Procédures modérées

Maintenues éveillées dans un tube de contention, les 648 souris du projet reçoivent toutes une injection dans la veine de la queue, et 192 d'entre elles une injection dans l'abdomen, sans anesthésie elle aussi. Elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une thérapie cellulaire destinée à accélérer la reconstitution du système immunitaire après une greffe de cellules souches. Selon les groupes, 48 sont irradiées éveillées, 128 reçoivent une injection dans le sinus orbital sous anesthésie générale et 48 sont gavées chaque jour pendant trois semaines, une chimiothérapie étant aussi prévue sans effectif précisé. Le porteur écrit pourtant que les injections peuvent provoquer un stress "nécessitant une anesthésie générale au préalable". Toutes sont tuées en fin d'expérience pour l'analyse de leurs organes, 192 après une prise de sang dans le sinus orbital sous anesthésie.

Objectifs

La greffe de cellules souches offre des perspectives de guérison aux patients atteints d’hémopathies malignes (cancer du sang) et à d'autres troubles hématologiques comme les déficits immunitaires. La transplantation avec des cellules souches peut être autologue (provenant des propres cellules du patient) ou allogénique (provenant d’un donneur sain et compatible avec le receveur). La greffe allogénique est limitée par le manque de donneurs compatibles. Lorsqu’un patient est atteint d’un cancer du sang, celui-ci subira des chimiothérapies et/ou irradiation réduisant à néant son système immunitaire avant d’être injecté par des cellules souche. Mais la durée de restauration d’un système immunitaire efficace et fonctionnel après la greffe peut aller jusqu’à deux ans. Durant cette période, le patient n’a pas d’immunité pleinement fonctionnelle et peut contracter de multiples infections représentant une des principales causes de mortalité. Nous proposons de réduire cette période de risque chez les patients en proposant une approche thérapeutique innovante pour accélérer la reconstitution d’un système immunitaire fonctionnel. De cette façon, le délai de reconstitution est réduit à 3 mois (au lieu de deux ans) permettant de réduire les durées d’hospitalisation et les risques d’infections opportunistes. Dans cette perspective, les résultats précliniques doivent être consolidés par des données pharmacologiques dans un modèle murin adulte mimant la condition clinique des patients. La souris représente un modèle pertinent pour l’étude. Ces souris nécessitent un conditionnement par chimiothérapie et/ou irradiation comparable à ceux utilisés chez les patients avant d’être greffés. Ces souris représentent un modèle indispensable afin de tester in vivo les stratégies thérapeutiques proposées dans des conditions similaires à celles utilisées chez les patients. Il s’agit d’une étape indispensable à l’application de nouvelles stratégies innovantes dans les protocoles cliniques.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de valider et de justifier la mise en place d'une stratégie thérapeutique utilisant l’injection de cellules immunitaires pour lutter contre les cancers du sang. L’acquisition de ces données est indispensable au développement de cette thérapie innovante, à fort potentiel translationnel. De plus, les études de régénération d’un thymus chez les souris âgées peuvent ouvrir la voie à une nouvelle perspective thérapeutique chez les patients souffrant de complications liées au processus de vieillissement, au SIDA, ou aux radiations dues à une catastrophe nucléaire. En effet, dans tous les cas cités, les personnes sont susceptibles de perdre leurs systèmes immunitaires et l’approche thérapeutique proposée permettrait de régénérer de façon rapide et efficace une défense immunitaire fonctionnelle.

Procédures

Les interventions se limiteront à : 1. Irradiation : L’irradiation durera moins de 5 minutes sur les animaux vigiles. 48 souris seront irradiées 1 fois. 2. Une seule injection intraveineuse dans le sinus orbitale gauche et/ou droit sous anesthésie générale. L’injection durera 1 minute / animal sur 128 souris 3. Une injection intraveineuse dans la veine caudale de la queue des souris vigiles maintenues dans un tube de contention. L’injection durera

Impact sur les animaux

De façon général, les médicaments de chimiothérapies et/ou irradiation peuvent occasionner chez l'animal des symptômes cliniques de type amaigrissement et anémie. Les injections peuvent provoquer une légère douleur localisée et un stress nécessitant une anesthésie générale au préalable. Le gavage peut provoquer un stress et une douleur au niveau de l’œsophage chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérience pour le prélèvement et l’analyse des organes nous permettant de conclure sur l'efficacité du traitement.

Remplacement

Des études de différenciation in vitro ont été réalisées afin d’optimiser les conditions de préparation des cellules à injecter et de s’assurer de leur potentiel à donner des cellules fonctionelles. Les expériences chez l’animal interviennent donc au terme d’un long processus expérimental de mises au point. Les études précliniques de pharmacologie (mode d’administration, effet dose-réponse, efficacité de colonisation du thymus âgés) sont demandées par les autorités règlementaires avant les essais cliniques et ne peuvent pas être substituées ou mimés in vitro.

Réduction

La méthode de chimiothérapie et/ou irradiation la plus adaptée sera préalablement choisie avant les études de dose réponse. Ces études permettront de choisir une condition de greffe optimale et ainsi de diminuer les échecs de greffe. Le modèle animal choisi et le plan expérimental sont inspirés de plusieurs études similaires très bien documentées dans la littérature. Cela confirme la pertinence du modèle expérimental et renforce la validité de nos hypothèses évitant des étapes intermédiaires de mise au point chez l’animal. Le nombre d’animaux par groupe dans les différentes procédures a été calculé selon une méthode fiable et très utilisée dans la littérature permettant de fournir des données statistiquement exploitables. Les expérimentations seront regroupées au maximum et dans la mesure de la faisabilité technique, afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Une partie des animaux pourra ne pas être utilisée en fonction des résultats obtenus pour permettre l’ajustement de la dose des traitements (168 souris potentielles).

Raffinement

Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés dans des cages enrichies à l’aide de coton de nidification et de rouleaux en carton pour favoriser les cachettes et le jeu. Le nombre de souris sera limiter à 5 animaux par cage. Afin d'améliorer le bien-être animal au cours de l'étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés. La mise à mort sera précédée par une anesthésie générale pour éviter le stress et la souffrance. Nous n’attendons aucun phénotype dommageable ou souffrance à l’issue de la greffe des cellules immunitaires au sinus retro-orbital chez les animaux greffés. Toute chimiothérapie et/ou irradiation sera suivie rapidement par une greffe de cellules et toute manifestation de signes de douleur sera scrutée selon les critères de définition des points limites de la présente étude. En cas de signe de souffrance et selon les résultats de la grille préétablie, le personnel qualifié et le responsable scientifique de l’étude pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement du systéme immunitaire. En effet, le système immuno-hématologique murin est très similaire au système humain dans sa fonctionnalité et son développement permettant une extrapolation des résultats obtenus. Cette espèce est facile à élever en animalerie et présente une grande homogénéité génotypique. Souris adultes de 6 à 12 semaines (et souris adultes âgées de plus de 9 mois) car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier son développement.

Une souris chez qui une perte de poids liée à une baisse d'alimentation et une mobilité réduite deviennent prononcées en même temps est mise à mort, tout comme celle qui montre des signes de douleur avec une tumeur de grande taille. 540 souris mâles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées au plus tard après huit semaines pour prélever leur tumeur et leur sang. Elles reçoivent sous anesthésie une injection de cellules de mélanome sous la peau du flanc, puis, une fois la tumeur de la taille d'un petit pois, trois injections d'immunothérapie dans l'abdomen, éveillées, et jusqu'à quatre prises de sang à la joue sans anesthésie. Certains groupes reçoivent en plus une injection quotidienne dans l'abdomen, cinq jours par semaine, d'un inhibiteur de la protéine étudiée, et la tumeur peut s'ulcérer, modifier la respiration ou réduire la mobilité. Le projet cherche si un récepteur des cellules cancéreuses favorise la résistance aux traitements du mélanome, et le porteur avance qu'à terme ce récepteur "pourrait être un marqueur prédictif de réponse" chez les patients.

Objectifs

Le mélanome est un cancer de la peau ayant un mauvais pronostic et une incidence croissante, ce qui en fait un problème majeur de santé publique. De nouvelles thérapies ont permis d’améliorer la prise en charge du mélanome lorsque celui-ci s’est propagé dans d’autres organes, cependant l’échappement thérapeutique et la toxicité sont des phénomènes très fréquents qui limitent grandement leur bénéfice clinique. Ainsi, l’identification de nouveaux marqueurs de la résistance à ces thérapies reste un enjeu considérable. Il a déjà été démontré qu’un récepteur présent à la surface des cellules de la peau, est impliqué dans la progression du mélanome et que son expression est associée à un mauvais pronostic avec une diminution de la survie des patients. Nous souhaitons donc évaluer si ce récepteur est impliqué dans la résistance aux traitements dans le cancer de la peau et pourrait être utilisé comme molécule permettant d’anticiper la non réponses aux traitements des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de démontrer le rôle du récepteur dans la réponse aux traitements et ainsi confirmer son rôle de cible thérapeutique dans le mélanome. A terme, ce récepteur pourrait être un marqueur prédictif de réponse à ces thérapies chez les patients atteints de mélanome.

Procédures

La mise en place du modèle d’étude consiste dans un premier temps à injecter une seule fois sous la peau des souris (au niveau du flanc) des cellules de cancer de la peau où la protéine d’intérêt est exprimée ou non. Cette injection se fait sous anesthésie et dure environ 1 minute. Lorsque la tumeur sera détectable (taille d’un petit pois), les souris recevront le traitement (3 injections, sur souris éveillée, dans l’abdomen espacées de 3 jours ; durée de l’injection : 15s). Des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (sans anesthésie ; durée : 1 min) seront réalisées avant le début du traitement, puis 1 fois par semaine (4 prélèvements maximum). Pour les groupes de souris où il y a la combinaison des molécules inhibitrices de la protéine d’interêt, en plus des 3 injections d’immunothérapies espacées de 3 jours, s’ajouteront une injection quotidienne (5 jours par semaine) sur souris éveillée, dans l’abdomen d’un produit inhibant la protéine d’intérêt (durée : 15s). Les tumeurs seront mesurées deux fois par semaine (durée 30s). Au bout de 8 semaines maximum, les souris sont euthanasiées afin de prélever les tumeurs.

Impact sur les animaux

Suite à la croissance des tumeurs et/ou au développement de métastases, une perte de poids peut être observée. Un développement trop important de la tumeur peut également induire une ulcération, un changement de la respiration ou encore une agressivité. Le point d’injection des cellules tumorales étant sur le flanc, les souris peuvent présenter une mobilité réduite si la tumeur atteint une taille trop importante. Enfin, l’immunothérapie peut se révéler légèrement toxique, ce qui se manifestera par une perte de poids principalement ou un gonflement de l’abdomen.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures expérimentales afin de collecter la tumeur et le sang, qui seront analysés et conservés afin de caractériser au niveau cellulaire l’effet de la thérapie en présence ou non de la protéine d’intérêt.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences en utilisant des cellules en culture (in vitro, sans utilisation d’animaux) qui ont montré que le récepteur avait un impact sur la réponse aux traitements anti-cancéreux. Cependant, pour obtenir des résultats plus proches de ce qui se passe dans le corps humain, nous devons passer à des tests dans des modèles animaux vivants (in vivo). Ces modèles intègrent des caractéristiques importantes des tumeurs humaines, telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, la présence de tissus sains et des barrières qui peuvent limiter l’efficacité des traitements. Il est donc impossible de poursuivre la validation de nos résultats in vitro sans utiliser un modèle animal entier vivant.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Pour cela nous nous sommes basés sur des tests statistiques.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une fois par semaine une grille d'évaluation prenant en compte la taille de la tumeur, l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. En effet, tout signe de souffrance et/ou douleur caractérisés par une réduction de l’alimentation avec une perte de poids ou une réduction de la mobilité donneront lieu à une mise à disposition de croquettes humidifiées dans les cages avec une surveillance quotidienne. Si ces signes sont observés d’une manière prononcée la surveillance de l’animal sera bi-quotidienne avec une mise à disposition de croquettes humidifiées dans la cage et la mise en place d’une analgésie injectée une fois par jour afin de soulager la potentielle douleur. Si deux de ces signes sont observés de manière prononcée simultanément, l’animal sera euthanasié selon une méthode réglementaire. En cas de signe de douleur (expression faciale, posture voutée) et de tumeur d’une taille importante (définie dans la grille de score) avec ou sans ulcération, la souris sera immédiatement euthanasiée selon une méthode réglementaire.

Choix des espèces

Le modèle de greffe de cellules cancéreuses est bien décrit dans la littérature scientifique et est pertinent pour l’étude de l’effet de thérapies sur la croissance des cellules cancéreuse. Pour mener à bien ce projet, nous utiliserons des souris adultes, afin qu’elles disposent d’un système immunitaire complétement développé. Cela nous permet d’être dans des conditions comparables à ce qui est observé chez l’Homme, le cancer de la peau étant un cancer observé chez l’adulte. Le mélanome étant un cancer qui se développe chez l’adulte, ainsi des souris mâles adultes âgées de 7-8 semaines seront utilisées lors de l’expérimentation, ce qui permettra également un suivi durant une période suffisamment longue.

L'abdomen ouvert sur sept centimètres, l'aorte incisée, un cathéter à ballonnet poussé jusqu'aux artères iliaques pour en abîmer la paroi : l'intervention dure environ 90 minutes. 480 rats vont être utilisés ainsi, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La lésion sert à provoquer un rétrécissement artériel sur lequel un gel de nanoparticules lipidiques sera testé, avec pour effets possibles une occlusion des artères et une thrombose. Le porteur ne donne aucun calcul pour l'effectif et se contente d'évoquer un "plan expérimental stéréotypé" permettant la puissance statistique voulue.

Objectifs

L'hyperplasie intimale (HI) est un phénomène complexe qui entraine la diminution progressive de la lumière du vaisseau sanguin puis son obstruction. Elle apparait après des gestes de chirurgie vasculaire comme un pontage ou encore une pose de stent. L'HI représente une des complications majeures non encore résolue à ce jour, de ces interventions chirurgicales pratiquées de manière courante. Ce phénomène survient rapidement après le geste initial : entre le 3ème et le 18ème mois. Ce phénomène considéré comme une "surcicatrisation" au niveau de la paroi artérielle conduit au rétrécissement de l'artère jusqu'à son occlusion, et nécessite une nouvelle intervention chirurgicale. Diverses approches ont été envisagées pour limiter le phénomène d’HI telles que l’utilisation de matériaux biocompatibles synthétiques pour remplacer les vaisseaux sanguins, ou alors l’utilisation d’endoprothèse modifiés en surface (stent enrobé par des agents thérapeutiques) lors d’une recanalisation. Cependant, ces approches thérapeutiques peuvent reconduire à l'apparition d'HI. Dans ce projet, nous cherchons à développer un biomatériau de type hydrogel de nanoparticules lipidiques contenant une substance thérapeutique capable de limiter ce phénomène d’HI. Le gel pourrait être appliqué sur la paroi externe des vaisseaux (le site d’intervention) par le chirurgien après la suture vasculaire. L'agent thérapeutique se trouvant dans le gel sera diffusé le long de la paroi des vaisseaux sur le long terme et limiterait l'HI, ce qui diminuerait considérablement le taux de réintervention chirurgicale. À travers les expérimentations animales, nous cherchons à démontrer l'efficacité de ce biomatériau de type hydrogel sur un modèle animal d'HI. Pour ce faire, nous allons induire l'HI par un geste chirurgical chez le rat puis appliquer le gel sur le site d'intervention. Après 1 à 4 semaines, nous étudierons les effets de l’hydrogel sur le développement de l’HI.

Bénéfices attendus

Le développement de l’hyperplasie intimale (HI) suite à une intervention chirurgicale des vaisseaux est un phénomène très fréquent. En fonction de type d’intervention, plus de 50% des patients peuvent développer l’HI. De nos jours, seul traitement étant réintervention chirurgicale, il est primordial de prévenir et de limiter son apparition. Le principe de cet hydrogel des nanoparticules lipidiques (NpL) est d’appliquer directement sur le site d’intervention à la fin de la chirurgie, ce qui ne nécessite pas une réintervention chirurgicale chez les patients. Par ailleurs, il est possible de moduler le temps de libération des substances à partir de l'hydrogel en modifiant la quantité des composants du gel. L’intérêt étant de limiter la surcicatrisation après la mise en place de la bonne cicatrisation, la libération de molécule thérapeutique peut être retardée dans le temps. De plus, grâce à ses composants biodégradables, il n’y a peu, voire pas de résidu après l’absorption par l’organisme. Notre hydrogel des NpLs présente donc une meilleure biocompatibilité par rapport à d’autres types de nanoparticules. Ce type d’hydrogel contenant une autre substance thérapeutique a déjà été étudié sur un cancer cérébral. Les résultats ont montré une amélioration de taux de survie chez les animaux cancéreux. Si les résultats de ce projet sont prometteurs, cela permettra de proposer une nouvelle thérapie pour l’HI et d’ouvrir la possibilité d’application de ce type d’hydrogel pour d’autres pathologies.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’induction d’hyperplasie intimale (HI) au niveau de l’aorte abdominale (incision) et des artères fémorales (lésion pariétale). L’intervention durera environ 90 min au total. Sous l’anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront des piqûres d’analgésiques en sous-cutanée en préopératoire. 15 min plus tard, l’abdomen sera incisé d’environ 7 cm. Les animaux des groupes « HI » subiront une petite incision au niveau de l’aorte abdominale et l’introduction de cathéter à ballonnet jusqu’aux artères iliaques pour une lésion pariétale. Après avoir retiré le cathéter, l’incision de l’aorte et l’abdomen seront refermées par des points de suture. De l’ouverture à la fermeture de l’abdomen, la durée estimée est d’environ 45-50 min. L’animal subiront une administration sous-cutanée d’analgésique en post-opératoire avant de retourner dans sa cage d’initial (environ 2h plus tard après l’intervention).

Impact sur les animaux

Au cours de leur vie, ils ressentiront des inconforts liés à la préhension et à la manipulation, qui seront minimisés par l’intervention d’un seul expérimentateur. Durant la procédure chirurgicale, les douleurs liées à l’intervention seront gérées et soulagées par l’administration des analgésiques. L’hypothermie sera également gérée par l’utilisation de tapis chauffant et d’une couveuse. Ils pourront ressentir l’angoisse liée à l’isolement pendant le rétablissement post-opératoire, qui durera au maximum une demi-journée. Il peut également y avoir des effets indésirables du modèle pathologiques d’HI tels que l’occlusion des artères et/ou la thrombose.

Devenir

Utilisation de tous les animaux pour récupérer les tissus artériels et étudier les effets de l'hydrogel sur le développement de l'hyperplasie intimale.

Remplacement

Dans ce projet, nous utilisons 5 nanoparticules (NpLs) différentes, ce qui leur donnent des caractéristiques physico-chimique différentes. La biocompatibilité et la capacité d’internalisation des NpLs varient en fonction de ces caractéristiques. Nous avons effectué des études sur des cellules (in vitro) pour définir une NpL parmi les 5 qui présente la plus faible toxicité et le meilleur taux d’internalisation dans les cellules. Suite à ces résultats, nous utiliserons la seule NpL définie pour des expériences sur les animaux (in vivo). En revanche, l’hyperplasie intimale (HI) étant due à des mécanismes et des processus de régulation complexe de l'organisme, il n’est pas possible de reproduire ces conditions pathologiques in vitro pour étudier l’efficacité de notre biomatériau d’hydrogel sur la pathologie. C’est pourquoi nous avons recours au modèle animal en choisissant le rat comme modèle classique de mammifère qui est également un modèle d’HI bien établi dans la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes.

Raffinement

Les animaux seront élevés en cages enrichies avec des cartons et des cabanes et sont surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les rats seront manipulés uniquement par l’expérimentateur du projet pour l’habituation à la préhension permettant de réduire le stress lié. Suite à l’intervention, une surveillance accrue sera mise en place par l'expérimentateur afin d'aller voir ces animaux opérés tous les jours pendant au moins une semaine, en plus de la visite quotidienne par les animaliers. Après l’opération, chaque animal sera mis individuellement dans une cage placée dans une couveuse réglée à 27°C pendant quelques heures pour le rétablissement post-opératoire puis sera remis avec d’autres rats en groupe social. L'isolement ne dépassera pas 24h. Afin de réduire au maximum les douleurs liées à l'intervention, les analgésiques seront administrés en préopératoire, post-opératoire et dans le cas d'apparition de signes cliniques. La pesée et l’évaluation de comportement et d'apparence selon la grille du score seront également effectuées pour d’assurer le bien-être de l’animal.

Choix des espèces

Les rongeurs sont recommandés par les agences de régulation du médicament (FDA, EMEA) comme première approche. L’utilisation des rats est préférable au vu du type d’intervention. Il aurait été très difficile d’effectuer ces interventions chez les souris à cause de leur petite taille. La perte liée à la chirurgie aurait été beaucoup plus importante chez la souris que chez le rat. Par ailleurs, le rat est le modèle animal d’hyperplasie intimale (HI) couramment utilisé et très bien établi dans la littérature. Chez l’Homme, les pathologies vasculaires surviennent à l’âge adulte. Les adultes sont donc sujets à recevoir des interventions chirurgicales des vaisseaux et sont susceptible de développer l’HI par la suite. De ce fait, nous travaillerons sur les rats adultes âgés de 18 à 24 semaines pour reproduire l’HI.

Former des techniciens à trois examens fonctionnels et caler les protocoles : 64 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit les trois actes, une exploration respiratoire de 22 minutes, une échographie musculaire de 30 à 60 minutes sous anesthésie générale, puis une mesure de la force de flexion du pied sous anesthésie, avec des aiguilles de stimulation plantées dans le muscle. Le porteur signale des réveils spontanés possibles, des détresses respiratoires pendant l'anesthésie et des douleurs post-opératoires liées aux piqûres. Il présente l'opération comme un moyen de réduire "considérablement" le nombre d'animaux dans les projets à venir, et précise que ces 64 souris étaient de toute façon promises à la mort, leur génotype ne servant aucun projet.

Objectifs

L’objectif de cette demande a pour but de développer nouvelles techniques in vivo chez la souris contribuant à l'avancée de la recherche sur les maladies neuromusculaires et de former les applicateurs. La mise en place de ces études permettra d’ajouter de nouvelles évaluations et ainsi proposer aux équipes de recherche des projets plus complets. Les différents actes réalisés seront l’échographie de muscles squelettiques, l'évaluation de la fonction respiratoire et de la force générée lors d’une flexion du pied. La technique d’élastographie par échographie permet de mesurer l'élasticité des différents tissus dans un muscle d'intérêt. Cette technique, nécessitant seulement une anesthésie générale, a pour but d’observer le développement des différents tissus composant le muscle dans les modèles murins de maladies neuromusculaires. Cet examen peut être réalisé plusieurs fois permettant un suivi régulier sur un même lot expérimental. Le nombre d’animaux inclut dans les projets scientifiques sera considérablement réduit et favorisera l’obtention de meilleurs résultats en éliminant la variabilité inter-individuelle. Le pléthysmographe est une exploration fonctionnelle respiratoire. Elle mesure l’ensemble des volumes gazeux pulmonaires. Cela indiquera également la contribution du diaphragme dans le système respiratoire. Cet examen est rapide, indolore et non invasif pour l’animal. L’évaluation de la force générée lors d’une flexion plantaire consiste à mettre en évidence les défauts de contractilité musculaire. Elle se déroule sous anesthésie générale accompagnée d’un analgésique et n’est pas terminale. Ces évaluations pourront être répétées sur un même lot expérimental permettant un suivi régulier de l’évolution des symptômes de la maladie neuromusculaire. Cette technique permettra de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés dans les projets scientifiques.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette demande a pour but de développer de nouvelles techniques in vivo contribuant à l'avancée de la recherche sur les maladies neuromusculaires et de former les applicateurs. La réalisation de cette étude pilote peut s'avérer très utile pour la détermination précise des points limites, et pour la formation complète des techniciens. Cette étude utilisant un nombre restreint d'animaux peut aider à déterminer la durée de l’acte et la fréquence des observations nécessaires des lots dans les futurs projets expérimentaux. Ce projet de formation, préliminaire aux études des équipes de recherche peut également donner une indication de la variance des réponses entre les groupes de traitement, laquelle peut être alors utilisée pour estimer plus précisément la taille appropriée des groupes des projets expérimentaux. De plus, mener une expérience pilote offre l'occasion de se familiariser avec les signes et symptômes attendus et de conseiller au mieux les concepteurs de projets par la suite.

Procédures

La totalité des animaux inclus dans ce projet seront soumis aux trois techniques d'études fonctionnelles décrites : - L'évaluation de la fonction respiratoire sera réalisée 1 seule fois par animal et durera approximativement 22 minutes. - Une échographie de muscles squelettiques réalisée également 1 seule fois par animal. L'examen durera 30 à 60 minutes et se réalise sous anesthésie générale. - L'évaluation de la force musculaire lors d'une flexion plantaire sera le dernier test effectué 1 seule fois par animal. Il nécessite l'anesthésie des animaux et l'ajout d'un anti-douleur. Il dure environ 15 à 20 minutes. Ces trois actes consitant à analyser trois paramètres physiologiques permettront d'évaluer l'efficacité d'un nouveau traîtement thérapeutique, de caractériser un nouveau modèle murin de maladies neuromusculaires. Ces équipements modernes sont similaires à ceux utilisés chez l'homme et vont permettre la réalisation d'étude complète et abouties. Le nombre d'animaux inclut dans les projet expérimentaux s'appliquant à la recherche des maladies neuromusculaires se verra considérablement réduit.

Impact sur les animaux

Lors de la pléthysmographie, seul le stress peut survenir pendant l’acte dû à la manipulation des animaux. Pendant une échographie, le réveil spontané d’un animal peut être attendu ainsi qu’une détresse respiratoire lors de l’anesthésie. Lors de l'évaluation de la force générée lors d'une flexion plantaire, les nuisances tels qu’un réveil spontané, une détresse respiratoire, des douleurs post-opératoires dues aux piqûres des aiguilles de stimulation et à la contraction involontaire appliquée peuvent être attendus. Durant la semaine de stabulation suivant l’échographie, le stress et l’inconfort dû au réveil après l’anesthésie générale est à prévoir.

Devenir

Les animaux utilisés dans cette procédure étaient initialement voués à l'euthanasie dû à un génotype sans intérêt pour les projets scientifiques. Ils seront donc euthanasiés à la fin de cette procédure.

Remplacement

Ces techniques qui permettent une analyse fonctionnelle de la physiologie animale suite à des traitements thérapeutiques ne peuvent être remplacées actuellement par des méthodes alternatives ou in vitro. Tous les projets nécessitant l'utilisation de ces techniques pour évaluer les nouveaux traitements thérapeutiques en cour de test utilisent les modèles murins qui restent une source unique et indispensable permatant l'évaluation d'une amélioration histologique et fonctionnelle induite par les traitement testés. Les modèles de culture in vitro disponibles ne permettent pas de récapituler la complexité physiologique in vivo. Cette étude permettra d’inclure au sein d’un même projet un ensemble de techniques qui amènera à la réalisation d’une recherche plus complète et aboutie.

Réduction

Cette étude pilote utilise un nombre d’animaux restreint et donnera une meilleure estimation du nombre nécessaire d’animaux dans la réalisation de ces actes au sein des projets expérimentaux. Les souris utilisées seront celles issues de la reproduction de lignées et qui étaient vouées à l'euthanasie à cause de leur mauvais génotype (sans phénotype dommageable). 10 animaux par sexe pour les groupes "jeunes" et "adultes" et 12 animaux par sexe pour le groupe "agées" sont nécessaires pour maitriser parfaitement les techniques, déterminer la taille des cohortes appropriées, la fréquence des observations nécessaires à l’établissement d’un point limite. Ce nombre est également suffisant pour déterminer la variance des réponses entre les futurs groupes de traitement. Aucun test statistique ne sera utilisé pour cette étude. Le nombre total des animaux s'inscrivant dans ce projet est de 64.

Raffinement

L’ensemble des animaux sera hébergé en pièce de stabulation dans des portoirs ventilés. Ces pièces sont équipées de cycle jour/nuit permettant un cycle de réveil et de sommeil constant et sain pour l’animal. Ils auront accès à de la nourriture et de l’eau (système d’abreuvement automatique) à volonté. Les zootechniciens de l’animalerie s’occuperont du nettoyage de la litière une fois par semaine et mettra dans chaque cage de l’enrichissement (maisonnettes et lanières de papier kraft (nid)). La température et l’hygrométrie seront contrôlés quotidiennement. Les animaux sélectionnés seront au minimum 2 et maximum 5 par cage. Aucun animal isolé ne sera choisi pour ce projet. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long du projet en suivant la grille de scoring. Afin d’éviter le stress lors de la pléthysmographie, une séance d’entrainement est prévue deux jours avant. Suite aux 30 minutes d’anesthésie pendant l’échographie, seul un stress de réveil peut être ressenti par l’animal. Une semaine de stabulation sera appliquée afin de l’éviter au maximum. Si des douleurs légères post-opératoires (selon grille de scoring) sont observées après l'évaluation de la force de la flexion plantaire, une injection sous-cutanée d’analgésique sera réalisée.

Choix des espèces

La souris est le modèle commun le plus utilisé par les équipes de recherche, de l'animalerie expérimentale, œuvrant pour la recherche sur les maladies neuromusculaires. Les trois stades de développement chez les souris (jeunes/adultes/vieilles) ont été choisis afin d’expérimenter en fonction de la taille et du poids changeant des animaux, de comprendre les différents résultats obtenus pour chaque lot et de préciser les points limites pouvant être modifié avec l’âge.

Une hypoglycémie confirmée sur deux prélèvements successifs entraîne la mise à mort immédiate de la souris. 6 048 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent une modification génétique qui augmente le risque de tumeurs neuroendocrines, reçoivent une injection de tamoxifène, jusqu'à deux prélèvements sanguins et jusqu'à trois injections d'anti-inflammatoires en cas de douleur, avant une anesthésie terminale. Les mises à mort s'échelonnent à 3, 6, 12, 18 et 24 mois de vie pour prélever les organes, et l'effectif de 6 048 animaux repose sur une probabilité de phénotype tumoral estimée d'après la littérature, le porteur indiquant qu'il le réduira si l'effet observé dépasse son estimation.

Objectifs

La néoplasie endocrinienne multiple de type 1 (NEM1) est une maladie rare prédisposant à la survenue de plusieurs tumeurs du système endocrinien. Elle est due à des mutations du gène MEN1, codant pour la ménine. Notre hypothèse est que l’inactivation de Men1 dans des cellules dérivées de la crête neurale (CCN) favorise la tumorigénèse dans les sites endocriniens avoisinants. Notre objectif est de développer, de caractériser et de comparer les phénotypes tumoraux et hypophysaires de modèles murins présentant une inactivation du gène Men1 dans ces CCN à différents moments de leur différenciation pré- et post-natale, afin de déterminer le rôle de la crête neurale dans le développement des tumeurs hypophysaires. L’étude des autres lésions de la NEM1 dans nos modèles murins permettra de mieux connaître le rôle des CCN dans la tumorigénèse des patients.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet qu’il augmente nos connaissances sur le rôle des cellules dérivées de la crête neurale dans le développement tumoral hypophysaire, pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans ces tumeurs. Nous pensons que ce travail nous permettra de mettre en évidence des facteurs juxtacrines ou paracrines impliqués dans la prolifération et l’hypersécrétion hypophysaire. L’étude des autres lésions de la NEM1 dans nos modèles murins permettra de mieux connaître le rôle des CCN dans la tumorigénèse des patients. Ce travail original permettra de mieux comprendre l’expression et les conséquences des déficiences de la ménine et plus généralement la tumorigénèse hypophysaire, afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques translationnelles et actionnables.

Procédures

Les animaux seront soumis à: - Une modification génétique augmentant le risque d'apparition de tumeur neuro endocrinienne - Une injection unique intrapéritonéale de tamoxifène - Des potentiels prélèvements sanguins pour suivi de la glycémie (maximum 2/souris) - Des potentiels injections sous cutanées d'anti inflammatoires en cas de douleur (maximum 3 injections/souris)- Une anesthésie générale profonde terminale pour laquelle deux injections seront réalisées (une en sous cutanée et une intrapéritonéale)

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les individus seront susceptibles de développer des anomalies du système endocrine et neuroendocrine :( (adénome hypophysaire, hyperparathyroïdie primaire, tumeur neuroendocrine digestive (dont insulinome), tumeur surrénalienne, tumeurs testiculaires). Le risque de développer ces tumeurs chez les lignées que nous étudierons ne peut pas être prédit car seule une faible proportion des cellules de chaque souris portera la mutation. Les tumeurs liées à une déficience du gène Men1 sont le plus souvent bénignes et de croissance lente et donc peu susceptibles d’entraîner une souffrance, d’altération de l’état général ou de symptômes liés à la compression ou la mort des individus par des phénomènes de compression. Les animaux issus des certains croisements recevront une injection unique de tamoxifène, qui en dehors de l'inconfort lié à la contention et à l'injection, ne devrait pas induire d'effet indésirable.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort pour prélèvement d'organes.

Remplacement

Notre projet consiste en l’étude du rôle du microenvironnement dans la tumorigénèse hypophysaire et en particulier, du rôle des cellules dérivées de la crête neurale dans cette tumorigénèse, par leur rôle de soutien et leurs effets paracrines. Ces interactions ne peuvent être reproduites en culture cellulaire. Le modèle murin est le modèle de choix pour étudier ces mécanismes puisque : 1) Ce modèle a été validé dans la littérature 2) L’étude du phénotype endocrinien des individus n’est pas possible chez la drosophile et le zébrafish

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette procédure, nous avons choisi une approche statistique pour réduire au strict minimum le nombre d’animaux utilisés dans notre projet. Notre critère de jugement principal est un critère qualitatif : l’objectivation d’un phénotype tumoral hypophysaire. Nous avons estimé la probabilité d’observer ce phénotype en nous basant sur la littérature concernant les souris Men1 mutées hétérozygotes dans toutes les cellules. Néanmoins, si l’effet observé était plus fort que celui estimé nous réduirons le nombre de souris engagées dans chaque groupe.

Raffinement

Dès la naissance des animaux dans notre établissement utilisateur, nous porterons une attention au bien-être animal. Nous avons opté pour une méthode d’identification couplée au prélèvement pour génotypage, afin de réduire la douleur et le stress des animaux (prélèvement par poinçonnage à l'oreille). L’environnement sera enrichi en fonction des préférences des animaux à l’aide de bandelettes de kraft ou de dômes en carton ou de batônnets à ronger. La manipulation des animaux ne sera faite que par des personnes compétentes et sensibilisées à la manipulation à faible stress des rongeurs. Certains des modèles que nous allons utiliser n’ont pas été caractérisé d’un point de vue phénotypique. Nous allons donc procéder à des observations poussées des animaux et identifier, de la manière la plus précoce, l’apparition de signe de souffrance ou de détresse. Les tumeurs liées à une déficience du gène MEN1 sont le plus souvent bénignes et donc peu susceptibles d’entraîner la mort des individus par des phénomènes de compression ou d’envahissement métastatique. Pour certaines tumeurs extra hypophysaires, en particulier les insulinomes, l’hypersécrétion hormonale pourrait induire une hypoglycémie, que nous surveillerons par glycémie capillaire si des signes cliniques (tremblements, faiblesses musculaires) venaient à apparaître. En cas d’hypoglycémie, une supplémentation par une eau enrichie type DietGel ou un régime hyperénergétique seront mis en place. En cas d’hypoglycémie objectivée sur deux prélèvements successifs, la souris sera euthanasiée immédiatement. Les points limites seront revus régulièrement en discussion avec la Structure chargée du Bien Etre Animal (SBEA)

Choix des espèces

L’anatomie et la fonction de l’hypophyse et du système endocrinienne des souris et des hommes sont proches, les orthologues impliqués dans la tumorigénèse également. Les souris génétiquement modifiées sont des modèles reconnus d’étude de la tumorigénèse du système endocrine et de ses causes génétiques. Les animaux seront mis à mort à 3 mois de vie puis à 6 mois, 12 mois, 18 mois et 24 mois. Trois et six mois correspondent à des stades matures (post pubertaire) et donc pleinement fonctionnels de l’hypophyse auxquels nous pensons pouvoir mettre en évidence des différences biologiques reflets des interactions paracrines prétumorales entre CCN et cellules hypophysaires sécrétantes. Douze mois, 18 mois et 24 mois correspondent aux stades auxquels un phénotype tumoral peut être observé d’après la littérature concernant le phénotype des souris Men1+/-.

2 800 souris de 8 à 10 semaines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection de cellules tumorales sous la peau sous anesthésie générale, puis une irradiation stéréotaxique de la tumeur entière ou partielle, puis des injections d'immunomodulateurs tous les deux à trois jours pendant deux semaines. Le porteur ramène les nuisances de l'irradiation à la contention précédant l'anesthésie, qu'il qualifie de légère et très transitoire, et annonce des points limites précoces strictement appliqués. Il affirme qu'il n'existe aucune alternative non animale pour étudier la réponse des cellules immunitaires dans leur environnement tumoral, ce qui selon lui justifie le recours à des animaux vivants.

Objectifs

La radiothérapie est la thérapie ciblée permettant de traiter de façon curative des formes avancées de cancer. Plus d’un patient sur deux en bénéficie. L’efficacité de la radiothérapie s’explique par la mort des cellules tumorales qui dépend de la dose totale et de la dose par fraction. De plus, l’efficacité anti tumorale dépend aussi du système immunitaire de l’hôte ; Les progrès en immunologie ont révolutionné le pronostique de maladies métastatiques autrefois incurables et de nombreuses études montrent des combinaisons prometteuses entre radiothérapie et immunothérapie chez l’humain. L’administration de certains anticorps diminue nettement l’efficacité de la radiothérapie démontrant l’enjeu immunitaire. La réponse interféron radio-induite puis la sécrétion de cytokines et de médiateurs vont favoriser l’infiltration de cellules immunitaires pro tumorales ou anti tumorales par vagues successives. Mais la différence d’effet selon les sous-populations considérées reste inconnue. Différentes études précliniques montrent l’efficacité systémiques de la radiothérapie variant selon la dose et le fractionnement, l’effet immunitaire est plus important à des doses intermédiaires. Des études précliniques suggèrent l’intérêt de combiner une irradiation partielle et des immunomodulateurs. De plus, une analyse en sous-groupe d’une étude confirmant la bonne tolérance d’une combinaison de la radiothérapie stéréotaxique en 3 à 5 séances et d’un anti PD-L1 a montré que des patients dont les tumeurs étaient trop volumineuses pour être irradiées présentaient un contrôle tumoral similaire. Nous pensons que les cellules immunitaires infiltrées ont permis d’éliminer les cellules tumorales non irradiées. Ce projet a pour objectif l’analyse de la croissance tumorale puis de l’infiltrat leucocytaire intratumoral après différentes doses d’irradiation stéréotaxiques de la tumeur en entier ou en partie. Nous comparerons l’infiltration immunitaire en fonction de ces distributions de doses et en combinaison avec des immunomodulateurs.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont multiples. Tout d'abord il permettra de mieux comprendre les mécanismes associés aux combinaisons radiothérapie et immunothérapie. De plus projet permettra d'établir un rationnel fort de l'intérêt de réduire le volume d'irradiation afin de limiter la toxicité radio induite sans pour autant réduire le contrôle tumoral. Les applications potentielles sont importantes notamment pour présentant des tumeurs très mal placées et pour lesquelles des organes à risque sont limitants mais aussi pour des patients présentant des grosses tumeurs et pour lesquelles une réduction du volume pourrait être la bonne option thérapeutique.

Procédures

Des injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux : une injection par animal sous anesthésie générale, durée 2-3 minutes. L’injection des médicaments sera faite par la suite. La première injection aura lieu après l‘irradiation et sera renouvelée tous les 2 à 3 jours sur une période de deux semaines suivant l’irradiation., durée de chaque injection: 1 minute maximum sous anesthéie locale. Une irradiation de tumeur sera réalisée sous anesthésie générale pour tous les animaux chez qui la tumeur aura atteint la taille attendue, excepté pour le/les groupe(s) contrôle(s), durée 5-10 minutes. Après l’irradiation les souris sont placées en thermacage pour le réveil.

Impact sur les animaux

Des injections de cellules tumorales seront réalisées chez tous les animaux en sous cutanée. Les souris seront anesthésiées (isoflurane) et les cellules seront injectées avec une aiguille de petit diamètre (aiguille à insuline). Des effets indésirables chez les animaux seront occasionnés par l’injection des cellules tumorales et par la croissance des tumeurs : douleur tranistoire et légère après injection, gêne modérée lors de la croissance des tumeurs à une taille limitée. L'irradiation localisée n'entraîne pas de nuisances au-delà de la contention avant anesthésie générale, légère et très transitoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les prélèvements de tissus et tumeurs pour analyses ultérieures, ou pour respecter les points limites dans le cadre des études d'efficacité.

Remplacement

Dans sa globalité, ce projet a pour but d'objectiver et de comprendre comment une tumeur irradiée partiellement peut être traitée en association avec une molécule capable de réguler la réponse immunitaire. Les données obtenues sont primordiales pour pouvoir in fine passer à des applications potentielles chez l'homme. Dans ce projet les modèles animaux permettront d'étudier finement la relation entre la radiothérapie et l’immunothérapie dans un organisme vivant et intégré. Nous proposons d'étudier ceci sur plusieurs modèles de tumeurs afin de savoir si les mécanismes identifiés sont associés à des caractères oncologiques généraux. Il n’existe en effet pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales et des cellules immunitaires dans leur environnement tumoral, ce qui justifie l’utilisation d’animaux vivants dans cette étude.

Réduction

Les modèles animaux d’expérimentation pour l’étude des tumeurs implantées présentent un certain taux d’échec de prise de greffe (environ 20%) et sont, d’autre part, influencés par la physiologie des animaux, ce dont nous devons tenir compte pour établir les effectifs de souris par groupe. L’approche go/no go entre la procédure 1 et la procédure 2 va nous permettre également in fine de réduire le nombre d’animaux. Les effectifs ont été calculés en fonction des analyses qui seront faites par la suite (histologie, biologie moléculaire sur cellules uniques).

Raffinement

Nous avons mis en place des stratégies d'expérimentation et d'observation afin de réduire au minimum la souffrance et la douleur des animaux. Les souris seront hébergées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. De plus, l'environnement des animaux sera enrichi en permanence par du coton et des niches en carton afin de diminuer leur angoisse et favoriser leur bien-être. Les souris seront suivies quotidiennement et des mesures des tumeurs seront réalisés 3 fois par semaine à partir de l’injection des cellules tumorales. Les points limites précoces seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et elle est parmi les plus utilisées pour étudier les réponses immunitaires pendant le développement tumoral. Les outils (notamment les anticorps et le scRNA-seq) et les banques de données de référence (pour le scRNA-seq en particulier) sont très développés chez la souris. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez cette espèce en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui promeut et facilite le transfert des résultats obtenus vers des applications cliniques. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures pour ce type d’étude.

Comparer deux modes d'administration du pimobendane, en bolus ou en perfusion continue : 5 chiens sains sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sur deux périodes de 24 heures séparées d'une semaine, chacun reçoit un cathéter artériel posé sous anesthésie générale, puis subit 13 examens échographiques et 10 prélèvements sanguins, en cage individuelle tant qu'il porte le cathéter. Le porteur juge l'hypotension et les arythmies très peu probables chez le chien et prévoit malgré tout de les surveiller. Les 5 chiens sont gardés en vie pour être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont des affections fréquentes du chien âgé, particulièrement chez certaines races prédisposées. L’insuffisance cardiaque, lorsqu’elle survient, a un fort impact sur le confort des chiens et sur leur espérance de vie. Dans ses formes aigües, le traitement actuel repose sur l’administration de médicaments comme le pimobendane lors de la prise en charge du chien en clinique vétérinaire. En effet, le pimobendane est recommandé dans la prise en charge des insuffisances cardiaques congestives (ICC) du chien secondaire à une valvulopathie. Plusieurs études, réalisées chez des chiens sains, rapportent les effets hémodynamiques bénéfiques du pimobendane injectable : augmentation de la contractilité cardiaque, augmentation du débit cardiaque, réduction des résistances vasculaires systémiques et maintien voir légère augmentation de la pression artérielle. Chez l’homme, un médicament similaire au pimobendane, le levosimendan, est utilisé dans le traitement des ICC. En aigu, lors d’ICC, son utilisation est associée amélioration plus rapide des patients (notamment une disparition plus rapide des signes de congestion pulmonaire et une réduction de la fatigue de ces patients). Étrangement, malgré des propriétés similaires, les protocoles d’administration de ces médicaments sont très différents : - Chez l’homme, le levosimendan est administré en perfusion continue. - Chez le chien, le pimobendane est administré toutes les 12h. Il semble néanmoins que l’utilisation de doses plus importantes puissent être bénéfiques : d'après la littérature, les chiens recevant de plus grosses doses présentent moins de récidives d’épisodes congestifs. Nous souhaitons étudier l’efficacité de l’administration du pimobendane avec un protocole similaire à celui utilisé pour le levosimendan chez l’homme et comparer ce protocole à celui recommandé actuellement. L’administration d’une perfusion après un bolus pourrait permettre de maintenir une concentration plasmatique stable et donc des effets hémodynamiques constants, permettant probablement un meilleur traitement des signes de congestion. Afin de tester cette hypothèse, nous souhaitons réaliser une étude préclinique sur chien sains. Cette étude permettra de comparer les effets hémodynamiques des deux protocoles d’administration du pimobendane.

Bénéfices attendus

Les bénéfices concernent les chiens présentant une insuffisance cardiaque congestive. Si les résultats sont favorables, notre travail pourrait permettre d’améliorer la prise en charge de ces animaux et pourrait conduire à une modification des protocoles thérapeutiques d’administration du pimobendane lors de cette affection.

Procédures

L’essai se déroule sur deux périodes de 24 h déparées d’une semaine Pendant l’essai, le chien sera dans des conditions équivalentes à celle d’une hospitalisation en clinique vétérinaire, mais en plus, un cathéter artériel sera mis en place sous anesthésie générale. Le chien recevra le pimobendane par administration intra-veineuse lente (bolus) ou par perfusion. Il subira aussi 13 examens échographiques (10 à 15 minutes maximum) et 10 prélèvements sanguins (moins de 1-2 minutes). Le port du catheter artériel nous oblige à conserver les chiens en cage individuelle pendant chaque période de 24h.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : légère douleur à l'injection, inconfort et stress. Néanmoins, des effets secondaires décrits dans la littérature pour des molécules de la même famille que le pimobendane (comme le lévosimendan) chez l'homme, tels que l'hypotension artérielle ou des arythmies, sont possibles. Ces deux complications semblent très peu probables puisqu'elles n'ont pas été décrites chez le chien dans les études précédemment réalisées. Cependant, notre protocole prévoit de surveiller et d'anticiper ces complications.

Devenir

Les animaux seront gardés en vie à l'issue de leur procédure, afin de pouvoir être réutilisés, après avis du vétérinaire sanitaire et de la structure chargée du bien-être animal, prenant en compte un temps de repos suffisant, ainsi que leur état de santé et des possibilités de réutilisation.

Remplacement

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : légère douleur à l'injection, inconfort et stress. Néanmoins, des effets secondaires décrits dans la littérature pour des molécules de la même famille que le pimobendane (comme le lévosimendan) chez l'homme, tels que l'hypotension artérielle ou des arythmies, sont possibles. Ces deux complications semblent très peu probables puisqu'elles n'ont pas été décrites chez le chien dans les études précédemment réalisées. Cependant, notre protocole prévoit de surveiller et d'anticiper ces complications.

Réduction

Pour calculer le nombre d’animaux nécessaires, nous avons estimé que nous souhaitions mettre en évidence une augmentation significative du débit cardiaque de 25% dans le groupe perfusion, 12h après le début d’administration du pimobendane. Pour nos calculs, nous avons utilisé les valeurs de débit cardiaque publiées dans la littérature, ainsi que notre estimation de débit cardiaque moyen 12h après la première administration de pimobendane. Le calcul des effectifs a été réalisé grâce à un logiciel statistique et indiquait que 4 chiens étaient nécessaires. Nous avons fixé l’effectif à 5 chiens au cas où une complication conduirait à exclure l’un des chiens de l’étude.

Raffinement

Les chiens seront manipulés en prenant toutes les précautions pour limiter le stress et compenser les désagréments engendrés par le protocole. Ces chiens sont bien socialisés, régulièrement utilisés pour ce type de petites procédures, et très habitués à notre équipe. L'hébergement individuel est de courte durée, et les chiens sont en contact visuel, olfactif, auditif et même tactile au travers des barreaux des cages. Ils sont hébergés dans des cages équipées de litière et ils sont sortis en récréation toutes les 4 h pendant la journée, pendant 10 minutes. Toutes les pharses d'examen qui peuvent provoquer du stress sont accompagnées de la distribution d'une friandise, par du personnel entrainé à l'éducation canine.

Choix des espèces

L’étude est réalisée chez le chien car il s’agit d’une étude préclinique visant à optimiser la prise en charge thérapeutique d’une affection chez le chien. Ce seront des animaux adultes, nous avons choisi ce stade de développement parce que l’insuffisance cardiaque congestive apparaît chez l’adulte.

Humanisées par injection de cellules souches ou de globules blancs humains, les souris de ce projet développent une maladie du greffon contre l'hôte, les cellules humaines finissant par attaquer leur organisme. 1 240 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous anesthésie générale, jusqu'à deux administrations par jour pendant huit semaines, des prélèvements de sang au sinus rétro-orbital ou à la veine caudale, et une ponction intracardiaque terminale. Le porteur classe la maladie du greffon contre l'hôte en gravité modérée au motif que la perte de poids importante déclenche la mise à mort de l'animal avant la suite.

Objectifs

L'immunothérapie a révolutionné le traitement des cancers depuis 10 ans, avec des taux de survie à long terme sans précédent, mais ses bénéfices restent limités. La particularité de cette approche est qu'elle ne cible pas directement la tumeur comme les autres stratégies thérapeutiques (chimiothérapies, radiothérapie,…), mais vise à utiliser les cellules du système immunitaire pour défendre l’organisme en reconnaissant et détruisant les cellules cancéreuses grâce notamment à des anticorps qui vont réveiller le système immunitaire (anticorps inhibiteurs de points de contrôle immunitaire) ou obliger des cellules dites « tueuses » à attaquer directement les cellules cancéreuses (anticorps bispécifiques). Mais comme tous les types de tumeurs et tous les patients ne répondent pas ou deviennent résistants aux médicaments existants, il faut identifier de nouveaux traitements qui pourraient prolonger les réponses ou améliorer le taux de patients répondeurs. Il y a donc une demande importante de modèles expérimentaux plus prédictifs et pertinents, pour améliorer la compréhension des mécanismes impliqués dans la réponse ou la résistance aux immunothérapies actuelles, et permettant d’évaluer de nouveaux traitements immunothérapeutiques. La particularité de ces traitement nécessite l'utilisation de modèles expérimentaux spécifiques possédant des cellules immunitaires capables de détruire la tumeur. Pour cela nous projetons de travailler avec deux types de modèles souris humanisées qui sont des modèles de choix pour étudier les interactions entre cellules immunitaires et cellules tumorales humaines greffées conjointement: - des souris humanisées par injection de cellules souches capable de recréer un système immunitaire humain chez la souris; - des souris humanisées à l'aide de cellules immunitaires présentes dans le sang (appelées Leucocytes ou globules blancs)

Bénéfices attendus

Ce projet a donc pour objectif le développement de modèles de souris humanisées portant à la fois un système immunitaire humain et des tumeurs humaines nécessaires pour déterminer l'efficacité d'immunothérapies (anticorps thérapeutiques) développées ou en cours de développement dans un contexte préclinique. Ces modèles devraient permettre d'identifier et d'évaluer de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de valider de nouveaux anticorps dirigés contre ces cibles afin d'améliorer la prise en charge des patients pour lesquels il n'existe pas de solutions thérapeutiques à l'heure actuelle, et/ou d'apporter de nouvelles solutions thérapeutiques à des patients pour lesquels les traitements actuels sont insuffisants.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale réalisée sous anesthésie générale (greffe de tumeurs) qui dure 1 à 2 minutes. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées minimum 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale suivie jusqu’à 12 semaines. Les cellules immunitaires humaines servant à humaniser les souris seront injectées une seule fois. Selon les traitements expérimentaux, les animaux recevront au maximum 2 administrations quotidiennes pendant 8 semaines maximum. Des prélèvements de sangs seront effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques seront pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Suite à l’anesthésie et la chirurgie, des douleurs post-opératoires et un risque d’infection peuvent être attendus. Ces nuisances sont transitoires et peuvent donc être classées en modérées. Si ces nuisances devaient persister, elles déclencheraient l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite. Dans le cas de l’injection de cellules immunitaires humaines, les cellules humaines finissent par attaquer la souris, il s'agit de la 'maladie du greffon contre l'hôte' ou GvHD. Elle se manifeste quelques semaines après l’injection et se traduit d’abord par une perte de poids importante, puis une voussure dorsale et/ou une mobilité réduite. Cette nuisance peut être classée comme modérée dans la mesure où la perte de poids importante déclenche l’euthanasie de l’animal par atteinte d’un point limite.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur de tumeurs, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. Leur réutilisation n'est pas possible compte tenu des procédures expérimentales que ces animaux ont subies (greffe de tumeurs, injection de cellules immunitaires humaines).

Remplacement

La production de nouveaux traitements permettant de lutter contre le cancer nécessite la réalisation de tests pré-cliniques afin de valider leur effet antitumoral. De nombreuses lignées cellulaires originaires de tumeurs de patient ont été dérivées pour la réalisation de tests in vitro, et depuis quelques années l’utilisation de modèles cellulaires en '3D' (organoïdes) est en plein essor. Ces modèles sont très utiles mais sont plutôt utilisés en amont des tests sur les animaux dans le processus de développement de médicaments contre le cancer. Ces tests in vitro contribuent à une évaluation plus complète des candidats médicament et à une réduction de l'utilisation d'animaux dans la recherche. Cependant, il est difficile de remplacer entièrement les tests sur les animaux par des tests in vitro, d'une part car les tumeurs sont des environnements complexes et les tests in vitro ne capturent pas pleinement cette complexité. Dans le cas spécifique de ce projet utilisant des souris humanisées, il est nécessaire de pouvoir caractériser les cellules du système immunitaire capables d'infiltrer la tumeur et celles présentent dans la circulation pour comprendre l’impact d’un traitement sur les cellules immunitaires présentes et les cellules tumorales. Et ces interactions système immunitaire/tumeurs ne peuvent être évaluées de manière optimale qu'in vivo

Réduction

La connaissance parfaites des modèles de tumeurs utilisés dans ce projet permet de mettre en place une stratégie expérimentale n’utilisant que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats pertinents. Les traitements retenus pour ce projet auront été sélectionnés au préalable lors d’études de caractérisation poussées in vitro pour ne tester que des traitements potentiellement efficaces chez l'animal.

Raffinement

Lors de l’acte chirurgical, pour éviter le risque d’hypothermie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant. Afin d’éviter les risques d’infection en suite de chirurgie, un antiseptique (Biseptine®) sera appliquée sur la peau de l’animal préalablement à l’incision réalisée lors de la greffe. Les agrafes permettant de refermer l’incision après la greffe seront également aseptisées avec de la Biseptine®. Le matériel utilisé lors de la greffe (ciseaux, pinces, puces) sera préalablement stérilisé par autoclave. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. Si une sécheresse oculaire est observée lors des prélèvements, un protecteur oculaire (Ocry-Gel®) sera administré à l’animal.

Choix des espèces

On considère que passé l'âge de 6 mois (soit 26 semaines) les souris sortent de la catégorie "adulte mature" et commencent à montrer des signes de sénescence. Pour rester au plus près de cette catégorie d’adulte mature et du fait des contraintes de temps liées à l’utilisation d’animaux humanisés par injection de cellules souches, les animaux utilisés ne devront pas dépasser l’âge de 31 semaines. En effet, la période nécessaire au développement du système immunitaire étant de 12 à 13 semaines après injection des cellules sur des animaux de 4-5 semaines, les tumeur seront greffées sur des animaux de 17 à 19 semaines en fin de période d’acclimatation et la croissance tumorale suivie jusqu'à 12 semaines après la greffe, ce qui nous amène à un âge des animaux maximum de 31 semaines. Dans le cas des souris humanisées par injection de Leucocytes (ou globules blancs), les animaux utilisés seront tous des animaux adultes âgés de 6 semaines en fin de période d'acclimatation et âgés de moins de 13 semaines au moment de la greffe et la croissance tumorale sera suivie jusqu’à 12 semaines après la greffe. La durée de chaque procédure correspond donc au suivi de la croissance tumorale, elle est donc de 12 semaine maximum.

300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont identifiées par un trou dans l'oreille ou une puce sous-cutanée, gavées une fois par jour pendant dix-sept jours avec des souches probiotiques, infectées par Clostridioides difficile lors d'un gavage unique et rendues plus réceptives à la bactérie par une injection d'antibiotique. Le porteur annonce des diarrhées et une perte de poids, avec recueil quotidien des selles, la mise à mort finale servant à prélever les organes. Il conclut que le recours à l'animal est "indispensable" pour valider l'effet thérapeutique et qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du microbiote, tout en indiquant que la vérification in vivo est de toute façon exigible réglementairement.

Objectifs

Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie impliquée dans la plupart des cas de colites associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (24000 cas par an dont 14% de formes compliquée en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3%. Les ICD représentent également un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts associés à leur prise en charge particulière. C. difficile a ainsi été classée comme « menace urgente » dans le dernier rapport du centre de prévention et de contrôle des maladies portant sur les menaces liées à la résistance antibiotique. Trois molécules antibiotiques sont utilisées actuellement pour le traitement des ICD. Bien que généralement efficaces elles présentent des inconvénients tels que le risque de sélection de bactéries résistantes, coût important voir échec thérapeutique. En effet, les ICD sont caractérisée par un taux de récidive important de l’ordre de 20% avec parfois des récidives multiples particulièrement invalidantes pour les patients. Les antibiotiques font partie des molécules les plus prescrites dans le monde et il a été démontré qu’elles peuvent induire des modifications du microbiote. La perturbation du microbiote intestinal appelé dysbiose est un facteur de risque pour les ICD. En effet, l’implantation de ce pathogène est favorisée dans ce contexte. Il est donc capital de rechercher des thérapeutiques complémentaires/alternatives aux antibiotiques telles que les probiotiques permettant d’épargner/restaurer le microbiote dans le cadre de la prise en charge des ICD. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Il a ainsi été montré que les probiotiques pouvaient participer au rétablissement du microbiote intestinale et de ce fait restaurant son effet de barrière contre les pathogènes. A ce jour diverses souches bactériennes et différentes combinaisons de ces souches ont été testées avec des effets variables pour traiter et prévenir le risque d’ICD. Ce projet de recherche a pour objet de développer des stratégies de lutte contre la colonisation intestinale de C. difficile grâce à l’utilisation de probiotiques ayant diverses propriétés. En effet, les mécanismes d’action des probiotiques peuvent être divers et nous allons tester plusieurs stratégies.

Bénéfices attendus

Le développement de nouvelles stratégies de lutte contre ce pathogène permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque de récidives.

Procédures

Les souris seront identifiées par un trou dans l’oreille ou une puce insérée en sous-cutané avec un dispositif dédié aux rongeurs. Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale des souches probiotiques (1 gavage/jour pendant 17 jours) ou la souche de C. difficile (un gavage unique durant la procédure) et une injection d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection d’une durée de 10 secondes durant la procédure). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum), sur la durée de l'essai.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux sont de classe modérée. Elles incluent les actes expérimentaux d’identification, de gavage et l’unique injection d’antibiotique ainsi que les nuisances liées à l’infection par la bactérie C. difficile pour les groupes d’animaux qui y seront exposés comprenant des diarrhées et une perte de poids des animaux. Les méthodes d’identification (trou dans l’oreille, puce) essentielles pour suivre les animaux au cours du temps occasionnent également des nuisances.

Devenir

Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales nécessite l'euthanasie des animaux.

Remplacement

Plusieurs tests in vitro ont permis de sélectionner les souches probiotiques présentant une activité anti C. difficile intéressante. L'étape de vérification de leurs activités in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.

Réduction

Une planification statistique minutieuse basée sur les expériences passées du laboratoire et les publications scientifiques du domaine a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. En utilisant des logiciels statistiques spécifiques nous avons ainsi déterminé que pour pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 10 animaux par groupe seront ainsi nécessaires. Ainsi le nombre total d’animaux est de 300 pour minimiser le nombre d’animaux tout en préservant la validité statistique de l'étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques locaux permettant de limiter la souffrance des animaux lors des injection intrapéritonéales. Une procédure d’euthanasie anticipée est mise en place et des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Enfin, à terme, les souris seront identifiées par une puce insérée en sous cutanée permettant à la fois l’identification et le relevé de la température ». Le puçage avec relevé de température est une méthode nouvelle dans l’équipe permettant d’avoir un critère supplémentaire permettant d’objectiver l’état de santé de l’animal et pouvant constituer un point limite supplémentaire (fièvre ou hypothermie).

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.