Procédures modérées

Toutes les souris de ce projet sont immunodéprimées, pour que leur organisme ne rejette pas les cellules de mélanome humain qui leur sont injectées. 144 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'injection se fait dans l'oreille sous anesthésie, puis un groupe reçoit chaque jour une application du composé étudié, également sous anesthésie, et la progression des métastases est suivie par bioluminescence après injection de luciférine, jusqu'à dix minutes d'anesthésie par séance. Un dernier groupe reçoit l'injection sans anesthésie, et toutes sont tuées pour prélever les organes et comparer la position des lysosomes dans les cellules les plus invasives.

Objectifs

La progression du cancer et la formation de métastases repose sur la capacité des cellules tumorales à envahir de nouveaux tissus. Ceci implique la dégradation de la matrice extracellulaire par l'intermédiaire d'enzymes dont un certain nombre provient d'un compartiment dégradatif, le lysosome. Notre équipe a découvert que les cellules issues des mélanomes les plus agressifs possèdent des lysosomes plus périphériques et fusionnant plus fréquement avec la membrane plasmique. Ceci s'accomagne d'une plus grande dégradation de la matrice et de propriétés invasives plus développées in vitro. Nous souhaitons désormais déterminer si il en est de même in vivo chez la souris. Ce projet vise donc à comparer les capacités d'invasion et de métastases des plusieurs lignées cellulaires humaines qui présentent différentes localisations de leurs lysosomes (naturellement ou contrôlés artificiellement).

Bénéfices attendus

Meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux contrôlant la formation des métastases. Amelioration du diagnostique du mélanome et à plus long terme des thérapies visant à limiter la dissemination métastatique.

Procédures

Un groupe subira une injection de cellules tumorales dans l'oreille (sous anésthésie, dureé 3 minutes), puis une injection de luciférine suivi d'une anésthésie pour permettre l'imagerie par bioluminescence (durée 10 minutes). Un groupe subira une injection de cellules tumorales (sous anésthésie, dureé 3 minutes), puis une injection de luciférine suivi d'une anésthésie pour permettre l'imagerie par bioluminescence (durée 10 minutes). Un groupe subira une injection de cellules tumorales dans l'oreille (sous anésthésie, dureé 3 minutes), puis une application quotidienne de du composé etudié sur l'oreille accompagnée d'une anésthésie (durée 5 minutes). Un groupe subira une injection de cellules tumorales (sans anésthésie; durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées ou intraveineuse qui peuvent entrainer une légère inflammation au point d'injection. La progression métastatique peut s'accompagner de perte de poids et de difficultés à se déplacer. Les anésthésies répétées peuvent entrainer un stress sur l'animal. L'injection du composé testé doit diminuer la formation de métastases et donc avoir un effet bénéfique sur les animaux.

Devenir

Mise à mort de l'animal afin de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses.

Remplacement

Le modèle animal est essentiel à la finalisation de ce projet, car lui seul reproduit la complexité du microenvironnement que les cellules tumorales doivent envahir pour devenir métastatiques. Notre projet s'est jusqu'ici appuyé sur une combinaison d'approches in vitro en 2D et 3D et d'expériences réalisées chez l'embryon de poisson zèbre de moins de 5 jours post-fécondation, ce qui a grandement contribué à diminuer le nombre de souris prévues.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé au minimum mais néanmoins suffisamment pour pouvoir réaliser une analyse statistique pertinente. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier des travaux réalisant des expériences similaires.

Raffinement

Des points limites ont été établis pour limiter la souffrance animale. En cas de douleur, les symptômes seront traités par analgésie. Les animaux sont anésthésiés avant injections de cellules tumorales ou de luciferin. Les souris seront hébergées en groupe de maximum 5 par cage. Les cages seront enrichies avec des dômes de carton et l'ajout de bâtonnets en ouate. Les animaux seront hébergés au minimum 1 semaines avant le début de l’expérimentation pour permettre leur l’adaptation à l’animalerie. Les animaux étant immunodéprimés, ils sont conservés dans des portoirs ventilés afin d'éviter tout risque d'infection. Ils sont également manipulés sous hotte pour les même raisons. Les animaux sont habitués aux injections avant l'expérience.

Choix des espèces

La souris présente l’avantage d’avoir des organes très proches de ceux impliqués dans la pathologie humaine (en particulier la matrice extracellulaire). Au cours des dernières années, nous avons mis au point des outils et protocoles nous permettant de suivre par imagerie non-invasive dans la souris vivante la progression métastatique de carcinome mammaire par bioluminescence et par fluorescence. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines en début de procédure car nous avons mis au point nos protocoles et caractérisés la croissance tumorale et métastatique sur des animaux de cet âge.

1 100 souris mâles âgées de 15 à 18 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'équipe injecte dans le crâne de chaque souris, sous anesthésie, une protéine Tau destinée à déclencher une pathologie de type Alzheimer, puis administre un traitement quotidien, prélève du sang une fois par mois et fait passer des tests de mémoire de trente minutes par jour, du troisième au quinzième jour. Le porteur signale que l'induction peut provoquer pertes de mémoire et agressivité, et que l'âge avancé des souris augmente la mortalité attendue. Il annonce en une phrase que le projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements, et justifie l'ensemble en écrivant qu'il paraît "indispensable" de développer de nouveaux médicaments contre cette maladie.

Objectifs

Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la MA.

Procédures

L'ensemble des animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter la protéine pour induire la maladie d’Alzheimer. Cet acte chirurgical durera 15 minutes sous anesthésie générale. Un traitement quotidien sera administré sur animaux vigiles. Un prélèvement sanguin au maximum une fois par mois sera réalisé sur animaux vigiles. Des séries de tests comportementaux, s'étalant de J3 à J15 post-induction de la MA, seront réalisés pour une durée totale de 30 minutes maximum par jour, afin de mesurer les déficits de mémoire liés à la MA. Enfin, à la fin du projet, le cerveau sera prélevé. Les procédures pouvant engendrer une douleur seront réalisées sous anesthésie générale associée à une analgésie.

Impact sur les animaux

L’hébergement en cage individuelle des animaux durant la phase d'évaluation comportementale peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire et une agressivité. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h). La mortalité peut se trouver légèrement augmentée de par le recours à des souris âgées pour mimer au mieux la MA. Les séries de prélèvements sanguins s’effectueront sur souris vigiles en moins d’une minute tout au long de l’étude.

Devenir

Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin de la procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale), afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques.

Remplacement

La MA est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem (propagation de la protéine notamment). Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles et isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (tunnel, brique d’Aspen et papier kraft), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Une attention toute particulière sera portée aux animaux pendant la chirurgie (analgésie pré-opératoire, anesthésie générale, maintien de la température corporelle, désinfection, anesthésie locale du site d’incision, gel ophtalmique pour prévenir de la déshydratation de la cornée) ainsi qu’après (analgésie post-opératoire). Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une grande résistance et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques. Enfin, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant l’intégralité du projet : pesée des animaux et contrôle des points limites.

Choix des espèces

Les animaux utilisés seront des souris mâles C57BL6J âgées de 15 à 18 mois à l’arrivée au laboratoire. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. Il est admis que l’âge est un élément crucial dans le développement de la MA, dans ce contexte, l’utilisation de souris âgées de 15 à 18 mois afin de prendre en compte le facteur vieillissement est primordial.

Suivre où va un candidat médicament radiomarqué dans le corps d'une souris porteuse de tumeur, pour le compte d'entreprises clientes : 2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau de l'omoplate, puis jusqu'à dix prélèvements sanguins par microsampling en deux semaines, deux prélèvements par voie rétro-orbitaire, jusqu'à dix séances d'imagerie planaire et un prélèvement terminal intracardiaque. Le porteur mentionne un inconfort léger à modéré lié à la pousse de la tumeur et à son ulcération. Le nombre d'animaux par groupe est fixé par le client, ramené à deux souris dont les tumeurs seront exploitables, et le porteur présente ce criblage rapide comme un moyen d'éviter des études plus lourdes sur davantage d'animaux.

Objectifs

Chaque année, le cancer affecte des millions de personnes et représente la 2ème cause de décès dans le monde. Les modèles animaux sont encore aujourd’hui indispensables en cancérologie notamment pour comprendre la physiopathologie de ces maladies, trouver des thérapeutiques innovantes et évaluer leur efficacité. Les études de distributions tissulaire et sanguine de candidats médicaments représentent une étape essentielle dans le développement d’un médicament. Ces études, demandées par les conseils scientifiques des entreprises clientes, ont pour but la compréhension et l’analyse du devenir du médicament dans l’organisme, d’évaluer une potentielle accumulation de ce dernier dans les organes et/ou tissus et ainsi de pouvoir mieux appréhender d’éventuels effets indésirables. Dans le cadre d'études en cancérologie, il est également crucial de vérifier le ciblage spécifique des candidats médicaments pour les cellules cancéreuses que ce soit à but diagnostic ou thérapeutique. Cette distribution est rendue possible par le marquage du candidat médicament avec un élément radioactif non toxique aux doses utilisées, la radioactivité pouvant être suivie dans les tissus animaux après prélèvements ou par imagerie. L’objectif de ce projet est donc de suivre le devenir du candidat médicament par une technique d’imagerie et de faire une évaluation précoce du ciblage tumoral des molécules testées et de leur répartition vers d’autres organes non-cibles (majoritairement foie et reins) en utilisant un nombre réduit d’animaux. Ces études permettent un criblage rapide utilisant peu d’animaux de candidats médicaments avant de réaliser des études plus poussées de biodistribution classique et ainsi d’éviter ces études sur un nombre plus important d’animaux pour les candidats qui ne cibleraient pas spécifiquement les tumeurs. Ces études in vivo s’inscrivent dans un contexte d’études répétitives car elles seront réalisées selon un même schéma directeur expérimental ayant pour objectif l’étude pharmacologique d'une sélection de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la distribution tissulaire des composés thérapeutiques de nos clients dans l’organisme par imagerie (tissus cibles, notamment tumeurs et organes non-cibles où ils pourraient s’accumuler de manière non désirée) et ainsi de sélectionner ceux qui feront ensuite l'objet d'études de distribution tissulaire avec quantification (l’imagerie permettant d’avoir une très bonne idée de la répartition du candidat mais sans quantification précise) et / ou d'efficacité dans le cadre d'autres projets.

Procédures

Sur animal vigile : Pesée (de 1 à 3 fois/semaine, 20 s) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) ; Administration de composé pour analgésie /anesthésie (maximum 2 fois, 15 s); mesure du volume tumoral (1 à 7 fois/semaine, 20 s) ; Prélèvement de sang par microsampling (maximum 10 fois en 2 semaines , 1 min) Sur animal anesthésié : Tonte de l’omoplate en vue de la greffe ou de la mesure du volume tumoral (1-3 fois, 10 s) ; Greffe de cellules tumorales en sous-cutanée (omoplate) (1 injection, 15 s) ; Prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire (2 fois maximum , 30 sec) ; Prélèvement de sang terminal en intracardiaque sous analgésie (1 fois, 5 min) ; Administration de composé thérapeutique (maximum 2 fois, 15 s) ; Imagerie planaire (jusqu’à 10 fois ; 10min)

Impact sur les animaux

Stress et douleur légère liés à l’administration des molécules radiomarquées en sous cutanée, gavage oral, voie intra péritonéale, voie intramusculaire ou intraveineuse ; stress lié à l’anesthésie à l’isoflurane ; stress lié à la manipulation vigile pour les pesées ou les mesures de tumeurs au pied à coulisse ; stress et douleur légère liés au prélèvement par microsampling ou au niveau du sinus-orbital ; inconfort léger à modéré lié à la pousse tumorale et/ou à son ulcération.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux de chaque procédure lorsque l’une des conditions ci-après est remplie : Prélèvement d’organe ou de tumeur en cours de l’étude ; Atteinte d’un point limite justifiant la mise à mort de l’animale ; Fin de l’étude

Remplacement

Les molécules testes de nos clients ont fait l’objet d’études préliminaires d’efficacité in vitro et/ou in vivo au préalable. Néanmoins, évaluer la distribution tissulaire et l’accumulation d’un composé thérapeutique dans un organisme vivant implique d’être dans un système biologique complexe. En effet, son efficacité finale dépendra entre autres de son métabolisme et de sa distribution dans l'organisme ainsi que des caractéristiques de son environnement, ce qui n’est, actuellement pas possible de reproduire in vitro. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux dans le cadre de ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé par groupe est déterminé par le client en fonction des résultats préalables qu'il a obtenu avec le modèle tumoral sélectionné (homogénéité de la croissance des tumeurs SC). Ce nombre est réduit au minimum afin d’avoir 2 animaux par groupe dont les tumeurs seront homogènes et exploitables. En effet, la caméra planaire permet une vision fiable, rapide et reproductible de la distribution tissulaire. Elle peut représenter une étape préalable de validation rapide de candidats médicaments qui pourront être évalués dans un second temps par des méthodes quantitatives et robustes si pertinent. De plus, les biodistributions classiques entraînent la mise à mort des animaux à chaque temps d’intérêt. La mise en place de l’imagerie planaire par notre laboratoire permettra un suivi longitudinal des animaux et un nombre d’animaux utilisés bien moins important que lors de biodistributions classiques.

Raffinement

Afin de réduire la douleur, la souffrance et l'angoisse au maximum, les animaux sont surveillés quotidiennement et des points limites les plus précoces possibles sont mis en place. Les animaux sont également hébergés en groupes sociaux harmonieux de 2 à 6 par cage maximum dans un environnement enrichi comme la réglementation l'exige. Les injections et les prélèvements de sang effectués sur l’animal vivant le seront selon les bonnes pratiques de bien-être animal en termes de volumes, de matériel utilisé, d’anesthésie éventuelle et de préhension des animaux.

Choix des espèces

Le choix de la souris comme modèle in vivo est guidé par le haut niveau de similarité de sa biologie par rapport à l’homme, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation et des temps de gestation et de sevrage courts. De plus, l’analogie fonctionnelle des systèmes immunitaires murin et humain et l’existence de lignées immunodéprimées et/ou génétiquement altérées font de la souris un modèle pertinent pour analyser la distribution de candidats médicaments variés. Les souris seront utilisées à un âge compris entre 6 et 12 semaines lors de leur entrée en étude, âge auquel le système immunitaire de ces animaux est décrit comme mature.

Quinze jours d'acclimatation, deux prélèvements sanguins hebdomadaires, puis l'implantation sous la peau d'une pompe sous anesthésie générale, une heure d'intervention : 8 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La pompe diffuse une hormone qui fait monter leur taux de calcium sanguin, avec pour effets attendus apathie, diarrhées et augmentation du volume urinaire, avant l'injection de l'anticorps censé faire redescendre ce taux, dont un surdosage provoquerait contractions musculaires, faiblesse, tétanie et convulsions. Chaque jour à partir de l'implantation, un prélèvement sanguin est réalisé sur animal vigile, la contention durant cinq à dix minutes. La pompe est ensuite retirée sous anesthésie et les huit macaques sont gardés en vie, décision que le porteur présente comme une manière de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Objectifs

Ce projet a pour objectif d’évaluer l'effet pharmacodynamique et de définir la pharmacocinétique d’un anticorps monoclonal humanisé ciblant le recepteur PTH1R (récepteur à la parathormone) sur deux modèles différents d’hypercalcémie provoquée chez le primate : 1) un modèle d‘hyperparathyroïdie primaire (HPP), induit par la perfusion de parathormone (PTH), une hormone impliquée dans la régulation du calcium 2) un modèle d’hypercalcémie humoral maligne (HHM) induit par une perfusion de peptide lié à la parathormone (PTHrP), une hormone également impliquée dans la régulation du calcium L’augmentation provoquée de la PTH (dans le premier modèle) ou de la PTHrP (dans le second modèle) va induire une augmentation du taux de calcium sanguin. Le but de l’anticorps ciblant le récepteurs PTH1R est de faire diminuer ce taux de calcium dans les deux modèles (modèle HPP et HHM). Le projet constitue donc une étape importante et indispensable dans le processus de développement d’un candidat médicament. Des prélèvements sanguins répétés seront réalisés avant et après l’administration de l’anticorps. Différents paramètres physiologiques pertinents seront également relevés (température corporelle, poids). L’objectif scientifique de ce type d’étude n’est pas de rechercher une dose toxique. C’est pourquoi, toutes les doses utilisées dans ce projet sont, a priori, efficaces pharmacologiquement mais non toxiques.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont à terme la validation et la mise sur le marché d’un traitement permettant d’agir sur l’hypercalcémie lié à des pathologies comme la HPP (hyperparathyroïdie primaire) et HHM (hypercalcémie humorale maligne). Cette étude génèrera des données scientifiques qui permettront d’affiner les protocoles des études règlementaires sur le primate. Ainsi les connaissances acquises permettront de réduire le nombre d’animaux mais aussi d’adapter les méthodes de suivi et de raffinement spécifiques aux primates.

Procédures

Avant tout acte et dans le but de diminuer leur stress, les animaux bénéficieront d'une période d'acclimatation de minimum 15 jours. Les animaux recevront deux administrations par voie sous cutané de l’élément à tester. Après les administrations, les prélèvements de sang et un suivi des paramètres physiologiques (poids et/ou température corporelle) seront réalisés à intervalles de temps définis afin d'étudier l’évolution du taux de calcium et la pharmacocinétique de l’élément testé (temps contention compris entre 5 et 10 minutes en moyenne). Des mesures basales de ces données seront réalisées pour les comparer avec celles obtenues post-administration dans le but de détecter toute variation physiologique après administration du candidat médicament. Les volumes prélevés et administrés aux animaux tout au long du projet ainsi que les temps de repos accordés entre ces différents actes respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Les administrations de l’anticorps et les prélèvements de sang seront moins traumatisants pour les animaux qu'une anesthésie et seront donc réalisés sur animal vigile. Les prélèvements sanguins dureront ponction moins de 5 minutes en moyenne. En amont de la pose de la pompe, deux prélèvements quotidien seront réalisés une fois par semaine. A partir de l'implantation de la pompe, un prélèvement sera fait quotidiennement. La pompe permettant l’administration des hormones sera implantée en sous-cutané. Pour le confort et pour le bien-être des animaux, cet acte sera réalisé sous anesthésie générale (anesthésie chimique fixe).L'intervention durera environ une heure. Les animaux devront être mis à jeun avant la réalisation l’implantation (moins de 16h). Les animaux seront gardé en vie à la fin de la procédure ce qui implique l'explantation de la pompe. Cette prodédure ce dérulera de la même façon que l'implantation (anesthésie générale chimique). Cette intervention durera envrion 30 minutes. Enfin les animaux seront récompensés à la fin de toute manipulation.

Impact sur les animaux

L’induction d’une hypercalcémie peut provoquer des symptômes associés à cette biochimie. On pourrait observer une apathie (baisse d’énergie globale), des diarrhées ou encore une polyurie (augmentation du volume urinaire). A la suite de l’injection de l’anticorps, il pourrait y avoir une hypocalcémie. En effet, l’effet attendu de ce traitement est une diminution du taux de calcium. Une dose trop élevée lors des administrations de l’anticorps pourrait induire des effets indésirables. Les signes cliniques classiquement observés lors d’une hypocalcémie sévère sont : agitation, contractions musculaires faciales ou généralisées, faiblesses, anorexie, tétanie et convulsions. La réalisation de prélèvements sanguins pourra également provoquer un stress, une douleur légère et/ou l'apparition de réactions locales (du type hématome ou œdème léger par exemple) au niveau de la zone de ponction. L'anesthésie générale des animaux pourra également engendrer un stress ou une sensation d'inconfort lié : 1) à la mise à jeun, qui peut engendrer un stress léger. La durée de cette mise à jeun sera inférieure à 16h. 2) à la procédure d'induction (contention, administration, perte de conscience...); 3) au réveil de l'animal (risque de vomissements, perte d'équilibre...).

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de l'étude dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés à des fins scientifiques. Cette décision sera prise par un vétérinaire en consultation avec la SBEA (Structure en charge du Bien Etre Animal)

Remplacement

Cette étude de pharmacocinétique / pharmacodynamique chez l’animal est indispensable au développement d’une nouvelle molécule pharmaceutique. En effet, celle-ci permet de déterminer la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de la molécule testée. Actuellement, aucune méthode alternative à l'utilisation des animaux (ex : in-vitro, in silico...) n'est susceptible d'apporter le même niveau d'information qu'un organisme vivant entier et complexe dans ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques du projet et pour obtenir des résultats interprétables et transportable à l’homme. Pour ce projet 2 lots de 4 animaux (un lot HPP et un lot HHM) seront utilisés. Comme le protocole le permet, les animaux seront gardés en vie à l’issue de l’étude dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques (cette décision sera validée par un vétérinaire en consultation avec la SBEA (Structure en charge du Bien Être Animal)).

Raffinement

Afin d'optimiser leur bien-être et de leur permettre d'exprimer leurs besoins comportementaux, les animaux sont hébergés en groupes sociaux de même sexe. De l'eau fraîche ad libitum est mise à leur disposition et un aliment adapté à l'espèce et au poids de chaque individu est distribué quotidiennement. Les paramètres environnementaux de l'animalerie sont également suivis et contrôlés afin de répondre aux exigences physiologiques de l'espèce (ex : température, hygrométrie, intensité lumineuse, cycle d'éclairage, renouvellement d'air). En parallèle, un programme d'enrichissement complet est mis en place au sein de l'animalerie. Ce dernier comprend: 1) Des enrichissements structuraux permettant aux PNH d'évoluer dans un environnement tridimensionnel (perchoirs, barres transversales, grillages...) ; 2) De la litière pour leur permettre de fourrager; 3) Des jouets variés faisant l'objet d'une rotation une fois par semaine pour éviter que les animaux ne se lassent; 4) Des friandises (ex: céréales, fruits secs) et des fruits et légumes frais distribués quotidiennement (cachés dans la litière ou dans des jouets distributeurs) ; 5) De la musique d'ambiance diffusée pendant la journée à un volume raisonnable dans le but de réduire le stress en couvrant le bruit causé par les activités du personnel dans les salles adjacentes et en habituant les animaux à la voix humaine. Une période d'acclimatation de 15 jours minimum sera mise en place avant le début de l’étude pour permettre aux animaux de se familiariser avec leur environnement. Un programme d'habituation à l'Homme et de conditionnement aux actes techniques associés à du renforcement positif permettra de réduire le stress des animaux lié aux manipulations (contention, prise de sang, de température rectale). Les animaux seront suivis individuellement et bi-quotidiennement tout au long de l'étude pour détecter tout signe de stress ou de douleur (à l’aide d’une grille d'évaluation de l'état clinique des animaux). De même, le personnel veillera à garder une interaction quotidienne avec chaque animal afin de diminuer le stress qui pourrait être engendré par les manipulations. Les temps de repos accordés aux animaux entre les prélèvements et les volumes prélevés respecteront les recommandations éthiques en vigueur. Des mesures préventives et correctives de diminution de la douleur et du stress seront déterminées au préalable.

Choix des espèces

Le candidat médicament étudié dans ce projet étant à visée humaine, il est important d'avoir recours à un modèle animal pertinent et prédictif. En raison de sa proximité phylogénétique et physiologique avec l'Homme, le macaque cynomolgus (macaca fascicularis) a été retenu dans le cadre de ce projet. Cette espèce de primates non humains (PNH) partage de nombreuses similitudes avec l'Homme, notamment en termes de leurs principales caractéristiques physiologiques. La régulation du calcium par la PTH est connue pour être nettement différente chez les rongeurs et les chiens par rapport à l'homme, rendant ainsi les données obtenues chez ces espèces difficiles à interpréter en ce qui concerne la physiologie humaine. En comparaison, la molécule testée a déjà été testé sur des macaques cynomolgus et a montré un effet pharmacologique prolongé, confirmant ainsi la pertinence de cette espèce. Des jeunes adultes seront utilisés dans ce projet. En effet, à ce stade développement, les animaux disposent d’un système hormonale mature. De plus ce stade de développement a déjà été utilisé pour des études de pharmacodynamique.

Les petits sont tués avant ou peu après la naissance, au stade embryonnaire, le jour de la mise bas ou sept jours plus tard, pour prélever leur cerveau. 198 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles gestantes subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie, au plus tard quatre jours avant la mise bas, pour électroporer dans l'utérus deux plasmides différents selon les embryons, ce qui permet au porteur de diviser par deux le nombre de femelles utilisées. Il indique que cette chirurgie peut entraîner douleur, infection, hypothermie et difficultés lors de la mise bas, et conclut que l'étude de la formation du cerveau "nécessite" l'utilisation d'animaux.

Objectifs

L'objectif général de ce projet est de comprendre, gràce à la souris, l'origine de certaines malformations cérébrales qui ont lieu durant l'embryogenèse et conduisant à des troubles du comportement chez l'adulte (autisme).

Bénéfices attendus

Une meilleure comprehension des mécanismes impliqués dans la migration, la maturation et l'activité des neurones de cortex. De nouveaux champs d'étude pour les neurosciences et les pathologies qui y sont associées (autisme).

Procédures

Une procédure chirurgicale sous anesthésie (durée de l'intervention 30-45min).

Impact sur les animaux

Une chirurgie sur des femelles gestantes peut entrainer des complications à court terme (douleur, infection, hypothermie) et à long terme (difficultés lors de la mise bas).

Devenir

Mise à mort requise pour prelever le cerveau des animaux afin de réaliser des études histologique et electrophysiologique.

Remplacement

Ce projet s’intègre dans un projet plus global combinant différents travaux de recherche complémentaires allant de l’étude biochimique ou électrophysiologique au comportement. De nombreuses études « in-vitro » ont donc été effectuées au laboratoire sur des neurones en culture en amont de l’utilisation d’animaux pour limiter au maximum leur utilisation. Néanmoins, l'étude de la formation du cerveau nécessite l'utilisation d'animaux.

Réduction

Pour réduire de moitié le nombre de femelle gestante utilisée, nous avons choisi d'injecter deux plasmides par portées d'embryons. La moitié des embryons recevront le plasmide portant le gène muté et l'autre moitié le plasmide contrôle. Les embryons seront utilisés pour deux études : une étude histologique et une étude électrophysiologique des neurones du cortex.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’une anesthésie générale (induction par un mélange isoflurane et d’un traitement analgésique pre/post-opératoire. Après l’acte chirurgical, les animaux sont observés sur 72h, deux fois par jour (matin et après-midi), y compris le week-end. Lors de ces observations, on vérifie son comportement, l'état de la plaie, que la souris est capable de s’alimenter, de se redresser, de reconstruire et entretenir son nid. Si un signe anormal est repéré, un des responsables du bien-être des animaux interviendra afin de l’examiner et prendre les décisions qui s’imposent (mise en place de mesures conservatoires, euthanasie). Le vétérinaire référent sera également contacté. Si l’animal ne présente aucun signe d’amélioration après mise en place des mesures, il sera alors mis à mort. La décision de mise à mort sera prise par le responsable du projet en concertation avec la vétérinaire, si le responsable du projet est injoignable la vétérinaire prendra seule cette décision.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car l'étude du developpement du cortex cérébral necessite d'analyser un cerveau qui peut être comparé à celui de l'homme. Une majeure partie des études in-vitro ont été réalisées sur des neurones en culture provenant de cette même espèce et nous avons l'expertise de la technique chirurgicale (électroporation in-utero) chez la souris. Les animaux sont des femelles gestantes adulte. Le stade adulte est indispensable pour atteindre une maturité sexuelle indispensable à la mise en reproduction des futures femelles gestantes. La chirurgie est réalisée au plus tard 14.5 jours après l'accouplement, c’est-à-dire 4 jours avant la mise bas. Cette procédure a pour but de marquer les neurones du cortex durant leur migration afin de mieux comprendre le développement du cerveau des mammifères. Les embryons seront mis à mort soit au stade embryonnaire E17.5, à la naissance ou au stade post-natal P7. Ces trois stades nous permettent d'étudier, par histologie et electrophysiologie, la morphologie et l'activité des neurones au cours de leur developpement.

Les souris qui perdent plus de 15 % de leur poids sont tuées. 439 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des bactéries productrices d'acides gras par la bouche et par voie rectale, cette seconde voie sous anesthésie légère, et subissent un test de tolérance au glucose qui commence par une coupure d'un millimètre au bout de la queue, décrite par le porteur comme une douleur modérée à cicatrisation rapide. L'objet est de comprendre comment ces bactéries agissent sur l'axe intestin-cerveau, avec pour horizon des thérapies probiotiques contre l'obésité, le diabète et les troubles du comportement alimentaire, que le porteur range parmi les applications potentielles.

Objectifs

L'objectif principal de ce projet est d'identifier et de caractériser les mécanismes moléculaires par lesquels les souches bactériennes productrices d'acides gras polyinsaturés influencent l'axe intestin-cerveau et régulent l'équilibre énergétique chez la souris. Cette recherche vise à élucider comment ces interactions microbiennes peuvent moduler les fonctions intestinales et neurologiques, ainsi que leur impact sur le métabolisme énergétique global. Les résultats de cette étude permettront de mieux comprendre les bases biologiques sous-jacentes des effets du microbiote intestinal sur la santé métabolique et neurologique, ouvrant ainsi la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter des conditions telles que l'obésité, le diabète et les troubles du comportement alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus incluent une meilleure compréhension des interactions microbiote-intestin-cerveau, l'identification de nouveaux biomarqueurs et de cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement des maladies métaboliques et neurologiques. Les applications potentielles incluent le développement de nouvelles thérapies probiotiques et l'amélioration des stratégies de santé publique.

Procédures

Les souris seront soumises à la technique de l'enrichissement de flore, une technique de classe modérée consistant à inoculer des bactéries dans le microbiote intestinal des souris, par voie orale et/ou rectale. C'est une technique qui necessite une contention de courte duree (

Impact sur les animaux

Au vu de l'expérience dans le type de procédures mises en œuvre dans ce projet, qui ont toutes été déjà optimisées, il n'y pas de nuisances ou effets indésirables prévues qui pourraient conduire à la mise à mort anticipée des animaux. En ce qui concerne l'acte "d'enrichissement de flore", l'inoculation des bactéries productrices d'acides gras polyinsaturés par gavage chez l’animal est une technique qui necessite une contention de courte duree (

Devenir

Mise à mort pour prélèvement d'organes

Remplacement

Le contrôle du métabolisme fait intervenir de nombreux organes (foie, intestin, cerveau, muscles, tissus adipeux) qui communiquent entre eux, avec la contribution de produits du microbiote intestinal, en permanence pour informer l'organisme des besoins énergétiques et contrôles les flux énergétiques en fonction des besoins. Il est très difficile de mimer in vitro toutes ces interactions et c'est pour cela que l'utilisation des modèles animaux vivants est encore nécessaire

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons effectué un travail en amont qui nous a permis d'identifier les bactéries, non virulentes et qui peuvent croître dans des conditions préférable à la souris, grâce à des analyses in vitro et in silico. Ainsi cette sélection a abouti à ne retenir que les bactéries candidates les plus fiables et ce sont elles qui seront testées in vivo, réduisant ainsi le nombre d'animaux nécessaires à l'étude. Les échantillons prélevés chez chaque animal permettront de générer un grand nombre d’informations sur des marqueurs moléculaires. De plus, nous avons estimé la taille des échantillons (n=8) permettant une analyse statistique efficace grâce aux données de la littérature.

Raffinement

Les animaux seront maintenus avec leurs congénaires dans les milieux enrichis avec les morceaux de bois, une maison et des tubes en carton, ce qui permettra d'améliorer leur bien être. Les souris seront également observés quotidiennement et un suivi de poids et de la prise alimentaire seront réalisés 1 fois par semaine. Cela nous permettra d'identifier rapidement les animaux en souffrance. En cas de perte supérieure à 15% la souris sera euthanasiée. Pour réduire le stress infligé aux animaux, l'enrichissement de flore par voie rectale sera effectué sous anesthésie légère après passage dans une chambre d'induction à l'isoflurane, et le diamètre de la sonde est adaptée à la taille de l'animal. Les sondes sont en plastique ce qui ne causera pas de blessure à l'animal. L'inoculation par voie orale sur animal vigile est préférée car à la fois plus simple pour l'expérimentateur et mieux tolérée par l'animal. Pendant le test de tolérance au glucose, les prises de sang seront réduites au minimum pour permettre le dosage d'insuline (nécessitant 5ul de plasma).

Choix des espèces

Les modèles précliniques de souris sont des outils complémentaires et essentiels, partageant avec l'humain de fortes homologies dans les régulations physioplogiques, en particulier le contrôle de l'homéostasie glucidique et de l'adiposité. Les souris nous seront livrées à l'âge 3 semaines et nous commencerons nos expérimentations à 4 semaines (après une semaine d'acclimatation), car leur flore intestinale est encore immature, et cela permettra à nos bactéries de s'implanter plus facilement, sauf pour la procédure 1, nous utiliserons des souris adultes âgées de 8 semaines, car c'est une étude pilote.

316 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 36 seulement subiront la lésion musculaire et la greffe de cellules satellites qui font l'objet du projet. Les 280 autres sont gavées de tamoxifène et analysées au repos. Le porteur écrit qu'aucun phénotype dommageable n'est attendu, tout en reconnaissant qu'une paralysie ou une nécrose de la patte lésée reste possible. Toutes sont tuées au plus tard 28 jours après la lésion, pour prélever les muscles et comparer la capacité de régénération de deux sous-populations de cellules souches.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables parce qu’il possède de grandes capacités régénératrices, faisant de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. Il a été démontré qu’une partie d’entre elles a une capacité de se différencier plus rapidement que d’autres, ce qui suggère des mécanismes cellulaires sous-jacents conférant cette disparité. Ceci interroge désormais sur le rôle respectif de ces deux sous-populations quant à la réparation du muscle squelettique. Comme notre projet s’intéresse à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires nous ne pouvons pas mettre en place une méthode alternative au vivant. Avec ce projet nous voulons comparer dans le contexte du vivant les greffes de ces cellules dans un muscle en régénération et identifier s’il y a une sous-population avec une capacité régénérative plus importante. Ces expériences nous permettront d’analyser la capacité des sous-populations des cellules satellites à régénérer un muscle lésé, comme c’est le cas dans un contexte de maladie musculaire. Notre étude nécessitera un total de 316 souris réparties sur 2 procédures expérimentales, dont seulement 36 animaux seront soumis aux lésions et greffes musculaires.

Bénéfices attendus

Il a des études qui ont montré qu’il y a une hétérogénéité des cellules souches musculaires, les cellules satellites, associé à l’expression de certaines protéines. Pendant la régénération musculaire, la présence de d’une protéine importante pendant le développement musculaire chez les cellules satellites est associé avec plus de prolifération et différenciation plus rapide. Avec ce projet nous avons comme objective comprendre si dans le contexte de l’in vivo, les cellules satellites qui expriment cette protéine sont capables de mieux régénérer le tissue. La régénération musculaire est perturbée dans le contexte des dystrophies musculaires. Mieux comprendre les mécanismes de régénération par les cellules souches musculaires, les cellules satellites, va permettre d’approfondir sur la possibilité de la réussite de nos cellules candidates dans les thérapies cellulaires pour les maladies musculaires humaines.

Procédures

Dans cette étude 36 de la totalité des animaux (316) seront anesthésiés et soumises à des injections intramusculaire et greffé avec des cellules satellites dans ces muscles. Les 280 autres animaux seront traités avec de la tamoxifène par gavage et analysés en homéostasie, donc non-soumis à des injections.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu un phénotype dommageable. L’induction de la régénération musculaire peut entrainer des contraintes au niveau du mouvement de la patte pendant quelques heures. Nous n’attendons pas de complications majeures liés à la régénération musculaire mais nous ne pouvons pas négliger la possibilité qu’une éventuelle paralysie ou nécrose de la patte puisse se manifester.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire pour prélèvement des tissus nécessaires à l’analyse.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire. Cependant, nous faisons tous les tests d’optimisation du protocole in vitro et seulement dans un deuxième temps nous ferons les greffes avec un minimum d’animaux nécessaire aux analyses.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 10 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires.

Raffinement

Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. De plus, pour l'enrichissement du milieu de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours après induction de la régénération musculaire pour améliorer les conditions d’alimentation des animaux. Tout au long du projet, il y aura une surveillance quotidienne du comportement et le poids des souris afin de détecter tout signe de douleur ou d'inconfort. Les animaux qui présenteraient des signes anormaux associés à des points limites seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. En plus d'être un mammifère, le fait d'avoir des souris transgéniques et immunodéprimées est essentiel pour permettre l'analyse de cellules greffées tardivement sans avoir une réponse immunitaire. Ce modèle murin étant couramment utilisé, nous permettra d’avoir une idée plus approfondie sur la possibilité de la réussite de nos cellules candidates dans les thérapies cellulaires pour les maladies musculaires humaines. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 8 semaines. Passé 8 semaines, le muscle adulte est complétement formé et il est donc possible de faire la distinction entre le processus de régénération et la croissance musculaire.