Procédures modérées

1 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir dix séances d'imagerie et six mesures de tumeur, toutes sous anesthésie. Une tumeur leur est implantée sous la peau, puis viennent cinq injections dans le péritoine, une injection dans la circulation sanguine et une injection directement dans la tumeur, avant l'échauffement par nanoparticules magnétiques. Le porteur annonce comme bénéfice de "développer de nouvelles nanoparticules performantes pour l'hyperthermie magnétique", en une phrase, quand les nuisances décrites incluent nécrose, douleur, perte de poids et fatigue liée aux anesthésies répétées. Le choix de la souris tient à la sensibilité de l'imagerie optique sur petit animal et à un poids qui, entre huit et douze semaines, reste "raisonnable" pour la manipulation.

Objectifs

Les thermothérapies regroupent un ensemble de méthodes basées sur l’utilisation d'un dépôt de chaleur local à des fins thérapeutiques incluant le traitement des cancers. Elles sont actuellement utilisées pour traiter directement la tumeur et/ou pour aider l'action des radiothérapies ou chimiothérapies. L’hyperthermie magnétique fait partie des thermothérapies et elle est déjà utilisée en clinique. Cependant les nanoparticules utilisées à l’heure actuelle pour réaliser cette hyperthermie doivent être améliorées afin d’augmenter leur efficacité. L’objectif de ce projet est de tester de nouvelles formulations de nanoparticules magnétiques in vivo dans l’optique de les transférer à la clinique.

Bénéfices attendus

Développer de nouvelles nanoparticules performantes pour l’hyperthermie magnétique afin de traiter les tumeurs solides.

Procédures

Injection sous la peau de cellules : 1 minute, 1 fois, durée anesthésie 5 minutes. Injection dans le péritoine : 10 secondes, 5 fois. Injection dans la circulation sanguine : inférieur à 1 minute, 1 fois, durée anesthésie 2 minutes. Injection dans la tumeur : 30 secondes, 1 fois, durée anesthésie 1 min 30. Imagerie : 10 fois, durée anesthésie 10 minutes. Mesure des tumeurs : 6 fois, durée anesthésie 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection des cellules cancéreuses en sous cutané : infection au niveau du site d’injection. 2. La présence d’une tumeur : douleur, gêne occasionnée, nécrose. Perte de poids liée à la croissance tumorale. 3. Hyperthermie et suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention.

Devenir

Les souris seront euthanasiées car elles auront une tumeur sous-cutanée.

Remplacement

Nous souhaitons développer de nouvelles nanoparticules qui permettraient d’améliorer la thérapie des tumeurs solides par hyperthermie magnétique. Même si leur potentiel thérapeutique, leur validité et l’absence de toxicité seront testés en amont sur des modèles de cultures cellulaires ou d'organoides quand cela est possible, la finalité est le test sur des modèles in vivo avant d’envisager un passage en clinique.

Réduction

Les nanoparticules seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les nanoparticules validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de bioluminescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal. Chaque animal est son propre contrôle. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Pour les anesthésie de longues durée de l’ocrygel est utilisé pour éviter l'asséchement des yeux. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur selon une grille de score. En cas de léger mal être un antidouleur sera administré à l'animal et de la nourriture sera déposée directement au fond de sa cage pour plus d'accessibilité.

Choix des espèces

L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.

Une partie des souris utilisées est immunodéficiente et porte une greffe de peau humaine, le méningocoque n'interagissant qu'avec des vaisseaux humains. 1 145 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffe de peau de quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, infection par injection intraveineuse, injections intrapéritonéales d'anticorps et d'inhibiteurs, jusqu'à cinq ponctions veineuses : le porteur indique que l'infection peut provoquer une baisse d'activité, une perte de poids et une hypothermie, des points limites devant permettre de tuer les souris avant que l'infection ne le fasse. Le sang est ensuite prélevé par ponction dans le cœur sous anesthésie, l'analyse des vaisseaux et des organes exigeant leur mort à toutes.

Objectifs

La méningite et le purpura fulminans sont des infections bactériennes foudroyantes et sévères qui touchent principalement les enfants et les jeunes adultes. La mortalité approche 100% en l'absence de prise en charge médicale. En France, malgré une prise en charge adaptée, le taux de mortalité reste élevé : 3%pour les cas de méningite et 30% pour les cas de purpura fulminans qui se traduit par des plaques hémorragiques cutanées et un choc septique foudroyant. De plus, lorsque l’évolution n’est pas fatale, les séquelles sont fréquentes, graves et handicapent leur vie durant les jeunes patients atteints : amputations, troubles de la vision, perte partielle ou totale de l’audition, déficience mentale permanente, difficultés d’apprentissage, mémorielles, dépression nerveuse… Le purpura fulminans est un syndrome infectieux très sévère, qui associe une septicémie à des lésions tissulaires nécrotiques disséminées sur la peau et les organes internes. Ces infections sont complexes et impliquent plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme. Une étape essentielle de ces infections sévéres est l'infection des vaisseaux sanguins. La bactérie responsable de ces infections n’interagit qu’avec les vaisseaux sanguins humains, nous utiliserons donc une lignée de souris gréffées avec de la peau humaine (modèle mimant le purpura fulminans). Différents variants bactériens seront utilisés afin de déterminer l’importance de différents facteurs de virulence. Nous analyserons le rôle des cellules du système immunitaire dans ces infections. Nous chercherons également à valider in vivo les effets d’agents pharmacologiques préalablement validés in vitro .

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont importants, car mieux comprendre les mécanismes de la méningite cérébro-spinale et du purpura fulminans, pourra conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cela permettra à terme de diminuer voire supprimer la mortalité et les séquelles dramatiques de ces infections sévères et fulgurantes.

Procédures

Ce projet comporte 5 types d'intervention : - 1 Greffe de peau humaine, durée : 45 min. sous anesthésie générale - 2 : Infections expérimentales à méningocoque par injection intraveineuse, durée de 4h pour les souris NOD/SCID gréffées et 72h pour les souris Balb/c. une infection par animal - 3: Injection d’anticorps et d'inhibiteurs par voie intra-péritonéale (moins de 5 min) (deux injections par animal, 24 et 48h avant l'infection). Injection d’agents pharmacologiques en association ou non avec un antibiotique (moins de 5 min) (une injection par animal). - 4 : Mesure de la bactériémie chez les souris par ponction veineuse (moins de 5min). (une mesure pour les souris NOD/SCID; 5 pour les souris Balb/c)- 5 : Prélèvement de sang par ponction intracardiaque sur des souris anesthésiées avant leur mise à mort 3 min.

Impact sur les animaux

La greffe peut provoquer un stress lié à l’anesthésie. La greffe peut produire une inflammation ou une infection. L’infection peut provoquer un stress chez les souris se traduisant par une diminution de leur activité, une perte de poids ainsi qu’une potentielle hypothermie, la définition des points limites permet de mettre à mort les animaux avant la léthalité due à l'infection. L’injection d’agents pharmacologique peut produire un stress. La mesure de la bactériemie peut produire du stress lié à la manipulation et la contention.

Devenir

L'analyse de l'impact de l'infection et des traitements sur l'intégrité vasculaire et l'analyse de différents organes, nécessite la mise à mort de tous les animaux.

Remplacement

Ces infections sont complexes et impliquent plusieurs organes et systèmes physiologiques à l’échelle de l’organisme (cellules endothéliales, circulation sanguine, coagulation, système immunitaire…), c’est pourquoi notre étude nécessite le recours à un modèle animal. Il est impossible de mener une telle étude sur les modèles in vitro existants.

Réduction

Nous utiliserons pour chaque expérience le nombre minimal d'animaux permettant d'observer une différence significative en se basant sur des données publiées. Pour les comparaisons statistiques entre les groupes de souris, nous utiliserons un test adapté aux petits effectifs in vivo. Afin de réduire le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons développé des expériences permettant l'analyse de plusieurs paramètres sur un même animal, comme par exemple les analyses sanguines et les analyses sur les greffons de peau.

Raffinement

Pour réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des souris au cours de notre étude, de l’enrichissement sera ajouté dans chaque cage d’hébergement (coton et maison en carton) afin de limiter le stress des animaux. De plus, nous réaliserons les greffes sous anesthésie générale et des analgésiques seront utilisés en période péri- et postopératoire. L’analgésie per et post-opératoire sera réalisée par injection sous-cutanée d’un antalgique 30 min. avant la chirurgie et dans les deux jours suivants. Des points limites ont été définis et leur atteinte entraînera la mise à mort anticipée de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle d'infection à méningocoque largement décrit dans la littérature. Il permet d'obtenir une bactériémie reproductible et prolongée après infection par voie intraveineuse. Ce modèle sera utilisé pour analyser les effets de différents variants bactériens et agents pharmacologiques sur l’initiation et la progression des lésions tissulaires. Souris femelles adultes âgés de 7 à 10 semaines car il est nécessaire que ces souris présentent une surface corporelle suffisante pour greffer des fragments de peau.

Les rats reçoivent dans la vessie une instillation d'isothiocyanate d'allyle, principal composé de l'huile de moutarde, qui y provoque une inflammation sur laquelle l'établissement teste les candidats médicaments de ses clients. 1 500 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'instillation dure une trentaine de minutes sous anesthésie, la sensibilité abdominale est mesurée en appliquant des filaments de Von Frey pendant deux à trois minutes, et les animaux reçoivent des administrations quotidiennes de molécules dont le porteur écrit ne connaître "ni la nature ni les effets secondaires possibles". L'effectif ne repose sur aucun calcul statistique, le porteur invoquant son expérience pour fixer dix animaux par groupe et annoncer cinq études par an, soit 1 500 rats sur cinq ans.

Objectifs

L'inflammation joue un rôle important dans la plupart des pathologies de la vessie et représente une réaction de défense à une lésion physique, des substances chimiques, des micro-organismes ou d'autres agents pathogènes. Cette inflammation entraîne notamment une augmentation de la perméabilité vasculaire vésicale. Le projet proposé permettra d’évaluer l’effet de candidats médicaments sur l’œdème vésical et la douleur associée à l’inflammation. Dans la littérature, il est décrit que l’instillation intravésicale d’huile de moutarde ou de son principal constituant, l'isothiocyanate d'allyle (AITC) provoque une forte réaction inflammatoire dans les tissus de la vessie, entraînant une extravasation.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces que les molécules utilisées actuellement pour traiter les pathologies vésicales.

Procédures

Tous les animaux vont recevoir des administrations de candidats médicaments (voie, fréquence dépendant de chaque protocole expérimental mais des administrations quotidiennes per os, intrapéritonéales, sous-cutanées ou intraveineuses seront classiquement les plus utilisées). Cependant, ces gestes étant réalisé par du personnel qualifié et avec de l’expérience, ces gestes seront très rapides (1 min). Les animaux seront anesthésiés et recevront une instillation vésicale de produit irritant la vessie. Lors de cette procédure, les animaux seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées (classiquement instillation de 30 min). Les animaux seront placés dans un set-up de Von Frey et des filaments de différentes forces seront appliqués sur l’abdomen (au niveau de la vessie). Cette méthode est non invasive et est très rapide (environ 2-3 min par animal). Les animaux seront anesthésiés avec un anesthésique sans réveil car l’anesthésique utilisé est le seul qui n’a pas d’effet sur la contrcation de la vessie et auront des administrations de composés et des prélèvements sanguins (gestes très rapides 1-2 min).

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). De plus, ce modèle crée une inflammation vésicale donc les animaux pourront avoir les mêmes symptômes que chez l’Homme (sensation de « brûlure » lors des mictions, œdème vésical, gène pour uriner, mictions fréquentes…).

Devenir

L’anesthésique utilisé étant un anesthésique irréversible (l’animal ne peut pas se réveiller) tous les animaux de l’expérience sont mis à mort à la fin et des prélèvements de sang et des tissus seront réalisés.

Remplacement

Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum e 10 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre les groupes expérimentaux. Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Nous pensons réaliser 5 études par an avec un total de 1500 animaux pour 5 ans.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. De plus un enrichissement (type tunnel et aspen brick) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Toutes les procédures nécessitant une anesthésie des animaux se feront en utilisant des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie. Si un animal présentait un mauvais état général (prostration, perte de poids importante, pâleur, plaie…), celui-ci serait observé plus attentivement, soigné s’il avait une blessure et séparé de ces congénères si son état le nécessitait, réhydraté si besoin. L’accès à la nourriture pourra être facilité (directement dans la cage). Si après les premiers soins, son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

L’instillation intravésicale d’huile de moutarde ou de son principal constituant, l'isothiocyanate d'allyle (AITC) provoquant une forte réaction inflammatoire dans les tissus de la vessie chez le rat est très bien décrite dans la littérature. Nous utiliserons des rats âgés d’au moins 7 semaines afin d’avoir des jeunes adultes matures en accord avec la littérature.

Les souris utilisées ici ont un système immunitaire fonctionnel, à la différence des lignées immunodéficientes des modèles précédents du même laboratoire, ce qui constitue l'intérêt déclaré du projet. 252 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent une ouverture de la paroi abdominale de trente minutes pour que leurs embryons, à 12,5 ou 13,5 jours, reçoivent une injection suivie d'un champ électrique déclenchant la formation d'une tumeur, avec des douleurs modérées que le porteur attribue aux gestations interrompues. Les tumeurs obtenues sont ensuite greffées par stéréotaxie dans le cerveau de souris adultes, qui présentent ataxie, perte d'équilibre, prostration et amaigrissement avant d'être tuées pour la conservation des tissus tumoraux.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de mettre au point des modèles de souris génétiquement modifiés de Gliome Diffus pédiatriques de la ligne médiane (DMG). Les gliomes sont l'ensemble des tumeurs cérébrales, bénignes ou malignes, issues du tissu de soutien neuronal appelé la glie. Ces tumeurs sont universellement incurables à ce jour. Ceci est dû à la résistances importantes de ces tumeurs aux peu de traitements disponibles aujourd’hui. Elle sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs du cortex de l’enfant et il est nécessaire de pouvoir les étudier plus spécifiquement. Notre groupe a pu développer les premiers modèles in vivo au monde de Gliome Diffus de la ligne médiane à partir de biopsies de patients au diagnostic. Cependant, ces modèles présentent le défaut d'être développés dans des souris immunodéficientes. Nous avons deux objectifs finaux utilisant les modèles créés à l’aide de ces protocoles. D’une part, l'évaluation d'immunothérapies, de médicaments immuno-modulateurs ou de stratégies vaccinales afin d'éradiquer cette tumeur. Et d’autre part, l’étude des étapes précoces de la formation de la tumeur (oncogénèse) et le rôle du système immunitaire dans ce contexte.

Bénéfices attendus

Obtenir un modèle murin génétiquement modifié de DMG permettra de mieux comprendre les étapes précoces du développement de ces tumeurs, pour le moment encore inconnu. Cette compréhension permettra d’identifier les modifications précoces menant à l’apparition de cellules tumorales. L’induction de modification menant à des tumeurs dans des animaux ayant un système immunitaire compétant permettra l’exploration de nouvelles approches thérapeutiques, en prenant en compte l’environnement immunitaire de tumeurs, et tester ainsi des approches immuno-oncologiques (immunothérapie, médicaments immuno-modulateurs, stratégies vaccinales…).

Procédures

Les animaux femelles gestantes seront soumises à une intervention chirurgicale telle qu’une ouverture de la paroi abdominale (pour une durée de 30 minutes), précédés d’injections d’analgésiques et anesthésiques. Les embryons quant à eux auront des injections ainsi que l’utilisation d’un champ électrique (de moins d’une minute) menant à la formation de tumeurs. Ces futures tumeurs seront par la suite greffées dans des souris adultes, par stéréotaxie (sous anesthésie, avec une injection dans le cerveau d’une durée de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liées aux symptômes tumoraux et à la chirurgie. On pourra observer des symptômes neurologiques modérés qui sont fréquemment observés en présence d’un volume tumoral conséquent (ataxie), perte d'appétit et donc perte de poids, prostration des animaux, perte d’équilibre. Chez les mères, on pourra également constater des douleurs modérées dues à des gestations interrompues.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour conservation et analyse de tissus tumoraux post-mortem.

Remplacement

Une singularité des gliomes de la ligne médiane (composée du thalamus, du pont et de la moelle épinière), résulte de leur phénotype systématique d’infiltration des structures de la ligne médiane dans un premier temps, puis plus largement de tout le cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur environnement qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite. De plus, la barrière hématoencéphalique, qui isole le cerveau du reste de l’organisme, est une limitation très importante dans le traitement de cette maladie (barrière non rompue) et il est nécessaire de développer des modèles de greffes afin d’évaluer une nouvelle médication avant les phases cliniques. Les molécules médicamenteuses potentiellement identifiées par la suite serons testées sur des modèles de cultures cellulaires afin de limiter leur toxicité lors du traitement des animaux, en déterminant des concentrations et une posologie adéquat. Une des perspectives de ce projet, est également d’étudier le système immunitaire dans toute sa complexité, ce qui n'est possible que dans un animal vivant.

Réduction

Nos souris vont être suivies par bioluminescence. Ce suivi longitudinal permet d’éviter l’ajout d’animaux supplémentaires à sacrifier au cours de l’étude pour avoir des informations sur la présence ou non de tumeur. Cela permet donc de diminuer le nombre des animaux par procédures. Le nombre d'animaux a été déterminé par calcul de puissance, et les résultats seront étudiés par analyse de variance.

Raffinement

Pour limiter la souffrance liée, premièrement à la chirurgie , les femelles gestantes recevront une injection d’antalgique avant et après la chirurgie, puis une autre injection le lendemain. Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale pour limiter la douleur et le stress des animaux. La température de l’animal est maintenue grâce à une plaque chauffante durant la chirurgie et le réveil. Des injections de sérum physiologique à la température de l’animal sont réalisées avant et après la chirurgie pour maintenir l’hydratation de l’animal. Un gel oculaire est également utilisé pour éviter la sécheresse oculaire ainsi que de la Betadine pour éviter tout risque d’infection. Suite à la chirurgie, les femelles sont placés seuls dans une cage chauffée le temps de leur réveil complet (+/-2h) et seront par la suite replacés en hébergement en groupe où ils reçoivent nourriture et boisson ad libitum. Pour limiter la souffrance liée à la progression tumorale chez les jeunes souris injectées, les animaux seront pesés plusieurs fois par semaine et observés tous les jours pour surveiller les signes cliniques. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

L'utilisation de souris ayant un système immunitaire est ici essentielle pour la poursuite de ce projet. De plus, ce modèle, déjà établi, a été réalisé chez la souris . Des femelles âgés de minimum 7 semaines seront mises en accouplement, ce qui correspond à l’âge du jeune adulte possédant les meilleures capacités de reproduction et ceci jusqu’à la limite de leurs capacités de reproduction, à partir de 8 mois. Les embryons seront injectés au jour embryonnaire 12.5-13.5. Lors de la greffe, les souris seront agées de 6 semaines au minimum.

Nourries pendant douze semaines avec un régime riche en graisses jusqu'à peser environ le double d'une souris témoin, mises à jeun six heures une fois par mois, gavées de boissons trois fois par semaine pendant six semaines, 64 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une goutte de sang est prélevée à leur queue tous les quinze jours pendant trois mois pour mesurer leur glycémie. Le porteur reconnaît que l'obésité induite réduit leur mobilité, peut dégrader leur toilettage jusqu'à l'alopécie et provoquer une polyurie, et prévoit de changer leur litière deux fois par semaine à cause des souillures. Toutes sont tuées par ponction cardiaque pour prélever le maximum de sang et neuf tissus, dont le cœur, le foie, le cerveau et le contenu du cæcum, l'objet du projet étant de tester l'effet prébiotique de tisanes de plantes médicinales réunionnaises.

Objectifs

Le projet vise à évaluer les effets prébiotiques et anti-diabétiques de tisanes riches en polyphénols de plantes médicinales réunionnaises chez un modèle de souris obèse. Ce projet s’insère dans un programme de recherche visant à développer des thérapies innovantes contre l’obésité et l’état diabétique associé qui sont des problèmes de santé publique majeurs dans le Monde. En effet, l’accumulation de graisses causant l’obésité engendre des désordres métaboliques et inflammatoires conduisant à une résistance à l’insuline et au diabète de type 2. L’obésité s’accompagne également d’une dérégulation des communautés bactériennes du microbiote intestinal, appelée dysbiose, et d’une perméabilité de la barrière intestinale. Il en résulte une translocation dans le sang de composés bactériens comme des endotoxines de type lipopolysaccharides (LPS) et des métabolites comme la triméthylamine métabolisée en oxyde de triméthylamine (TMAO) par le foie. Ces métabolites d’origine bactérienne atteignent des organes métaboliquement actifs tel que le tissu graisseux et aggravent l'inflammation, la résistance à l'insuline et l’état diabétique au cours de l’obésité. Des études montrent que la réduction de la dérégulation du microbiote intestinal par des agents prébiotiques naturels comme les fibres et les polyphénols végétaux, diminue le risque de complications de l’obésité. En effet, les prébiotiques sont des composés utilisés comme substrats nutritifs par des communautés bactériennes spécifiques et sont en faveur de leur croissance. Notre hypothèse de recherche est que les polyphénols contenus dans des tisanes, servent de substrats aux bactéries intestinales et protègent contre la dérégulation du microbiote intestinal liée à l’obésité. Pour vérifier cette hypothèse, notre projet a pour but d’évaluer pour la première fois la capacité de tisanes riches en polyphénols issues de deux plantes médicinales réunionnaises à exercer une action prébiotique sur les bactéries intestinales chez un modèle de souris obèses. De plus, le projet vise à déterminer l’impact des tisanes riches en polyphénols sur la production de métabolites bactériens de type LPS et TMAO, pour limiter le développement de l’état inflammatoire et diabétique des souris obèses.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : - d’ordre scientifique et médical : la preuve du lien entre les métabolites bactériens et les désordres métaboliques et inflammatoires au cours de l’obésité contribuera à l’apport de nouvelles connaissances sur le rôle de la dysbiose du microbiote intestinal comme facteur de risque et cible thérapeutique potentielle. De nouvelles perspectives thérapeutiques utilisant des prébiotiques pourront être développées pour la prise en charge de patients en situation d’obésité et à risque diabétique. - d’ordre biotechnologique : la preuve de l'efficacité de thérapies riches en polyphénols de plantes médicinales visant à améliorer la composition du microbiote intestinal, à moduler la production de métabolites bactériens atteignant les tissus métaboliquement actifs et à réduire les troubles métaboliques comme le diabète au cours de l'obésité permettra de valoriser le potentiel nutrition-santé de ces molécules naturelles issues de la biodiversité végétale.

Procédures

Les nuisances prévues sont associées à 4 types d'interventions chez les animaux : 1- Prélèvement d’une goutte de sang au niveau de l’une des veines latérales de la queue pour la mesure de la glycémie (durée 1 min, 1 fois tous les 15 jours pendant 3 mois, 8-10 µL). 2- Gavage de boissons (durée 2 min, 3 fois par semaine pendant 1,5 mois). 3- Gavage d’une solution de glucose pour le test de tolérance au glucose (durée 2 min, 1 fois par mois pendant 3 mois). 4- Ponction cardiaque terminale sous anesthésie générale (euthanasie, durée 2 min).

Impact sur les animaux

Le régime riche en graisses provoque une augmentation du poids/état d’obésité des souris générant des contraintes physiques (mobilité réduite/inactivité, diminution possible de toilettage/alopécie, modification des fécès, polyurie) voire psychologiques (stress/angoisse), engendrant une augmentation de la souillure des litières. Pour détecter ces possibles effets indésirables et garantir au mieux le bien-être des animaux, un suivi quotidien du comportement des animaux, et de leur poids et de leur prise alimentaire toutes les semaines sera effectué. Le test oral de tolérance au glucose réalisé une fois par mois va induire un stress vu que les souris seront mises à jeun pendant 6 h pour évaluer l’hyperglycémie provoquée. Les mesures de glycémie seront réalisées grâce à un glucomètre à partir d’une goutte de sang prélevée par ponction au niveau d’une des veines latérales de la queue, après application sur la queue d’une crème analgésique. Pour limiter le stress et la douleur, les manipulations seront réalisées par un personnel habilité et dûment expérimenté. L’étape de gavage des boissons prévue 3 jours par semaine pendant 6 semaines peut aussi induire un état de stress chez les animaux. Pour limiter ce stress, les manipulations seront réalisées par le même personnel habilité et expérimenté. Un suivi quotidien du comportement des animaux et une mesure de leur poids et de leur prise alimentaire toutes les semaines permettront de détecter des possibles effets indésirables afin de garantir au mieux le bien-être des animaux.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer chez les animaux un volume de sang maximal ainsi que différents tissus (tissu adipeux sous-cutané et épididymal, foie, coeur, crosse aortique, cerveau, caecum et contenu cécal) qui sont requis pour réaliser des dosages de marqueurs métaboliques et inflammatoires circulants permettant de caractériser l’état diabétique des souris.

Remplacement

Au laboratoire, nous développons des études mécanistiques sur modèles in vitro de cellules graisseuses, sur lesquelles des composés bactériens et polyphénols végétaux sont testés. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de mimer la complexité de l’organisme vivant, avec les échanges inter-organes impliqués dans le métabolisme énergétique comme entre l’intestin, le tissu graisseux et le foie, ni de mesurer la bioaccessibilité tissulaire des métabolites bactériens et des polyphénols en condition d’obésité. Il est aussi question d’évaluer l’impact du régime obésogène associé aux boissons à potentiel prébiotique sur la composition du microbiote intestinal et l’état inflammatoire des souris en situation d’obésité. Seul un modèle animal permet de reproduire ces conditions physiopathologiques liant dysbiose du microbiote intestinal, obésité et complications métaboliques et inflammatoires. L’utilisation d’animaux vivants permet d’évaluer l’efficacité de la stratégie nutritionnelle envisagée à base de molécules prébiotiques et anti-diabétiques, car celles-ci nécessitent un métabolisme dans le tractus digestif par les bactéries puis une absorption intestinale pour un impact sur les échanges métaboliques inter-organes intestin-foie-tissu graisseux impliqués dans la pathologie de l’obésité et l’état diabétique qu’elle engendre. Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour tester notre hypothèse de recherche selon laquelle les polyphénols de tisanes issues de plantes médicinales pourraient exercer des effets prébiotiques et anti-diabétiques dans le contexte de l’obésité.

Réduction

Au laboratoire, nous disposons uniquement de souris transgéniques ne permettant pas la réutilisation d’animaux. Les expériences seront conçues en utilisant le moins d’animaux possible, tout en permettant de réaliser des études statistiques exploitables. Une approche statistique a permis de déterminer qu’il faut au moins 8 souris par groupe pour atteindre des résultats significatifs. Pour comparer les effets du régime alimentaire standard et du régime riche en graisses, supplémenté ou pas par une des deux tisanes ou par des fibres alimentaires, le projet impliquera 8 groupes de 8 souris, soit un total de 64 souris. Cet effectif prend aussi en compte les études précédentes du laboratoire ayant mesuré la variabilité des expérimentations visées et établi le nombre d’animaux nécessaire pour atteindre une puissance statistique permettant de valider l’hypothèse de recherche testée.

Raffinement

Les souris seront placées dans des conditions optimales, au nombre de 4 par cage maximum, et l’atmosphère contrôlée en température, humidité, lumière, ambiance sonore. Les animaux bénéficieront d’un accès facilité à la nourriture et à l’eau, et d’un enrichissement de leur environnement pour favoriser leur comportement naturel et limiter leur stress et anxiété. Les animaux seront séparés en cas de bagarre ou de barbering important. Le change des litières sera effectué une fois par semaine et adapté à 2 fois par semaine pour les souris en situation d’obésité en cas de souillures plus fréquentes. Dans un objectif de respect du bien-être animal et de réduction de la douleur, les mesures seront prises telles qu’une habituation des souris par un personnel habilité et expérimenté ainsi que l’utilisation d’anesthésie générale par inhalation d’isoflurane 2% et d’administration de buprénorphine (0,05 mg/kg) lors des expérimentations. En cas d’atteinte d’un point limite strict, une mise à mort par dislocation cervicale sera effectuée.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé pour les expérimentations in vivo. Les procédures, les manipulations, l’évaluation de la douleur ou de la souffrance sont par conséquent bien établies. Les souris C57BL/6 sont choisies car c’est un modèle sensible au développement de l’obésité et du diabète de type 2 induit par un régime riche en graisses. De plus, la littérature évoque chez ces souris la présence d’un microbiote intestinal et la production de métabolites bactériens comparables à ceux détectés chez l’homme, de par l’existence de principaux phyla bactériens (Actinobacteria, Bacteriodetes, Firmicutes, Proteobacteria) qui permettent d’évaluer la dysbiose du microbiote intestinal causé par le régime obésogène. Ce modèle animal est donc idéal pour la réalisation de notre projet et l’ensemble des procédures est maîtrisé sur ce modèle, notamment au laboratoire. Les 64 souris C57BL/6 utilisées seront des souris mâles (32) et femelles (32) âgés de 10 semaines au démarrage de l’étude qui durera ensuite 12 semaines. La pathologie de l’obésité et l’état diabétique qu’elle engendre touchent principalement les adultes, il est donc indispensable d’avoir des animaux de cet âge afin de donner une perspective thérapeutique à ce projet de recherche. Nos résultats antérieurs issus de projets similaires ont été obtenus à ces stades de développement des animaux, ce qui permet de réaliser des analyses comparatives dans le but de limiter le nombre d’animaux. Poids d’une souris nourrie avec un régime équilibré standard (ND) : environ 20-25 g. Poids d’une souris nourrie avec un régime riche en graisses (HFD) : environ 45-50 g.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection intramusculaire d'une formulation de nanoparticules lipidiques et trois injections dans le péritoine, puis des séances répétées d'imagerie sous anesthésie, le porteur citant comme nuisances une infection possible au point d'injection, de la douleur, une inflammation et la fatigue liée aux anesthésies répétées. L'ARN messager injecté ne code aucun principe actif mais une protéine luminescente, servant seulement à visualiser où les nanoparticules se rendent. Le bénéfice avancé se limite à "évaluer le potentiel" de nouvelles formulations dans l'optique d'améliorer les vaccins à ARN, quand les atteintes décrites sont, elles, immédiates.

Objectifs

L’objectif est de tester différentes formulations de nanoparticules lipidiques qui pourraient être utilisées pour la fabrication de vaccin. Afin de visualiser l’efficacité des nanoparticules, un ARN messager permettant l’expression d’un rapporteur d’imagerie sera utilisé dans les formulations.

Bénéfices attendus

Evaluer le potentiel de nouvelles formulations de nanoparticules lipidiques dans l’optique d’améliorer les vaccins ARN.

Procédures

Injection dans le muscle des formulations : 30 secondes, 1 fois. Injection dans le péritoine : 10 secondes, 3 fois.

Impact sur les animaux

Les nuisances peuvent provenir de : 1. L’injection intramusculaire : infection au niveau du site d’injection, douleur, inflammation. 2. Suivi en imagerie : fatigue et stress liés aux anesthésies répétées, stress lié à la contention.

Devenir

Nous envisageons de prélever des organes après l'euthanasie afin de faire des tests complémentaires.

Remplacement

L’objectif est de développer de nouvelles formulations de nanoparticules lipidiques qui pourraient être utilisées pour la fabrication de vaccin . Même si les formulations seront validées en amont sur des cultures cellulaires, la finalité est le test sur des modèles in vivo avant d’envisager un passage en clinique.

Réduction

Les formulations seront préalablement testées et validées in vitro avant d’être injectées à l’animal. Seules les formulations validées seront utilisées. Le suivi se fait par imagerie de bioluminescence qui est une technique d’imagerie non invasive permettant de faire un suivi du début à la fin sur un même animal ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque animal est son propre témoin. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique.

Raffinement

Les souris seront acclimatées pendant 7 jours après leur arrivée dans l’animalerie. Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (tunnel, maison, paille) sur un portoir filtrant. Les étapes du projet sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l’anesthésie l’animal est maintenu sur un tapis chauffant. Les animaux sont surveillés par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur. En cas de léger mal être un antidouleur sera administré à l'animal.

Choix des espèces

L'imagerie optique est plus sensible et facilement réalisable sur le petit animal tel que la souris. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 et 12 semaines. A cet âge les souris ont un poids et une taille raisonnable permettant leur manipulation.

900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, chacune reçoit une injection de cellules de carcinome pulmonaire sur le flanc, puis des administrations répétées de principes actifs, son poids et le volume de sa tumeur étant mesurés deux fois par semaine pendant quatre semaines à six mois. L'hypothèse testée est qu'un vaccin à ARN messager dirigé contre les cellules souches cancéreuses empêche la formation de tumeurs bronchiques, les essais chez des personnes à haut risque restant renvoyés au conditionnel. Le porteur justifie le choix de l'espèce par le "souci d'utiliser un nombre minimum d'animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique", et retient une implantation sur le flanc, décrite comme moins douloureuse qu'une greffe dans le poumon.

Objectifs

Le cancer bronchique est la première cause de mortalité par cancer toutes populations confondues (33 100 décès en France en 2018). Il constitue la première cause de décès chez l’homme entre 45 et 64 ans. Il s’agit du deuxième cancer le plus fréquent chez l’homme parmi les tumeurs solides (31200 nouveaux cas ; 22800 décès en 2018) et le troisième chez la femme (15100 nouveaux cas ; 10300 décès en 2018). Le pronostic associé au cancer bronchique demeure sombre, avec une survie à cinq ans de moins de 5%. Les données de la recherche convergent vers l'idée que les cellules souches cancéreuses (CSCs) sont responsables de l'échappement pharmacologique et de l'échec thérapeutique. L'hypothèse émise pour ce projet est que la mise en place d'une vaccination prophylactique à ARN messager (ARNm) contre les CSCs, en ciblant ces protéines anormales produites par ces CSCs, permettra de freiner, voire d'empêcher la formation de tumeurs bronchiques. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer l'efficacité d'un vaccin à ARNm prophylactique ciblant les CSCs pour empêcher la formation de tumeurs bronchiques.

Bénéfices attendus

Un vaccin contre le cancer bronchique représenterait une avancée majeure en termes de santé publique et suscite de ce fait beaucoup d'intérêt et de recherche. En cas de résultats positifs, ce projet déboucherait sur des études cliniques testant ce même vaccin à ARNm chez l’homme, chez des patients à haut risque de cancer bronchique. Le développement d'un vaccin contre le cancer du poumon reste un objectif ambitieux, mais les bénéfices potentiels justifient largement les efforts de recherche en cours. Une telle avancée pourrait transformer le paysage de la prévention et du traitement du cancer du poumon, améliorant considérablement les perspectives de santé pour des millions de personnes dans le monde.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, les souris subiront les interventions suivantes : - L’induction des tumeurs se fera selon une procédure d’injection d’une suspension de cellules tumorale, réalisée sous anesthésie. L’intervention dure environ 10 minutes et n’est réalisée qu’une seule fois. - Une administration préventive ou curative de principes actifs évalués, en aigu ou chronique, qui sera délivrée aux souris vigiles ou anesthésiés selon une voie d’administration en adéquation avec les propriétés pharmacodynamiques et pharmacocinétiques du principe actif. Un suivi du poids des souris ainsi que de l’évolution des diamètres et volumes tumoraux dont les données seront récoltées 2 fois par semaine à partir de l’injection des cellules tumorales jusqu’à la mise à mort des animaux. - La durée totale du suivi est comprise entre 4 semaines et 6 mois. Des prélèvements d’organes et de sang total ainsi que des tumeurs seront effectués à la fin de l’étude après euthanasie des animaux pour évaluer les effets des traitements sur certains tissus ou afin d’évaluer des biomarqueurs.

Impact sur les animaux

Bien que l’injection de cellules tumorales soit réalisée sur des animaux anesthésiés, une sensation d’inconfort peut apparaître chez la souris après cette procédure. De même, l’administration des composés peuvent entraîner un stress et ou une sensation d’inconfort chez les souris. Enfin, le développement de la tumeur au cours du temps ainsi que la manipulation des souris afin de mesurer la taille des tumeurs peut constituer une source d’inconfort et de stress chez les souris.

Devenir

Les animaux seront injectés en sous-cutané par une suspension de cellules cancéreuses. L’efficacité des nouveaux traitements va être évalués par l’analyse de l’évolution de la taille des tumeurs sur les animaux vivants, ainsi que les différents prélèvements de sang, d’organes ou de tumeurs obtenu une fois les animaux euthanasiés. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l’étude.

Remplacement

Afin de proposer une thérapie vaccinale chez l’homme, il est important de démontrer l’efficacité thérapeutique des candidats vaccin dans un modèle pré-clinique pertinent chez l’animal. Les modèles in vitro ne suffisent pas seuls à évaluer l’efficacité de ces traitements. Le modèle syngénique de progression tumorale permet d’étudier l’efficacité d’interventions thérapeutique dans un contexte de système immunitaire compétent, ce qui se rapproche le plus de la pathologie humaine. De plus, le traitement prophylactique envisagé dans cette étude vise des cibles thérapeutiques qui sont à la fois présente chez la souris et chez l’homme, augmentant ainsi la pertinence du modèle choisi.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaires à ce projet a été calculé de manière à minimiser le nombre de souris tout en assurant des résultats robustes sur le plan scientifique et statistique. Le modèle animal ainsi que le protocole expérimental choisis permettent une faible variabilité inter-individuelle, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à une interprétation fiable des résultats. Enfin, une réduction du nombre d’animaux en testant plusieurs doses à la fois sera mise en place lorsque cela s’avèrera possible, afin d’éviter des tests en doublon pour les groupes non traités ou traité par molécule de référence.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible : - Les souris sont hébergés à au moins 3 souris par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de frisure de papier pour leur permettre de nicher et de bûchettes de peuplier pour ronger. - Un suivi quotidien de toutes les souris sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). - Des points limites sont fixés afin que les zootechniciens puissent signaler aux responsables des soins et du projet l’apparition des critères nécessitant les traitements nécessaires pour arrêter les souffrances. - L’administration de traitements ainsi que l’injection de cellules tumorales se font sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Le choix du modèle animal est guidé par le souci d’utiliser un nombre minimum d’animaux, les moins sensibles du point de vue neurophysiologique et présentant le maximum de chance d’obtenir des résultats satisfaisants. Les souris sont ainsi le modèle le plus utilisé en recherche et notamment dans le domaine du cancer. Le choix modèle de souris syngénique de CBNPC (modèle C57BL/6), inoculée avec la lignée Lewis Lung Carcinoma a été réalisé car présentant plusieurs avantages dont : - L’utilisation d’une lignée cancéreuse syngénique (pas de rejet des cellules greffées) ainsi que la présence d’un système immunitaire fonctionnel (souris C57BL/6 non immunodéficiente) sont des conditions sin qua non à l’étude d’efficacité d’un composé vaccinal. - L’induction de tumeur au niveau d’un site ectopique (sur le flanc de la souris) est modèle expérimental est très bien décrit dans la littérature, est relativement simple à mettre en place et présente moins de risque d’induire de la souffrance comparé aux modèles par injection orthotropique. - L’utilisation de souris consanguines C57BL/6 permet de réduire la variabilité inter-individuelle et de diminuer ainsi le nombre d’animaux utilisés. Des souris adultes de plus de 8 semaines seront employées, âge auquel les organes sexuels sont à maturité pour les deux sexes. Ce choix est justifié par la littérature scientifique.