Procédures modérées

Endormies de force au pentobarbital, après avoir reçu par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen, dans une veine ou dans le nez les substances à tester, 1656 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à cent vingt et une administrations, une privation de nourriture et un isolement de moins de seize heures. Le porteur indique que le pentobarbital leur fait perdre le réflexe de redressement, abaisse leur tonus musculaire, ralentit leur respiration et fait chuter leur température, et que les injections répétées dans l'abdomen laissent de petits hématomes. Neuf cent soixante-deux souris seront tuées pour des prélèvements d'organes, et six cent quatre-vingt-quatorze gardées en vie pour être réutilisées dans un autre projet, à condition qu'il soit classé en sévérité légère à modérée.

Objectifs

Ce projet est un projet g?n?rique qui vient poursuivre un projet arrivant ? son terme. Il vise ? ?valuer les effets de nouveaux candidats m?dicaments pour le traitement des troubles du sommeil d?origine centrale, tels que l?insomnie (difficult? d?endormissement, et/ou ? maintenir le sommeil) et l?hyper-somnolence ou l?hypersomnie, notamment la narcolepsie. Les traitements actuels des troubles du sommeil pr?sentent soit une efficacit? insuffisante, soit des effets secondaires n?fastes, notamment accoutumance ou addiction. Ce mod?le sera utilis? pour tester l?efficacit? de produits de diff?rents donneurs d?ordre pr?sentant potentiellement moins d?effets secondaires, notamment de produits naturels extraits de plantes. Les donn?es g?n?r?es contribueront ? la caract?risation pharmacodynamique pr?coce des candidats m?dicaments.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera ? la caract?risation pharmacologique pr?coce de nouveaux candidats m?dicaments en permettant l'identification d'?ventuelles propri?t?s s?datives, hypnotiques ou ?veillantes. Le test du sommeil induit pharmacologiquement constitue un outil reconnu pour d?tecter les interactions pharmacodynamiques susceptibles d'influencer l'?tat de vigilance et les fonctions neurocomportementales. Les donn?es obtenues permettront d'am?liorer la s?lection des candidats les plus prometteurs avant leur engagement dans des ?tudes pr?cliniques plus complexes et plus consommatrices en animaux. L'identification pr?coce de compos?s pr?sentant un profil pharmacologique inadapt? ou des effets centraux ind?sirables contribuera ? r?duire les risques d'?chec lors des phases ult?rieures du d?veloppement. ? plus long terme, les connaissances g?n?r?es pourront participer au d?veloppement de nouvelles approches th?rapeutiques dans diverses aires th?rapeutiques n?cessitant une action sur le syst?me nerveux central ou pour lesquelles l'absence d'effets s?datifs constitue un enjeu de s?curit?. Ainsi, les b?n?fices attendus du projet concernent ? la fois l'am?lioration des connaissances scientifiques relatives aux effets neuropharmacologiques des mol?cules ?tudi?es et l'optimisation du d?veloppement de futurs m?dicaments susceptibles d'apporter un b?n?fice aux patients.

Procédures

Les animaux seront soumis ? une ou plusieurs administrations de substances d'essai (orale, intrap?riton?ale, intraveineuse, sous-cutan?e ou intranasale) ainsi qu'? une administration de pentobarbital destin?e ? induire un ?tat de sommeil transitoire (moins d?une minute, au maximum 121). Les fr?quences d'administration d?pendront des caract?ristiques pharmacologiques des candidats m?dicaments. Une privation de nourriture et un isolement des animaux de moins de 16h seront effectu?s lors de ce projet. Un pr?l?vement sanguin sur animal anesth?si? sera r?alis? en fin d??tude d?une dur?e inf?rieure ? 2 min avec un volume maximal de 1 ml.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis ? une ou plusieurs administrations de substances d'essai ainsi qu'? une administration de pentobarbital destin?e ? induire un ?tat de sommeil transitoire. Les principales nuisances associ?es ? la proc?dure sont li?es ? la contention n?cessaire aux administrations et aux observations cliniques r?alis?es pendant l'?tude. Ces manipulations sont de courte dur?e et susceptibles d'engendrer un stress l?ger et transitoire. L?administration de traitement par injections intrap?riton?ales r?p?t?es pourra provoquer de petits h?matomes au niveau du site de la piq?re. Les administrations per os r?p?t?es peuvent exceptionnellement induire un inconfort lors de l'introduction de la sonde ainsi qu'une irritation de l'?sophage ou du pharynx. Les instillations intranasales r?p?t?es peuvent exceptionnellement induire une g?ne respiratoire transitoire ainsi qu'une irritation des muqueuses nasales. L'administration du pentobarbital induira une diminution de l'activit? locomotrice suivie d'une perte temporaire du r?flexe de redressement . Pendant cette p?riode, les animaux pourront pr?senter une diminution du tonus musculaire, une r?duction de la r?activit? aux stimuli ext?rieurs ainsi qu'un ralentissement mod?r? de la fr?quence respiratoire. Une baisse transitoire de la temp?rature corporelle peut ?galement ?tre observ?e chez certains animaux du fait des propri?t?s pharmacologiques du pentobarbital.

Devenir

En fin d??tude, pour des analyses s?rologiques, histologiques, mol?culaires et immunohistochimiques, certains animaux pourront ?tre soumis ? diff?rents types de pr?l?vements (organes) post mortem, ils seront donc mis ? mort en fin d'?tude. Dans le cas o? le projet ne n?cessite pas de pr?l?vement d'organe post mortem, les animaux pourront ?tre gard?s en vie pour ?tre r?utilis?s dans un projet de s?v?rit? l?g?re ? mod?r?e et sur avis v?t?rinaire. L?ensemble des animaux arrivant au point limite avant la fin de l??tude comportementale sera mis ? mort.

Remplacement

L??tude du comportement animal est une ?tape essentielle dans le d?veloppement des m?dicaments actifs sur le syst?me nerveux. L?effet de mol?cules sur le comportement est la cons?quence de leur action au niveau de l?ensemble de l?organisme et en particulier sur le syst?me nerveux. La mise en ?vidence de ces effets est r?alis?e sur un organisme vivant entier. Pour ?tre valide, un mod?le alternatif devrait prendre en compte l?ensemble des ph?nom?nes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l?animal. A ce jour, aucun test in vitro ou in silico ne permet de rendre compte de l?ensemble de ces ph?nom?nes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilis?s pour les ?tudes comportementales ne peuvent donc pas ?tre remplac?s par des m?thodes alternatives. Le recours ? l?animal de laboratoire s?av?re donc n?cessaire et incontournable pour ?tudier l?efficacit? de nouveaux candidats m?dicaments.

Réduction

Le nombre d'animaux est d?termin? ? partir de l'exp?rience historique de notre EU et d'une analyse statistique de puissance. Les calculs coupl?s ? notre exp?rience indiquent qu'un effectif de 12 animaux par groupe est n?vessaire et suffisant pour mettre en ?vidence un effet biologiquement pertinent. Pour chaque lot, des analyses statistiques seront utilis?es pour comparer soit 2 groupes entre eux soit plusieurs groupes au groupe contr?le.

Raffinement

Une p?riode d?acclimatation au nouvel environnement de 5 jours minimum sera respect?e avant que les animaux ne soient inclus dans le protocole exp?rimental. Toutes les manipulations seront r?alis?es par du personnel form?. Les doses du produit inducteur de sommeil utilis?es dans ce projet ont ?t? choisies d?apr?s la litt?rature et l?exp?rience acquise dans notre EU pour que celles-ci, seule ou lorsqu?elle est coupl?e ? l?administration d?une r?f?rence positive qui augmente la dur?e du temps de sommeil, n?induisent aucun probl?me de r?cup?ration des animaux apr?s leur r?veil. Les animaux seront soumis ? une grille de scoring sp?cifique adapt?e ? l?exp?rience durant toute la p?riode de sommeil et pendant les 72h qui suivent l?exp?rience s'ils sont gard?s en vie. Si des animaux pr?sentent des signes de souffrance au cours de l'?tude, des croquettes humides ou de l'hydrogel seront ajout?s dans les cages et le v?t?rinaire en sera inform?. Si un animal atteint un des crit?res d?arr?t pr?d?finis dans notre grille de scoring ? un moment donn? de l'exp?rience, il sera imm?diatement mis ? mort. Si le candidat m?dicament est administr? de fa?on chronique et par voie intrap?riton?ale, une alternance du site d?administration sera r?alis?e. Si l?administration du candidat m?dicament est effectu?e par voie intranasale, une habituation progressive ? la manipulation, ? la contention sp?cifique li?e ? l?instillation intranasale et ? l?instillation en elle-m?me sera effectu?e. Chaque s?ance d?habituation est accompagn?e d?une r?compense alimentaire pour l?animal. Si le projet n?cessite un pr?l?vement sanguin celui-ci sera effectu? sur animaux anesth?si?s.

Choix des espèces

La souris a ?t? retenue pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique dans l'?valuation pr?clinique des effets des substances d'essai sur le syst?me nerveux central. Cette esp?ce est largement utilis?e et valid?e dans les mod?les de s?dation et notamment d'hypnose induites par le pentobarbital. Le test du sommeil induit par le pentobarbital est un mod?le historiquement d?velopp? et largement document? chez la souris. L'utilisation de la souris facilite ?galement la comparaison des donn?es obtenues avec celles issues de compos?s de r?f?rence ou d'?tudes ant?rieures. La souris pr?sente par ailleurs des caract?ristiques physiologiques, neurobiologiques et pharmacologiques bien connues, ainsi qu'une sensibilit? adapt?e ? la mise en ?vidence des effets s?datifs, hypnotiques ou stimulants des substances ?tudi?es. Aucune m?thode alternative in vitro, ex vivo ou in silico ne permet actuellement de reproduire l'int?gration des m?canismes pharmacocin?tiques et pharmacodynamiques impliqu?s dans l'induction du sommeil observ?s chez un organisme vivant. L'utilisation d'animaux demeure donc n?cessaire pour r?pondre aux objectifs scientifiques du projet. Les animaux seront utilis?s ? l'?ge de 6 ? 15 semaines, correspondant au stade de jeune adulte. ? cet ?ge, les syst?mes physiologiques impliqu?s dans l'absorption, la distribution, le m?tabolisme et l'?limination des substances administr?es sont pleinement d?velopp?s, permettant une ?valuation fiable et reproductible des effets pharmacologiques des candidats m?dicaments. L'utilisation d'animaux jeunes adultes permet ?galement de limiter la variabilit? li?e aux processus de croissance observ?s chez les animaux plus jeunes ainsi qu'aux modifications physiologiques associ?es au vieillissement. Cette tranche d'?ge correspond ? celle utilis?e dans la majorit? des ?tudes de pharmacologie comportementale et pour laquelle le laboratoire dispose de donn?es historiques de r?f?rence. Le recours ? des animaux de cet ?ge contribue ainsi ? la robustesse scientifique du mod?le tout en permettant de limiter le nombre d'animaux n?cessaires ? l'obtention de r?sultats interpr?tables.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime enrichi en adénine leur provoque une maladie rénale chronique sur quatre semaines, ce qui réduit leur prise alimentaire et ralentit leur croissance. Une partie d'entre elles passe deux séjours en cage individuelle, quarante-huit heures puis vingt-quatre heures, isolées de leurs congénères et posées sur une grille métallique, le temps de recueillir urines et fèces. Le porteur indique que les souris dont aucun organe n'est prélevé sont tuées elles aussi, parce que le traitement les a rendues insuffisantes rénales, une atteinte qu'il qualifie d'irréversible et d'incurable.

Objectifs

La maladie r?nale chronique constitue un probl?me majeur de sant? publique, touchant environ 10 pourcents de la population mondiale et pr?s de 6 millions de fran?ais. Elle se caract?rise par une perte progressive et irr?versible de la fonction r?nale, associ?e ? des complications m?taboliques et nutritionnelles. Les principaux sympt?mes, en plus de l?alt?ration des fonctions r?nales, incluent la d?nutrition et la perte de masse adipeuse et musculaire. R?cemment, des analyses ont mis en ?vidence une association entre la s?v?rit? de cette maladie et les concentrations circulantes d?une prot?ine. Cette prot?ine est ?galement impliqu?e dans le maintien du taux de potassium dans le sang et de son acidit?. Ces deux param?tres pouvant ?tre fortement perturb?s lors de la maladie r?nale chronique, la question du r?le de cette prot?ine se pose. une alimentation enrichie en ad?nine permettra l?induction d?une maladie r?nale chronique r?nale chez des souris qui poss?dent ou non cette prot?ine et l??volution de la fonction r?nale, le d?veloppement de la fibrose, l?acidit? et le taux de potassium sanguin seront ?tudi?s, ces crit?res correspondant directement aux alt?rations observ?es chez les patients.

Bénéfices attendus

? court terme, ce projet permettra d??valuer si l?absence de la prot?ine ?tudi?e exerce un effet b?n?fique ou d?l?t?re sur les complications de la maladie r?nale chronique. Il s?agit d?un travail exploratoire dont les r?sultats pourront servir ? d?velopper un projet de plus grande ampleur. ? plus long terme, ces travaux pourraient contribuer ? l??mergence d?une nouvelle strat?gie th?rapeutique visant ? am?liorer la fonction r?nale, l??tat nutritionnel et la qualit? de vie des patients atteints de maladie r?nale chronique.

Procédures

Tous les animaux recevront un r?gime sp?cifique pour induire la pathologie ?tudi?e ou le r?gime contr?le pour une dur?e de 4 semaines (prise spontan?e). Une partie des animaux sera plac?s 2 fois en h?bergement individuel durant 48h (habituation) puis 24h (recueil) afin de r?cup?rer les urines et fec?s sur animal vigil. Une partie de ces animaux subiront un pr?l?vement de sang sous anesth?sie et analg?sie (1 fois, 5 minutes par animal). Une autre partie de ces animaux subiront une intervention chirurgicale sous anesth?sie et analg?sie sans r?veil (10 minutes par animal).Tous les animaux seront euthanasi?s par une m?thode r?glementaire sous anesth?sie et analg?sie.

Impact sur les animaux

L?induction de la maladie r?nale chronique r?duit la prise alimentaire et ralentit la croissance pond?rale, entra?nant un inconfort pendant les 4 semaines. Les effets ind?sirables des interventions pr?vues sont connus car d?j? test?s chez la souris dans d?autres contextes que celui du pr?sent projet. En fonction des groupes exp?rimentaux, certains animaux seront h?berg?s individuellement permettant ainsi de recueillir leur urine et leur f?ces. Ce type d?h?bergement g?n?re des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont h?berg?s individuellement (stress social) et se d?placent sur une grille m?tallique de surface r?duite. En fonction des groupes exp?rimentaux, une partie des animaux subira un pr?l?vement de sang sous anesth?sie et analg?sie (risque d?arr?t cardio-respiratoire) pouvant entrainer une h?morragie (stress h?modynamique).

Devenir

En fin de proc?dure, tous les animaux sont euthanasi?s. Les analyses permettant de r?pondre ? la question scientifique, n?cessitent des pr?l?vements d?organes qui rendent incompatible leur maintien en vie. Pour ceux qui n?ont pas subi de pr?l?vements d?organes, le traitement les ayant rendus insuffisants r?naux, maladie irr?versible et incurable, les animaux seront ?galement euthanasi?s.

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des m?thodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est pr?f?rable. Toutefois, seules des ?tudes sur des animaux nous permettront d??tudier les cons?quences de la maladie r?nale chronique. En effet ces processus font intervenir des syst?mes complexes qui travaillent de concert et qui agissent ?galement les uns sur les autres. L?identification de l?implication possible de ces diff?rents acteurs pourra ouvrir de nouvelles possibilit?s pour d?velopper des strat?gies th?rapeutiques novatrices.

Réduction

Ce projet a une dur?e de 4 ans, et n?cessitera l?utilisation de 480 souris. Nous avons calcul? la taille des effectifs, en nous appuyant sur notre exp?rience des m?thodes envisag?es, la connaissance de leur reproductibilit? et un calcul de puissance le nombre d?animaux au plus faible nous permettant d'obtenir des r?sultats statistiquement robustes. Nous r?duirons le nombre d?animaux en r?alisant des exp?riences sur les m?mes animaux en limitant toutefois les exp?riences qui aboutiraient ? des souffrances trop importantes et et/ou qui pourraient impacter n?gativement certains r?sultats, les rendant inexploitables. Le nombre d?animaux calcul? dans ce projet tient compte du taux de succ?s de l?induction de la maladie r?nale chronique.

Raffinement

Les animaux auront un acc?s libre ? la nourriture et ? de l?eau filtr?e, et seront plac?s dans des cages ventil?es. Leur environnement sera enrichi avec au moins deux objets : du nid v?g?tal et/ou des cylindres en carton et/ou des bouts de bois et/ou des maisons en plastique. Afin de limiter les d?sagr?ments li?s aux cages ? m?tabolisme et ? la grille, nous pla?ons une coupelle en verre de 6 cm de diam?tre ce qui permet ? la souris de dormir ou de se r?fugier sans ?tre en contact avec la grille. Nous avons v?rifi? que la majorit? des souris s?installent dans les coupelles pour dormir mais que cela ne change en rien les recueils d?urine et de f?ces. Ces cages sont situ?es sur des racks qui permettent aux souris de maintenir un lien olfactif, visuel et sonore entre elles. Afin de limiter la perte de poids li?e ? une baisse de consommation de nourriture, du chocolat en poudre est ajout? ? la celle-ci pour en augmenter l?app?tence. Par ailleurs, l?aspect g?n?ral des animaux et leur comportement (vivacit?, capacit? ? se mouvoir, propret? du pelage etc?) seront observ?s en m?me temps que la mesure du poids corporel, ces crit?res servant ? ?tablir des points limites En cas d?atteinte de ceux-ci, les animaux seront euthanasi?s pour ?viter toutes douleurs/souffrances suppl?mentaires. Les actes invasifs sont effectu?s par un personnel qualifi? et form? ? l?exp?rimentation animal et ? la chirurgie sous anesth?sie et analg?sie.

Choix des espèces

Le mod?le animal permet de r?aliser des exp?riences de physiopathologie r?nale de mammif?re en prenant en compte tous les param?tres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas suffisantes en ce qui concerne l'?tude des fonctions r?nales qui ont des effets syst?miques. Nous avons choisi de mener nos exp?riences chez la souris, car les mod?les d?invalidation des g?nes susceptibles de nous int?resser ont ?t? g?n?r?s chez la souris et pourrais nous ?tre utiles pour la suite de ce projet. Il s?agit d?animaux adultes car la maladie r?nale chronique touche particuli?rement les personnes adultes chez l?humain. De plus, ces exp?riences ont pour objectif d'?tre associ?es ou compar?es ? des exp?riences d?j? r?alis?es dans le laboratoire sur ces m?mes lign?es de souris.

Les souris rejoignent l'évaluation des vaccins une fois leur tumeur parvenue à 150 mm3. 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue, pour tester des vaccins contre le carcinome à cellules de Merkel. Huit servent d'abord à caler la dose de cellules tumorales, les trente-deux autres reçoivent une injection de cellules tumorales sous la peau puis quatre injections vaccinales espacées d'une semaine, avant d'être tuées vingt-huit jours plus tard. Le porteur indique qu'une graine de tournesol ou une cacahuète est proposée après chaque injection, et justifie l'effectif de huit souris par lot par une puissance statistique suffisante, sans donner de calcul.

Objectifs

Le carcinome ? cellules de Merkel (CCM) est un cancer rare et agressif de la peau qui touche principalement les personnes ?g?es de plus de 65 ans et les personnes dont le syst?me immunitaire est affaibli. Sa fr?quence augmente progressivement et la survie des patients ? 5 ans reste limit?e. Lorsque la maladie est avanc?e et ne peut pas ?tre trait?e par chirurgie, les possibilit?s th?rapeutiques restent encore insuffisantes pour obtenir des r?ponses durables chez tous les patients. L'objectif de ce projet est de d?velopper et d'?valuer de nouveaux vaccins th?rapeutiques capables d'aider le syst?me immunitaire ? reconna?tre et ? ?liminer les cellules tumorales du carcinome ? cellules de Merkel. Pour cela, des souris seront utilis?es afin de reproduire la maladie et d'?tudier l'efficacit? de diff?rents vaccins candidats. Apr?s l'apparition des tumeurs, les animaux recevront soit un vaccin candidat, soit une pr?paration contr?le. L'?volution de la taille des tumeurs sera ensuite suivie afin de d?terminer si ces nouveaux traitements permettent de ralentir ou de r?duire leur d?veloppement.

Bénéfices attendus

Cette ?tude vise ? ?valuer une nouvelle strat?gie th?rapeutique pour les carcinomes ? cellules de Merkel (CCM) dus au MCPyV pr?sentant une r?sistance primaire ou acquise aux immunoth?rapies actuellement disponibles. L'efficacit? de cette approche sera appr?ci?e au travers de sa capacit? ? ralentir la croissance tumorale, ? r?duire le volume des tumeurs, voire ? obtenir une r?gression tumorale. Au-del? de ce projet, ce travail permettra de valider le potentiel d?une plateforme vaccinale fond?e sur l'utilisation de la capside du virus de l'h?patite B comme vecteur d'antig?nes. Cette d?monstration de preuve de concept pourrait ouvrir la voie au d?veloppement de nouvelles strat?gies vaccinales th?rapeutiques applicables ? d'autres cancers ou ? des maladies infectieuses.

Procédures

L'ensemble des animaux exp?rimentaux recevront une injection sous-cutan?e de cellules tumorales (proc?dure 1) ou dans le cadre de la proc?dure 2 une injection sous-cutan?e de cellules tumorales et 4 injections sous-cutan?es de pr?parations vaccinales espac?es d?une semaine (J0, 7, 14, 21).

Impact sur les animaux

Les contraintes pour les animaux au cours de cette ?tude seront principalement li?es au stress occasionn? par les manipulations et les contentions, ainsi qu'? une douleur l?g?re et temporaire associ?e aux injections r?alis?es pour l'implantation des tumeurs et l'administration des vaccins candidats. Ces interventions seront de courte dur?e (moins de 20 secondes par injection et par manipulation). Le volume maximal des tumeurs ainsi que leur localisation ont ?t? choisis afin de limiter autant que possible l'impact sur les d?placements et les activit?s normales des animaux. Toutefois, le d?veloppement des tumeurs peut entra?ner une alt?ration de l'?tat g?n?ral des souris, pouvant se traduire par une perte de poids, une diminution de la mobilit? ou une baisse de la r?activit?. Les animaux feront l'objet d'une surveillance r?guli?re afin de limiter leur inconfort et d'intervenir d?s l'apparition de signes de souffrance.

Devenir

Proc?dure 1 : Les 8 souris utilis?es pour d?terminer la dose de cellules tumorales ? injecter seront euthanasi?es au plus tard ? J28 apr?s l'implantation des cellules tumorales, ou avant ce d?lai si un point limite d?fini dans le protocole est atteint. Proc?dure 2 : Les 32 souris utilis?es pour l'?valuation des vaccins candidats seront incluses dans l'?tude apr?s atteinte d'un volume tumoral de 150 mm?. Elles seront euthanasi?es ? J28 apr?s la premi?re injection de pr?paration vaccinale, ou plus t?t si elles atteignent un point limite exp?rimental. Les pr?l?vements r?alis?s apr?s euthanasie permettront l'analyse des tumeurs et des organes internes afin d'?valuer la r?ponse immunitaire induite et l'efficacit? des traitements.

Remplacement

Malgr? les progr?s r?alis?s dans le d?veloppement d'organo?des int?grant des cellules du syst?me immunitaire, ces mod?les ne permettent pas, ? ce jour, de reproduire l'ensemble des m?canismes impliqu?s dans l'induction et le d?veloppement d'une r?ponse immunitaire adaptative. L'?valuation de l'efficacit? d'une vaccination th?rapeutique n?cessite donc le recours ? un animal immunocomp?tent, seul capable de d?velopper une r?ponse immunitaire int?gr?e, faisant intervenir l'ensemble des populations cellulaires et des m?canismes effecteurs observ?s chez l'Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux n?cessaires dans chaque groupe exp?rimental a ?t? d?termin? afin d'obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre d'animaux utilis?s conform?ment au principe de R?duction (8/lot)

Raffinement

Les injections r?alis?es par voie sous-cutan?e sont des proc?dures rapides, associ?es ? une douleur faible et transitoire. Le geste technique est parfaitement ma?tris? par les personnels impliqu?s dans la manipulation des animaux, limitant ainsi le stress et l'inconfort li?s aux interventions. Afin de favoriser une exp?rience positive lors des manipulations, une r?compense alimentaire (graine de tournesol ou cacahu?te) sera propos?e aux souris apr?s chaque injection, qu'il s'agisse de l'administration des cellules tumorales ou des pr?parations vaccinales. - Mise en place de points limites grad?s : une grille d??valuation des points limite a ?t? cr??e prenant en compte l?apparence g?n?rale, l?activit?, le poids corporel, le volume et l?aspect de la tumeur, la g?ne locomotrice li?e au d?veloppement de la tumeur et l??tat clinique global. En fonction de l??volution de ces diff?rents signes, la surveillance des animaux sera renforc?e et une prise en charge sera adapt?e.

Choix des espèces

La souris repr?sente l'animal classiquement d?crit dans litt?rature, pour ce type d?exp?rimentation. L'utilisation de ce mod?le nous permettra de valider nos observations dans un syst?me immunocomp?tent ce qui est essentiel pour envisager un d?veloppement chez l'humain par la suite. Les souris arriveront au stade 6 semaines et seront incluses dans l??tude ? 7 semaines apr?s une semaine d'acclimatation. A cet ?ge, le syst?me immunitaire est mature et permet d?avoir des r?ponses immunitaires optimales.

Choisies pour ne pas rejeter les cellules humaines qu'on leur greffe, 120 souris reçoivent chacune une injection de cellules immunitaires humaines dans le cerveau, au cours d'une chirurgie de quarante-cinq à soixante minutes sous anesthésie générale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris seront tuées. Entre l'opération et la fin de l'étude, elles sont pesées deux fois par semaine et saignées tous les quinze jours sous anesthésie, à la jugulaire, à la saphène ou à la queue. Le porteur indique que l'injection de cellules humaines dans le cerveau peut provoquer une inflammation locale ou des troubles neurologiques, une perte d'équilibre ou de coordination, et que le liquide céphalo-rachidien est prélevé juste avant la mise à mort.

Objectifs

Le cerveau contient des cellules immunitaires spécialisées, appelées microglies, qui jouent un rôle essentiel dans son bon fonctionnement. Elles participent à la protection du cerveau contre les infections, éliminent les cellules endommagées et contribuent au maintien de l'équilibre du système nerveux. De nombreuses études ont montré que ces cellules sont également impliquées dans plusieurs maladies neurologiques, comme la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ou certaines maladies inflammatoires du cerveau. L'objectif de ce projet est de développer un nouveau modèle de souris dans lequel des cellules immunitaires humaines du cerveau pourront être implantées et étudiées. Ce modèle permettra de mieux comprendre le comportement de ces cellules dans un organisme vivant et d'observer leur capacité à survivre, à se développer et à s'intégrer dans le cerveau. Les différentes sources de cellules humaines seront comparées afin d'identifier celle qui permet d'obtenir le modèle le plus fiable et le plus représentatif de la biologie humaine. Des analyses seront ensuite réalisées pour vérifier que les cellules implantées sont présentes dans le cerveau et qu'elles présentent les caractéristiques attendues. À terme, ce modèle pourra être utilisé pour améliorer la recherche sur les maladies neurologiques et faciliter le développement de nouveaux traitements. Il contribuera également à disposer de modèles expérimentaux plus proches de la biologie humaine, ce qui pourrait améliorer la qualité des études précliniques et favoriser le développement de thérapies plus efficaces pour les patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre au point un modèle de recherche plus représentatif du fonctionnement des cellules immunitaires humaines du cerveau que les modèles actuellement disponibles. Les connaissances acquises aideront les chercheurs à mieux comprendre le rôle de ces cellules dans le fonctionnement normal du cerveau et dans le développement de certaines maladies neurologiques. À moyen terme, ce modèle pourra être utilisé pour étudier les mécanismes impliqués dans des maladies telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaques ou d'autres maladies inflammatoires et neurodégénératives. Il pourra également servir à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques avant leur utilisation chez l'Homme. Le modèle développé dans ce projet pourra être réutilisé dans d'autres travaux de recherche sur les maladies du système nerveux central. Il constituera un outil utile pour la communauté scientifique et contribuera à améliorer les connaissances sur le rôle des cellules immunitaires du cerveau, avec pour objectif à long terme de favoriser le développement de traitements plus efficaces au bénéfice des patients.

Procédures

Chaque souris subira une seule intervention chirurgicale sous anesthésie générale (45 à 60 minutes). Les animaux seront pesés (moins de 5 min, deux fois par semaine) Les prélèvements sanguins seront effectués tous les 15 jours sous anesthesie par une des voies suivantes • Jugulaire (moins d’1 min) • Saphène (moins d’3 min) • Queue (moins d’1 min) Le prélèvement de liquide cephalo-rachidien sera réalisé juste avant la mise à mort de l’animal. Les prélèvements de tissus/organes seront réalisés post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient ressentir un inconfort lié aux différentes étapes de l'étude. La randomisation pour former des groupes homogènes peut entrainer un stress de 1-2j lié au changement de congénères L'intervention chirurgicale réalisée sous anesthésie générale peut entraîner une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée pendant quelques jours, ainsi qu'une diminution temporaire de l'activité ou de l'appétit. Des médicaments contre la douleur seront administrés afin de limiter ces effets. Les prélèvements de sang peuvent provoquer un inconfort de courte durée au moment de la manipulation et de la ponction. Le régime alimentaire utilisé pour préparer les animaux à la transplantation est généralement bien toléré, mais une légère baisse de la consommation alimentaire ou une perte de poids modérée peut parfois être observée. Dans de rares cas, l'injection de cellules humaines dans le cerveau peut entraîner des complications, telles qu'une inflammation locale ou l'apparition de troubles neurologiques (par exemple une diminution de l'équilibre, de la coordination ou de l'activité). Bien que ces effets soient peu fréquents, les animaux feront l'objet d'une surveillance attentive tout au long de l'étude. Les souris seront observées chaque jour afin de détecter rapidement tout signe de douleur, de souffrance ou de mauvaise récupération. Si un animal présente une altération importante de son état de santé ou des signes indiquant qu'il pourrait souffrir de manière durable, il recevra les soins appropriés. Si son bien-être ne peut pas être rétabli, il sera euthanasié de façon à éviter toute souffrance inutile.

Devenir

Après les procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes, de sang, et de liquide cephalo-rachidien nécessaires pour évaluer la réussite de la transplantation

Remplacement

Avant de recourir aux animaux, des méthodes alternatives, telles que des cultures de cellules humaines produites en laboratoire sont utilisées. Ces méthodes permettent d'étudier certaines caractéristiques des cellules et de vérifier leur qualité avant leur utilisation. Cependant, l'objectif de ce projet est de comprendre comment ces cellules humaines survivent, se déplacent, s'intègrent et fonctionnent dans le cerveau au sein d'un organisme vivant. Il est également nécessaire d'étudier leurs interactions avec les autres cellules du cerveau et de mesurer certains marqueurs biologiques présents dans le sang ou le liquide entourant le cerveau. À l'heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet de reproduire l'ensemble de ces phénomènes complexes. Le recours aux animaux est donc indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les expérimentations sont limitées au strict nécessaire et ne sont réalisées que lorsque les informations recherchées ne peuvent pas être obtenues par d'autres méthodes. Les connaissances acquises grâce à ce projet pourraient également contribuer, à terme, au développement de modèles expérimentaux plus performants et permettre de réduire encore davantage le recours aux animaux dans les recherches futures.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Il a été déterminé à partir des connaissances scientifiques disponibles. Chaque animal fournit un grand nombre d'informations. Plusieurs analyses différentes seront réalisées à partir des mêmes prélèvements de sang, de liquides biologiques et de tissus, ce qui permet d'éviter d'utiliser des groupes supplémentaires d'animaux. De plus, les mêmes souris seront suivies tout au long de l'étude grâce à des prélèvements réalisés à différents moments, ce qui permet d'observer l'évolution des cellules transplantées sans avoir à utiliser de nouveaux animaux à chaque étape. Les procédures expérimentales ont été soigneusement préparées et seront réalisées par du personnel qualifié afin de limiter les échecs techniques qui pourraient conduire à répéter les expériences.

Raffinement

Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape du projet afin de limiter autant que possible la douleur, le stress et l'inconfort. Les souris sont hébergées dans des conditions adaptées à leurs besoins, avec de la nourriture et de l'eau à volonté, des matériaux leur permettant de construire un nid, des abris et un environnement favorisant leurs comportements naturels. Elles bénéficient d'une période d'adaptation avant le début des expériences. Toutes les interventions sont réalisées par du personnel spécialement formé. La greffe est effectuée sous anesthésie générale et des médicaments contre la douleur sont administrés avant et après l'intervention afin de limiter l'inconfort. Les animaux sont maintenus au chaud pendant leur réveil et leur état est surveillé attentivement jusqu'à leur récupération complète. Pendant toute la durée de l'étude, les souris sont observées quotidiennement afin de vérifier leur état de santé, leur comportement, leur alimentation et leur poids. Une surveillance renforcée est mise en place après la chirurgie. Si un animal présente des signes de douleur, de souffrance ou une altération de son état de santé, il reçoit rapidement les soins appropriés. Lorsque son bien-être ne peut plus être assuré ou que son état risque de se dégrader, il est euthanasié sans attendre la fin de l'étude afin d'éviter toute souffrance inutile.

Choix des espèces

La souris a été choisie car il s'agit de l'espèce la plus utilisée et la mieux connue pour étudier le fonctionnement de cellules humaines dans un organisme vivant. Elle partage de nombreuses caractéristiques biologiques avec l'Homme, ce qui en fait un modèle particulièrement utile pour comprendre certaines maladies et développer de nouvelles approches thérapeutiques. Les souris utilisées dans ce projet présentent également des caractéristiques particulières qui permettent l'implantation de cellules humaines sans qu'elles soient rejetées, ce qui est indispensable pour atteindre les objectifs de l'étude. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte, à l'âge d'environ huit semaines. À cet âge, le cerveau est complètement développé et fonctionne de manière stable. Cela permet d'étudier dans de bonnes conditions l'implantation, la survie et le comportement des cellules humaines greffées, tout en limitant les variations liées à la croissance ou au vieillissement. Les jeunes souris adultes récupèrent également généralement mieux après une intervention chirurgicale que les animaux plus âgés, ce qui contribue à limiter les contraintes liées aux procédures expérimentales et à améliorer leur bien-être.

Injectées dans l'abdomen à répétition, soumises à des frottis vaginaux et à des prises de sang hebdomadaires, 120 rattes Wistar subissent une stimulation ovarienne destinée à tester un anticorps censé augmenter le nombre d'ovocytes récoltés. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré, et toutes les rattes seront tuées pour des prélèvements d'organes destinés à des analyses morphologiques, histologiques et endocriniennes. Le porteur signale un risque de passage de liquide vers la cavité abdominale, suivi par dosage de l'hématocrite, et un point limite fixé à 15 % de perte de poids qui déclenche la mise à mort. Il écrit par ailleurs que "La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés".

Objectifs

L’objectif du projet est d’améliorer la réponse à la stimulation ovarienne. En effet, les échecs de procréation in vitro sont souvent dus à une mauvaise réponse des patientes à la stimulation ovarienne lors de leur prise en charge en assistance médicale à la procréation. L'hormone anti-Müllérienne est un des principaux régulateur des différentes étapes de la folliculogénèse. C'est pourquoi, nous avons développé un anticorps bloquant anti AMH et nous avons montré qu’un traitement avec cet anticorps est capable d’induire une ovulation chez des rattes anovulantes. Nous prévoyons maintenant de tester si cet anticorps pourrait augmenter le nombre d’ovocytes récoltés après une stimulation ovarienne chez des rates Wistar ovulantes.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d'améliorer la prise en charge des patientes répondant mal à la stimulation ovarienne en procréation médicalement assistée. Actuellement, en cas de mauvaise réponse à la stimulation ovarienne, les doses de gonadotropines sont augmentées ainsi que le nombre de stimulations ovariennes mais souvent sans qu'une amélioration du nombre d’ovocytes récoltés soit observée. La seule alternative pour ces patientes est alors le don ovocytes.

Procédures

Les animaux subiront au maximum un prélèvement de sang par semaine d’un volume inférieur à 5 % du volume sanguin total soit 2 à 4 prélèvements en fonction du protocole. Les animaux seront traités par des injections intra-péritonéale d’anticorps. Nous privilégions cette voie d'administration car nos tests précédent avec des injections en sous cutanée donnaient de moins bons résultats. Ce type de traitement avec des injections répétées d’anticorps anti-AMH a déjà été réalisé sur une durée plus longue (1 mois) sans effet secondaire. La stimulation ovarienne est une procédure courante sans effets secondaires rapportés.

Impact sur les animaux

Pour le suivi du cycle ovarien par la méthode des frottis vaginaux ainsi que pour l'injection intra péritonéale et les prélèvements sanguins, les femelles sont préalablement habituées à la contention par les expérimentateurs habilités. Pour les prélèvements sanguins, le volume de sang prélevé à chaque prise de sang (2 maximum, 1 par semaine) sera toujours en dessous du volume maximal autorisé (5% du volume sanguin total).

Devenir

Toutes les procédures conduiront à la mort des animaux afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux analyses morphologiques, histologiques, endocriniennes ...

Remplacement

Sur le plan scientifique, il est impossible de remplacer ces animaux par des systèmes ex vivo, in vitro ou in silico. L’anticorps anti-AMH utilisé dans ce projet est une IgG de rat, développée et validée dans cette espèce, notamment dans des modèles de dysfonction ovarienne. De plus, le fait que le rat ait une réponse plus modérée que la souris à la stimulation ovarienne en fait un meilleur modèle pour mettre en évidence une augmentation du nombre d'ovocyte après stimulation ovarienne comme nous l'avons déjà observé. L’utilisation de rattes permet ainsi de s’appuyer sur des données préexistantes robustes concernant sa spécificité, son efficacité et sa tolérance. De plus, la nature homologue de cet anticorps garantit une compatibilité optimale avec l’espèce étudiée et limite le risque de réponse immunitaire anti-anticorps lors d’administrations répétées. À l’inverse, son utilisation chez la souris pourrait induire une réponse immune dirigée contre cet anticorps hétérologue, ainsi qu’une incertitude quant à sa capacité à reconnaître et bloquer efficacement sa cible. Enfin, un changement d’espèce nécessiterait des études préalables de validation, impliquant l’utilisation d’animaux supplémentaires, ce qui serait contraire au principe de Réduction. La voie intrapéritonéale a été retenue sur la base de données expérimentales préalables issues de notre équipe, ayant montré une meilleure efficacité de l’anticorps anti-AMH par rapport à la voie sous-cutanée. L’utilisation de la voie sous-cutanée entraînerait ainsi une diminution de l’efficacité du traitement et une variabilité accrue des réponses, nécessitant une augmentation du nombre d’animaux pour atteindre une puissance statistique suffisante, ce qui irait à l’encontre du principe de Réduction. La voie intra-veineuse n'a jamais été testée car la majorité de nos protocoles incluent des injections répétées. Il faudrait tester cette nouvelle voie d'injection ce qui augmenterait le nombre d'animaux et irait à l’encontre du principe de Réduction. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, dans le respect des bonnes pratiques (choix du matériel adapté, volumes conformes aux recommandations, contention appropriée). Une surveillance clinique régulière des animaux sera assurée afin de détecter précocement tout signe d’inconfort, conformément au principe de Raffinement.

Réduction

Le projet comporte trois protocoles expérimentaux distincts visant à évaluer l’effet du schéma d’administration de l’anticorps anti-AMH sur la réponse à la stimulation ovarienne (1, 3 ou 4 injections). Chaque protocole comprend deux groupes (IgG témoin vs anticorps anti-AMH), avec un effectif de 20 animaux par groupe (soit 40 animaux par protocole).Les effectifs ont été déterminés sur la base de nos données préalables et de la variabilité observée dans ce modèle de ratte, déjà caractérisé dans notre équipe. Ces données permettent d’estimer de manière fiable le nombre d’animaux nécessaire pour mettre en évidence des différences biologiquement pertinentes, tout en garantissant une puissance statistique suffisante. La taille des groupes a ainsi été définie de manière à éviter à la fois un sous-dimensionnement (conduisant à des résultats non conclusifs et à la répétition des expériences) et un surdimensionnement (utilisation excessive d’animaux), conformément au principe de Réduction. Les trois protocoles correspondent à des schémas d’administration distincts et complémentaires, nécessaires pour répondre à la question scientifique posée. Leur dissociation permet d’éviter l’introduction de facteurs de confusion expérimentaux. Par ailleurs, plusieurs paramètres biologiques seront analysés chez les mêmes animaux, permettant de maximiser les données obtenues par individu. Les conditions expérimentales seront standardisées afin de limiter la variabilité interindividuelle et ainsi optimiser les effectifs requis. Les analyses statistiques seront adaptées à la distribution des données (tests paramétriques ou non paramétriques), afin d’optimiser la détection des différences entre groupes sans augmentation du nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront habitués à la manipulation en amont des procédures expérimentales afin de réduire le stress lié aux interventions. Les prélèvements sanguins seront réalisés dans le respect des recommandations en vigueur, en limitant les volumes à moins de 5 % du volume sanguin total et en espaçant suffisamment les prélèvements afin d’éviter toute altération de l’état général des animaux. Les injections intrapéritonéales, susceptibles d’induire une gêne locale, seront réalisées par du personnel formé et expérimenté, avec du matériel adapté et dans des conditions de contention maîtrisées, afin de minimiser la douleur et le stress. Un suivi clinique quotidien des animaux sera réalisé afin de détecter précocement tout signe d’inconfort ou de douleur (altération de l’état général, prostration, poils hirsutes, irritation au point d’injection, perte de poids). En cas d’apparition de tels signes, les animaux feront l’objet d’une surveillance renforcée et, si nécessaire, de mesures correctives telles que l’adaptation des conditions d’hébergement ou une réduction des manipulations. En cas de signes cliniques persistants, les animaux pourront être retirés du protocole expérimental et exclus de l’analyse, afin de préserver leur bien-être. Un point limite sera appliqué en cas de perte de poids supérieure à 15 % du poids initial, conduisant à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance prolongée. Par ailleurs, des administrations répétées d’anticorps par voie intrapéritonéale (toutes les 48 h pendant 15 jours) ont déjà été réalisées dans notre équipe sans impact observable sur le bien-être des rattes. Afin de renforcer le suivi du raffinement, des dosages de marqueurs biologiques seront réalisés avant et après traitement, incluant notamment des paramètres de tolérance générale (ALAT, ASAT pour la fonction hépatique). Un hématocrite sera également mesuré en fin de protocole. En effet, dans le contexte de stimulation ovarienne, une réponse excessive au traitement peut entraîner une augmentation de la perméabilité vasculaire, à l’origine d’un passage de liquide vers la cavité abdominale (ascite). Ce phénomène peut être associée à une altération de l’état général des animaux. L’élévation de l’hématocrite constitue ainsi un indicateur indirect de cette situation. En cas d'anomalies biologiques, les animaux concernés feront l'objet d'une surveillance renforcée, et pourront être retirés du protocole ou mis à mort.

Choix des espèces

La rate Wistar est un modèle validé pour l’étude de la physiologie de la reproduction et de la stimulation ovarienne. Son cycle œstral court (4–5 jours), bien caractérisé et reproductible, permet une analyse fine des mécanismes hormonaux et folliculaires. Les profils endocriniens présentent des similitudes fonctionnelles avec ceux observés chez l’humain, conférant à ce modèle une bonne pertinence biologique. À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de manière intégrée les interactions entre l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien et l’environnement systémique nécessaires à l’étude de la réponse à une stimulation hormonale. L’anticorps anti-AMH utilisé a été développé et validé chez le rat. Son utilisation chez la souris exposerait à un risque de réponse immunitaire et nécessiterait des études de validation supplémentaires, impliquant l’utilisation d’animaux additionnels, ce qui serait contraire au principe de Réduction. Femelles adultes de 2 à 4 mois, correspondant au début de l’âge adulte lorsque le stock d’ovocyte est encore important.

Déjà utilisées dans un autre protocole, 6 vaches laitières taries sont reprises pour tester un vaccin nasal contre la besnoitiose, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La tête bloquée au cornadis, chacune subit quatre prises de sang de trente millilitres, quatre écouvillonnages nasaux, trois instillations du vaccin et jusqu'à vingt-huit prises de température rectale. L'effectif tient à la disponibilité de ces six vaches, le porteur indiquant qu'il n'est pas modulable puisqu'elles proviennent d'un protocole antérieur. Toutes seront mises à mort à l'issue, au motif qu'elles auront été soumises à des produits expérimentaux.

Objectifs

La besnoitiose, caus?e par le parasite unicellulaire Besnoitia besnoiti (B. besnoiti), repr?sente une menace significative pour l??levage bovin. Maladie r?-?mergente en Europe, la besnoitiose progresse du sud vers le nord en France. Les parasites pr?sents dans la peau peuvent ?tre transmis par l?interm?diaire d?insectes ou d?aiguilles avec une progression jusqu?? 20% de nouveaux animaux infect?s par an dans les troupeaux touch?s. La phase f?brile est caract?ris?e par un larmoiement, un jetage nasal, une congestion des muqueuses, de la fi?vre ; puis la phase des ?d?mes touche toutes les r?gions du corps rendant les d?placements difficiles ; puis vient la phase de d?pilation et scl?rodermie accompagn? d?amaigrissement. La mort, spontan?e ou provoqu?e, peut atteindre jusqu?? 10 % des animaux infect?s. Cette maladie est ?galement une cause d?infertilit? des m?les pouvant impacter des taureaux de grande valeur g?n?tique. Aucun traitement curatif n?est disponible en Europe et les moyens de lutte sont limit?s au d?pistage et ? l??limination des animaux malades, ce qui est difficile pour les animaux asymptomatiques, ou au contr?le des insectes. Le d?veloppement d?un vaccin efficace offrirait aux ?leveurs une meilleure strat?gie de contr?le de cette maladie. Le but de ce projet est d??valuer l?immunog?nicit? et l?efficacit? d?un vaccin sous-unitaire ? administration nasale contre la besnoitiose. Ce vaccin est constitu? de prot?ines de B. besnoiti associ?es ? un muco-excipient ? base d?amidon. Les vaches seront immunis?es par voie intranasale pour d?clencher une r?ponse immunitaire muqueuse et syst?mique. Ces r?ponses seront ?valu?es par le suivi de l?apparition d?anticorps muqueux et s?riques sp?cifiques de B. besnoiti et par la production de mol?cules inflammatoires par les cellules sanguines. Le vaccin sera test? sur 6 vaches r?utilis?es et h?berg?es conform?ment aux directives europ?ennes, avec un enrichissement appropri? aux bovins. Toute m?dication interf?rant avec la r?ponse immunitaire est ? ?viter.

Bénéfices attendus

Les b?n?fices attendus sont la mise en ?vidence du d?veloppement d?une immunit? contre Besnoitia besnoiti, ? l?aide d?un vaccin nasal. Ces r?sultats sont essentiels pour envisager le d?ploiement de la vaccination de bovins dans les zones end?miques en France. Cet outil de lutte est attendu par les acteurs du secteurs (?leveurs impact?s, groupement de d?fense sanitaire qui soutient les ?leveurs dans la gestion de la besnoitiose).

Procédures

Les animaux seront soumis ? des pr?l?vements sanguins sous contention de la t?te au cornadis (environ 5 minutes par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des pr?l?vements nasaux par ?couvillonnage sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 4 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; d?instillation du vaccin par voie intranasale sous contention de la t?te au cornadis (environ 1 minute par animal, 3 fois au total, ? deux semaines d?intervalle) ; des prises rectales de la temp?rature (environ 5 minutes par animal, entre 16 et 28 fois avec un maximum de 2 fois par jour pendant 3 jours apr?s vaccination).

Impact sur les animaux

Les prises de sang peuvent ?tre source de stress et de douleur mod?r?e. Au total, 4 prises de sang de 30 mL chacune, ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. L??couvillon dans la narine peut provoquer une sensation de d?mangeaison limit?e ? la dur?e du geste. Au total, 4 ?couvillonages ? 2 semaines d?intervalle seront r?alis?es sur chaque animal. La prise rectale de la temp?rature peut occasionner une g?ne passag?re. Le pr?l?vement de sang au niveau de la veine jugulaire n?cessite une contention de la t?te ? l?aide d?un cornadis et d?un licol. Le pr?l?vement nasal se fera ? la suite pour profiter de l?immobilisation de la t?te de l?animal.

Devenir

A l'issue de la proc?dure 1, les 6 animaux seront mis ? mort ?tant donn? qu?ils auront ?t? soumis ? des produits exp?rimentaux.

Remplacement

Il n?existe ? ce jour aucune alternative non animale permettant d??tudier les r?ponses immunitaires. L??tude des r?ponses immunitaires n?cessite d?immuniser et de faire des pr?l?vements sur des animaux vivants. Le bovin est l?h?te de B. besnoiti. C?est donc la seule esp?ce pertinente pour ?tudier les r?ponses immunitaires d?un vaccin ? destination des bovins.

Réduction

Il s?agit d?une ?tude exploratoire sur des animaux r?utilis?s issus d?un autre protocole afin de ne pas en utiliser d?autres (r?duction). Le nombre d?animaux n?est donc pas modulable. Le fait que chaque animal soit son propre t?moin n?gatif permet d?avoir un lot unique et d?augmenter la robustesse des r?sultats. Pour les dosages de cytokines produites par les cellules sanguines stimul?es ex vivo, le test statistique non param?trique (2 ?chantillons appari?s) pourra ?tre utilis? pour d?terminer si la diff?rence entre le point avant vaccination (J0) et chaque point apr?s vaccination (J14, J28, J47) est significative. Une simulation r?alis?e avec l?outil de calcul de puissance de ce test indique que 6 individus sont n?cessaires pour atteindre 95 %, sans tenir compte de la grande variabilit? individuelle d?j? observ?e avec les cellules bovines et pour une augmentation attendue d?au moins 50 % de cytokines produites.

Raffinement

Les animaux ayant d?j? ?t? utilis?s, ils resteront dans leur environnement habituel. Ils ont d?j? ?t? acclimat?s et habitu?s aux pr?l?vements sanguins. Les prises de sang et les immunisations intranasales ne n?cessiteront qu?une contention minimale (au cornadis). Dans leur pr?cedent ?levage, les animaux ont d?j? ?t? habitu?s ? l?alimentation au cornadis. Un renforcement positif (granul?s pour vaches par exemple) sera appliqu? apr?s chaque immunisation et pr?l?vements. La vaccination ne devrait pas entrainer d?effet ind?sirable grave et toute m?dication pouvant interf?rer avec les r?ponses immunitaires (tels que les anti-inflammatoires) est proscrite. Enrichissement du milieu par : des brosses de grattage, des blocs de sels min?raux et de la paille r?guli?rement chang?e pour le couchage. Enrichissement social : les animaux seront h?berg?s en groupes stables et auront au minimum deux visites quotidiennes des animaliers.

Choix des espèces

Le bovin est l?esp?ce cible du vaccin test? dans cette exp?rimentation. Les vaches laiti?res sont au stade adulte et taries qui correspond au stade majoritairement infect? par B. besnoiti. En effet, le risque est li? aux piq?res d?insectes et il augmente avec l??ge des animaux.

Pour identifier le rôle d'un gène dans l'apparition de lésions précancéreuses du pancréas, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Au stade souriceau, elles sont tatouées à la base des phalanges et amputées de moins de deux millimètres de queue pour le génotypage. À partir de cinq semaines, elles reçoivent quarante injections dans l'abdomen réparties sur neuf semaines, jusqu'à six par jour, destinées à déclencher les lésions et à en accélérer la progression. Les retombées annoncées, de nouvelles cibles thérapeutiques contre le cancer du pancréas, sont formulées au conditionnel, quand les lésions sont provoquées puis laissées se développer jusqu'à l'âge de quatre mois, soit environ un quart de la vie d'une souris.

Objectifs

La partie exocrine du pancr?as joue un r?le essentiel dans la digestion des aliments. Elle repr?sente la grande majorit? du pancr?as et est constitu?e principalement de cellules sp?cialis?es, appel?es cellules acineuses, qui produisent des enzymes digestives. Ces enzymes sont ensuite transport?es par les canaux pancr?atiques jusqu?? l?intestin afin de participer ? la digestion. La grande majorit? des cancers du pancr?as prennent naissance dans ces cellules exocrines, qui peuvent subir des modifications progressives les transformant en cellules canc?reuses. L?activation anormale d?un g?ne appel? KRAS est notamment l?un des premiers ?v?nements fr?quemment observ?s dans le d?veloppement de ce cancer. La pancr?atite chronique est une maladie du pancr?as caract?ris?e par une inflammation persistante et progressive de cet organe. Au cours de la maladie, cette inflammation entra?ne une perte des cellules acineuses ainsi que la formation de tissu cicatriciel (fibrose), ce qui perturbe progressivement le fonctionnement normal du pancr?as. Plusieurs facteurs peuvent ?tre responsables d?une pancr?atite chronique, notamment les calculs biliaires, la consommation d?alcool, le tabagisme ou certaines pr?dispositions g?n?tiques. Toutefois, un certain nombre de cas, aucune cause pr?cise n?est identifi?e. Les modifications du tissu pancr?atique observ?es lors d?une pancr?atite chronique peuvent favoriser l?apparition d?un cancer du pancr?as. Ce cancer, dont le nombre de cas augmente r?guli?rement, est l?un des plus agressifs. Son taux de survie ? 5 ans reste tr?s faible, principalement parce qu?il est souvent diagnostiqu? tardivement, lorsque les possibilit?s de traitement sont limit?es. Il est donc essentiel de mieux comprendre les m?canismes responsables de la pancr?atite chronique ainsi que les premi?res ?tapes qui conduisent au d?veloppement du cancer du pancr?as. L?objectif de ce projet de recherche est d??tudier le r?le d?un g?ne impliqu? dans le d?veloppement du cancer du pancr?as. Pour cela, nous utilisons des mod?les de souris permettant de d?sactiver ce g?ne de mani?re contr?l?e afin d??valuer son influence sur l?apparition des premi?res l?sions pouvant ?voluer vers un cancer. Ces travaux pourraient contribuer ? une meilleure compr?hension des ?tapes pr?coces de la maladie et permettre d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques pour d?velopper de futurs traitements.

Bénéfices attendus

Ces mod?les de souris sont n?cessaires pour comprendre les causes de pr?disposition et de progression des l?sions pr?-canc?reuses pancr?atiques, ce qui a un int?r?t pour le d?veloppement de strat?gie de d?pistage et de strat?gie th?rapeutique du cancer du pancr?as.

Procédures

Les souriceaux sont marqu?s par tatouage ? la base des phalanges et un pr?l?vement d?un petit bout de queue (moins de 2 mm) est effectu? pour le g?notypage, c'est ? dire l'identification des modifications g?n?tiques induites chez chaque animal. La manipulation est tr?s rapide et n?induit pas de modification du comportement du souriceau, et la queue cicatrise tr?s rapidement ? ce stade. Les souris sont trait?es par injections au niveau de l?abdomen (1 fois par jour pendant 4 jours cons?cutifs ? l??ge de 5 semaines, puis 4 semaines apr?s elles sont inject?es 6 fois par jour pendant 2 jours cons?cutifs, puis 6 fois par jour 1 jour par semaine pendant les 4 semaines suivantes. La n?cessit? de ce nombre d'injection a ?t? ?tablie par des travaux de mise au point valid?s dans diff?rents laboratoires dans le monde). Ces injections servent ? induire les modifications g?n?tiques et ? favoriser le d?veloppement des l?sions pr?-canc?reuses pour ?tudier les causes de leur initiation et de leur progression.

Impact sur les animaux

Les souris sont trait?es par un certain nombre d?injections dans la cavit? p?riton?ale, au niveau de l?abdomen. Cela peut entrainer une l?g?re perte de poids le jour suivant l?injection. Les souris vont d?velopper des l?sions microscopiques pr?-canc?reuses au niveau du pancr?as. Les souris sont euthanasi?es pr?cocement pour l?analyse de ces l?sions avant le stade de cancer.

Devenir

Les animaux de la proc?dure sont euthanasi?s pour des analyses effectu?es sur le pancr?as (visualisation et ?tudes de mol?cules) afin d??tudier les l?sions pr?canc?reuses.

Remplacement

Les connaissances issues de cette ?tude sur l?animal ne peuvent pas ?tre actuellement obtenues par d?autres m?thodes compte-tenu de la complexit? physiologique du d?veloppement des l?sions pr?canc?reuses, nous obligeant ? travailler ? l'?chelle d'un organisme. Des ?tudes in vitro sur des cellules et des "mini-organes" en culture ou issus de pr?l?vements de l?sions humaines sont ?galement possibles en compl?ment mais ne peuvent pas remplacer cette ?tude avec ce mod?le physiologique. Les retomb?es de ce travail sont utiles du point de vue des implications th?rapeutiques ? terme chez l'homme.

Réduction

Nous utilisons l'effectif minimal de souris, determin? par des r?sultats obtenus pr?c?demment et dans les publications scientifiques pour ce type d?analyse, et qui permet d'obtenir des r?sultats statistiques permettant la validation de l'?tude.

Raffinement

Les m?thodes et les mesures choisies visent ? diminuer au maximum les contraintes impos?es aux animaux. Les souris sont plac?es dans des conditions optimales d'?levage, en portoirs ventil?s. Les souris sont 5 individus par cage au maximum pour avoir assez de place dans la cage sans pour autant ?tre isol?s car ce sont des animaux gr?gaires. La temp?rature, l'hygrom?trie, la nourriture et l'eau sont contr?l?es tous les jours. En plus de la liti?re, les cages sont enrichies avec des cotons et des petits abris. Une surveillance quotidienne du personnel de l'animalerie et un suivi r?gulier de l'exp?rimentateur (au moins 1 fois par semaine) avec la prise en compte de diff?rents ?l?ments bien d?finis tels que l'aspect du pelage et des yeux, le poids et le comportement des souris permet d'?viter toute souffrance des animaux. Nos analyses sont pr?coces et concernent les phases de l?sions pr?-canc?reuses. Les souris sont euthanasi?es pour analyse avant de d?velopper un cancer.

Choix des espèces

Les souris modifi?es g?n?tiquement sont largement utilis?es dans l'?tude des m?canismes physiopathologiques de pathologie humaine. L?objectif du projet est d??tudier le d?veloppement et l??volutivit? de l?sions pr?-canc?reuses pancr?atiques gr?ce au mod?le de souris et d?identifier de nouvelles cibles th?rapeutiques. Les souris seront utilis?es ? l??ge de 5 semaines car au tout d?but de l??ge adulte. On laisse les l?sions pr?- canc?reuses se d?velopper dans ce mod?le de souris jusqu?? l??ge de 4 mois (ce qui correspond ? environ 1/4 de la dur?e de vie de la souris). Cela permet d??tudier l?impact de notre g?ne d?int?r?t dans l?initiation et la progression de ces l?sions pr?canc?reuses.