Procédures modérées

Greffées sous la peau du flanc avec des cellules de mélanome de l'œil, puis injectées dans l'abdomen trois fois par semaine sur animal vigile et sans anesthésie, pendant jusqu'à seize semaines, 422 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes seront tuées pour récupérer les tumeurs et les organes porteurs de métastases. Le porteur décrit une croissance tumorale pouvant entraîner poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration et nécrose de la peau, auxquelles s'ajoutent rougeurs, infections et nécroses au point d'injection. Il annonce par ailleurs que la lignée cellulaire créée à cette occasion servira à des expériences in vitro permettant de "s'aligner sur le bien être animal".

Objectifs

Le mélanome oculaire est une tumeur cancéreuse de l’œil se développant à partir des cellules « les mélanocytes », responsables de la production de mélanine (le pigment de notre peau et de nos yeux). Ce cancer est le plus fréquent dans la population adulte. La majorité de ces mélanomes a pour origine l’uvée, un tissu de l’oeil. Si la tumeur primaire peut être traitée par énucléation ou irradiation, il a été mis en évidence que des micrométastases se propageaient via la circulation sanguine plusieurs années avant le diagnostic. Ces métastases sont fortement résistantes aux traitements par chimiothérapie ainsi qu’à la radiothérapie. L’absence de traitement efficace pour ces tumeurs entraine une mortalité à 90% dans les 6 mois qui suivent la découverte des métastases. Actuellement, il n’existe pas de traitement approuvé pour le mélanome uvéal métastatique. Il faut donc continuer à comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression de cette tumeur pour identifier des cibles thérapeutiques et des traitements efficaces. Pour ce faire, nous avons réalisées des études du profil d’expression des gènes qui nous ont permis d’identifier de nouveaux candidats cibles intéressants. De plus, l’absence de modèles expérimentaux (cellulaires, animaux) de mélanome uvéal ne permet pas de tester l’efficacité préclinique de drogues dans un contexte de système immunitaire complet. Pour améliorer cela et pouvoir proposer des traitements personnalisés pertinents, nous désirons mettre en place un modèle de souris qui repose sur la greffe de cellules issues de biopsies de mélanome uvéal de souris dans des souris immuno-déficientes.

Bénéfices attendus

Le premier but de ce projet est de développer une lignée de cellules de mélanome uvéal murin qui sera utile à la communauté internationale. Ce modèle sera utile à l’ensemble de la communauté scientifique travaillant dans ce domaine pour des études in vivo mais aussi in vitro permettant de s’aligner sur le bien être animal. Une fois ce modèle établi, il sera aussi possible d’étudier l’efficacité de certaines molécules dans des animaux ayant un système immunitaire complet dans le but de lutter contre la progression du mélanome uvéal.

Procédures

Les souris seront toutes injectées en une fois en sous-cutané (sous la peau) sur le flanc avec des cellules de mélanome uvéal murin. Après observation de la croissance tumorale, les souris sont traitées trois fois par semaine avec les différents produits décrits, par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) en alternant les côtés à chaque injection. La durée de traitement sera définie par la croissance tumorale et l’expérience sera arrêtée lorsque la tumeur aura atteint un volume défini (ou un maximun de 16 semaines après injection des cellules). Cette intervention ne nécessite pas d’anesthésie et est effectuée sur animal vigile.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourront être causés soit par la croissance de la tumeur, soit par l’injection de traitement. La croissance de la tumeur pourra entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance (poils hérissés, dos voûté, perte de poids, mobilité réduite, prostration), ainsi que des altérations visibles de la peau (nécrose…). L’injection des traitements pourra également entrainer des comportements significatifs d’une gêne ou d’une souffrance et des altérations locales au site d’injection (rougeur, infection, nécrose,..). Le site d’injection sera également surveillé.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses in vitro.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir complètement de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent la survie de cellules de mélanome oculaire murin fraichement isolées à partir d’une biopsie et de travailler de façon intégrée où l’écosystème tumoral est reproduit. Cependant, la nouvelle lignée cellulaire de mélanome oculaire murin pourra être utilisée pour des expériences in vitro.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) afin de réaliser des analyses in vitro. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, certaines procédures ou parties de procédures pourront être abandonnées, ou le nombre d’animaux réduit, en fonction des résultats obtenus. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris immunodéprimés mâles et femelles provenant de notre élevage.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi et observées quotidiennement par les animaliers et de façon exhaustive deux ou trois fois par semaine par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, stress ou inconfort. Les manipulateurs, habitués à l’expérimentation sur les souris, éviteront tout dommage à l’animal lors des injections.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une petite taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les deux modèles de souris que nous utiliserons dans ce projet sont commercialisés, bien connus et de nombreuses études ont déjà été réalisées à partir de ces modèles. Pour les procédures expérimentales, les souris sont utilisées au stade adulte (7 semaines). Elles sont commandées à 6 semaines, puis l’expérience commence après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. Ceci est scientifiquement cohérent avec les expériences déjà faites dans l’équipe et les données de la littérature.

Toutes tuées à la fin de l'étude pour des analyses histologiques et moléculaires, 24 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Douze portent l'invalidation d'un gène candidat des myopathies congénitales, les douze autres forment le groupe témoin. Après une biopsie de phalanges vers le sixième jour de vie, chaque souris passe un test de coordination motrice tous les mois de 2 à 8 mois, puis, à 8 mois, avant et après une heure de course forcée sur tapis roulant, un test de douleur où sa queue est exposée à une source de chaleur et 24 heures d'isolement dans une cage de mesure d'activité. Elle est ensuite anesthésiée, son muscle tibial antérieur disséqué pour en mesurer la contraction, puis elle est tuée. Le porteur juge l'emploi de souris "indispensable" et y voit un "modèle d'étude idéal de myopathies", en invoquant 96 % d'homologie de la protéine étudiée et des techniques de mesure perfectionnées depuis des années dans son équipe.

Objectifs

Notre travail est principalement axé sur l’étude de nouveaux gènes impliqués dans les myopathies congénitales. Après analyse de données de séquençage d’ADN de plus de 500 patients atteints de myopathies, trois mutations dans un même gène ont été identifiées. Néanmoins, nous ne savons pas si ces mutations sont la cause de la myopathie ou si elles sont là par hasard. Au cours de notre projet, des analyses moléculaires effectuées sur cellules humaines suggèrent que ces mutations mènent à la perte de fonction de la protéine et donc à un effet pathologique. La mesure de l’activité motrice et neuro-sensitive des souris présentant une invalidation du gène d’intérêt permettra éventuellement de confirmer la présence de symptômes associés aux myopathies, tels que retrouvés chez les patients, et cela à l’échelle d’un organisme entier. En dernier lieu, des analyses sur tissus prélevés chez les souris permettront de comprendre les mécanismes de la maladie liée à ce gène et ainsi d’ouvrir des perspectives thérapeutiques. Le gène étant sur le chromosome X, cette maladie concerne très rarement les femmes. Nous n'étudierons donc que les souris mâles. Nous utiliserons 12 mâles dont le gène d’intérêt est intact et 12 mâles dont le gène est invalidé que nous comparerons.

Bénéfices attendus

Les différents tests d’activité motrice et de neurosensibilité chez la souris permettront de rendre compte de symptômes similaire à ceux des patients atteints de myopathies et d’ainsi confirmer à l’échelle d’un organisme entier ce qui est observé au niveau moléculaire. Les souris analysées constitueront ainsi un modèle murin de myopathie. L’étude de l’activité des souris par test de coordination motrice chaque mois permettra d’observer ou non une différence d’activité en fonction de l’âge de la souris et ainsi de confirmer que nos études à l’âge de 8 mois sont appropriées. Les mesures de neurosensibilité et d’activité spontanée dans la cage sont réalisés avant et après effort sur tapis roulant. Cette décision a été prise car les patients ayant une mutation du gène présentent des douleurs et faiblesses à l’effort. Une fois que l’implication de ce gène dans les myopathies est confirmée, le diagnostic de patients présentant une mutation de ce gène sera facilité et leur prise en charge sera améliorée. Des études plus approfondies permettront de comprendre les mécanismes de la maladie et d’ainsi envisager des nouveaux traitements.

Procédures

Chacune des 24 souris seront soumises à une série de 5 tests au total. De 2 à 8 mois et de manière mensuelle, la coordination motrice des souris sera analysée une fois par mois pendant moins d'une heure sur animal vigile. A 8 mois, des tests de douleur avec exposition au chaud (~1h) et test de mesure d'activité spontanée dans une cage (~24h) seront réalisés avant et après effort sur tapis de course (~1h). Ces trois tests seront réalisés sur animal vigile. A la fin de ces tests, toutes les souris subiront une mesure d'activité contractile sur muscle tibial antérieur dissequé (~1h par souris). L'animal sera anesthésié au préalable. Les muscles seront conservés pour des tests histologiques et moléculaires. Une biopsie de phalanges des souris est effectuée autour du sixième jour de vie dans le but d’analyser l’ADN de l’animal et d’ainsi vérifier la présence ou non du gène d’intérêt. Cette même biopsie servira également à l'identification de l'animal.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons à observer un phénotype dommageable après effort sur tapis, de manière similaire aux patients présentant les mutations du gène étudié. En effet, les patients présentent des douleurs musculaires après activité physique. D’anciens travaux préliminaires sur ce modèle animal n’ont relevé aucun phénotype dommageable avant 4 mois. Etant donné que nos tests débutent à 2 mois, nous nous attendons à potentiellement observer des nuisances dès l’âge de 2 mois. Une faiblesse physique et douleur chez la souris pourra mener à une difficulté à se déplacer dans les cages, une difficulté à manger et éventuellement à respirer et une diminution des comportements sociaux et d’exploration. Parmi les différents tests, nous nous attendons à observer des nuisances lors de l’activité sur tapis qui provoque une fatigue de l’animal. La locomotion de la souris après retour dans sa cage risque d’être impactée. Le test de mesure de la douleur qui expose la queue de la souris à une source de chaleur provoque une douleur de très courte durée, égal au temps de réaction de la souris. La mesure d’activité spontanée dans une cage implique un isolement social pendant 24h. La mesure des propriétés contractiles musculaires nécessite une injection d'anesthésique et d'antalgique au préalable. La biopsie des phalanges décrite en 5.6.1 provoque une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette étude afin de procéder à des analyses histologiques et/ou moléculaires.

Remplacement

Afin de limiter les tests sur animaux, des études de l’activité à l’échelle moléculaire et cellulaire sont réalisées sur cellules humaines. L'utilisation d’animaux est cependant indispensable car les symptômes observés chez les patients atteints de myopathies et mécanismes de la maladie ne peuvent être observés et confirmés que dans un organisme entier. En effet, l’ensemble du tissu musculaire en lien avec le système nerveux sont étudiés. Le produit du gène étudié est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire sur la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies.

Réduction

Etant donné que le suivi en fonction de l’âge par test de coordination n’est pas invasif, cela va permettre de réutiliser les souris pour les autres tests et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Chacune des souris subira la totalité des tests au cours de sa vie. Etant donné que le test de force musculaire nécessite l’anesthésie puis la mise à mort de l’animal, les tissus d’intérêt pour analyses histologiques seront prélevés au même moment. Aucun autre animal ne sera donc sacrifié à cet effet. En ce qui concerne les tests avant et après efforts, ceux-ci n’ont de sens pour comparaison statistique que si un même animal effectue les tests avant et après l’effort. Cela réduit encore une fois le nombre d’animaux utilisés. Enfin, le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum tout en permettant d'obtenir une puissance statistique suffisante. Nous pouvons affirmer d’après la littérature qu'au total 24 souris seront nécessaires pour conclure sur le projet : 12 souris modèles de myopathie et 12 souris contrôles saines.

Raffinement

Une vigilance accrue aux moindres signes de douleur pendant les tests ou dans la cage sera appliquée grâce à une grille d’évaluation de la douleur. Les nuisances sur l’animal seront évitées autant que possible et le test arrêté si une des nuisances apparait. La mise à mort de l’animal sera appliquée si la douleur est trop élevée. De la nourriture en gel sera déposée dans la cage dès l'apparition des premiers signes de difficulté pour se déplacer et notamment après l’activité forcée sur tapis. A partir du sevrage, une perte de poids de 20% en moins de 2 semaines ou une immobilité prononcée conduira à la mise à mort. Le suivi du poids se fera une fois par semaine, voire 1 fois par jour si une baisse de poids est observée. Afin de réduire le stress des souris, celles-ci subiront une habituation à l’environnement du test un jour avant les tests et seront toujours manipulées à l’aide de tunnels. Lors de la mesure de force musculaire, les souris seront profondément anesthésiées à l’aide d’un anesthésique puissant. Afin d’éliminer toute forme d’inconfort et de douleur, une molécule à fort potentiel analgésique sera également administrée accompagnée d’un anxiolytique utilisé pour son fort pouvoir sédatif. L’animal est ensuite déposé sur une plaque chauffée afin d'éviter une hypothermie. Afin de protéger et humidifier l’œil, un gel sera appliqué. Avant de débuter l’opération, l’efficacité et la profondeur de l’anesthésie sont vérifiées par une pression exercée manuellement sur les pattes et la queue. Si le rongeur ne montre aucune réaction, l’opération chirurgicale et le test peuvent être réalisés.

Choix des espèces

La protéine issue de notre gène d’intérêt est très bien conservée chez la souris avec 96% d’homologie, ce qui suggère une fonction similaire chez l'humain et la souris. De plus, la souris possède une structure et physiologie du système musculaire et nerveux assez proche de l’Homme pour les comparer et mener à des conclusions. Des techniques de mesure d’activité musculaire propres à la souris ont été développées et perfectionnées dans notre équipe depuis de nombreuses années, ce qui fait de la souris un modèle d’étude idéal de myopathies. Les animaux subiront un test de coordination chaque mois de 2 à 8 mois afin d'obtenir un suivi de l'activité motrice selon l'âge. Cette gamme d’âges permettra d’avoir le plus de données possibles pour conclure, tout en maximisant le temps de repos des souris. Les autres tests moteurs et neurosensitifs seront effectués à l'âge de 8 mois, âge où la souris atteint ses capacités musculaires maximales. Les souris seront sexuellement matures lors de l’ensemble des tests. Elles seront adolescentes de 2 à 3 mois et adultes de 3 à 8 mois jusqu’à la fin des tests.

Pendant le test d'effort, les rats reçoivent des chocs électriques, l'épreuve étant arrêtée au bout de trois chocs en trente secondes ou de cinq chocs en une minute. 210 rats Wistar mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection unique déclenche chez eux une insuffisance cardiaque droite qui peut entraîner leur mort, puis un traitement est initié quatre semaines plus tard pendant dix ou soixante jours, avec IRM et échocardiographie sous anesthésie, mesure de la fonction rénale, test d'effort sur animal vigile, et enfin un cathétérisme cardiaque de vingt minutes sans réveil dont le porteur indique que l'animal peut mourir pendant l'examen. Les rats perdant plus de 15 % de leur poids sont tués, et le porteur retient de jeunes adultes de 200 à 220 grammes pour leur "meilleure résistance à la toxicité de la molécule".

Objectifs

Malgré des améliorations thérapeutiques majeures sur les 30 dernières années, l’insuffisance cardiaque (IC) reste associée à une mortalité et un taux de réhospitalisation à 1 an élevés. Les traitements actuellement disponibles sont efficaces pour améliorer la fonction ventriculaire gauche. Aucune thérapeutique n’a démontré son efficacité pour améliorer la fonction ventriculaire droite dans l’IC. Les gliflozines (ou SGLT2 inhibiteurs) sont des traitements qui ont récemment prouvé leur efficacité, administré seul ou en association avec des traitements classique de l’IC, pour réduire la mortalité cardiovasculaire et/ou le risque d’hospitalisation pour IC. L’effet sur la fonction ventriculaire droite de cette classe thérapeutique n’a jamais été étudié. Étant donné les mécanismes d’action connus de cette classe thérapeutique, nous faisons l’hypothèse que les gliflozines ont un effet bénéfique sur la fonction ventriculaire droite dans l’IC. En utilisant un modèle expérimental de dysfonction ventriculaire droite chez le rat, nous allons étudier si les gliflozines sont capables d’améliorer celle-ci et déterminer les mécanismes impliqués. Cela permettra d’approfondir la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués avec l’objectif de développer de nouvelles stratégies pharmacologiques pour améliorer la prise en charge et le pronostic des patients IC.

Bénéfices attendus

Le modèle utilisé et le design expérimental nous permettra d’étudier l’aggravation de la dysfonction ventriculaire droite ainsi que les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la progression de la dysfonction ventriculaire droite afin d’identifier/d’évaluer de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les Rat Wistar subiront une injection unique d'une molécule qui entraine une dysfonction du ventrciule droit au J1 de l'étude. Puis 4 groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 10 jours de traitement et 4 autre groupe aurons quatre semaines après induction de l’IC droite, un traitement sera initié puis mise à mort après 60 jours de traitement .Chaque injection de traitement serais de quelques secondes par animal. L'analyse des effets fonctionnels (IRM et échocardiographie cardiaque) qui sera effectuée sous anesthésie pour une durée de 10 minutes/rat. La fonction rénale sera évaluée sous anesthésie gazeuse 10 minutes/rat maximum pour l'injection du traceur fluorescent suivie d'un test à l'effort qui sera effectué sur les animaux vigiles. Le protocole invasif (cathétérisme cardiaque) sera réalise sur des animaux profondément anesthésiés et sera sans réveil(durée 20 minutes / rats ).

Impact sur les animaux

Les procédures sont classées modère . L'injection de la molécule entrainera potentiellement une dysfonction du ventrciule droit .Les deux procédures mènent à une insuffisance cardiaque. qui peut entraine le décès de l'animal. Les naissances des tests d'effort sont une fatigue de l'animal qui est évalué par des chocs électriques, mais tout cela est prise en compte avec une fiche procédure qui d'écrit les points limite du test. Arrêt du test à l'effort au bout de 3 chocs électriques en 30 secondes ou de 5 chocs électrique en 1 minute. On replace l'animal dans sa cage une fois le test fini ou les points limite définie dans le protocole dépasser. Pour le cathétérisme cardiaque, l'animal subira une chirurgie pour insertion d'un capteur de pression dans la carotide pour obtenir les pressions volume au niveau du coeur du rat, chaque animal sera mise à mort à la fin du test. Il se peut que l'animal décède lors du test ce cathétérisme cardiaque.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque série d’expérimentations suite au cathétérisme cardiaque pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Dans l’objectif de limiter le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, nous mettrons en place certaines expériences in vitro (tests de prolifération de cellules, interactions cellules-cellules). Cependant, l’utilisation des animaux est rendue nécessaire, car il n’existe pas à ce jour de modèle d’IC in vitro et encore moins de modèle d’IC droite in vitro. Les études fonctionnelles in vivo de notre projet ne peuvent pas être remplacées par des études in vitro à cause de la complexité de la pathogenèse de l’IC droite. En effet, des études dans notre modèle animal sont nécessaires pour comprendre les altérations globales cardiaques lors du développement de l’IC droite et son traitement (altérations simultanées des lymphatiques, des cellules immunitaires, des fibroblastes et du métabolisme des cardiomyocytes, modifications progressives de l’hémodynamique ventriculaire gauche et droite). Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires à cette étude, nous réaliserons séquentiellement des mesures non-invasives de la fonction cardiaque droite par échocardiographie, IRM, de la fonction rénale, de la capacité d'exercice. A la phase terminale nous avons également mis en place une stratégie d’optimisation des prélèvements et des analyses ex vivo au moment de la mise à mort. De plus, nous avons réalisé des tests statistiques appropriés pour calculer le nombre de rats (n=24 par groupe) nécessaires afin de détecter une différence de 10%. Des résultats historiques obtenues lors des expériences précédemment effectuées dans le laboratoire ont démontré qu’un nombre de 24 animaux par groupe sont nécessaires pour des évaluations fonctionnelles telles que l’échocardiographie/IRM. Il faut souligner que l’analyse répétée en échocardiographie ou en IRM sur le même animal au cours d’une étude permet également de diminuer le nombre d’animaux par groupe nécessaire pour démontrer un effet significatif. Concernant l’induction de l’IC droite, un suivi de la survie post-administration dune sera mis en place afin d’affiner et donc de limiter le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront nourris ad libitum et hébergés en groupes sociaux stables dans des portoirs conventionnés au nombre maximum de 4 par cage avec de l’enrichissement (Tunel, Kraft Paper). Les animaux seront maintenus avec un environnement contrôlé et stabilisé (température de 21°C , hydrométrie à 55% et luminosité à 100 lux avec une durée de cycle de lumière normal soit 12h/12h). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des rats sera observée avant le début des protocoles. Les conditions de soins et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Ainsi, un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée du protocole expérimental, ce qui permettra de déceler un éventuel signe de souffrance. Notre grille d’évaluation des point limites pour le bien-être animal est utilisé quand un animal présente un état de mal être ou de souffrance, il est exclu de l'étude et euthanasié en fonction de son score et de la discussion avec les membres de la cellule SBEA . Les rats perdant plus de 15 % de leur poids seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les expériences in vivo, ne peuvent pas être remplacées par des études in-vitro, qui nécessite des études fonctionnelles et physiopathologiques sur un modèle intégré. Ainsi, les procédures expérimentales ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous allons dans ce projet utiliser essentiellement des rats, ce qui diminuera les variations dans les réponses immunitaires, et permettra une meilleure comparaison entre nos modèles. Chaque animal est identifié de façon individuelle par une puce d’identification Les rats mâles Wistar jeunes adultes (200-220 g) seront utilisés pour induire l’IC droite. Cet âge est justifié par la meilleure résistance des animaux à la toxicité de la molécule, permettant de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés.

Rendues haplo-insuffisantes pour le gène Nipbl, les souris de ce modèle reproduisent selon le porteur les symptômes du syndrome de Cornelia de Lange, dont des comportements auto-agressifs. 18 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant trois semaines, à partir du sevrage, d'une molécule déjà en essai clinique en cancérologie, puis passent deux heures sous anesthésie gazeuse pour une imagerie cérébrale, à l'issue de laquelle elles sont tuées pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme réduire le nombre d'animaux "au minimum permettant de répondre à la question scientifique" tout en reconnaissant l'absence de données préliminaires sur la taille d'effet attendue, et présente un éventuel effet du traitement comme la première piste thérapeutique pour des enfants qui n'en ont aucune.

Objectifs

Le syndrome de Cornelia de Lange est une maladie rare du développement qui affecte plus de 9000 enfants en Europe, 30 000 aux Etats Unis. Il s’agit d’un retard de développement de la croissance accompagné de défaut de formation du cerveau, du système auditif, du cœur et d’une partie du système digestif. la cause génétique de ce syndrome est une insuffisance du gène nommé Nipbl. Il en résulte des problèmes d'expression de nombreux gènes. Les enfants souffrant de ce syndrome sont de plus petite taille que la normale, marchent très tardivement , doivent subir des interventions chirurgicales réparatrices, ne parlent pas ou parfois très tardivement, et ont des comportements auto-agressifs. Il n’y a aucune piste thérapeutique à ce jour. Avec un modèle de souris haplo-insuffisant pour le gène Nipbl, qui récapitule les symptomes des patients, nous avons trouvé que le syndrome induisait un arrêt de la prolifération cellulaire embryonnaire prématurée. Des cellules sénescentes ( en arrêt de prolifération) ont été identifiées dans tous les organes au cours du développement y compris dans le cerveau des nouveaux nés. Le traitement des souris gestantes par une molécule en essai clinique en oncologie permet la naissance de souriceaux de taille normale sans malformation cardiaque sans cellule sénéscente y compris dans le cerveau. Notre projet va étudier si le traitement des souris au sevrage et au cours de la maturation du cerveau peut prevenir ou limiter la sénéscence dans le cerveau et les effets fonctionnels tels que l 'agressivité .

Bénéfices attendus

Un effet positif du traitement sur le fonctionnement neuronal serait un atout majeur et permettrait d’apporter pour la première fois une piste thérapeutique pour les patients qui n’en ont aucune jusqu ‘aujourdh’ui. ce projet ouvrirait les discussions avec les cliniciens qui s 'ocupent des enfants affectés par le syndrome afin d'évaluer l 'utilisation du médicament.

Procédures

Les souris seront traitées avec le médicament pendant 3 semaines par un gavage quotidien durant 15 secondes . Elles seront ensuite anesthésiées pour un examen d'imagerie cérébrale de 2 heures . elles seront mises à mort à la fin de l 'examen

Impact sur les animaux

La prise du médicament par gavage est une nuisance bien que courte lorsque pratiquée par un expérimentateur très habitué. Le processus ne prend que 30s . Examen clinique par IRM sous anesthésie gazeuse : la seule nuisance ou effet indésirable possible pour ces animaux est la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, un évènement rare lorsque le vetflurane est administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique pendant l'IRM permet de détecter les premiers signes d’alerte et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux.

Devenir

Les souris seront mise à mort à la fin du protocole d'imagerie pour collecter les cerveaux à des fins d'histologie

Remplacement

Ce projet sera conduit dans le strict respect de la règle des 3R. L’étude de l’impact de la délétion de Nipbl sur le développement cérébral et l’éventuelle correction de ces anomalies par le traitement nécessite de recourir à l’animal car il n’existe aucune alternative. Il n’est pas possible d’obtenir ces informations par les organoides qui ne peuvent rendre compte du développement, de la maturation et du fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau. Il n’existe pas non plus de modèle informatique de la maladie.

Réduction

Le recours à l’animal étant incontournable, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum grâce à l’utilisation de méthodes non-invasives d’Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) et de Spectroscopie à Résonnance Magnétique (SRM). Ces méthodes avancées permettent de réaliser des explorations couvrant la totalité du cerveau et d’obtenir un grand nombre d’informations quantitatives dans le cadre d’un examen clinique sous anesthésie générale. Le caractère non invasif de l’exploration rend possible la réalisation d’examens répétées sans dommage pour l’animal. En l’absence de données préliminaires permettant de connaitre la "taille d'effet" attendue et compte-tenu de notre expérience en IRM préclinique, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum permettant de répondre à la question scientifique

Raffinement

Le raffinement concernera la diminution du stress par l’utilisation d’une anesthésie légère lors de l’IRM. Les animaux étant hébergé dans le même bâtiment que celui où sera réalisé l’imagerie, le délai d’acclimatation ne sera que de 2 à 3 jours, une habituation à l'expérimentateur sera assurée lors de l’arrivée des animaux. Pendant les sessions d’imagerie, les animaux seront plongés sous anesthésie gazeuse afin d’éviter tout stress. Ils bénéficieront d’un monitorage physiologique continu (t° rectale, respiration) avec un système dédié au rongeur permettant d’adapter immédiatement l’anesthésie afin d’éviter toute situation de détresse cardio-respiratoire. Les conditions d’hébergement seront optimisées afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels (animaux hébergés en groupes sociaux dans de grandes cages, boisson et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en plexiglas, cartons à ronger, fast-track, balançoires). Des points limites adaptés et précoces seront mis en place pour la procédure . Les souris sont visitées chaque jour incluant le week end par l’expérimentateur et sont conditionnées à la contention avant le gavage.

Choix des espèces

la souris peut être facilement modifiée génétiquement. Notre modèle murin récapitule parfaitement le phenotype des patients. elle est un bon modèle de biologie du développement, un avantage pour une pathologie du développement . Les souris seront traitées post-sevrage (3 semaines) lors de la maturation du cerveau qui persiste jusque 3 mois chez les rongeurs.

Un infarctus du myocarde leur est provoqué sous rayons X, puis viennent, six semaines plus tard, trois heures d'IRM au manganèse, à sept semaines quatre-vingt-dix minutes d'IRM au gadolinium suivies d'une échographie et d'un scanner, à huit semaines une angiographie et une cartographie de contact de quatre-vingt-dix minutes chacune. 60 moutons adultes vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une prise de sang de cinq millilitres avant chaque IRM et une première séance d'imagerie de trois heures avant l'infarctus. Le porteur qualifie la cicatrice cardiaque de non douloureuse, tout en signalant que la pose et le retrait des cathéters peuvent provoquer des saignements et que la cartographie de contact peut déclencher des tachycardies ventriculaires, un défibrillateur restant à proximité pour éviter le décès des animaux pendant les examens. Tous sont tués à la fin pour que leur cœur soit prélevé et analysé en IRM haute résolution, cartographie optique et histologie.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer des méthodes IRM innovantes afin d’améliorer la détection des cicatrices d’infarctus du myocarde. Les méthodes IRM développées ont pour but de détecter le tissu cardiaque vivant à l’intérieur et/ou autour de la cicatrice, et de permettre ainsi une meilleure évaluation des risques liés aux troubles du rythme cardiaque. Les données IRM seront validées en comparant avec d’autres examens d’imagerie (angiographie, échocardiographie, scanner) ainsi que des données de mesures de l’activité électrique (électrophysiologie) et de la structure du tissu (histologie).

Bénéfices attendus

Ces développements de méthodes ont pour but rendre l’examen IRM plus sensible (utilisation d’agents de contraste, amélioration de la résolution) et plus rapide (méthodes d’accélération de l’acquisition et/ou de la reconstruction des images). Ces méthodes ont pour ambition d'améliorer la caractérisation des cicatrices d’infarctus et donc de mieux diagnostiquer les troubles du rythme cardiaque chez les patients atteints d’infarctus du myocarde. Elle vise également à permettre de mieux cibler les régions du cœur à traiter, ce qui permettra de réduire les durées des procédures d’ablation chez les patients. Ces nouvelles méthodes d’imagerie pourront être directement utilisables sur l’ensemble des IRM cliniques.

Procédures

Les animaux auront une induction d’infarctus du myocarde sous fluoroscopie (imagerie à rayon X), ce qui donnera lieu à une cicatrice cardiaque non douloureuse. Les cicatrices seront analysées par des méthodes non-invasives utilisées en clinique et sous anesthésie générale avec l’administration d’une thérapie antidouleur appropriée: IRM, angiographie, échographie, scanner, cartographie de contact. Trois sessions d’imagerie seront effectuées: un examen IRM avant l’infarctus (180 min) avec injection d’agents de contraste à base de manganèse et de gadolinium, un examen IRM du manganèse (180 min) à 6 semaines après l’infarctus, un examen IRM du gadolinium (90 min) suivi d’un examen échographique (30 min) et scanner (45 min) à 7 semaines après l’infarctus. Avant chaque examen IRM, une prise de sang sera effectuée (5 ml) pour mesurer l’hématocrite (mesure de la portion du sang occupée par les cellules). A 8 semaines après l’infarctus, un protocole d’angiographie sera effectué pour déterminer l’état d’irrigation sanguine du cœur après l’infarctus (90 min), suivi d’une cartographie de contact (90 min) guidé par fluoroscopie pour mesurer les signaux électriques à la surface du cœur.

Impact sur les animaux

La pose et le retrait des cathéters pour la cartographie peuvent conduire à des saignements aux sites d’introduction. Les anesthésies générales peuvent impactées légèrement le bien-être animal en induisant une légère désorientation ou une apathie (absence d’énergie) transitoire lors du réveil. Lors des examens d’imagerie non-invasive (échocardiographie, IRM) ou mini-invasive (cartographie de contact), le bien-être animal peut être également impacté par la pose de cathéters: au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments et d’agents de contraste), au niveau de la veine fémorale et de l’abord sous-sternum (guide pour la cartographie de contact). Les procédures de cartographie de contact peuvent comporter des effets indésirables cardiaques tels que des déclenchements de tachycardie ventriculaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour effectuer des analyses complémentaires sur le cœur prélevé (IRM haute résolution, cartographie optique haute résolution, analyse tissulaire).

Remplacement

Le développement des séquences IRM sera effectué sur des objets tests. Néanmoins, la recherche en cardiologie qui vise à améliorer la prise en charge des patients nécessite l’utilisation de modèles animaux. En effet, il n’existe pas de méthode alternative pour étudier les mécanismes pathologiques de l’infarctus du myocarde et les risques associés aux troubles du rythme cardiaque. Les méthodes IRM développées nécessitent une validation par des méthodes invasives telles que les mesures de l’activité électrique (électrophysiologie) et l’analyse de la structure du tissu (histologie). Les résultats obtenus par les méthodes d’imagerie, les mesures de l’activité électrique et la caractérisation tissulaire permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques liés aux infarctus du myocarde et d’enrichir la base de données pour créer des modèles de cœurs « numériques » grâce à la modélisation informatique, et à terme de limiter l’utilisation de l’expérimentation animale.

Réduction

Dans le but de réduire le nombre d’animaux, plusieurs modalités seront mis en œuvres afin d’obtenir le maximum de données expérimentales dans ce projet tels que l’IRM avec injections d’agents de contraste, le scanner, la coronarographie, la cartographie de contact. De plus, un calcul de puissance statistique a été effectué pour déterminer le minimum d’animaux pour avoir des résultats significatifs.

Raffinement

Une attention permanente sera portée au bien-être des animaux tout au long du protocole, en particulier par une surveillance quotidienne (surveillance du comportement des animaux, de la température et de l’hygrométrie de la zone d’hébergement) et par l’enrichissement du milieu ainsi que le groupe social adapté. Lors des examens, les animaux seront sous anesthésie générale avec un protocole antidouleur approprié ainsi qu’une surveillance accrue (électrocardiogramme, capteur de pression, sonde de température, capteur de saturation en oxygène). Pendant l’anesthésie générale, une hydratation continue sera assurée ainsi que les molécules nécessaires aux protocoles (agents de contraste pendant l’imagerie, des anti-arythmiques). Un défibrillateur diphasique sera à proximité en cas d’urgence afin d’éviter le décès précoce des animaux lors des examens. Si l’état de l’animal le nécessite, les responsables de projet et/ou les vétérinaires pourront intervenir pour adapter le protocole antidouleur ou interrompre la procédure.

Choix des espèces

Les modèles de gros animaux offrent la possibilité d'étudier la pertinence clinique de nouvelles techniques de diagnostic en raison de leurs similitudes fonctionnelles et structurelles avec le cœur humain. Les ovins seront utilisés à l’âge adulte (12 mois) car ils ont un cœur avec une taille et des caractéristiques physiologiques proche de celle de l’Homme.

Pour évaluer un additif alimentaire au butyrate destiné à la filière porcine, 672 cochons, 48 truies et leurs portées, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les truies subissent cinq prises de sang, quinze jours avant la mise bas, le jour de la mise bas, puis après sept, quatorze et vingt et un jours de lactation, et sont mises à jeun la veille des prélèvements couplés aux pesées. Les porcelets, sevrés à vingt et un jours, soit une semaine plus tôt que d'ordinaire, sont prélevés à la naissance, au sevrage et un mois après, le porteur reconnaissant que ce sevrage anticipé représente pour eux "un stress plus important". Aucun n'est tué dans le cadre de l'essai, tous restent vivants et poursuivent leur cycle dans un élevage de production, l'objectif annoncé étant d'améliorer les performances zootechniques et de réduire les traitements antibiotiques.

Objectifs

Il s'agit d'évaluer l’efficacité du butyrate sous forme lactique, produit apporté chez la truie en période de fin de gestation et lactation, sur les performances et la santé de sa descendance, de démontrer et de clarifier le mode d’action de ce produit sur le métabolisme et les paramètres endocrinologiques chez la truie, améliorant ainsi le niveau de production, la composition et/ou les apports énergétiques du colostrum et du lait. Des études précédentes sur des molécules de la même famille et effectuées sur différentes espèces (porcines, bovines et murines) ont montré des améliorations dans l’homéostasie glucidique (maintien du taux de glucose sanguin) ainsi que des changements endocrinologiques très intéressants chez les femelles en fin de gestation et pendant la lactation avec des retombées positives sur la descendance. Le butyrate permettrait un accroissement de la quantité de lait et de colostrum produits et une augmentation de leurs teneurs en nutriments et en immunoglobulines. Le butyrate est un acide gras à chaîne courte naturellement présent dans les huiles végétales et les graisses animales. Chez les mammifères, il est produit par le microbiote intestinal, sert de source d'énergie pour les cellules intestinales et agit probablement sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons démontrer des effets bénéfiques sur les portées de porcelets pendant les périodes de lactation et de post-sevrage (réduction des diarrhées liées au syndrome post-sevrage), sur la santé intestinale chez les truies et les porcelets (augmentation de la survie et de la performance des portées), sur l'usage de médicaments (réduction de traitement à base d’antibiotiques notamment en post-sevrage), sur la transition gestation/lactation et sur la reprise d’état des femelles après la mise bas.

Procédures

Les truies et les porcelets seront soumis à des prises de sang. Des prélèvements de sang seront effectués sur 48 truies, 15 jours avant mise-bas, le jour de la mise-bas, puis après 7, 14 et 21 jours de lactation. Des prélèvements de sang seront effectués sur 48 porcelets à la naissance, au sevrage et après un mois de post-sevrage. Pour les prises de sang et les pesées effectuées le même jour, les truies devront être mises à jeun la veille et pour les porcelets en fin d'étude à 49 jours uniquement. Les porcelets seront sevrés à 21 jours d'âge. La durée de post-sevrage est de 8 semaines.

Impact sur les animaux

En se basant sur les précédentes études in vivo et in vitro, aucun effet indésirable de l'additif n’est attendu. Ce sont les prises de sang qui présentent une source de douleur pour les animaux. Mais les prélèvements de sang seront réalisés par des personnes spécialisées de façon à ce que la durée de contention soit la plus réduite possible. Le sevrage anticipé d'une semaine dans le cadre de cet essai représente un stress plus important pour les porcelets. En revanche les opérations de prélèvements de colostrum et de lait, ainsi que la procédure de mise à jeun ne représentent pas de risque.

Devenir

Tous les animaux sont conservés vivants à l'issue de l'essai et poursuivront leur cycle classique d'un élevage de production.

Remplacement

Les alternatives alimentaires à l'usage des antibiotiques en élevage de porcs doivent être évaluées sur l'animal concerné et dans des conditions d'élevages conventionnelles. Pour que le potentiel du butyrate sur l'incidence des infections bactériennes chez le porcelet soit appréhendé, l'étude ne peut être menée que sur des truies et leurs portées.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour l'étude est réduit au minimum : 48 truies et leurs portées au total soient 16 truies et environ 208 porcelets par traitement alimentaire. Ces effectifs permettront de vérifier, grâce à l’utilisation de tests statistiques appropriés, l'intérêt d'incorporer le butyrate dans l'alimentation des truies sur le plan de leur production laitière et colostrale et par conséquent sur l'état de santé des porcelets. Le cas échéant, les mécanismes en jeu (endocrinologiques, immunitaires et/ou métaboliques) pourront alors être identifiés.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions d'élevage adaptées à leur stade physiologique: surface par animal, température ambiante contrôlée, abreuvement à volonté, alimentation spécifique. Les porcs malades sont soignés, voire retirés de l'étude et isolés en infirmerie si nécessaire. Des précautions sont prises lors des prises de sang : utilisation de matériel adapté au gabarit des animaux, personnel spécialisé, rapidité de la prise de sang, suivi des animaux après prélèvement. Ils ont constamment accès à un abreuvement pendant toute la durée de l'étude. Les porcelets sevrés seront accueillis dans des salles préchauffées à 28°C. Un aliment spécifique au sevrage sera distribué pendant 3 semaines, puis sera remplacé par un aliment adapté à des animaux un peu plus lourds.

Choix des espèces

Il s'agit de mesurer des performances zootechniques (gain de croissance, efficacité alimentaire) sur des porcs en conditions d'élevages conventionnelles. Les truies recevront les régimes expérimentaux 2 semaines avant mise-bas puis pendant la phase de lactation. Elles seront donc suivies pendant 5 semaines, qui correspondent à la période de distrbution des aliments expérimentaux. Les porcelets recevront le même aliment quel que soit le régime de leur mère. Il sera adapté à leur stade physiologique et ne contiendra pas de butyrate. Leurs performances seront suivies en cours d'allaitement (3 semaines), puis en phase de post-sevrage (4 semaines). Tous les porcelets issus des 48 truies seront suivis en période d'allaitement et de post-sevrage.