Procédures modérées
Impact du stress gestationnel ou de l’exposition aux glucocorticoïdes sur le développement testiculaire
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
10 000 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Un quart des femelles gestantes subissent trois séances de contention de trente minutes par jour pendant sept jours consécutifs, puis une injection et un prélèvement sanguin submandibulaire, avant une perfusion intracardiaque de fixateur sous anesthésie qui provoque leur mort. Les femelles gestantes sont tuées pour permettre le prélèvement des fœtus, eux-mêmes tués pour les analyses. Les femelles nées de ces gestations sont tuées à leur tour, le porteur indiquant qu'elles ne sont pas "nécessaires aux analyses réalisées dans ce projet", qui portent sur le développement testiculaire et la fertilité masculine.
Objectifs
Le testicule est un organe vulnérable aux perturbations hormonales pendant la grossesse. Toute altération d’un des type de cellule du testicule peut induire des problèmes durables de fertilité masculine. Ce projet vise à comprendre comment l’exposition aux hormones du stress pendant la gestation perturbent le développement testiculaire et programment des défauts de fertilité à l’âge adulte. Cette étude est indispensable pour plusieurs raisons. La dexaméthasone est un médicament qui imite une hormone naturelle du stress et qui est utilisé chez la femme enceinte en cas de risque d’accouchement prématuré. Malgré son efficacité clinique, ses effets secondaires à long terme sur la reproduction masculine restent mal connus. Aussi, le stress est devenu très fréquent dans la vie moderne, en raison des contraintes environnementales, professionnelles et sociales. Il augmente durablement les hormones du stress dans l’organisme mais les répercussions pendant la grossesse sont largement sous-estimées. Enfin, de nombreuses causes connues d’infertilité masculine comme les perturbateurs endocriniens, l’obésité, les infections, les maladies chroniques s’accompagnent d’une augmentation des hormones de stress, suggérant un rôle mécanistique encore insuffisamment exploré. L’objectif du projet est d’identifier comment ces expositions modifient l’état des cellules du testicule en étudiant en particulier la protéine qui permet aux cellules de répondre aux hormones du stress. Le projet analysera également les conséquences à long terme sur la spermatogenèse et la fertilité adulte, ainsi que la possible transmission de ces effets aux générations suivantes. En améliorant la compréhension des mécanismes biologiques impliqués, ce projet contribuera à réévaluer l’utilisation de ces traitements pendant la grossesse et à prévenir les effets à long terme sur la fertilité masculine.
Bénéfices attendus
Le projet vise à améliorer la compréhension des mécanismes par lesquels le stress gestationnel et les glucocorticoïdes synthétiques, tels que la dexaméthasone, influencent le développement du testicule, la fertilité masculine et la production hormonale. À court terme, ce travail permettra d’identifier de manière précise les effets cellulaires et moléculaires induits par ces expositions au cours de la gestation. Les données obtenues fourniront des informations inédites sur les étapes critiques du développement testiculaire sensibles aux variations hormonales maternelles, ainsi que sur le rôle du récepteur des glucocorticoïdes dans ces processus. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer à une meilleure évaluation du risque associé au stress maternel chronique ou à l’utilisation de glucocorticoïdes pendant la grossesse. Les résultats permettront d’identifier des mécanismes responsables d’éventuelles altérations persistantes ou transmissibles de la fertilité masculine. Ces connaissances sont importantes pour améliorer le conseil clinique concernant l’usage de la dexaméthasone en contexte obstétrical et pour renforcer la prévention des expositions délétères durant la gestation. Enfin, en mettant en lumière les mécanismes cellulaires impliqués dans la programmation fœtale de la fertilité, ce projet pourrait à terme favoriser le développement de stratégies thérapeutiques visant à limiter ou corriger les effets néfastes d’expositions précoces. Ces avancées bénéficieraient potentiellement à la santé reproductive humaine et animale, dans un contexte de baisse globale de la fertilité et d’augmentation documentée des situations de stress environnemental.
Procédures
25% des femelles gestantes subiront une contention à raison de trois séances par jour, d’une durée de trente minutes chacune, pendant 7 jours consécutifs. Puis, elles reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). 50% des femelles gestantes reçoivent une injection unique d’un médicament ou un placébo (durée de l’injection : moins de 1 minute) une fois par jour, sur une durée de sept jours consécutifs. Puis, elles reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). 25% des femelles gestantes reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). Les mâles reçoivent une injection deux heures avant la mise à mort (durée de l’injection : moins de 1 minute). Puis un prélèvement sanguin réalisé une seule fois, juste avant la mise à mort (durée du prélèvement : moins de 1 minute, incluant la contention, la ponction et l’hémostase). Un anesthésique sera administré par injection pour permettre la perfusion intracardiaque d’un fixateur histologique. Les souris sous anesthésie sub-létale/profonde en moins de 5 minutes. La perfusion (10 minutes) résulte en la mort de l’animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables potentiels incluent un stress transitoire lié à la manipulation et à la contention, une douleur légère et brève au point d’injection ou de prélèvement, ainsi qu’une baisse temporaire de l’activité ou de la prise alimentaire après les procédures répétées. La contention répétée et les injections de médicament qui imite une hormone naturelle du stress induisent une élévation attendue des hormones de stress et une légère perte de poids. Elles induisent une augmentation temporaire de l’activité de l’axe du stress, se traduisant par une élévation des hormones glucocorticoïdes et un stress comportemental modéré chez les femelles gestantes. Ces effets sont attendus pendant la durée des séances de contention et sont réversibles après la fin du protocole qui n’excèdera pas 7 jours consécutifs. Aucun effet physique durable n’est attendu. Les injections répétées induisent un risque limité de rougeur, d’hématome ou d’inflammation locale. Le prélèvement sanguin submandibulaire peut entraîner un saignement transitoire et une ecchymose locale. La perfusion intracardiaque terminale est réalisée sous anesthésie profonde, éliminant toute perception douloureuse.
Devenir
Toutes les femelles gestantes sont euthanasiées afin de permettre le prélèvement des fœtus. Elles ne peuvent pas être gardées en vie, réutilisées ou replacées. Les embryons et fœtus prélevés sont euthanasiés pour la réalisation d’analyses moléculaires et histologiques. Ils ne peuvent pas être gardés en vie, réutilisés ou replacés. Les mâles issus des femelles gestantes expérimentales sont mis à mort afin de permettre le prélèvement des testicules nécessaires aux analyses moléculaires, histologiques et immunohistochimiques visant à étudier le développement testiculaire, la spermatogenèse et les mécanismes associés. Les femelles issues des femelles gestantes expérimentales sont mises à mort car elles ne sont pas nécessaires aux analyses réalisées dans ce projet, qui portent spécifiquement sur le développement testiculaire et la fertilité masculine.
Remplacement
Le développement du testicule fœtal, la mise en place des interactions entre cellules de Sertoli, cellules germinales, cellules de Leydig et macrophages testiculaires, ainsi que la mise en route de la spermatogenèse, sont des processus hautement intégrés qui dépendent de signaux hormonaux, paracrines et systémiques impossibles à reproduire dans des modèles in vitro. Les organoïdes testiculaires et les cultures cellulaires existantes permettent d’étudier certaines fonctions isolées, mais ne reproduisent ni l’organisation tridimensionnelle, ni la vascularisation, ni l’environnement endocrinien maternel, ni les variations physiologiques des glucocorticoïdes. Ils ne permettent pas non plus de modéliser un stress gestationnel, lequel implique une réponse neuroendocrinienne complexe propre à l’organisme entier. De plus, l’étude des effets du stress ou de la dexaméthasone sur la transmission transgénérationnelle nécessite la prise en compte de la reprogrammation épigénétique germinale, processus qui ne peut être étudié qu’in vivo. Le remplacement par des méthodes n’impliquant pas l’animal vivant n’est pas possible pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Pour obtenir des résultats statistiquement significatifs au risque de se tromper de 5%, aux stades intéressants, nous aurons besoin d’un nombre d’animaux assez important à savoir 10 individus par condition, par stade et par génotype. Plusieurs mesures ont été mises en place pour réduire le nombre total d’animaux. Les accouplements sont planifiés de manière à produire simultanément des animaux contrôles et mutants au sein des mêmes portées, limitant le nombre de reproducteurs nécessaires. Les analyses embryonnaires sont réalisées sur des stades choisis de façon ciblée, sur la base des phénotypes observés, afin d’éviter des prélèvements multiples et inutiles. Pour les adultes, seules les étapes développementales pertinentes seront examinées : aucun animal ne sera utilisé si les résultats des phases précédentes ne justifient pas la poursuite des analyses. Les tissus prélevés sont systématiquement partagés entre analyses histologiques, immunologiques ou moléculaires, de manière à éviter l’utilisation d’animaux supplémentaires pour des examens complémentaires. Les analyses intégratives, incluant par exemple des approches combinant transcriptomique et épigénomique, permettent également de réduire le nombre d’animaux en regroupant plusieurs types de données à partir des mêmes échantillons. Enfin, l’absence d’études pilotes supplémentaires limite l’utilisation d’animaux, car les protocoles reposent sur des méthodes déjà établies dans la littérature ou validées au sein de l’équipe.
Raffinement
Les femelles gestantes font l’objet d’un suivi quotidien après l’induction du stress et lors des périodes de traitement ; incluant l’évaluation quotidienne du poids et du comportement spontané. Toute absence de prise de poids, diminution de mobilité, ou altération de l’état général entraîne une action immédiate avec mise à disposition d’une alimentation en gel et surveillance trois fois par jour. Le stress gestationnel est induit par une contention dans un tunnel ventilée, sur une durée et fréquence standardisée, ne provoquant ni douleur physique ni lésion. Les périodes de contention sont réalisées dans un environnement calme afin de limiter les stimulations additionnelles. Les femelles sont remises immédiatement dans leur cage d’origine après la procédure et leur comportement est contrôlé après chaque session. Les administrations de médicaments ou de substances sont réalisées avec des volumes minimaux et des aiguilles adaptées afin de réduire l’impact de la procédure. Le volume des prélèvements sanguins sont limités au strict nécessaire pour les dosages hormonaux. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de limiter le stress et de respecter leurs besoins comportementaux. Des mesures de raffinement supplémentaires pourront être intégrées tout au long du projet comme des maisonnettes, des batônnets à ronger, une limitation du changement de cage et une mise à disposition de matériel de nidification supplémentaire. Des points limites ont été définis, en cas de souffrances constatés des mesures correctives adaptés seront mises en œuvre.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle constitue l’espèce la plus pertinente pour étudier le développement testiculaire, la fonction des glucocorticoïdes et les effets du stress gestationnel. Son organisation testiculaire, la dynamique de la spermatogenèse et la régulation endocrinienne du développement reproducteur présentent de fortes similarités avec celles de l’Homme. De plus, le développement embryonnaire du testicule y est décrit de manière très détaillée, ce qui en fait un modèle de référence. Le projet repose sur une approche de génomique fonctionnelle ciblant spécifiquement certaines cellules testiculaires, pour laquelle la souris est particulièrement adaptée en raison de son temps de génération court et de la disponibilité de nombreux outils génétiques. Son faible temps de gestation et sa descendance abondante facilitent les études intergénérationnelles. L’utilisation des femelles se limite aux fonctions reproductrices nécessaires à la production des animaux utilisés et à l’application des traitements gestationnels. Les femelles seront mises en accouplement entre 8 et 16 semaines d’âge, période correspondant à une maturité reproductive optimale. Les embryons et fœtus permettent d’analyser la différenciation sexuelle du testicule, la prolifération des cellules de Sertoli, la quiescence des cellules germinales, la mise en place de la vascularisation et la production de testostérone fœtale, tous processus sensibles aux variations hormonales maternelles et aux expositions gestationnelles expérimentales. Les nouveau-nés sont examinés pour le maintien de la quiescence des cellules germinales, la localisation et la prolifération des macrophages testiculaires anti-inflammatoires, ainsi que le développement initial des organes sexuels. Les stades néonatals correspondent à la reprise de la prolifération germinale, au début de la méiose et à l’apparition des progéniteurs de cellules de Leydig adultes. Les stades prépubères permettent d’étudier la maturation des cellules de Sertoli et la différenciation des cellules de Leydig immatures, la progression de la méiose et l’émergence des macrophages pro-inflammatoires. Les souris adultes permettent d'étudier la maturité sexuelle et le vieillissement testiculaire. Ces stades sont essentiels pour évaluer la spermatogenèse, la production hormonale, la fertilité et les conséquences à long terme des expositions gestationnelles.
Création et élevage de nouvelles lignées de souris permettant l’étude du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Inspectées et pesées deux à trois minutes par semaine pendant huit semaines à partir de quatre mois, soumises à contention lors de prélèvements de matières fécales, 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'inactivation de certains gènes doit leur donner des polypes intestinaux, avec anémie, saignements intestinaux et risque de perte de poids, pour obtenir des lignées qui développent d'elles-mêmes des micro-tumeurs de l'intestin. Le devenir compte 680 souris tuées, quand le porteur écrit que les animaux ayant servi à la reproduction ou dépourvus des combinaisons de gènes recherchées seront "en priorité mis à disposition à des fins pédagogiques", ou tués. Les procédures décrites s'arrêtent à l'inspection, à la pesée et aux prélèvements fécaux, sans que le porteur précise ce que subissent les souris dont les polypes progressent, ni ce que couvre l'usage pédagogique annoncé.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste à comprendre le rôle de différents gènes dans les toutes premières étapes de la formation de tumeurs intestinales. A ce titre, nous développerons des lignées de souris génétiquement modifiées développant de manière spontanée des micro tumeurs intestinales, mimant la maladie humaine. Ce projet de création de lignées sera accompagné d’un protocole d’élevage et de suivi adapté.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de disposer de nouveaux modèles d’études valorisables dans le cadre de la lutte contre le cancer colorectal, touchant de nombreuses personnes dans les pays occidentaux. L’exploitation de ces modèles permettront de découvrir de nouveaux éléments clefs dans la prise en charge de l’inflammation et son impact dans la formation des tumeurs.
Procédures
Les animaux, à partir de 4 mois d’âge, seront régulièrement inspectés et pesés (2-3 minutes par semaine, durant 8 semaines). Les animaux seront soumis à contention lors de prélèvements fécaux, et manipulés lors des phases de mises en accouplement et de leur suivi.
Impact sur les animaux
L'inactivation de certains gènes conférera une susceptibilité accrue des animaux à la formation de polypes intestinaux, avec apparition de signe d’anémie, et risque de perte de poid et de saignements intestinaux.
Devenir
Les animaux, après utilisation pour reproduction, ou ne possédant pas les combinaisons de gènes souhaités seront en priorité mis à disposition à des fins pédagogiques ou euthanasiées.
Remplacement
La question centrale de notre projet implique de comprendre les interactions entre les microbes, les cellules intestinales et le système immunitaire dans le cadre de la formation du tumeurs digestives. A ce jour, les alternatives utilisant des cultures de cellules ne permettent pas de reproduire un tel niveau de complexité. Dans ce contexte, le modèle animal représente notre seule alternative
Réduction
Nous avons, sur la base de données précédemment acquises, et grâce à une approche statistique robuste, pu déterminer le nombre minimum d’animaux requis pour permettre d’obtenir des données interprétables.
Raffinement
Nous avons mis en place un mode de suivi adapté à nos procédures, consistant en une surveillance accrue des individus lors des phases de vieillissement, accompagné d’une grille de suivi reprenant les paramètres physiologiques les plus pertinents à mesurer. L’utilisation de points limites adaptés nous permettra de rapidement stopper l’expérience en cas d’atteintes de critères d’arrêts, et réduire toutes nuisances aux animaux.
Choix des espèces
La souris possède de nombreuses similitudes avec l’homme en termes de biologie digestive, et cette espèce permet d’inactiver certains gènes d’intérêts. Les animaux seront utilisés à partir de 5 à 6 semaine, lorsque le système digestif arrive à maturité.
Création d’une souche d’Eimeria tenella génétiquement modifiable et multiplication chez le poulet
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Produire en série un parasite génétiquement modifiable : 115 poulets vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leurs cæca, y mesurer la charge parasitaire et y noter les lésions. Chacun reçoit Eimeria tenella par la bouche ou par le cloaque, à une dose que le porteur dit calculée pour ne pas déclencher de symptômes, la coccidiose clinique donnant sinon perte d'appétit, soif intense, crête décolorée, prostration et diarrhées sanglantes. Le rendement attendu est de dix millions d'oocystes par poulet infecté, et il faut recommencer régulièrement pour "préserver l'infectiosité de la nouvelle souche transgénique générée". Le porteur écrit avoir publié une culture in vitro qui "permet d'accéder à la totalité des stades du cycle parasitaire", puis qu'elle "ne reproduit que la 1ere multiplication asexuée" et "ne couvre pas la fin du cycle".
Objectifs
Les coccidioses représentant un problème majeur en élevage aviaire, elles entraînent de lourdes pertes économiques. Ces parasitoses sont causées par des apicomplexes intracellulaires obligatoires dont Eimeria tenella. Face au coût élevé des vaccins et l’émergence de parasites résistants aux anticoccidiens, il devient urgent d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. La possibilité de modifier génétiquement le parasite serait un outil précieux pour nos recherches portant sur la compréhension du parasite et la mise en place de nouvelles stratégies de contrôle : suivi de l’infection in vitro et in vivo, identification de facteurs de virulence, génération de mutants ou de vaccins, test d’efficacité de nouveaux traitements. Ce projet a pour but de créer une souche d’Eimeria tenella génétiquement modifiable par des systèmes tels que CRISPR/Cas9 pour réaliser de l’édition de génome dite « propre » et servira de souche de base pour la génération des souches transgéniques pour les recherches futures de l’équipe.
Bénéfices attendus
Le développement d’une souche d’E. tenella génétiquement modifiable permettra d’accélérer les recherches conduisant à l’identification de nouvelles molécules. En effet, cette nouvelle souche premettra de rendre diverses applications possibles (ex : génération de mutants ou de vaccins, identification et caractérisation de facteurs de virulence parasitaires par génétique inverse) plus aisées, robustes et rapides au laboratoire (ex : criblage et test d’efficacité de nouveaux traitements, suivi d’infection in vitro). Des multiplications régulières sur animaux sont nécessaires pour préserver l’infectiosité de la nouvelle souche transgénique générée et ainsi permettre la continuité des études au laboratoire.
Procédures
Les animaux seront soumis à une administration par voie orale ou cloacale du parasite Eimeria à une dose qui ne cause pas de morbidité et qui n’induit pas de signes cliniques proches du point limite. L’objectif est de générer une souche d’Eimeria tenella génétiquement modifiable. L’inoculation est réalisée au fond de la cavité buccale de l’animal et n’est pas invasive comme le serait un gavage dans lequel l’embout serait inséré jusqu’à l’oesophage. L’inoculation est de courte durée (20s maximum). De même l’inoculation par voie cloacale n’est pas invasive et est de courte durée (10s). Aucune douleur n'est attendue suite aux deux types d’inoculations. L’angoisse liée à la contention est estimée comme légère et de très courte durée. Elle est effectuée par du personnel expérimenté.
Impact sur les animaux
En coccidiose aviaire, on ne parle pas de virulence mais plutôt de pouvoir pathogène des parasites car la gravité de l’infection est dépendante de la dose infectieuse. La coccidiose clinique est très symptomatique, avec une perte d’appétit, une perte de poids, une soif intense, une crête décolorée, des modifications du comportement (oiseaux prostrés, ailes pendantes), et des diarrhées sanglantes. Ces signes impactent fortement la croissance des jeunes et le taux de ponte des poules. En élevage, la plupart des cas de coccidiose sont des infections subcliniques, qui impactent les performances zootechniques des oiseaux, sans symptômes visibles. Dans le cadre de nos travaux, les doses inoculées aux poulets sont faibles et n’induisent pas de symptômes cliniques. La contention lors des inoculations peut engendrer un stress estimé comme léger et de très courte durée.
Devenir
Pour chaque procédure de ce projet, tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever différents tissus (caeca) et de pouvoir analyser la charge parasitaire contenue et le scoring des lésions.
Remplacement
L’équipe a publié une méthode de culture in vitro qui permet d’accéder à la totalité des stades du cycle parasitaire. Il s’agit là d’une preuve de concept et en aucun cas d’une méthode de production de parasites en grande quantité. La culture in vitro ne reproduit que la 1ere multiplication asexuée (production de mérozoïtes) et ne couvre pas la fin du cycle, c’est-à-dire, les 2 autres multiplications asexuées puis la reproduction sexuée (qui génère les oocystes). Nous avons publié une preuve de concept : avec une souche vaccinale (qui ne fait qu’une seule multiplication asexuée) et sur culture primaire de cellule de rein de poulet, on a réussi à produire in vitro quelques oocystes. Mais la manipulation des Eimeria nécessite la reproduction de 10e7 oocystes (c’est le rendement obtenu pour chaque poulet infecté).
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dépend de la prolificité de la souche et du nombre de parasites requis. Pour la souche sauvage utilisée au laboratoire, le rendement en parasites produits peut être déterminé. En revanche pour la souche recombinante à générer, nous n’avons aucune donnée sur sa prolificité.
Raffinement
Chaque inoculum fait l'objet d'une attention particulière pour administrer des doses définies et adaptées à l’espèce présente et ainsi éviter toute pathogénicité. Pour un rendement optimal, la muqueuse intestinale ne doit pas être trop abîmée. Il est donc inutile d’inoculer une dose trop forte de parasites qui pourrait induire des effets pathogènes et donc provoquer de la douleur. Même si la dose inoculée est calculée de manière à ne pas induire de pathogénicité, nous restons vigilants à l’état de santé des animaux : après inoculation de l’agent infectieux, deux visites quotidiennes sont réalisées dans la salle expérimentale afin de surveiller l’éventuelle apparition des premiers symptômes liés à la maladie : plumes ébouriffées, prostration. Ils sont hébergés par groupe de 3 à 20 animaux en parquet, sur litière de miscanthus pour éviter les poussières ou bien en cage, selon les disponibilités des salles d’expérimentation. Ils ont à disposition aliment et eau ad libitum. Pour le raffinement des conditions d’hébergement, des petites plateformes triangulaires ont été placées pour permettre aux poulets de se percher à l’intérieur des parquets.
Choix des espèces
A l’heure actuelle, il n’existe pas de méthode alternative suffisamment efficace (in vitro) pour multiplier les parasites, en routine et en grande quantité. Le poulet est l’espèce hôte exclusive chez laquelle se multiplient les parasites. Des poulets de statut sanitaire contrôlé seront utilisés. L’étroitesse du spectre d’hôtes des parasites du genre Eimeria empêche toute tentative de manipulation d’une espèce parasitaire aviaire sur un modèle animal autre que la poule. Les animaux sont utilisés entre 3 et 7 semaines d’âge, considéré comme l’âge optimum pour un meilleur rendement en parasite.
Exploration de nouvelles voies de régulation de la fibrose et de la résistance aux thérapies ciblées dans le carcinome hépatocellulaire
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une injection unique de composé cancérigène à l'âge de douze jours doit faire pousser un cancer du foie chez 96 souris mâles, suivies jusqu'à un an, avec dix prélèvements de sang et sept échographies sous anesthésie gazeuse chacune, et deux injections par semaine pendant cinq mois pour vingt-quatre d'entre elles. Le niveau de souffrance déclaré reste modéré. Le porteur détaille le stress de contention, la douleur légère à l'insertion de l'aiguille et le risque d'hypothermie sous anesthésie, et mentionne en une ligne la perte de poids, l'hépatomégalie et la masse hépatique qu'entraîne le cancer qu'il provoque. Les 96 souris sont tuées pour analyser leur foie, et seuls des mâles sont utilisés, le porteur indiquant que les femelles sont moins sensibles aux maladies du foie.
Objectifs
L’inflammation chronique et la fibrose (cicatrisation progressive du foie) jouent un rôle central dans l’évolution des maladies du foie vers la cirrhose, puis vers un cancer du foie appelé carcinome hépatocellulaire (CHC). À ce jour, ce cancer est surtout traité par des médicaments appelés inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK), mais les patients finissent souvent par devenir résistants à ces traitements. Ce projet a pour objectif de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans la progression de la fibrose, du CHC et dans l’apparition de cette résistance aux ITK. Pour cela, nous utilisons un modèle de souris dans lequel un cancer du foie est provoqué par une injection unique de d'un composé cancerigène. Deux moments d’analyse sont prévus : à 8 mois, correspondant au stade de cirrhose, et à 12 mois, correspondant au stade de CHC. Les expériences consisteront à modifier certaines voies biologiques dans le foie à l’aide de vecteurs viraux, puis à analyser les tissus à ces deux stades clés (8 et 12 mois) par des examens microscopiques et moléculaires.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de mettre en évidence des marqueurs biologiques et des pistes thérapeutiques plus ciblées pour ralentir la progression vers la cirrhose et améliorer la prise en charge du CHC résistant.
Procédures
Durant ce projet les animaux subiront une injection à 12 jours (30s/ injection) ainsi que 1 prélèvement sanguin par mois de 3 à 8 ou 12 mois sur animaux vigiles par contention (1min / prélèvement), soit au total 10 prélèvements maximum par animal. Les animaux seront également soumis à une échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée de 15 minutes une fois par mois de 6 à 8 ou 12 mois, soit au maximum 7 échographies maximum par animal. 2 groupes d'animaux (24 souris) seront soumis à 2 injections par semaine pendant 5 mois.
Impact sur les animaux
Le modèle d'hépatocarcinome que nous utilisons induit le développement d'un cancer à 1 an, pouvant induire une perte de poids ainsi que des troubles hépatiques (hépatomégalie ou masse sur le foie). Lors des injections, l’animal va ressentir un stress lors de la contention et une douleur légère lors de l’insertion de l’aiguille. Les animaux subiront des prélèvements sanguins répétés, pouvant entraîner une légère douleur. Des contentions seront pratiquées ce qui entraîne un stress léger. Une anesthésie gazeuse induit un stress et pourrait induire une hypothermie (prévenue par le maintien de l'animal sur une plaque chauffante).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure afin d'analyser différents organes dont le foie.
Remplacement
Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de l’inhibition ou la surexpression de protéines sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie hépatique. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologiques de régulations (homéostasie lipidique, fonction hépatique). Seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (régulation des lipides, dérèglements biochimiques, balance inflammatoire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 12 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d’analyse et réduction du nombre d’animaux utilisés. Seules des souris mâles seront utilisées, car il est bien documenté dans la littérature que les femelles sont moins sensibles aux maladies hépatiques. Au cours de cette étude, des données seront recueillies et analysées par des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Les animaux sont hebergés dans les conditions réglementaires. Nous suivrons l'état général des animaux, incluant le toilettage, la posture et la présence de vocalisations. Tous ces éléments nous permettront d'évaluer l'atteinte de points limites, pouvant entraîner l’euthanasie de l'animal afin d'éviter toute souffrance. En cas de douleur, un antalgique pourra être administré conformément aux recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés toutes les deux semaines, en plus du suivi quotidien habituel. Lors des prélèvements sanguins, le volume prélevé sera compensé par l'injection de sérum physiologique. Le modèle d’hépatocarcinome que nous utilisons a déjà été largement décrit dans la littérature et étudié au laboratoire, et nous savons qu'il induit un hépatocarcinome après 1 an. Afin de suivre l'apparition de l'hépatocarcinome, en plus du suivi clinique quotidien, une analyse mensuelle de différents marqueurs sanguins sera réalisée ainsi qu'une échographie du foie.
Choix des espèces
La souris permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. La molécule provoquant l’hépatocarcinome est administrée à des animaux de 12 jours, car à ce stade les hépatocytes (cellules du foie) sont encore très prolifératifs et par conséquent plus sensibles aux mutagènes. Les animaux sont ensuite suivis jusqu’à un an maximum, âge auquel ils présentent un hépatocarcinome.
Rôle des gènes d’études dans le développement des myosites inflammatoires : analyse de modèles murins à invalidation musculaire conditionnelle.
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Une posture inhabituelle, un poil hérissé, un dos voûté, le retrait et l'absence d'interaction avec les congénères déclenchent le retrait de l'étude et une mise à mort immédiate. 2400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré à sévère, toutes tuées en fin de procédure pour des analyses de tissus. Toutes reçoivent cinq jours d'injections dans le péritoine pour inactiver les gènes étudiés dans le muscle, ainsi que jusqu'à trois prélèvements de sang, et 1600 d'entre elles des injections en quatre zones sous la peau qui provoquent des lésions musculaires, suivies d'un gavage quotidien de glucocorticoïde pendant une semaine. Le porteur présente les 2400 souris comme "une estimation haute", ce nombre devant être "ajusté à la baisse" en fonction des résultats intermédiaires.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle des gènes d’études dans l’homéostasie du muscle squelettique et dans le développement des myosites inflammatoires, à l’aide de modèles murins présentant une invalidation conditionnelle et spécifique du muscle squelettique. Plus précisément, il s’agit de comparer l’impact d’une délétion musculaire de ces gènes induite après une lésion musculaire aiguë par toxine et avant l’induction d’une myosite expérimentale, sur les paramètres cliniques, histologiques, moléculaires et immunologiques du muscle.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de mieux comprendre le rôle précis des gènes d’études dans la physiopathologie des myosites inflammatoires et des myopathies inflammatoires idiopathiques, qui se caractérisent par une faiblesse musculaire proximale, une élévation des enzymes musculaires et une inflammation musculaire persistante. L’utilisation de modèles murins à invalidation musculaire conditionnelle, combinée à des modèles de myosite expérimentale, devrait permettre d’identifier des voies de signalisation et des populations cellulaires clés dans la transition entre lésion musculaire aiguë, régénération et inflammation chronique. À terme, ces données pourraient contribuer à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques orientées vers le muscle dans les myopathies inflammatoires, ou à l’optimisation des stratégies de prise en charge existantes.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (2400) seront sujets à des traitements par injection intra-péritonéale pendant 5 jours pour induire l’inactivation des gènes d’étude au niveau des muscles (30 secondes maximum de contention par injection soit 2minutes et 30 secondes au maximum par animal). Tout animal de l’expérience pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum (30 secondes de contention par prélèvement) au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Les 1600 souris des procédures 2 et 3 seront injectés en 4 zones en sous-cutanée et sous anesthésie gazeuse afin d’induire les lésions musculaires (30 minutes de l’anesthésie au réveil par animal), suivi d’une administration quotidienne par gavage (30 secondes de contention par administration et par animal) d’un glucocorticoïde pendant 1 semaine.
Impact sur les animaux
Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Des effets indésirables liés aux injections sous anesthésie sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie prévu dans la grille de scoring. Les gavages peuvent entraîner une légère gêne, mais des expériences similaires menées auparavant n’ont pas montré de souffrance particulière chez les animaux. Les animaux subiront trois prélèvements sanguins, chacun suivi d’une légère compression pour stopper le saignement. Ces gestes sont effectués par un personnel compétent.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour analyses des tissus (histologiques, analyses des transcrits, expression protéiques...).
Remplacement
Les myosites inflammatoires impliquent des interactions complexes entre myofibres, cellules immunitaires, matrice extracellulaire et vascularisation, qui ne peuvent pas être reproduites de manière pertinente par des modèles in vitro ou in silico seuls. L’utilisation de modèles murins de myosite expérimentale est actuellement la seule approche permettant de reproduire l’ensemble des aspects cliniques, histologiques et immunologiques de ces pathologies et d’évaluer l’impact d’une invalidation musculaire conditionnelle des gènes étudiés.
Réduction
Le nombre d’animaux a été calculé de manière à obtenir une puissance statistique suffisante tout en limitant le nombre de souris par groupe, en se basant sur les pratiques publiées en modèles murins de myosite et de lésion musculaire (10 animaux par groupe et par condition). Pour chaque lignée et par temps étudiés (1 ; 3 ;5 ;7 ;9 mois post-traitement), 10 souris sont prévues pour les analyses de rétro transcrits, 10 pour l’expression protéique, 10 pour les analyses FACS et 10 pour l’histologie, réparties entre transgéniques et contrôles. Ainsi, 40 souris transgéniques pour chacune des 3 lignées sont nécessaires, soit 120 souris transgéniques et 40 contrôles par temps d’études de chaque procédure expérimentale (soit (120+40)x5 temps x 3 procédures), au total 2400 animaux au maximum seront nécessaires pour cette étude. Lorsque cela est possible sans compromettre la qualité des analyses, plusieurs types de mesures seront combinés sur un même animal (par exemple tests fonctionnels, prélèvements sanguins et analyses moléculaires sur muscles distincts). Ce nombre constitue une estimation haute et sera ajusté à la baisse en fonction des résultats intermédiaires, notamment si certains temps expérimentaux précoces ou tardifs s’avèrent non pertinents.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid, bâtons de bois et des maisonnettes...) en animalerie. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, le saignement sera stoppé par pression de la zone de prélèvement qui seront par la suite surveillées et désinfectées jusqu’à cicatrisation complète. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Le gavage sera réalisé, avec une sonde rigide de 20G, par du personnel formé et expert en expérimentation animale, le risque de noyade accidentelle au moment du gavage sera également pris en compte en évitant de mettre l'animal sur le dos et en lui délivrant lentement le liquide contenu dans la seringue à l’aide d’une sonde adaptée à la taille de l’animal. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux.
Choix des espèces
La souris est nécessaire pour l’étude des maladies musculaires et des myosites expérimentales, car les myosites inflammatoires impliquent des interactions complexes entre myofibres, cellules immunitaires, matrice extracellulaire et vascularisation, qui ne peuvent pas être reproduites de manière pertinente par des modèles in vitro ou in silico seuls Les stades d’études vont de jeunes adultes à adultes, nous utiliserons donc des souris de 1, 3, 5,7 et 9 mois après le 1er traitement, les souris les plus âgées auront donc 11 mois.
Etude in vivo de la virulence de Escherichia coli
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Toutes tuées à l'issue pour prélever organes et fluides, 840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une seule inoculation d'Escherichia coli, dans le péritoine pour une infection généralisée, dans la vessie ou dans le nez sous anesthésie générale pour une infection urinaire ou pulmonaire, avec un prélèvement de sang au bout de la queue sur souris éveillée, puis sept jours de suivi. Le porteur attend une inflammation de l'appareil urinaire et un affaiblissement de l'état général, et fait mettre à mort les souris qui atteignent un point limite fixé par un score clinique noté en aveugle. Il décrit des tests déjà conduits sur cellules en culture, puis affirme que le recours à l'animal reste "irremplaçable" parce qu'aucun tube à essai ne permet de suivre la dissémination de la bactérie entre les organes.
Objectifs
L'étude des facteurs de virulence d'Escherichia coli (E. coli) est importante pour mieux comprendre comment cette bactérie provoque des infections. E. coli est une bactérie naturellement présente dans l'intestin de l'Homme et de nombreux animaux. La plupart des souches sont inoffensives, mais certaines peuvent provoquer des infections parfois graves lorsqu'elles atteignent d'autres organes. Dans ce projet, l'étude porte sur plusieurs types d'infections causées par E. coli : les infections pulmonaires, urinaires et généralisées (septicémie). Ces infections sont de plus en plus fréquentes, notamment à l'hôpital, en particulier chez les patients fragiles, immunodéprimés ou intubés. L'utilisation de modèles murins permet d'étudier, dans un organisme vivant, les mécanismes qui rendent certaines souches de E. coli plus agressives que d'autres. Ces mécanismes comprennent notamment la production de toxines, la capacité de la bactérie à se fixer aux cellules de l'organisme ou à échapper aux défenses immunitaires. Ces recherches permettent de mieux comprendre le développement des infections causées par E. coli. Elles peuvent également aider à identifier de nouvelles cibles pour développer des traitements ou des stratégies de prévention. Cette démarche est particulièrement importante car certaines souches de E. coli deviennent de plus en plus résistantes aux antibiotiques. Mieux connaître les mécanismes qui leur permettent de provoquer une infection peut contribuer à mettre au point de nouvelles approches thérapeutiques, complémentaires ou alternatives aux antibiotiques actuels.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de cette étude sont multiples. Sur le plan fondamental, elle permettra d’identifier les déterminants moléculaires impliqués dans la capacité de certaines souches d’Escherichia coli à coloniser l'hôte, à induire une réponse inflammatoire excessive ou à échapper aux défenses immunitaires. Cette meilleure compréhension des interactions hôte-pathogène contribuera à élucider les mécanismes spécifiques qui différencient les souches commensales (innofensive) des souches pathogènes (qui induisent une maladie). Sur le plan appliqué, ces connaissances pourraient déboucher sur le développement de nouveaux outils diagnostiques permettant de prédire le potentiel pathogène d’une souche, ou sur l’identification de cibles thérapeutiques innovantes, notamment en dehors des approches antibiotiques classiques. À plus long terme, cette étude pourrait ainsi participer à la mise en place de stratégies préventives et thérapeutiques mieux adaptées aux infections à E. coli, en particulier dans un contexte de résistance croissante aux antimicrobiens.
Procédures
Les animaux sont répartis dans trois modèles d'infection selon l'objectif de l'étude : Infection généralisée : injection intrapéritonéale d'une suspension d'Escherichia coli (environ 1 minute), avec ou sans administration d'antibiotique selon le protocole (environ 1 minute). Infection urinaire : administration d'une suspension bactérienne dans la vessie par voie intravésicale sous anesthésie générale (environ 1 minute) avec ou sans administration d'antibiotique selon le protocole (environ 1 minute). Infection pulmonaire : administration d'une suspension bactérienne par voie intranasale sous anesthésie générale (environ 2 minutes) avec ou sans administration d'antibiotique selon le protocole (environ 1 minute). Chaque animal ne subit qu'une seule inoculation bactérienne. Un prélèvement sanguin à l'extrémité de la queue peut être réalisé sur animal vigile (environ 1 à 2 minutes) afin d'étudier la réponse immunitaire de l'organisme. Les animaux sont suivis jusqu'à 7 jours avec une surveillance clinique régulière. À la fin de l'étude, ou si un point limite est atteint, les animaux sont mis à mort selon une méthode réglementaire afin de permettre le prélèvement des organes pour les analyses.
Impact sur les animaux
Certaines de ces procédures expérimentales pourront entrainer des effets indésirables chez l’animal avec des effets locaux (inflammation de l’appareil urinaire) ou encore systémiques (affaiblissement de l’état général par exemple). Pour les effets locaux nous prévoyons d'utiliser un anesthésiant local, pour les effets systémiques nous aménagerons l'environnement de la souris pour qu'elle ait un accès facilité à la nourriture et la boisson. La gestion de la douleur engendrée par ces différentes procédures sera suivi à l’aide d’une grille d’évaluation de score clinique. Lorsqu'un point limite sera atteint l'animal en questionsera mis à mort et autopsié.
Devenir
À l’issue des procédures expérimentales, les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des organes et fluides biologiques nécessaires aux analyses microbiologiques, histologiques, immunologiques et moléculaires prévues dans le projet. Ces analyses nécessitent la collecte de tissus qui ne peut être réalisée sur des animaux maintenus en vie. Aucun animal ne pourra donc être réutilisé, replacé ou maintenu en vie à l’issue de la procédure.
Remplacement
L'utilisation de méthodes alternatives in vitro ont été préalablement réalisées pour démontrer l'impact des différentes souches mutées ou des inhibiteurs sur les cellules eucaryotes en culture. Le recours à l’animal est cependant irremplaçable car aucun autre modèle ou tube à essai ne permet d’examiner la dissémination bactérienne entre les différents organes. De plus les objectifs sont de découvrir le(s) rôle(s) des différents facteurs de virulences sur la colonisation de E. coli, ainsi que d’identifier des inhibiteurs de E. coli qui permettront de diminuer sa virulence et enfin de mesurer les effets des facteurs environnementaux sur leur expression in vivo. En effet suivant l’organe cible de E. coli, l’environnement sera forcément très différent (exemple vessie vs poumons). Or on sait que les interactions entre la bactérie et son environnement vont être très importants et non négligeables dans notre étude, et cette interaction complexe ne peut être modélisée in vitro.
Réduction
L’ensemble des modèles décrit dans cette saisine sont déjà mis en place au laboratoire : modèle d’injection dans la vessie, du sepsis ou encore de l’infection pulmonaire. De plus nous utiliserons des inhibiteurs déjà testés in vitro et décrit dans la littérature ou utilisés chez l’homme dans d’autres contextes. Plusieurs paramètres seront analysés chez chaque animal (signes cliniques, charge bactérienne, prélèvements de tissus et fluides lors de la nécropsie) pour réduire le nombre d’animaux nécessaires. De plus une étude longitudinale de la présence de bactérie sera réalisée avec un système de visualisation 3D sur animal vigile. Cet outil nous permettra de suivre le niveau d’infection des souris de manière longitudinale sans les euthanasier, nous permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Le bien-être de l’animal sera en permanence au centre de nos préoccupations. Les souris sont hébergées au nombre de 5 par cage en portoirs ventilés, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 2 fois par mois (tous les 15 jours). Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont 5-10 jours d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Les conditions d’expérimentations font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement et plus fréquemment pendant les phases aigues. Les points limites seront définis selon une valeur objective de score clinique obtenue par observation « en aveugle » de chaque animal (l’observateur n’a pas connaissance du groupe expérimental afin de réduire le biais cognitif). Si un point limite est atteint alors l'animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude des facteurs de virulence de E. coli dans des conditions in vivo. De plus la littérature sur les différents modèles proposés avec E. coli est largement décrite. Nous utliserons des souris de 5 à 9 semaines suivant le modèle expérimental. Dans la littérature, les souris utilisées pour les différents modèles décrits sont classiquement âgées entre 6 à 9 semaines. Nous prenons une marge d’une semaine pour respecter la période d’acclimatation.
Identification et neurostimulation de réseaux cérébraux impliqués dans le développement de la dépression majeure suite à une douleur chronique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1040 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses post-mortem. Une chirurgie sous anesthésie leur installe une douleur chronique censée produire un état anxio-dépressif, suivie de cinq examens d'IRM sous anesthésie pouvant durer deux heures quarante, d'un test de douleur, de quatre tests d'anxio-dépression que le porteur ne nomme pas, d'un jeûne de vingt-quatre heures et d'un isolement de même durée en cage individuelle. Le porteur écrit que cette douleur et ce phénotype anxio-dépressif "sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Il juge "indispensable" de travailler sur un "modèle animal, social, entier" et qualifie la souris adulte d'"incontournable dans la recherche en neurosciences".
Objectifs
La dépression majeure est une maladie fréquente qui touche environ 5 à 10 % de la population mondiale. Elle représente aujourd’hui l’une des principales causes d’invalidité et constitue un enjeu majeur de santé publique, avec un impact social et économique très important en Europe. Malgré les nombreux travaux de recherche menés dans ce domaine, le diagnostic repose encore principalement sur l’évaluation clinique des symptômes, car aucun biomarqueur fiable de la maladie n’a encore été identifié. Une meilleure compréhension des mécanismes biologiques impliqués dans la dépression est donc nécessaire afin d’identifier de nouveaux outils diagnostiques et de nouvelles cibles thérapeutiques. La douleur chronique est un facteur important dans le développement de la dépression : environ la moitié des patients dépressifs présentent également des douleurs chroniques. Des études d’imagerie cérébrale ont montré que ces troubles sont associés à des modifications de l’organisation et du fonctionnement de certains réseaux cérébraux. Cependant, les altérations spécifiques liées à l’association entre douleur chronique et dépression restent encore mal comprises. Ce projet vise à étudier ces mécanismes à l’aide d’un modèle murin de douleur chronique associé à un état anxio-dépressif. L’objectif est d’analyser l’évolution des connexions entre différentes régions du cerveau au cours du temps, ainsi que l’effet potentiel de stimulations cérébrales ciblées sur ces réseaux. Les protocoles de stimulation utilisés s’inspirent directement d’approches de neuromodulation actuellement étudiées chez l’humain et l’étude des modifications cérébrales sera réalisée grâce à l’imagerie par résonance magnétique, une technique non invasive largement utilisée en recherche clinique, ce qui favorisera la comparaison entre les résultats obtenus chez l’animal et ceux observés chez les patients. À terme, ces travaux pourraient contribuer à mieux comprendre les bases biologiques de ces troubles et à développer des stratégies thérapeutiques plus ciblées pour améliorer la prise en charge des patients souffrant de douleur chronique et de troubles émotionnels associés.
Bénéfices attendus
Le but de cette étude est d’identifier des biomarqueurs cérébraux caractéristiques du développement de la comorbidité douleur - dépression, ainsi que d’approfondir la compréhension des mécanismes neurobiologiques impliqués dans deux protocoles de neuromodulation actuellement en phase d’essais cliniques. L’identification de ces biomarqueurs et la caractérisation des effets de ces protocoles de neurostimulation permettra, in fine, d’optimiser l’efficacité thérapeutique et d’améliorer la prise en charge des patients présentant une douleur chronique associée à des troubles émotionnels.
Procédures
- Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1h -Les animaux sont soumis à un maximum de 5 examens IRM sous anesthésie d’une durée maximale de 2h40. - Les animaux subissent un test évaluant la douleur de 15 minutes en moyenne. – Les animaux subissent une stimulation courte de maximum 20 secondes, et 4 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test). Les tests répétables seront effectués un maximum de deux fois. - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental. -Les animaux seront mis en cage individuelle pour une période de 24h maximum au cours de l’un des tests comportementaux. - Les animaux subissent une chirurgie terminale pour prélèvement de tissus sous anesthésie profonde pour une durée de 10 minutes.
Impact sur les animaux
- La présence de la douleur et l’apparition du phénotype anxio-dépressif chez le modèle animal sont inévitables et ne peuvent pas être soulagées car c'est l'objet de l'étude. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48h. - La douleur post-chirurgicale est aiguë, transitoire et inflammatoire. - Les animaux subissent un stress aigu ainsi qu’une douleur transitoire et de faible intensité lors des tests de comportement.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation fonctionnelle et comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité des réponses individuelles des animaux.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation de 2 semaines après leur arrivée pour s’habituer aux nouvelles conditions environnementales. Ils seront hébergés en groupe sociaux de 3 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA (structure chargée du bien-être des animaux) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme, le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences
Imagerie photoacoustique et de fluorescence de l’activité neuronale dans le systeme nerveux central chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 65
Ouverture du crâne pendant trente minutes à deux heures quinze, pose d'une fenêtre crânienne, injections de vecteurs viraux dans des régions précises du cerveau au moyen d'un cadre stéréotaxique : 194 souris et 65 rats, 259 individus au total, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil. Certains enchaînent des séances d'imagerie répétées pendant quelques semaines à plusieurs mois, jusqu'à ce que la qualité des données ne permette plus de poursuivre. L'objectif est de mettre au point l'imagerie photoacoustique, une technique dont les applications médicales sont renvoyées au long terme. Le porteur indique que l'effectif n'a pas été calculé statistiquement, les informations requises manquant encore pour cette technologie, et l'avoir fixé d'après son expérience et celle d'autres équipes.
Objectifs
Les techniques actuelles de microscopie permettent d’observer l’activité des neurones dans le cerveau avec une très grande précision. Cependant, la lumière utilisée pour ces observations ne pénètre que sur une faible profondeur, de l’ordre d’un millimètre. L’étude de régions cérébrales plus profondes nécessite alors des interventions chirurgicales invasives pouvant altérer les tissus observés. L’imagerie photoacoustique est une technologie émergente qui pourrait permettre d’observer l’activité cérébrale à des profondeurs plus importantes tout en limitant ces contraintes. Cette technique utilise la lumière pour stimuler les tissus et les ultrasons pour recueillir l’information. Elle pourrait ainsi permettre d’accéder à des régions du cerveau aujourd’hui difficiles à étudier. L’objectif de ce projet est de développer et d’optimiser cette technologie afin de la rendre utilisable pour l’étude de l’activité neuronale. Les travaux porteront sur trois aspects complémentaires : l’amélioration des performances de l’instrument d’imagerie, le développement de fenêtres crâniennes adaptées permettant le passage de la lumière et des ultrasons, et l’identification des marqueurs biologiques les plus adaptés à cette nouvelle méthode. Une première phase d’optimisation sera réalisée sur des échantillons de tissu nerveux, avant une phase d’évaluation chez l’animal vivant. À terme, ce projet pourrait contribuer au développement de nouvelles approches d’imagerie cérébrale permettant d’étudier le fonctionnement du cerveau de façon moins invasive et à plus grande profondeur que les techniques actuellement disponibles.
Bénéfices attendus
La compréhension du fonctionnement du cerveau repose sur la capacité à observer l’activité des neurones dans des conditions aussi proches que possible de leur état naturel. Ces connaissances sont essentielles pour mieux comprendre de nombreuses maladies neurologiques, psychiatriques ou neurodégénératives et pourraient, à plus long terme, contribuer au développement de nouvelles méthodes de diagnostic ou de traitement. Les techniques actuelles d’imagerie permettent déjà d’observer l’activité cérébrale avec une très grande précision, mais elles sont principalement limitées aux régions superficielles du cerveau. L’étude de structures plus profondes nécessite souvent des interventions invasives susceptibles de perturber les tissus observés. L’imagerie photoacoustique constitue une approche prometteuse pour dépasser cette limitation. Elle pourrait permettre d’observer l’activité cérébrale à plusieurs millimètres de profondeur, voire davantage, tout en limitant les perturbations induites par la mesure elle-même. À terme, cette technologie pourrait permettre l’étude de structures cérébrales profondes impliquées dans la mémoire, le mouvement, les émotions ou certaines pathologies neurologiques. Le projet vise ainsi à développer et optimiser une nouvelle méthode d’imagerie fonctionnelle du cerveau, capable de fournir des informations plus détaillées et moins invasives que celles actuellement accessibles pour les régions profondes du système nerveux central. Les connaissances acquises bénéficieront principalement à la recherche fondamentale en neurosciences, mais elles pourraient également contribuer, à plus long terme, à l’amélioration de la compréhension et de la prise en charge de nombreuses maladies du cerveau.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à différentes interventions réalisées sous anesthésie générale : * Injection de faibles volumes de vecteurs viraux dans des régions précises du cerveau à l’aide d’un dispositif stéréotaxique. Cette intervention dure généralement entre 1 heure 15 minutes et 1 heure 45 minutes et est suivie d’une période de récupération post-opératoire. * Réalisation d’une ouverture limitée de l’os du crâne (craniotomie) afin de permettre l’accès aux structures cérébrales d’intérêt et, selon les procédures, la mise en place d’une fenêtre crânienne destinée à l’imagerie. Selon la procédure, la durée de l’intervention est comprise entre 30 minutes et 2 heures 15 minutes. Les animaux récupèrent ensuite de l’anesthésie et bénéficient d’un suivi post-opératoire adapté. * Séances d’imagerie réalisées sous légère sédation ou sous anesthésie générale selon la procédure considérée. Ces séances permettent d’enregistrer l’activité cérébrale sans provoquer de douleur supplémentaire. * Dans les procédures où la dernière intervention est terminale, les animaux sont placés sous anesthésie profonde et ne sont pas réveillés. Selon les objectifs scientifiques, cette intervention se termine soit par une perfusion intracardiaque, soit par l'administration d'un agent euthanasiant. Ces procédures terminales durent généralement une quinzaine de minutes.
Impact sur les animaux
Les principales nuisances attendues sont liées aux interventions chirurgicales nécessaires à la réalisation du projet, notamment les injections ciblées dans le cerveau et la mise en place de fenêtres crâniennes permettant l’imagerie. Comme pour toute intervention chirurgicale, ces procédures peuvent entraîner une douleur ou un inconfort transitoire après l’opération ainsi qu’une perte de poids temporaire pendant la phase de récupération. Toutes les interventions sont réalisées sous anesthésie générale et bénéficient d’une prise en charge antalgique avant, pendant et après la chirurgie afin de limiter au maximum la douleur et la souffrance des animaux. Les animaux font également l’objet d’un suivi post-opératoire rapproché permettant de détecter rapidement tout signe d’inconfort ou de complication. Dans un faible nombre de cas, des irritations locales, une inflammation ou une infection peuvent apparaître au niveau de la zone opérée ou autour de la fenêtre crânienne. Si nécessaire, des traitements adaptés (anti-inflammatoires, analgésiques ou traitements locaux) sont mis en œuvre et des points limites prédéfinis permettent d'interrompre la procédure et de procéder à une euthanasie anticipée si le bien-être de l’animal est compromis. Les séances d’imagerie elles-mêmes sont non invasives. Elles sont réalisées sous légère sédation ou sous anesthésie selon les procédures et ne devraient pas entraîner de douleur supplémentaire pour les animaux.
Devenir
À l'issue de toutes les procédures prévues dans ce projet, les animaux sont mis à mort. Les procédures 1 et 2 se terminent par une perfusion intracardiaque réalisée sous anesthésie générale profonde. Cette intervention terminale est nécessaire à la préparation, à la conservation et à l'analyse des tissus nerveux dans le cadre du projet. Dans les procédures 3, 4 et 5, les animaux participent à des séances répétées d'imagerie cérébrale pendant une période pouvant aller de quelques semaines à plusieurs mois, en fonction de la qualité et de l'intérêt scientifique des données recueillies. Lorsque les objectifs scientifiques du projet sont atteints ou que la qualité des données ne permet plus de poursuivre les acquisitions dans des conditions satisfaisantes, les animaux sont euthanasiés. En outre, tout animal atteignant l'un des points limites prédéfinis garantissant son bien-être est immédiatement retiré de l'étude et mis à mort. La dernière phase de la procédure 6 est réalisée sous anesthésie terminale. Les animaux ne sont pas réveillés après la séance d'imagerie et sont euthanasiés sous anesthésie générale profonde à l'issue de celle-ci. Aucun animal ne peut être replacé ou réutilisé à l'issue des procédures, en raison des interventions chirurgicales réalisées, de la présence d'implants crâniens, des injections intracérébrales effectuées et, selon les procédures, de la nécessité de prélever ou de préserver les tissus dans des conditions compatibles avec les objectifs scientifiques du projet.
Remplacement
Les cultures cellulaires et les autres méthodes réalisées en dehors de l’organisme vivant constituent des outils précieux pour réduire le recours aux animaux et sont utilisées dans ce projet chaque fois qu’elles permettent de répondre à une question scientifique. Cependant, elles ne permettent pas de reproduire toute la complexité du fonctionnement du cerveau ou de la moelle épinière, qui reposent sur les interactions entre de très nombreuses cellules organisées en réseaux et en communication permanente avec le reste de l’organisme. Les préparations de tissu nerveux (tranches) préservent une partie de ces connexions et seront utilisées lors de la phase initiale d’optimisation du projet. Elles permettent d’obtenir des informations importantes tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Néanmoins, elles ne reproduisent qu’imparfaitement le fonctionnement du système nerveux dans un organisme vivant. L’objectif principal du projet étant de développer une méthode permettant d’observer l’activité cérébrale dans des conditions physiologiques, certaines questions scientifiques nécessitent l’étude du cerveau chez l’animal vivant. À l’heure actuelle, aucune méthode alternative ne permet d’obtenir l’ensemble des informations recherchées.
Réduction
Le nombre d'animaux a été limité au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Les animaux sont hébergés dans des conditions contrôlées, conformes aux bonnes pratiques, afin de limiter le stress et les problèmes sanitaires susceptibles d'influencer les résultats. Cette standardisation permet d'obtenir des données plus fiables et de réduire le nombre d'animaux nécessaires. Habituellement, le nombre d'animaux utilisé dans une étude est déterminé à l'aide de méthodes statistiques. Toutefois, le présent projet vise à développer et optimiser une nouvelle technologie d'imagerie, pour laquelle les informations nécessaires à ce type de calcul ne sont pas encore disponibles. Les effectifs ont donc été définis à partir de notre expérience et de celle d'autres équipes utilisant des approches similaires. Plusieurs mesures sont mises en œuvre pour limiter le nombre d'animaux utilisés. Lorsque cela est possible, plusieurs expériences sont réalisées sur un même animal. Pour les procédures où cela est pertinent, une première phase d'optimisation technique, conduite sur un nombre limité d'animaux, permet d'identifier les meilleures conditions expérimentales avant le lancement des expériences principales. Cette stratégie réduit les échecs d'origine technique et contribue ainsi à limiter l'utilisation d'animaux. Enfin, les expériences sont réalisées chez des animaux des deux sexes afin d'éviter la production d'animaux non utilisés et de garantir que les résultats obtenus soient représentatifs des femelles comme des mâles.
Raffinement
Le projet a été conçu de manière à réduire autant que possible la douleur, la souffrance, l’angoisse et les contraintes imposées aux animaux. Les animaux sont hébergés en groupes afin de préserver leurs interactions sociales (2 à 5 souris ou 2 à 3 rats par cage). Leur environnement est enrichi à l’aide de matériaux de nidification, d’abris et d’objets à explorer ou à ronger. Ces enrichissements sont régulièrement renouvelés afin de favoriser l’expression de comportements naturels et d’améliorer leur bien-être. Toutes les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale. L’anesthésie par inhalation est privilégiée car elle permet un endormissement et un réveil rapides ainsi qu’un meilleur contrôle de la profondeur anesthésique. Des traitements antalgiques sont administrés avant et après les interventions afin de prévenir et limiter la douleur. Une analgésie locale est également réalisée au niveau de la zone opérée. Pendant les interventions, la température corporelle des animaux est maintenue à l’aide d’une couverture chauffante et un gel ophtalmique est appliqué afin de protéger les yeux. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés et la zone opératoire est désinfectée afin de limiter les risques d’infection. Après les interventions, les animaux bénéficient d’un suivi renforcé permettant de détecter rapidement tout signe de douleur ou de complication. Leur état général, leur poids et leur comportement sont évalués à l’aide d’une grille de suivi standardisée. Si des signes de douleur ou d’altération du bien-être sont observés, des traitements adaptés sont administrés. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas malgré ces mesures, des points limites prédéfinis conduisent à une euthanasie anticipée afin d’éviter toute souffrance prolongée. Notre expérience montre que les interventions prévues dans ce projet sont généralement bien tolérées lorsque ces mesures de prise en charge et de suivi sont appliquées.
Choix des espèces
Les souris et les rats sont les espèces les plus couramment utilisées en recherche en neurosciences. Leur système nerveux présente de nombreuses similitudes d’organisation et de fonctionnement avec celui des autres mammifères, ce qui en fait des modèles particulièrement adaptés pour développer et évaluer de nouvelles méthodes d’imagerie du cerveau. Le projet utilise à la fois des souris et des rats, car ces deux espèces présentent des avantages complémentaires. Les souris permettent notamment de tirer parti des nombreuses ressources génétiques disponibles, en particulier des lignées transgéniques exprimant des marqueurs biologiques d’intérêt pour l’étude de l’activité neuronale. Des souris sauvages et transgéniques adaptées aux objectifs du projet seront utilisées. Les rats seront principalement utilisés lors des expériences d’imagerie chez l’animal vivant. Leur taille plus importante est mieux adaptée aux caractéristiques techniques du système d’imagerie photoacoustique utilisé dans ce projet et facilite l’étude de structures cérébrales plus profondes. Certaines souches de rats, notamment les rats Long-Evans, pourront être privilégiées lorsque leurs caractéristiques sont particulièrement adaptées aux procédures prévues. Le projet nécessite l’utilisation d’animaux à différents stades de développement. Les expériences réalisées sur des échantillons de tissu nerveux utilisent préférentiellement de jeunes animaux, car leurs tissus sont mieux adaptés à la préparation de tranches destinées aux études préliminaires. Les expériences d’imagerie chez l’animal vivant sont réalisées chez des animaux plus âgés, dont le système nerveux est suffisamment développé pour répondre aux objectifs du projet.
Évaluation préclinique de l’efficacité des vésicules extracellulaires dérivées de cellules souches mésenchymateuses dans l’atténuation des lésions neuroinflammatoires induites par les rayonnements chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
692 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, dont 632 tuées à l'issue. Elles subissent une irradiation du cerveau sous anesthésie, une injection de vésicules dans le nez, cinq tests comportementaux que le porteur rattache à la mémoire et à la locomotion sans les nommer, puis un prélèvement de sang et une perfusion intracardiaque. Il attend de l'irradiation une perte de mémoire et un manque de sociabilité, et décrit chez les souris irradiées à 15 Gy des signes d'agressivité, un pelage hérissé et des blessures qui conduisent à une mise à mort. 60 souris seront proposées à l'adoption, celles passées par les tests comportementaux d'après le porteur, les 632 autres étant tuées pour des analyses histologiques ou moléculaires.
Objectifs
L’irradiation des tissus cérébraux sains peut entraîner une forte toxicité cérébrale et avoir pour conséquence des altérations neurocognitives sévères, comme observées à la suite des radiothérapies des tumeurs cérébrales. Deux mécanismes expliquent ces effets secondaires : la barrière protectrice du cerveau devient plus perméable, laissant passer des substances toxiques et une inflammation excessive s’installe, aggravant les lésions et perturbant le fonctionnement normal du cerveau. Une piste prometteuse pour moduler la réponse immunitaire induite par les rayonnements consiste à utiliser des vésicules dérivées de cellules souches embryonnaires du mésenchyme (VE-CSM) qui transportent des molécules actives biologiquement. Ces vésicules, capables de franchir la barrière cérébrale, s’administrent simplement de façon ciblée par voie nasale. Elles ont la propriété de bloquer la production de molécules activant l’inflammation, de limiter la suractivation des cellules immunitaires et gliales souvent à l’origine de lésions secondaires.Elles stimulent la régénération des neurones et la réparation des neurones et créent un environnement favorable à la récupération. Les vésicules enrichies en HLA-G, une molécule aux propriétés anti-inflammatoires et immunorégulatrices, offrent un contrôle accru de la réponse immunitaire excessive dans le cerveau et un effet prolongé grâce à une élimination plus lente par le système immunitaire. Des VE-CSM enrichies de molécules qui régulent le système immunitaire ont été démontrées comme possédant des propriétés immunosuppressives plus importantes que les VE-CSM classiques L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de vésicules extracellulaires chargées en HLA-G, mais également de prévenir la dégradation des fonctions cognitives chez les patients irradiés. En agissant tôt sur l’inflammation et la réparation neuronale, ces vésicules pourraient stabiliser les capacités cognitives existantes, réduire le risque de déclin lié aux traitements et améliorer la qualité de vie à long terme, en limitant l’impact des séquelles neurocognitives. En résumé, ces vésicules, surtout lorsqu’elles contiennent HLA-G, ouvrent la voie à une prise en charge plus globale des patients sous radiothérapie : protéger le cerveau, réparer les lésions et préserver les fonctions cognitives.
Bénéfices attendus
Ce projet permettrait de développer une nouvelle thérapie non invasive après une exposition aux rayonnements ionisants, accidentelle ou liée à la radiothérapie, afin de réduire les troubles cognitifs, notamment les troubles de l’attention et de la mémoire, et d’améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
Une irradiation cérébrale sous anesthésie, durée 15 minutes Injection intranasale de vésicules sous anesthésie, durée 15 minutes L’ensemble des tests comportementaux (au nombre de 5) sera réalisé (mémoire, locomotion) une seule fois par souris (2 mois après irradiation), 5-10 minutes par test. Le prélèvement sanguin et la perfusion intracardiaque sous anesthésique, durée 20 minutes
Impact sur les animaux
1/ irradiation des animaux De façon rare, l’anesthésie peut avoir un effet sur certaines variables physiologiques, entraînant notamment une hypothermie, une hypotension ou une hypoxie. . Un problème d’anesthésie peut entrainer dans de rares cas la perte d’un animal. A plus long terme, les animaux irradiés à 15Gy peuvent présenter des signes d’agressivité (pelage hérissé et signes de blessures). Dans ce cas, les animaux blessés, seront euthanasiés. 2/ Traitement intra-nasal des animaux avec des vésicules extracellulaires Les animaux seront légèrement anesthésiés : il est possible de noter un inconfort qui devra être transitoire (24h) après l’administration. Les effets indésirables observés peuvent être un écoulement nasal important et/ou une tête penchée, difficultés à se déplacer, amaigrissement de l’animal. 3/Analyse du comportement et de la cognition Les signes cliniques attendus dans notre modèle concernent essentiellement une perte de mémoire, un manque de sociabilité associés à un dysfonctionnement cognitif. L’anxiété générée par ce type d’analyse peut entrainer de l’agressivité.
Devenir
A la fin de la procédure les animaux seront euthanasiés afin de permettre la réaslisation des analyses histologiques (analyses de tissus) ou moléculaires excepté les souris utilisées pour les tests de comportement, ces dernières seront proposées à l’adoption.
Remplacement
L’étude de l’impact de l’irradiation sur l’altération de la neurocognitionne peut être abordé dans des modèles in vitro mais uniquement in vivo. . Il n’existe pas d’alternative non animale permettant ce type d’étude.
Réduction
Compte tenu de la variabilité des réponses des souris au sein d’un même groupe dans les tests de comportement, nos expériences précédentes (et celles d’autres laboratoires) montrent qu’un nombre de dix animaux par lot est un minimum requis pour assurer des résultats statistiquement significatifs. le nombre d’animaux a été adapté en fonction des besoins nécessaires à chacune des analyses réalisées et afin de permettre d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Les animaux reçoivent un dispositif de nidification périssable chaque semaine au moment du change des cages. Les souris sont irradiées sous anesthésie générale afin de limiter le stress lié au confinement de l’animal dans l’irradiateur. Pour limiter la baisse de la température corporelle sous anesthésie, les animaux seront placés sur une couverture chauffante ou dans une cage elle-même placée sur une plaque chauffante jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux sont suivis quotidiennement. Avant les phases de tests de comportement, une phase d’adaptation des souris est effectuée pendant deux semaines. Pendant cette phase d’adaptation, les animaux sont familiarisés à la manipulation quotidiennement par l’expérimentateur dans la pièce où se dérouleront les tests. Des points limites ont été définis à l’aide d’une grille de score permettant d’évaluer régulièrement l’état général et le bien-être des animaux.
Choix des espèces
Nous avons décidé de travailler chez la souris pour deux raisons majeures : 1) La souris est une espèce couramment utilisée en recherche fondamentale, qui possède une structure neuro-anatomique comparable à celle du cerveau humain. 2) La souris est une espèce sociale, qui présente notamment des niveaux élevés d’interactions sociales réciproques. Ceci permet d’utiliser des tests de comportement et de mettre en évidence un déficit social radioinduit. 3) Le choix d’animaux adultes permet d’étudier les effets de l’irradiation sur un cerveau mature, correspondant à la situation rencontrée chez l’homme adulte.
Signalisation astrocytaire en physiopathologie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
568 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, 80 d'entre elles subissant une chirurgie d'injection dans le cerveau pouvant durer quatre heures, et 80 huit séances d'imagerie de soixante minutes maintenues sous contention. Jusqu'à 332 souris reçoivent en plus des substances par gavage cinq jours de suite ou par voie orale huit fois. Le projet cherche à localiser un facteur de transcription dans les prolongements des astrocytes qui touchent les vaisseaux du cerveau, après induction d'une inflammation périphérique, les retombées annoncées pour la maladie d'Alzheimer ou l'accident vasculaire cérébral restant à l'état de perspectives. Toutes sont mises à mort pour prélever leur cerveau, analysé en biochimie et en histologie.
Objectifs
Les astrocytes sont des cellules importantes dans le cerveau. Elles remplissent des fonctions clés notamment au niveau des vaisseaux sanguins cérébraux, qu’elles contactent par des structures spécialisées appelées prolongements périvasculaires. En conditions pathologiques, les astrocytes subissent d’important changements, sous l’influence notamment de voies de signalisation qui activent l’expression de gènes cibles dans le noyau des astrocytes, via des facteurs de transcription. Des données préliminaires montrent que certains facteurs de transcription sont aussi présents dans les prolongements périvasculaires des astrocytes, près des vaisseaux. Nous émettons l’hypothèse qu’un facteur de transcription cible a un rôle spécifique au niveau des prolongements périvasculaires, où il pourrait détecter les signaux physiopathologiques venant de la périphérie et réguler efficacement la fonction des astrocytes. Nous utiliserons une nouvelle souris transgénique dans laquelle ce facteur de transcription est marqué par une protéine fluorescente seulement dans les astrocytes, qui ne s’exprimera qu’après traitement au tamoxifène. Nous pourrons alors visualiser directement sa localisation et ses mouvements dans les prolongements périvasculaires par imagerie biphotonique. Nous pourrons aussi identifier les partenaires de ce facteur de transcription dans les prolongements périvasculaires, grâce à des analyses protéomiques en conditions physiologiques et après induction d’une inflammation périphérique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre le fonctionnement des astrocytes à l’interface avec le système vasculaire en conditions normales et inflammatoires. Ceci ouvre des perspectives thérapeutiques pour mieux cibler des potentielles altérations pathologiques au niveau vasculaire qui se produisent dans de nombreuses pathologies du cerveau (maladie d’Alzheimer, inflammation, accident vasculaire cérébral…).
Procédures
Injection sur souris vigile ou anesthésiée : 10 sec, 1 fois. (196 souris) Administration de substance par gavage sur souris vigile : 10 secondes, 5 fois sur 5 jours (maximum 332 souris) ou par voie orale sur souris vigile : 1 min, 8 fois au total (1 fois/jour) (maximum 332 souris) Chirurgie avec injection dans le cerveau sur souris anesthésiée : 4h maximum, 1 fois (80 souris) Injection d’une substance sur souris anesthésiée, 30 secondes, 5 fois sur 5 jours (40 souris) Imagerie sur souris vigile après habituation à la contention : 8 sessions de 60 min maximum sur 5 jours. (80 souris)
Impact sur les animaux
Des douleurs post-opératoires modérées et de courte durée sont possibles. Certaines injections peuvent induire un inconfort de type « état grippal » : provoquant des douleurs légères à modérées pendant maximum 72h. Stress et inconfort liés à la contention nécessaire pour l’acquisition d’images. Stress léger lors de l’administartion par gavage et douleur légère et de courte durée liées à certaines injections.
Devenir
Les souris de chaque procédure seront mises à mort par une méthode validée, pour récupérer leur cerveau qui sera analysé par différentes méthodes complémentaires (biochimie, histologie)
Remplacement
Le cerveau est un organe complexe dans lequel interviennent de nombreuses interactions entre neurones et différentes cellules partenaires, dont les astrocytes, mais aussi avec les vaisseaux sanguins, objets de cette étude. Ces interactions cellulaires complexes ne sont pour le moment pas fidèlement reproduites dans des modèles de lignées cellulaires ou cultures dérivées de cellules induites à la pluripotence ou in silico, ce qui nécessite l’utilisation de modèles animaux. Les modèles animaux permettent d’étudier les neurones, les astrocytes et les cellules vasculaires dans leur environnement cérébral, en interaction avec le système immunitaire périphérique, qui a un rôle clé pour moduler l’inflammation cérébrale.
Réduction
Le projet prévoit au maximum 568 souris nées dans notre élevage ou achetées chez un fournisseur agréé. Le nombre d’animaux dans chacun des groupes expérimentaux est réduit au minimum nécessaire permettant une interprétation statistique fiable des résultats. Plusieurs paramètres sont mesurés sur les mêmes souris grâce à des approches de protéomique et d’analyses histologiques. De même l’imagerie longitudinale permet d’analyser la même souris au cours du temps au lieu de devoir mettre à mort des souris différentes à chaque temps d’analyse. Ceci permet d’exploiter au mieux les informations biologiques de chaque souris, et de réduire le nombre total d’animaux utilisés, selon le principe des 3R.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation, permettra de garantir leur bien-être. En cas d’apparition d’effets inattendus, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. La gestion de la douleur et de l’inconfort liés aux procédures expérimentales mettra en œuvre des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire, un soutien nutritionnel et thermique, ainsi qu’un suivi clinique post-opératoire incluant la prolongation des traitements analgésiques si besoin. L’habituation des souris à la manipulation par l’expérimentateur une semaine avant l’imagerie permet de réduire le stress des souris. Enfin, nous évaluerons l’administration de substance par prise volontaire pour éviter le stress de la contention lors du gavage.
Choix des espèces
Ce projet vise à étudier les interactions entre neurones, astrocytes et cellules vasculaires. Les organismes modèles simples (C Elegans, D Melanogaster) possèdent des cellules gliales ressemblantes mais pas identiques aux astrocytes du cerveau mammifère et pas de véritable système vasculaire. Seul le modèle souris que nous allons utiliser dans ce projet permet d’identifier notre protéine d’intérêt seulement dans les astrocytes grâce à sa fusion à une protéine fluorescente i) détectable par microcopie biphotonique et en histologie et ii) purifiable par des techniques de biochimie. Ces analyses seront réalisées chez la souris adultes (entre 2 et 6 mois) pour analyser un système nerveux et vasculaire mature. Ces analyses seront réalisées chez la souris adultes (entre 2 et 6 mois) pour analyser un système nerveux et avasculaire mature.
Efficacité d’action des cellules CAR-VST restimulées par des cellules dendritiques dans un modèle de rechute leucémique chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
Injectées de cellules leucémiques humaines puis de cellules traitement dans la veine de la queue, 218 souris dépourvues de système immunitaire vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère. Elles subissent une prise de sang par semaine pendant sept semaines et des séances d'imagerie sous anesthésie, après injection dans l'abdomen d'un produit qui rend les cellules leucémiques lumineuses. Le porteur décrit une maladie de type leucémie avec poils hérissés, perte de poids et, dans les cas extrêmes, un début de paralysie des pattes arrière, ainsi qu'une possible maladie du greffon contre l'hôte avec lésions cutanées et diarrhées. L'expérience s'arrête au 56e jour, ou plus tôt si un point limite est atteint, les souris étant alors tuées.
Objectifs
La thérapie anti-cancéreuse à partir des cellules du patient modifiées génétiquement pour les armer contre les cellules cancéreuses (appelées CAR-T cells) permet de traiter la leucémie. Bien qu’elles soient efficaces et arrivent à tuer les cellules cancéreuses, leur efficacité disparait à court terme. De plus, leur préparation est complexe, longue et présente un risque potentiel de contamination par des cellules malades. En conséquence, la production de ces cellules à partir de donneurs sains se développe, pour les rendre immédiatement opérationnelles. Nous souhaitons utiliser une nouvelle source de cellules provenant de donneurs sains et qui sont anti-virales (VST) : celles-ci sont capables de persister à long terme chez les patients. Aussi, nous souhaitons fabriquer des cellules anti-cancéreuses à partir de ces VST. Nous obtiendrons des CAR-VST qui permettraient d’apporter un bénéfice majeur par rapport au traitement de référence par CAR-T car persistant plus longtemps dans l’organisme. Nous avons pu montrer que les cellules CAR-VST sont aussi efficaces que les CAR-T dans des modèles murins classiques. Ce projet s’attèle à montrer la supériorité des CAR-VST en termes de persistance antitumorale au long terme, grâce à la restimulation antivirale.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de déterminer avec certitude si les CAR-VST possèdent un effet anti-leucémique persistant et supérieur au traitement de référence par CAR-T cells. Une fois cette preuve de concept démontrée, envisager leur production à plus grande échelle devient un projet plus réalisable.
Procédures
- Une injection de cellules « traitement » à la veine de la queue sur souris vigiles avec contention douce à J7 (1min) - Contention manuelle et injection ventrale d’un produit d’imagerie permettant de suivre les cellules leucémiques - Pendant le temps où la substance agit (10min), induction de l'anesthésie pour que l’animal reste immobile pendant l’imagerie (15min max) - A l’issue des 10min d’attente, imagerie du signal lumineux (30min maximum) - Arrêt de l’expérimentation par euthanasie des souris au dernier jour (56e jour) ou en cas de détection précoce de progression de la maladie
Impact sur les animaux
- L’injection intraveineuse est douloureuse mais de courte durée, réalisée sous anesthésie locale, et elle peut induire un saignement léger après retrait de l’aiguille au point de ponction (arrêté par compression avec une compresse stérile). - Dans les jours suivants l’injection des cellules cancéreuses, les souris présenteront une maladie type leucémie avec des poils hérissés, moins d'activité et une perte de poids, et en cas extrême, un début de paralysie des pattes arrière. - Dans les semaines qui suivent l’injection des cellules d’intérêts (CAR T cells ou CAR VST), les souris peuvent présenter des signes de maladie de greffon contre l’hôte, caractérisés par une perte de poids, une altération de la fourrure avec lésions cutanées, un mal-être et des diarrhées. - Les animaux seront modérément stressés lors de l’injection dans l’abdomen du produit d’imagerie. - Un prélèvement sanguin par semaine pendant 7 semaines au niveau de la veine caudale sera réalisé avec contention douce.
Devenir
Les souris étant totalement dépourvues de système immunitaire et ayant reçu une injection des cellules leucémiques, une progression tumorale va se développer. Afin d’éviter une souffrance à l’animal, les animaux ne seront pas conservés au-delà de 56 jours post injections ou en cas de point limite atteint.
Remplacement
Nous continuons à réaliser des expériences sur cellules pour générer des résultats sur le ciblage des cellules tumorales et valider leur potentiel anti-leucémique de façon à limiter le nombre d’expériences chez l’animal. La culture cellulaire à partir de cellules humaines est donc la base de notre projet pour produire des cellules traitement. Cependant, les cultures cellulaires ne permettent pas reproduire la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement développé dans un organisme. Cette saisine permet de vérifier l’efficacité d’un nouveau traitement cellulaire par rapport à un traitement de référence.
Réduction
La saisine est construite de manière séquentielle. Si les deux premiers objectifs ne sont pas atteints, il n’y aura pas d’intérêt de poursuivre les deux suivants, ce qui permettra de réduire in fine le nombre de souris utilisées. Le nombre d’animaux a été calculé afin d’avoir le minimum d’individus, sans aller au détriment des résultats.
Raffinement
Les souris seront logées dans une grande cage avec des jouets et des matériaux pour qu'elles aient suffisamment d'espace. La pièce où les souris seront logées sera bien aérée, dans une zone spéciale pour les souris nécessitant un suivi quotidien, avec un contrôle de la température, de l'humidité et de la lumière pour qu'elles se sentent bien. Leur nourriture est préparée de manière à être ultra propre pour éviter les problèmes de contamination microbienne, et leur eau est stérilisée pour éviter les maladies. Chaque jour, une personne qualifiée vérifiera leur état de santé et détectera d’éventuels signes de souffrance. Si elles ne se sentent pas bien, une grille de score permet de savoir la conduite à suivre pour réduire ou stopper le mal être. L’utilisation d’anesthésique et la bonne organisation du plan d’expériences permet de réaliser les expériences dans un temps court afin de limiter le stress et les douleurs des souris.
Choix des espèces
Les souris utilisées, ne possédant pas de système immunitaire, accepte les cellules humaines normales et leucémiques. Ce modèle murin est mondialement reconnu et indispensable pour valider toute étude pré-clinique de thérapie cellulaire dans les hémopathies malignes. Les souris sont expérimentées à partir de 8 à 12 semaines de vie, pour limiter la variabilité de poids, et parce que dans la littérature la prise de greffe humaine est meilleure dans cette période de vie.
Immunophénotypage d’un nouveau mutant (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris de ce projet portent une mutation créée en laboratoire d'après l'anomalie génétique d'un nourrisson de sept jours atteint d'un déficit immunitaire rare. 86 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune subissant quatre prises de sang à six, huit, dix et douze semaines, compensées par une injection de sérum physiologique sous la peau. Toutes sont tuées en fin de protocole pour prélever leurs organes, et le porteur précise qu'une modification importante des paramètres immunitaires pourrait avancer cette mise à mort. L'effectif d'abord annoncé était de 32 souris, augmenté de deux lots de vingt après qu'un "effet batch non attendu" a empêché de conclure, le total déclaré du projet s'établissant à 86.
Objectifs
Notre recherche porte sur une protéine présente dans les cellules, qui joue un rôle important dans la régulation du calcium. Ce calcium est essentiel à de nombreuses fonctions du corps : il participe à la croissance, à la production d’énergie, au bon fonctionnement des cellules et même à leur disparition quand cela est nécessaire. Cette protéine semble donc impliquée dans plusieurs mécanismes clés, bien que son rôle exact ne soit pas encore totalement compris. Un cas particulier nous a récemment interpellés : un bébé de 7 jours souffrant d’un trouble rare du système immunitaire. Il présente une anomalie génétique inhabituelle, jamais décrite auparavant et portant sur la protéine mentionnée ci-dessus, qui pourrait être liée à son déficit en cellules immunitaires. Ce lien possible a poussé notre équipe à explorer cette piste plus en détail. Pour mieux comprendre les effets de cette anomalie, nous avons mis au point un modèle animal, en modifiant le patrimoine génétique de souris grâce à une technique de pointe. Le but est d’observer les conséquences de cette modification, en particulier sur le sang et le système immunitaire. L’étude prévoit d’analyser deux groupes de souris : celles qui portent la modification, et celles qui ne l’ont pas. Des prélèvements sanguins seront effectués pour comparer leur état de santé et leur fonctionnement immunitaire. Au total, 32 souris seront nécessaires pour obtenir des résultats fiables. MODIFICATION : Pour palier à un effet de lot lors de la génération des cohortes expérimentales, nous ajouterons 2 lots chacun composé de 5 mâles mutants et 5 mâles WT, 5 femelles mutantes et 5 femelles WT. (soit 2x20 animaux)
Bénéfices attendus
L'objectif de notre projet est l'étude du système immunitaire, nous souhaiterons comprendre les mécanismes biologiques qui découlent de la mutation du gène d'intérêt et son effet sur l'immunité des souris.
Procédures
Dans le cadre de cette procédure, quatre prélèvements de sang seront réalisés sur chaque animal à 6 semaines, 8 semaines, 10 semaines et 12 semaines d'âges. Pour compenser la perte de volémie, la quantité de sang prélevé sera équilibré par une injection sous-cutanée de sérum physiologique d’un volume équivalent. Ce geste dure environ une minute.
Impact sur les animaux
Comme la mutation chez l’homme induit une dysfonction de la fonction immunitaire, un faible risque de faiblesse immunitaire pourrait être observé sur notre modèle de souris mutantes. Le prélèvement sanguin sera effectué sur animal vigile pouvant induire un stress. MODIFICATION: Aucun signe de phénotype dommageable sur les animaux mutants générés n'a été constaté sur la partie déjà réalisée de ce projet.
Devenir
En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder a la collecte de différents organes afin de les analyser.
Remplacement
Une partie importante de l’étude de caractérisation du gène ne nécessite pas l’utilisation d’animaux vivants et peut être étudié in vitro sur des lignées cellulaires modifiées génétiquement. Cependant, le modèle animal reste indispensable et nécessaire pour identifier l’effet de la modification du gène à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique ; le système in vitro ne pouvant apporter un même niveau d’information. De plus, le système immunitaire est complexe et impliques plusieurs organes. Ce projet vise à mettre en évidence l'impact de la modification d’une protéine sur des fonctions métaboliques complexes lors d’une maladie immunitaire. Celles-ci ne sont modélisables que dans un organisme complet à même d'exprimer l'ensemble des fonctions physiologies de régulations (régulation et production des cellules immunitaires). Seul une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes mis en jeu dans cette étude (fonctionnement du système immunitaire), fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Vu l'expérience que nous avons sur l'étude de mutation génétique notamment au sein de consortiums, des groupes de 8 animaux par sexe sont nécessaire pour obtenir des résultats robustes. Durant cette étude nous allons générer des données (analyses sanguines, caractérisation des populations cellulaires du système immunitaire) qui seront analysées à l'aide de tests statistiques appropriés. MODIFICATION : Suite à une difficulté à la génération des animaux expérimentaux, nous avons réalisés les analyses en deux parties. Tous les animaux mâles et 4 femelles ont été étudiés dans une première partie et 12 animaux femelles dans un deuxième temps. Un effet batch non attendu a été observé ne permettant pas de conclure dans les conditions initialement prévues. Nous ajouterons ainsi deux lots de 5 mâles mutant et 5 mâles WT, 5 femelles mutantes et 5 femelles WT. Si le premier lot permet de conclure dans les conditions prévues nous ne générerons pas le second lot d’animaux.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé. Si la surveillance générale (apparence, comportement, posture, présence de vocalisation) indique un changement pouvant impacter la santé de l’animal, une surveillance rapprochée comportant un tableau de suivi sera mise en place. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi. Des soins locaux seront administrés à tout animal blessé. Si une douleur est présente, un antalgique pourra être administré selon les recommandations vétérinaires. Des points limites sont mis en place, si un des points limites est atteint, la mise à mort de l'animal pourra être envisagée afin d'éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Le modèle souris est très pertinent et est nécessaire pour étudier de la modification de notre gène d'intérêt à l’échelle de l’organisme entier dans le cadre d'un syndrome multi-systémique. Le modèle de souris est très étudié pour les fonctions immunitaires. La souris est un animal dont la modification génétique est aisée et nous possédons des techniques éprouvées pour obtenir une lignée génétiquement modifiée. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative concernant les mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physio-pathologie humaine. En particulier, les systèmes immunitaires chez l’humain et chez la souris ont de nombreuses similitudes (réponse innée et adaptative, même protéines exprimées…). Les prélèvements commenceront sur les animaux à 6 semaines car c'est un âge compatible avec un prélèvement sanguin suffisant pour effectuer les analyses, mais aussi un âge où le système immunitaire est développé et permet une analyse fonctionnelle. Les prélèvements sont échelonnés sur quelques semaines pour permettre d'observer une modification du système immunitaire si la modification devait apparaitre plus tardivement. Les prélèvements s'arrêteront au plus tard à 12 semaines d'âge. Sur le temps des prélèvements, les résultats nous permettront de déterminer l'intérêt de ce gène. Si les résultats devaient montrer une modification importante des paramètres immunitaires, les animaux pourraient être sacrifiés avant pour prélèvement des organes.