d’intérêt. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.