Procédures modérées

1 100 souris mâles âgées de 18 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie du crâne de quinze minutes pour recevoir le peptide bêta-amyloïde qui déclenche la pathologie, puis un traitement quotidien, des prélèvements sanguins jusqu'à deux fois par mois et des tests de mémoire de trente minutes par jour, du troisième au quinzième jour, en cage individuelle. L'âge des animaux augmente la mortalité attendue, et l'induction de la maladie peut provoquer pertes de mémoire et agressivité. Les bénéfices annoncés se limitent à la possibilité de faire apparaître de nouveaux traitements, sans que les molécules testées soient nommées ni l'étape suivante décrite. Sur le remplacement, le porteur affirme que seuls des tests sur animaux vigiles répondent à la question posée, les approches in vitro et in silico ne permettant pas selon lui de prédire l'effet d'un traitement sur des troubles cognitifs.

Objectifs

Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la MA.

Procédures

L'ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter la protéine pour induire la maladie d’Alzheimer. Cet acte chirurgical durera 15 min sous anesthésie générale. Un traitement quotidien sera administré sur animaux vigiles. Un prélèvement sanguin au maximum deux fois par mois sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s'étalant de J3 à J15 post-induction de la MA, seront réalisés pour une durée totale de 30 min maximum par jour, afin de mesurer les déficits de mémoire liés à la MA. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

L’hébergement en cage individuelle des animaux peut conduire à un stress transitoire par la limitation des interactions sociales directes. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire et une agressivité. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h). La mortalité peut se trouver légèrement augmentée de par le recours à des souris âgées pour mimer au mieux la MA. Les séries de prélèvements sanguins s’effectueront sur souris vigiles en moins d’une minute tout au long de l’étude.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale), afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

La MA est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem. Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles et isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (tunnel, brique d’Aspen et papier kraft), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection, anesthésie locale du site d’incision, gel ophtalmique pour prévenir de la déshydratation de la cornée) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une grande résistance et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris mâles C57BL6J âgées de 18 mois à l’arrivée au laboratoire. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. Il est admis que l’âge est un élément crucial dans le développement de la MA, dans ce contexte, l’utilisation de souris âgées de 18 mois afin de prendre en compte le facteur vieillissement est primordial.

Deux chirurgies de dix minutes séparées par trois injections, et entre les deux une douleur neuropathique installée pour deux semaines sans possibilité d'analgésie : 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'objet déclaré est de comprendre comment un récepteur identifié récemment interagit avec le système opioïde dans les réseaux nerveux de la douleur, pour ouvrir la voie à de nouveaux traitements. Le porteur signale une mobilité modifiée, des réactions exagérées ou diminuées et une perte de poids chez les animaux lésés, et indique que les points limites ont été établis de façon à permettre à l'animal de se soustraire à la souffrance. Ni les tests employés pour mesurer ces comportements ni le calcul qui aboutit à 360 souris ne sont précisés.

Objectifs

La manière dont la douleur aiguë se transforme en douleur pathologique chronique fait toujours l'objet de recherches approfondies afin d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Il est bien connu que la chronicisation de la douleur reflète un déséquilibre entre les systèmes sensoriels excitateurs et inhibiteurs en faveur des systèmes excitateurs (sensibilisation à la douleur). Plusieurs données de la littérature démontrent l'importance du système opioïde inhibiteur dans l'adaptation à la douleur après une blessure et sa perte d'effet analgésique dans des situations de douleurs neuropathiques. Un recepteur a recemment ete identifié comme jouant un role important dans la perte d'effet des opioides. Ce recepteur est donc une cnouvelle cible therapeutique prometeuse dans le traitement des douleurs neuropathiques.Le but de ce projet est d'etudier l'interaction de cette nouvelle cible therapeuthique avec le systeme opioide dans les reseaux neuronaux centraux impliqués dans l'integration des informations douloureuses.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre les mécanismes à l'origine de la chronicisation des douleurs neuropathiques périphériques et de la perte d'effet analgésique des opioides. Ainsi une meilleure compréhension des mécanismes sous-tendant la mise en place et la chronicisation des douleurs devrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie d'une durée de 10 minutes, 3 injections (1 minute max) puis une autre chirurgie d'une durée de 10 minutes. Les chirurgies sont réalisées sur aninal anesthésié et les injections sur animal vigil préalablement habitué a la manipulation.

Impact sur les animaux

Modèle neuropathique : -douleur sans possibilité d'analgésie -comportements et stress associés à la douleur. Ces comportements associés à l'état douloureux sont notammant: augmentation ou diminution de la mobilité (comportement spontané), hyporéaction ou hyperréaction (comportement provoqué). Le tout d'une d’une durée de 2 semaines. -perte de poids -irritation et inflammation au niveau de l'intervention Traitement par voie i;p : le stress de contention et l'inflammation du aux injections répétées

Devenir

mise à mort pour prélèvement

Remplacement

Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes spinaux responsables du développement des douleurs inflammatoires et du développement et du maintien des douleurs neuropathiques. Le réseau neuronal spinal est encore mal identifié et n’est pas modélisé à ce jour. Les connaissances actuelles ne permettent donc pas de réaliser des études par modélisation, sans avoir recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe a été établi en fonction de la dispersion des données mésurées lors des expériences précédemment publiées par l’équipe et afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.

Raffinement

Le raffinement est assuré en offrant un hébergement approprié aux souris, permettant de respecter leur éthogramme : les animaux sont hébergés dans des cages collectives enrichies avec des barrots de bois, et du matériel de nidification (coton et frisure). Lors des procédures invasives de réalisation du modèle douloureux (opération pour le modèle neuropathique) et lors du prélèvement de moelle épinière, les animaux sont maintenus sous anesthésie profonde. Les points limites ont été établis de facon à permettre à l'animal de se soustraire à la souffrance

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont largement utilisées en recherche sur le système nociceptif et sur la douleur. En effet, le système nociceptif de ces animaux étant evolutivement analogue à celui des humains (ce système est apparu chez l’ancêtre commun des rongeurs et des primates). Les souris représentent donc un bon modèle pour l’étude du système nociceptif. De nombreuses lignées de souris transgéniques sont disponibles, et pourrons dans le futur nous permettre de disséquer les mécanismes auxquels nous nous intéressons ; ce qui justifie l’utilisation du modèle murin. Tous les animaux utilisés seront adultes âgés de 6 à 12 semaines. Nous avons décidé de cet âge afin que toutes les études soient réalisées sur le même stade développemental, correspondant à un système spinal mature. De plus, ceci nous permettra de mettre nos résultats en parallèle avec les études disponibles dans la littérature (études comportementales, études histologiques, etc).

Quarante minutes de contention sur chaise à chaque administration, treize prélèvements sanguins par animal, et pour trois d'entre eux deux ponctions de liquide cérébrospinal sous anesthésie : 12 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent trois fois par voie intraveineuse des ARN interférents couplés à un anticorps censé leur faire franchir la barrière hématoencéphalique, pour un développement industriel de transport de médicaments vers le cerveau. Le porteur reconnaît que les ponctions peuvent provoquer une infection post-opératoire, de la fièvre ou un œdème au point de piqûre, et annonce dans le même temps n'attendre aucun effet indésirable lié au produit testé. Le choix du macaque tient selon lui à sa proximité phylogénétique avec l'être humain, et celui de jeunes adultes au fait que des animaux plus âgés présenteraient des anomalies susceptibles d'altérer la qualité des échantillons prélevés après leur mise à mort.

Objectifs

Ce projet consiste à étudier les effets et le devenir de trois molécules d'intérêts, conjugués à un même transporteur, passant la barrière hématoencéphalique chez le primate non humain dans le but de transporter des médicaments dans le système nerveux central. Le premier objectif est d’évaluer les structures qui sont ciblées dans le système nerveux central par les trois molécules d'intérêts. Le deuxième objectif est d’évaluer le devenir dans le sang des trois molécules d'intérêts couplées au transporteur avec deux méthodes différentes afin d’évaluer leur stabilité dans le sang. Le troisième objectif sera d’évaluer les concentrations dans le cerveau des trois molécules d'intérêts à la fin du projet. Enfin, le quatrième objectif sera d’évaluer le profil général de sécurité des molécules d'intérêts testées. Ce projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont, à terme, la validation et la mise sur le marché d’une molécule permettant le passage de médicaments directement dans le système nerveux central via une simple administration intraveineuse. Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Au cours de ce projet, les animaux vigiles recevront à trois reprises un candidat médicament par voie intra-veineuse (sédation en cas de besoin). L’injection durera 30 minutes et la contention sur chaise durera environ 40 minutes. Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’une semaine entre chaque administration. Treize prélèvements sanguins par animal seront réalisés sur toute la durée du projet (temps de contention : environ 5minutes). Une sédation sera envisagée en cas de besoin. Deux prélèvements de liquide cérébrospinal par animal seront réalisés sur 3 animaux (sous anesthésie générale et analgésie). La chirurgie durera environ 1 heure (anesthésie et réveil compris) Les animaux bénéficieront d’une période de repos d’environ 5 semaines entre les deux prélèvements. Le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) tout au long du projet nécessitera une contention d’environ 5 minutes. Pour le confort des animaux, certains prélèvements et suivis pourront être réalisés simultanément (ce qui diminuera le nombre de manipulations et de contentions). Des points limites précoces ont été déterminés afin de prendre en charge toute forme de douleur ou de souffrance. En cas d’atteinte d’un de ces points, l’animal concerné sera pris en charge selon les recommandations du vétérinaire.

Impact sur les animaux

Durant les administrations, les animaux seront placés sur des chaises à contention ce qui a pour conséquence de réduire leurs mouvements. Les animaux auront tout de même accès à de l’eau et des friandises durant la manipulation. D’après des études préliminaires réalisées sur le primate, nous n’attendons pas d’effet indésirable lié à l’élément d’essai sur ce projet. Les prélèvements sanguins pourront provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger) au niveau de la zone de ponction. Les prélèvements de liquide cérébrospinal pourront provoquer des réactions locales au niveau des sites de ponction, une infection post-opératoire et/ou une réaction systémique de type fièvre. L'anesthésie générale des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort liés la mise à jeun, à l'induction et au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...). Enfin, le suivi des paramètres physiologiques (poids et température corporelle) pourra provoquer un stress léger sur une courte période.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du projet dans le but de récolter les organes et d’évaluer la distribution et la toxicité des candidats médicaments.

Remplacement

Les études de pharmacocinétique et de sécurité chez l’animal sont indispensables au développement de nouvelles molécules pharmaceutiques. En effet, celles-ci permettent de : - déterminer la biodisponibilité de candidats médicaments; - étudier les relations dose-concentration et/ou dose-effet ; - prédire la voie et la dose d’administration chez l'Homme; - déterminer la forme galénique à utiliser. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre estimé d'animaux utilisés dans ce projet a été défini à 12 primates réparties en 4 lots de 3. 4 lots car nous testons trois molécules différentes (une molécule par lot) et un lot contrôle en plus pour pouvoir comparer les résultats selon une base. Le fait d'avoir 3 animaux par lot permet d'avoir plus d'assurance en cas de résultats variables au sein d'un groupe. En effet, des résultats divergeant sur deux animaux sont difficiles à interpréter, trois animaux par groupe est donc le plus petit nombre possible qui permet cette approche de détermination égalitaire des résultats.

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe dans des volières respectant les recommandations de la Directive Européenne 2010/63/UE. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement.Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce (exemple : température, hygrométrie, intensité lumineuse, cycle d'éclairage, renouvellement d'air). En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend : - Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; - De la litière pour leur permettre de fourrager ; - Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent ; - Des friandises (exemple : céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; - De la musique d'ambiance est diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation sera mise en place avant le début de l’étude. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur (à l’aide d’une grille d'évaluation de l'état clinique des animaux). De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress ont été déterminées au préalable sans compromettre les objectifs scientifiques de l’étude.

Choix des espèces

La molécule d’intérêt étudiée dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le primate non humain a été retenu dans le cadre de ce projet. En effet, les primates partagent de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de patrimoine génétique, de processus épigénétiques, d’organisation fonctionnelle de leur système nerveux et immunitaire, et de leurs principales caractéristiques physiologiques, cognitives et comportementales. Par conséquent, les données obtenues avec ce modèle sont communément les plus prédictives des réponses observées chez l'Homme vis à vis de ces molécules d’intérêt. Des animaux juvéniles seront utilisés dans ce projet (jeunes adultes). Dans la littérature, certaines études montrent que les animaux matures (>4ans) sont statistiquement plus sujet aux anomalies liées au vieillissement pouvant affecter la qualité des échantillons prélevés et notamment les analyses histologiques. Sachant que des prélèvements d’organes seront réalisés post-mortem dans ce projet, il est préférable d’écarter au maximum ce biais lié à l’âge des animaux.

Diabète déclenché par une injection unique d'une molécule toxique pour le pancréas, ou installé sur douze semaines par un régime gras et de l'eau sucrée : 540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent jusqu'à 24 prélèvements sanguins pour confirmer l'installation de la maladie, puis sept injections intrapéritonéales en quatorze jours, puis un test de tolérance au glucose de deux heures après cinq heures de jeûne. Le porteur décrit une augmentation de l'émission d'urine, une soif accrue et une perte de poids possible, et qualifie l'induction du diabète de "strictement nécessaire". Les souris sont ensuite tuées pour prélever pancréas, foie, muscles et tissus adipeux, à la recherche de facteurs musculaires qui pourraient un jour régénérer des cellules productrices d'insuline chez des patients.

Objectifs

Les diabètes de type 1 et 2 sont caractérisés par une augmentation de la concentration du sucre dans le sang entrainant notamment des maladies du cœur et des reins mettant ainsi en jeu la vie des patients diabétiques. L’excès de sucre dans le sang se met en place lorsque le pancréas produit de façon insuffisante l’insuline qui est l’hormone capable de baisser la concentration de sucre dans le sang. La piste thérapeutique explorée vise à augmenter la production d’insuline par le pancréas pour traiter ces maladies. Les muscles squelettiques de souris peuvent produire différents facteurs capables d’augmenter le nombre de cellules productrices d’insuline sur des pancréas de souris mis en culture, en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline à partir de cellules souches du pancréas. L’objectif sera donc de tester si ces facteurs peuvent également agir chez la souris de laboratoire diabétique (dans un modèle de diabète de type 1 et un modèle de diabète de type 2), en augmentant le nombre de cellules productrices d’insuline et par conséquence la quantité d’insuline produite.

Bénéfices attendus

Le diabète de type 1 est caractérisé par un déficit total en cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline, la seule hormone hypoglycémiante de l’organisme. Le diabète de type 2 est caractérisé par une résistance à l’insuline associée à une carence relative en insuline. En France, on dénombre 4,3 millions de personnes diabétiques. La prévalence augmente depuis des années et est passée de 5,6 pour cent en 2015 à 6,07 pour cent en 2021 (source Santé Publique France et Fédération Française des diabétiques). Si les tendances restent identiques, 520 000 personnes deviendront diabétiques d’ici 2027 en France. 90 pour cent des diabétiques sont atteints du diabète de type 2, maladie touchant préférentiellement les adultes et associée à l’obésité. 10 pour cent des patients sont atteints du diabète de type 1 dont le déclenchement est observé majoritairement chez l’enfant et est lié à une dérégulation du système immunitaire. Des traitements contre cette maladie existent avec notamment des anti-diabétiques oraux pour le diabète de type 2 et des injections quotidiennes d’insuline pour le diabète de type 1. Néanmoins, des nouvelles pistes de traitement doivent être explorées pour tenter de restaurer une production endogène d’insuline, permettant une régulation physiologique de la glycémie, notamment en stimulant la formation de nouvelles cellules productrices d’insuline dans le pancréas. Le projet actuel a donc pour objectif de définir le potentiel thérapeutique de différents facteurs pour restaurer chez la souris diabétique un nombre suffisant de cellules productrices d’insuline et ainsi permettre de normaliser la concentration de sucre dans le sang chez la souris diabétique.

Procédures

Une partie des animaux subira une induction d’un diabète qui se fera par injection unique sur animal vigile d’une molécule toxique pour une population de cellules du pancréas (quelques secondes par animal) effectuée après une mise à jeun courte (4h). Des prélèvements sanguins de faible volume effectués quotidiennement pendant 5 jours après l’injection permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 5 prélèvements sur la durée de maintien. Une autre parte des animaux sera nourri par un régime riche en graisse associé à l’administration de sucre dans l’eau de boisson pendant 12 semaines. Des prélèvements sanguins de faible volume (quelques microlitres) effectués 2 fois par semaines permettront de confirmer l’induction du diabète. Ces prélèvements sont effectués sur animal vigile et durent moins d’une minute par animal soit 24 prélèvements sur la durée de maintien. Les souris seront ensuite soumises à des traitements administrés par injections intrapéritonéales tous les 2 jours. Chaque souris recevra 7 injections sur une période de 14 jours. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. A la fin des traitements, les souris seront soumises à l’un des deux tests pour évaluer soit la tolérance au glucose ou celle à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun courte (5h), les souris seront injectées en intrapéritonéal et 5 à 7 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Les animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les souris concernent principalement l’induction d’un diabète chez les souris. Le diabète est associé à une augmentation de la concentration de sucre dans le sang pouvant impacter le bien-être des animaux avec notamment une augmentation de l’émission d’urine, de la prise de boisson et éventuellement une perte de poids. L’induction de cette pathologie est malheureusement strictement nécessaire pour mener à bien ce projet puisque notre objectif vise à identifier des thérapies innovantes pour traiter le diabète. L’induction du diabète de type 1 sera effectuée par administration unique d’un agent par injection au niveau de l’abdomen pouvant être source de stress et d’une douleur de courte durée au point d’injection. L’induction du diabète de type 2 sera effectuée en alimentant les animaux avec un régime hyperlipidique et du sucre dans l’eau de boisson. Le changement de régime pourra induire un léger stress. De même, le suivi glycémique longitudinal des animaux pourra induire un stress et une douleur de courte durée. Les traitements reposent sur une injection intrapéritonéale tous les 2 jours, pouvant ainsi induire un stress et une douleur de courte durée au point d’injection pour les animaux. Le traitement pourrait induire une production accrue d’insuline chez les souris non diabétiques. De ce fait, des épisodes d’hypoglycémies modérées pourraient prendre place chez les souris non diabétiques. D’autres effets secondaires pourraient être observés mais sont difficiles à prévoir et une surveillance accrue des souris sera réalisée quotidiennement. Les tests métaboliques, qui comprennent une injection intrapéritonéale puis plusieurs prélèvements sanguins de faible volume afin de suivre la glycémie, peuvent être source de stress et d’inconfort pour l’animal. Ils peuvent également induire un stress et une légère sensation de faim pour les animaux en raison de période courte de mise à jeun.

Devenir

Notre étude nécessite le prélèvement d’organes afin de caractériser l’effet des traitements mis en œuvre sur la pathologie étudié (le diabète). Ainsi, l’euthanasie des animaux est strictement nécessaire afin de répondre aux enjeux scientifiques du projet.

Remplacement

Les cellules bêta pancréatiques produisent l’insuline qui va agir sur ses tissus cibles pour stimuler le stockage du glucose, inhiber la production de glucose et la lipolyse. Lorsque l’insuline est produite en quantité insuffisante, la concentration de glucose dans le sang n’est plus régulée et augmente de façon chronique. C’est l’hyperglycémie qui est le symptôme premier du diabète, maladie multi-organes. Nous développons des stratégies afin de former de nouvelles cellules bêta dans le pancréas. Dans un premier temps, par des études in vitro sur un modèle d’explant de pancréas avec des résultats très prometteurs, puis in vivo sur un modèle de souris diabétiques pour augmenter la production d’insuline et résoudre l’hyperglycémie. Un organisme vivant est nécessaire pour établir la preuve d’efficacité des traitements par nos différents facteurs dans des modèles animaux de ces maladies humaines. Il n’est pas possible de recréer en culture de cellules la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires rentrant en jeu et de tester le potentiel thérapeutique de nos facteurs sur la résolution du diabète.

Réduction

Un total de 540 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet. Nous analyserons sur chaque souris les cellules bêta pancréatiques productrices d’insuline mais également les tissus cibles de l’insuline tels que le foie, les muscles squelettiques et les tissus adipeux gonadiques et sous cutanés. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe tout en nous assurant que nous obtiendrons des résultats statistiquement fiables. En effet, en raison des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, les procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (formation, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés . La principale contrainte concerne le développement du diabète nécessaire pour mener à bien ce projet. Les traitements devraient quant à eux réduire les effets liés à la pathologie avec de possibles effets secondaires mais qui semblent très limités. Toutefois, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids et de la glycémie sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Nos résultats ont montré chez la souris adulte que le muscle squelettique rendu insulino-résistant produisait des protéines appelées myokines pour lesquelles nous avons montré qu’elles possédaient in vitro la capacité de stimuler la formation de nouvelles cellules bêta sur un modèle d’explants pancréatiques. Notre projet vise à tester cette même capacité chez la souris adulte normale et diabétique de type 1 et de type 2 justifiant le choix de cette espèce. Justification du stade de développement : Notre projet vise à définir le potentiel thérapeutique de nos traitements pour former de nouvelles cellules bêta et à permettre une nouvelle production d’insuline par le pancréas adulte dans des modèles de souris diabétiques de type 1 et de type 2. Il convient donc d’utiliser des souris adultes pour ce projet.

Démontrer qu'un nouvel aliment thérapeutique fait mieux que celui utilisé depuis les années 1990 passe ici par la mise en malnutrition aiguë sévère de souris, un régime pauvre en protéines leur faisant perdre environ 15 % de leur poids en quatre jours. 420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever tube digestif, foie, rate, reins et cerveau. Elles subissent un gavage quotidien pendant sept jours, huit prélèvements de sang sous anesthésie, cinq séjours de dix heures en cage à fond grillagé pour collecter urine et fèces, et deux tests d'anxiété et d'activité locomotrice de dix minutes. Le porteur met en avant, parmi les bénéfices du nouvel aliment, une composition sans huile de palme ni graisses hydrogénées, plus respectueuse de l'environnement.

Objectifs

Selon un récent rapport de l’Organisation des Nations Unies, 828 millions de personnes ont été touchées par la faim dans le monde en 2021. Parmi les affections liées à la faim, la malnutrition aiguë sévère (MAS), qui se caractérise par une perte de poids très importante et une dysfonction du tube digestif, est une pathologie qui touche à l’échelle mondiale plus de 13 millions d’enfants âgés de moins de 5 ans. La perte de masse sévère chez les enfants de moins de 5 ans cause un cinquième de la mortalité infantile mondiale. Afin de lutter contre cette pathologie un aliment thérapeutique prêt à l’emploi (ATPE) a été développé à la fin du XXème siècle. La composition de cet ATPE n’a pas évolué depuis sa première formulation et pourrait être considérée comme désuète compte tenu des connaissances actuelles en physiologie de la digestion. Ce projet propose de montrer l’efficacité accrue d’un nouvel ATPE par rapport à l’ATPE existant sur la reprise de poids, la fonction intestinale et les fonctions cognitives de souris atteintes de malnutrition aiguë sévère.

Bénéfices attendus

Au terme de cette étude nous espérons apporter la preuve d’une meilleure efficacité d'un nouvel aliment prêt à l'emploi (ATPE2) par rapport à un ATPE1 de souris atteintes de malnutrition aiguë sévère et valider l’ATPE testé en tant qu’aliment thérapeutique pour combattre la malnutrition aiguë sévère. En plus d'apporter une nouvelle solution pour lutter contre la malnutrition aiguë sévère, la composition de l’ATPE2 est plus respectueuse de l’environnement car il ne contient pas de graisses hydrogénées ou d’huile de palme.

Procédures

Interventions sur animaux : 1) Alimentation hypo-protéinée à volonté pour 360 souris vigiles. 2) Administration par gavage sur 360 souris vigiles (Durée 15 sec ; 1x tous les jours pendant 7 jours) 3) Administration à volonté de l’aliment thérapeutique prêt à l’emploi sur 360 souris vigiles (Durée 5 min/jours pendant 50 jours). Les souris seront placées dans une cage vide avec une boite de pétri contenant l’aliment thérapeutique prêt à l’emploi ou d’aliment standard. 4) Contention pour mesure de la masse (1x/jours tous les jours, 10 sec), de la longueur de la queue (1x/jours tous les jours, 10 sec) sur 420 souris vigiles. 5) Prélèvement sanguin (1x/7 jours, soit 8 fois, durée 2 min) sur 420 souris anesthésiées. 6) Mesure de l’activité métabolique (cage avec un fond grillagé permettant de collecter l’urine et les fèces) avec une durée de 10h sur 420 souris vigiles (5x) 7) Mesure de l’anxiété et de l’activité locomotrice (1x avant traitement et 1x en fin de traitement, durée 10 min) sur 420 souris vigiles. Les souris sont placées dans une boite de 40x40 cm et sont libres d’explorer cette boite pendant 10 min.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de la malnutrition aiguë sévère est l’importante perte de poids qui, pour la souris, est de l’ordre de 15%. Cet effet est visible après 4 jours de régime hypo-protéiné. De plus, les souris modèles de malnutrition aiguë sévère n’ont pas une courbe de croissance normale, leur masse n’augmentant pas en fonction du temps. Les aliments thérapeutiques prêts à l’emploi sont des produits alimentaires destinés à l’humain et pourraient avoir des effets indésirables sur les souris (Ex : diarrhée). L’induction de la dysfonction intestinale peut provoquer une inflammation du système digestif chez la souris, ce qui pourrait aussi nuire à la digestion normale de l’animal. Enfin, les prélèvements sanguins répétés sur les souris (1 fois par semaine) lors de nos expérimentations pourraient engendrer des nuisances.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes pour des analyses biologiques. Ces analyses permettront de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet thérapeutique du nouvel ATPE. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter l’appareil digestif, le foie, la rate, les reins et le cerveau pour procéder à des analyses biologiques.

Remplacement

L’utilisation de l’animal est inévitable pour notre projet car nous cherchons à caractériser l’effet bénéfique d’un régime alimentaire au niveau systémique. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité.

Réduction

L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 20 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres biologiques sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux seront suivis quotidiennement, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. Dans le cadre de notre projet la perte de poids est l’élément majeur à prendre en compte. Dans le cas d’un animal montrant une perte de poids supérieur à 20% de son poids initial, l’animal sera exclu de l’étude le temps de son rétablissement et à nouveau alimenté pendant la période de convalescence. Si ce nouveau régime alimentaire ne permet pas une reprise de poids et que l’animal atteint les points limites définis il sera euthanasié. Par exemple, un animal sera euthanasié s’il présente une prostration continue, une déshydratation ou une perte de poids supérieure à 20% de son poids initial. Enfin, les études sont systématiquement optimisées (durée du régime) d’après la littérature. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible : alimentation (Administration à volonté). Enfin, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse afin de minimiser le stress induit par cet acte sur les animaux.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux vivants est un jalon nécessaire dans la conception de nouveaux médicaments, en particulier pour obtenir la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du produit que nous avons développé. Ce projet a pour but de démontrer qu’un nouvel aliment thérapeutique prêt à l’emploi est efficace dans un modèle de malnutrition aiguë sévère (MAS). Les rongeurs et en particulier les souris, sont fréquemment utilisés pour modéliser les maladies humaines. La pathologie dans notre étude est induite par une diminution de l’apport journalier en protéine. Les souris présentent, dans ce cas, bon nombre des signes physiopathologiques caractéristiques de la maladie (dont la perte de poids, ralentissement du développement). Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il est simple, rapide d’utiliser cette espèce et qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles, par rapport aux autres espèces. La malnutrition aiguë sévère est une pathologie qui peut affecter les individus à tout âge. Nous focaliserons notre étude sur la période de développement post-sevrage jusqu’à l’âge adulte. Les symptômes induits par la MAS, ainsi que les effets indésirables, ont une influence délétère à long terme lorsque cette pathologie intervient pendant l’enfance. Il s’agit donc ici de modéliser cette affection durant le développement, ce qui correspondra à la MAS observée durant l’enfance. De plus, des paramètres de développement pourront être mesurés durant l’expérimentation et comparés à ceux d’un développement normal (Poids, dimension des organes) en fonction de l’âge des animaux.

150 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin du projet pour confirmer les résultats d'imagerie par des coupes histologiques. Cent d'entre elles reçoivent une implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau, cinquante une injection intraveineuse, puis une partie est irradiée en une ou plusieurs séances de radiothérapie et toutes passent des IRM répétées sous anesthésie, avec injection d'un produit de contraste à chaque examen et un transfert vers un autre établissement pour le suivi. Le porteur indique que les tumeurs cérébrales peuvent provoquer titubation, léthargie, tête penchée, tremblements et crises d'épilepsie, et qu'une nécrose du tissu cérébral sain pourrait devenir douloureuse. L'objectif est de mettre au point une séquence IRM capable de distinguer une récidive tumorale d'une nécrose due aux rayons, le suivi s'arrêtant quand une souris a perdu 15 % de son poids.

Objectifs

Chaque année, environ 65 000 européens sont diagnostiqués avec une tumeur cérébrale primitive. La radiothérapie est une option thérapeutique établie en association avec une chimiothérapie ou une résection chirurgicale. Même si son efficacité a largement été prouvée, la radiothérapie peut cependant engendrer des phénomènes nécrotiques et inflammatoires intenses, appelés radio-nécrose, 6 mois à 2 ans chez près de 25% des patients. Cette radio-nécrose est un effet secondaire de la radiothérapie et limite la précision de l'évaluation de la réponse tumorale à la thérapie. En effet, ces lésions dues aux radiations peuvent être confondues avec la progression tumorale, d'où le terme parfois utilisé « pseudoprogression ». A ce jour, seule l’analyse d’échantillons extraits par biopsie s’avère être totalement fiable pour différencier ces deux phénomènes. Mais la biopsie reste une intervention chirurgicale pouvant présenter certains risques pour le patient et le résultat peut s’avérer peu informatif étant donnée la petite taille de l’échantillon vis-à-vis du volume et de l’hétérogénéité tumorale. Diagnostiquer précisément le plus tôt possible une radionécrose ou une récidive est essentielle afin d’adapter au mieux le traitement. En effet, la progression tumorale et la radio-nécrose ont des approches thérapeutiques et des pronostics différents : des sessions supplémentaires de radiothérapie peuvent être bénéfiques pour les patients présentant une récidive de la maladie, alors qu'elles sont contre-indiquées lors de présence de radionécrose. Par conséquent, des biomarqueurs spécifiques et sensibles sont nécessaires pour différencier le plus tôt possible les deux effets. Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie. Ainsi, l’objectif de cette demande est de développer un modèle de radionécrose chez la souris portant un gliome.

Bénéfices attendus

Ces modèles sont représentatifs de cas chez l’homme, donc la méthodologie IRM pourra être transférée rapidement. L’IRM devrait permettre de détecter la radionécrose, et de la différencier de la pseudo-progression. Les données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour 1) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies chirurgicales et 2) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie. Ces informations sont cruciales pour mieux orienter le traitement du patient.

Procédures

Un premier groupe de 100 animaux sera soumis à une implantation de cellules cancéreuses dans le cerveau (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Un deuxième groupe de 50 animaux sera soumis à une injection de cellules cancéreuses en intraveineux (en une seule fois) puis traités par radiothérapie (session unique ou répétée) ou pas. Toutes les procédures seront réalisées sous anesthésie générale. Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse d'un agent de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d'au minimum 3 jours.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.

Devenir

A l’issue de la radiothérapie (ou pas pour les contrôles), les animaux seront transférés à un autre établissement utilisateur pour les héberger à proximité d’une plateforme d’imagerie pour leur suivi par IRM. A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés afin de confirmer les résultats IRM avec des coupes histologiques.

Remplacement

Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic précoce et fiable de la radionécrose. Il n'existe pas de modélisation suffisamment aboutie pour reconstituer un micro-environnement tumoral, une immunité, et une vascularisation tumorale suffisamment intégrée pour reconstituer un modèle proche de l'homme. L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.

Réduction

Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de quatre jours entre chaque examen. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.

Raffinement

Pendant les chirurgies et les examens IRM, l'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle visuel de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. Au cours du suivi post-opératoire, les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Des points limites ont été instaurés pour surveiller la santé et le bien-être des animaux. Si des signes de souffrance apparaissent, les animaux seront soit euthanasiés soit pris en charge par un analgésique. Les animaux seront observés au réveil pour une recherche de signes cliniques de la douleur. Les animaux sont observés 2 fois par jour pendant les 3 jours suivant les chirurgies puis 1 fois par jour. La fréquence repassera à 2 fois par jours en cas de début de perte de poids (10%).

Choix des espèces

Les souris sont des animaux permettant d'obtenir des modèles oncologiques, proches de ceux rencontrés chez l'homme. De plus, leur variabilité inter-individuelle est faible, permettant d'établir des protocoles IRM reproductibles, avant tout transfert à l'homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.

La barrière qui protège le cerveau est ouverte par ultrasons focalisés, geste qui peut provoquer des microhémorragies cérébrales ou un œdème visibles à l'imagerie. 36 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées après la dernière séance d'imagerie. Elles font l'aller-retour entre leur animalerie et une plateforme d'imagerie, reçoivent une molécule radioactive par voie intraveineuse et passent jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie, d'une heure au maximum chacune, l'enjeu étant de mettre au point un traceur pour diagnostiquer plus tôt la maladie d'Alzheimer chez l'être humain. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est attendu puisque les souris sont anesthésiées pendant l'imagerie, et annonce des points limites "adaptés aux modèles" sans dire lesquels.

Objectifs

L’objectif global du projet est de développer une nouvelle molécule radioactive pour identifier en scintigraphie une protéine dans la maladie d’Alzheimer chez l’humain. Evaluer l’entrée de la molécule radioactive dans le cerveau d’une souris après application d’ultrasons. Evaluer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau de ces souris. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents mais voisins.

Bénéfices attendus

Confirmer que la molécule radioactive reconnait sa cible dans le cerveau des souris. Cette étape permettra de poursuivre le développement de la molécule radioactive, le but étant de pouvoir l’utiliser chez l’humain pour le diagnostic précoce et le suivi des traitements de la maladie d’Alzheimer.

Procédures

Les souris seront transportées depuis leur animalerie d’hébergement jusqu’à une plateforme d’imagerie (10 min) dans laquelle elles seront anesthésiées afin d’effectuer une ouverture temporaire de la barrière protégeant le cerveau pour faire entrer la molécule radioactive (durée quelques minutes), et toujours sous anesthésie des images IRM pour confirmer cette ouverture. Les animaux réveillés retournent dans leur établissement utilisateur principal pour injection intraveineuse de la molécule radioactive, à la suite de laquelle des images seront réalisées à différents temps, sous anesthésie (durée maximum d’une heure par image, jusqu’à 8 temps d’imagerie).

Impact sur les animaux

La procédure d’ouverture de la barrière du cerveau par ultrasons peut entrainer de possibles microhémorragies cérébrales ou un œdème identifiable en imagerie. Aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux qui sont sous anesthésie gazeuse pendant les sessions d’imagerie. Le transport et le changement d’animalerie peuvent induire un stress léger lié au balancement des cages et au changement de température. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min. Le réveil d’anesthésie ainsi que l‘injection intraveineuse de la molécule radioactive peuvent également causer un stress léger.

Devenir

A la fin de la dernière session d’imagerie, les souris seront mises à mort. Des analyses post mortem seront effectuées pour détecter d’éventuelles conséquences de la procédure d’ultrasons et pour déterminer la distribution de la molécule radioactive dans le cerveau.

Remplacement

Des modèles in vitro de la membrane protégeant le cerveau ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Malheureusement, les techniques in vitro démontrent une perte rapide de leurs propriétés. Leur utilisation est donc limitée. Néanmoins, ces modèles nous ont permis de réaliser des études préliminaires de sélection, mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des molécules radioactives définitives et la reconnaissance de la cible, en raison de la combinaison de tous les aspects complexes du cerveau.

Réduction

Nous limitons le projet aux seules expériences considérées comme absolument indispensables chez l’animal. Au total 36 souris seront utilisées. Il s’agit du minimum d’animaux nécessaire afin de pouvoir obtenir des résultats exploitables durant le protocole prévu. L’imagerie permet également de réduire le nombre d’animaux puisqu’une même souris peut être imagée à plusieurs reprises si elle n’est pas mise à mort en fin de procédure.

Raffinement

Une attention particulière sera apportée au bien-être des animaux avec ajout d’objets récréatifs , un hébergement par groupe et un suivi de leur bien-être sera effectué quotidiennement. Des points limites adaptés aux modèles permettront de réduire le stress et la souffrance. Les sessions d’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale, avec une anesthésie inférieure à 1h. Les animaux seront placés sur un lit avec couverture chauffante le temps de l’imagerie et la fréquence respiratoire sera monitorée en continu afin de contrôler le degré d’anesthésie et de le moduler si nécessaire, un médicament contre la douleur pourra également être administré. Le transport et changement d’animalerie se fera avec soin en isolant les animaux des stimuli extérieurs. La cage sera transportée avec soin et isolée des stimuli extérieurs ainsi que thermiquement. Le transport sera également inférieur à 10 min.

Choix des espèces

Il existe des modèles de souris génétiquement modifiées présentant la cible pathologique étudiée. Le protocole concernera uniquement des souris adultes car la maladie se développe progressivement dans le temps et n’est donc détectable qu’à l’âge adulte.

Opérées pour provoquer un lymphœdème d'une patte, 360 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, et celles qui passent en fin de protocole une lymphographie sous anesthésie générale sont tuées sans réveil. Le projet étudie le rôle d'une enzyme dans la fibrose qui suit le lymphœdème après un cancer du sein, et dans la dissémination des métastases, sur des souris privées de cette enzyme dans certains tissus. Un score de douleur et de stress égal ou supérieur à 10 sur 12 entraîne la mise à mort immédiate. Le porteur présente un gonflement de 10 à 15 % de la patte opérée comme le "seul effet indésirable attendu", dans un protocole qui prévoit aussi un gavage et une injection de cellules tumorales.

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalementimplique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation dusysteme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence un remodelage pathologique de la matrice extracellulaire promouvant la fibrose induit par une augmentation de l'expression d'une enzyme. Dans cette étude, nous proposons d'étudier l'impact de cette enzyme sur la matrice extracellulaire entourant les vaisseaux lymphatiques et l'impact sur leur fonction de drainage, paramètre critique pour le développement du lymphoedème. Des études ont par ailleurs suggéré que cette enzyme jouait un rôle dans la carcinogenèse, nous étudierons donc également si elle peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique

Bénéfices attendus

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : gavage oral, durée : 1min/animal. Les animaux seront égalements soumis à une procédure d'injection de cellules tumorales (10min/animal) Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études validées dans la littérature scientifique et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure. Un scoring des signes de douleur et de stress sera effectué suivant la grille de scoring mise en place par le service du bien-être animal de la zootechnie. Cette grille évalue 4 paramètres : apparence, prise de poids/alimentation, comportement naturel, comportement provoqué et permet d’établir un score de douleur/stress sur une échelle de 0 à 12. Tout animal obtenant un score égal ou supérieur à 10 sera immédiatement euthanasié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux. Le laboratoire est par ailleurs activement engagé dans le développement de microvaisseaux lymphatique in vitro de type "organe sur puce" pour améliorer la relevance physiologique des modèles in vitro et limiter au maximum l'utilisation des animaux

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif. Nous reduirons donc au maximum l'utilisation d'animaux dans ce protocole

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme étudiée a ete generée seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de cette enzyme de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques et dans les fibroblastes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 6 semaines. Les procedures seront realisees de 6 a 12 semaines

Comme l'hormone recombinante testée n'a pas d'autorisation de mise sur le marché, les brebis qui la reçoivent seront tuées et envoyées à l'équarrissage, tandis que les 25 brebis traitées avec l'hormone extraite du sang de juments gestantes retourneront dans l'élevage. 75 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et 50 d'entre elles seront donc tuées. Chacune passe par trois séries d'expériences, avec à chaque fois la pose d'une éponge dans le vagin, une injection d'hormone dans le muscle et, selon les lots, quinze jours de prises de sang quotidiennes à la jugulaire ou une prise unique. Le porteur affirme répondre aux attentes sociétales concernant "le bien-être animal" des juments, prélevées en grands volumes de sang puis souvent avortées, et fixe comme objectif final le "dépôt d'une demande de brevet" pour protéger la propriété intellectuelle.

Objectifs

La maîtrise de la reproduction en élevage des ruminants (bovins, ovins, caprins) ainsi que des porcins fait appel depuis 70 ans à une hormone naturelle très active, purifiée à partir de sang de juments gestantes (PMSG : Pregnant Mare Serum Gonadotropin, aussi appelée eCG : equine Chorionic Gonadotropin). Les fortes oppositions d’ordre éthique liées au bien-être animal nous ont conduit à envisager la production de cette hormone par génie génétique et sa production in vitro en cultures cellulaires, donc sans prélèvement de sang sur des « animaux-usines ». L’objectif du projet est de réaliser une preuve de concept de la capacité des eCG recombinantes d’induire une ovulation fertile chez la brebis avec une efficacité similaire à celle de la eCG extraite du sang des juments gravides. L’objetif final est le dépôt d’une demande de brevet pour les eCG recombinantes afin de proteger la proprieté intellectuelle.

Bénéfices attendus

Le principale benefice de l’eCG recombinante est de répondre aux attentes sociétales concernant le bien-être animal. En effet, on évitera de prélever de grands volumes de sang chez des juments gestantes, puis souvent de réaliser les avortements car les concentrations baissent fortement dans la deuxième moitié de la gestation et qu’il est plus rentable pour la production de l’hormone de redémarrer une gestation. Redistribuer à des millions d’animaux d’élevage une eCG partiellement purifiée provenant de sérums de multiples juments, au statut sanitaire inconnu, constitue un risque. En 2017 l’Union Européenne a publié un rapport dans lequel elle se dit "vivement préoccupée par l'importation et l'utilisation de médicaments vétérinaires contenant de la eCG". Cette situation impacte très négativement l’image des industriels et des éleveurs, lesquels se trouveraient par ailleurs en grande difficulté en cas d’interdiction de la eCG naturelle. Par ailleurs, en l’état, la capacité de synchroniser les ovulations par des méthodes sans hormone (effet mâle et photopériode pour les brebis) est insuffisante pour la pratique efficace de l’insémination artificielle, véritable pilier de la diffusion du progrès génétique en élevage. Le besoin d’une molécule de type eCG est réel et pressant pour les entreprises et les éleveurs, avec un cahier des charges exigeant, respectueux du bien-être animal. Notre proposition est le développement d’une eCG recombinante largement similaire à la eCG mais n’impliquant pas, de fait, le prélèvement de volumes sanguins très conséquents chez des juments gestantes. Ceci permettrait donc d’éliminer l’utilisation des juments pour la production de l’eCG et par consequant une amélioration du bien être animal.

Procédures

Chaque brebis sera soumise à 3 séries d’expériences et chaque expérience est constituée de la pose d'une éponge intravaginale et d’une injection intramusculaire d’hormone suivie, en fonction des lots experimentaux, par quinze jours de prélèvements sanguins à raison d’un prélèvement par jour et par brebis ou d'un seul prélevement 8 jours après l'injection de l'hormone. Chaque prélèvement sanguin dure entre 3 et 5 seconds.

Impact sur les animaux

Les différentes prises de sang à la jugulaire peuvent engendrer une légère douleur ainsi qu’un hématome au niveau du site de prélèvement, les injections en intramusculaire peuvent également engendrer une légère douleur au niveau du site d’injection. De plus, la contention pour ces différents actes peut stresser les animaux. La pose d’une éponge intravaginale peut être désagréable pour la brebis.

Devenir

Comme l’eCG naturelle possède une AMM (autorisation de mise sur le marché) les 25 brebis traitées avec cette eCG seront réplacées et retourneront dans l’élevage. Par contre, comme l’eCG recombinante n’a pas d’AMM les brebis traitées avec cette molécule seront euthanasiées et envoyées à l’équarissage.

Remplacement

La physiologie est bien plus que la somme des multiples niveaux d’action – que nous sommes loin d’appréhender. Et cette somme ne peut pas être anticipée ; notre niveau de connaissance est très insuffisant. Chaque niveau interagit avec celui ou ceux qui a (ont) engendré son activité, et réagit aussi en fonction des niveaux d’intégration supérieurs afin de produire la réponse physiologique la mieux adaptée (le nombre de paramètres intégrés nous échappe largement mais reste la clé de l’adaptation des organismes à leur environnement – laquelle est en perpétuelle évolution). Tout cela ne peut se produire que dans un organisme entier ; aucune possibilité de reproduire cette somme d’interactions dans un modèle in vitro – on parle ici assurément de multiples (dizaines?) de types cellulaires et d’organes « indépendants » - ou dans un quelconque modèle in silico – qui restera toujours borné par les informations (partielles et incomplètes) dont nous pouvons le nourrir. Aujourd’hui, aucune approche in vitro ou in silico ne peut rendre compte de la complexité de ce qui se passe dans un organisme entier. Ceci justifie pleinement l’emploi d’animaux entiers ; seuls à même de rendre compte de ce que signifie la physiologie, et seule option valide pour espérer modifier les paramètres de celle-ci

Réduction

Nous allons réutiliser le même lot de brebis pour réaliser les trois experiences prévues dans le projet. Nous allons utiliser trois lots de 25 brebis. Ce nombre a été éstimé en utilisant un test de comparaison de deux proportions (proportion de brebis ayant ovulé et nombre d'ovulations fertiles dans chaque groupe).

Raffinement

Suite à l’injection et au prélèvement de sang nous donnerons des granulés à manger comme renforcement positif. Tout au long des experiences les animaux seront régulierement surveillés pour identifier des possibles signes de douleurs ou d’inconfort. Tout signe d’inconfort et/ou de douleur sera pris en charge par des antalgiques locaux. Les brebis étant des animaux sociaux resteront en groupe tout au long de l’expérience afin d’éviter un stress d’isolement social. Un suivi journalier sera mis en place tout au long de la période des prélèvements pour évaluer l'état de bienêtre des animaux en s'assurant que les points limites ne soient pas atteints. Le comportement et l'apparence seront suivi avec attention pour détecter d'éventuels signes de souffrance et de détresse. En cas de signe de détresse et de malêtre significatif, les animaux seront traités comme suit : Anti inflammatoire non stéroïdien en intramusculaire éventuellement renouvelé 48H après si signes douloureux. Dans le cas où ces traitements ne résulteraient pas en une amélioration significative de l’état des animaux, ou dans le cas où certains comportements témoignant une douleur seraient détectés les animaux seraient alors euthanasiés par surdosage de barbituriques intraveineux.

Choix des espèces

La brebis est une des espèces cibles pour l’utilisation d' eCGs recombinante dans la maitrise de la reproduction en élévage. En outre la brebis est un modèle largement utilisé pour l’étude de la reproduction chez les animaux d’élevage et nous pouvons nous baser sur une littérature très riche sur ce modèle. Pour pouvoir étudier l'effet sur l'ovulation et la fertilité nous utiliserons des brebis adultes.