Procédures modérées

Tuées quand elles ne portent pas la mutation recherchée, quand elles sont trop âgées pour la reproduction ou quand elles n'ont plus donné de portée depuis deux mois, même sans aucun signe de mal-être, 8 500 souris vont être utilisées dans un élevage de six lignées génétiquement modifiées. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. À trois ou quatre semaines, l'extrémité de la queue de chaque petit est coupée aux ciseaux pour vérifier la présence de la mutation, et certaines lignées développent des tumeurs à partir de deux mois. L'établissement affirme que seul un animal vivant et entier permet d'étudier la réponse immunitaire, et présente ce projet comme la fourniture d'animaux à d'autres protocoles déjà autorisés.

Objectifs

Les syndromes myélodysplasiques (SMD) marquent une étape préalable à la leucémie, caractérisée par une moelle osseuse défaillante qui entraine une production insuffisante de cellules sanguines saines. Lorsque des mutations génétiques perturbent le renouvellement, la multiplication et la maturation des cellules souches (= cellules à l'origine de toutes les cellules du sang) dans la moelle osseuse, cela conduit à la leucémie myéloïde aigue (LAM). Parmi les mutations décrites dans la littérature scientifique, nous nous intéressons tout particulièrement à deux d'entre elles pour lesquelles nous disposons de souris génétiquement modifiées (modifications génétiques reproduisant celles observées chez les patients atteints de ce type de cancer). Notre projet consiste à identifier (mise en place d'une boucle numérotée à l'oreille) et à vérifier la présence des modifications génétiques chez ces souris afin de disposer d'animaux pouvant ensuite être inclus dans des projets de recherche faisant l'objet d'une autorisation délivrée par les instances.

Bénéfices attendus

Les modèles murins utilisés sont essentiels pour comprendre les mécanismes impliqués mais aussi pour évaluer le développement de nombreuses pathologies comme dans notre projet SMD/LAM. Cela pourrait nous permettre d’ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques en testant des drogues et ce, pour aider les patients souffrant de ces maladies souvent encore incurables.

Procédures

Ce projet consiste en l'élevage de 6 lignées de souris génétiquement modifiées. Afin de caractériser les souris, issues des différents croisement, exprimant les gènes modifiés, l’extrémité de la queue (moins de 5 mm) sera coupée à l’aide de ciseaux fins, parfaitement aiguisé et préalablement désinfectés. Ce geste, réalisé à l'âge de 3-4 semaines, est très rapide et ne dure pas plus de quelques secondes. Ce fragment de tissu permettra d'obtenir l'ADN de la souris et ainsi s'assurer de la présence de la mutation génétique d'intérêt. Certaines lignées de souris peuvent développer des tumeurs (à partir de l'âge de 8-9 semaines). Nous réaliserons donc un suivi clinique une fois par semaine afin de détecter l'apparition de ces pathologies, se caractérisant par un affaiblissement général de l'animal.

Impact sur les animaux

L’incision de l’extrémité de la queue (moins de 5mm) nécessite une contention de courte durée, pouvant entrainer un stress, et peut conduire à une légère perte de sang. Une partie des animaux génétiquement modifiés peuvent développer (à partir de l'âge de 8-9 semaines) des tumeurs conduidant à un affaiblissement général.

Devenir

Les animaux comportant la mutation d’intérêt seront utilisés pour de la reproduction, le prélèvement de tissus post- mortem ou seront utilisés dans d’autres procédures expérimentales validées et autorisées par le comité d’éthique et le ministère. Les animaux ne comportant pas la mutation d’intérêt ou trop âgés (pour être utilisées en accouplement ou incluses dans un protocole de recherche) ou n'ayant plus donnés de portées depuis 2 mois seront euthanasiés, même s'ils ne présentent pas de signes de mal-être. Les souris seront euthanasiées de manière anticipée si elles présentent des signes de souffrance. Les souris incluses dans un projet de recherche seront euthanasiées à l'issue des procédures expérimentales, conformément au protocole autorisé.

Remplacement

Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité la réponse immunitaire et l’effet des traitements sur la réponse anti tumorale, ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte physiologique ou pathologique. Cela est impossible à reproduire in vitro (dans des cultures de cellules) en raison de la complexité des interactions entre les différents types de cellules jouant un rôle dans le développement et la progression de la maladie.

Réduction

Nous connaissons bien l'ensemble de ces lignées (nombre et taille des portées), ce qui permet de gérer les élevages de façon raisonnée. Nous avons déterminé le nombre de souris inclus dans ce projet afin de ne produire que le nombre d'animaux nécessaire à la réalisation de nos projets de recherche.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents pathogènes. Elles sont maintenues en groupe dans un environnement enrichi (présence de tunnel en carton, papier kraft pour faire des nids et buchettes en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Pour les souris pouvant développer une pathologie (type cancer), la surveillance sera renforcée par un suivi clinioque hebdomadaire afin de détecter de manière anticipée l'affaiblissement de l'animal. Les souris seront utilisées autant que possible avant l'âge d'apparition de la maladie. Après coupure de l'extremité de la queue de la souris, nous surveillerons qu'il n'y a pas de saignement et dans le cas contraire, un point de compression sera fait pour favoriser la coagulation.

Choix des espèces

L'utilisation de ces différentes lignées de souris génétiquement modifiées pour l’étude des SMD/LAM est largement décrit dans la littérature scientifique. Ces modèles sont robustes et reproductibles et leur élevage permettra d'inclure ces souris dans des projets de recherche permettant de mieux comprendre le développement de ces maladies et de trouver de nouvelles pistes de thérapie. Les souris seront mises en accouplement à l'âge adulte (8 semaines), stade qui correspond à leur maturité sexuelle. Le sevrage, l’identification et le prélèvement de tissu en vue de l’analyse génétique seront réalisés entre 3 et 4 semaines.

Injectées tous les deux jours pendant neuf jours avec une molécule qui déclenche une crise migraineuse, 320 rates subissent ensuite l'application d'un filament sur la face pour mesurer leur hypersensibilité à la douleur. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les rates sont tuées sous anesthésie profonde pour prélever leurs tissus nerveux. L'objectif porte sur le rôle des astrocytes dans le déclenchement de l'allodynie, avec la perspective annoncée de nouvelles cibles contre la douleur chez l'être humain. Les nuisances attendues sont estimées à partir de travaux menés sur des rats mâles, alors que le projet porte sur des femelles.

Objectifs

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Une des signatures comportementales de la migraine est l’hypersensibilité à la douleur mécanique cutanée appelée allodynie qui représente en plus de la douleur spontanée un symptôme très handicapant pour les malades. L’allodynie correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse qui peut être déclenchée suite à une inflammation. En temps normal, les informations tactiles et douloureuses n’aboutissent pas au même niveau de la moelle épinière ou du tronc cérébral, les deux modalités sensorielles (tact et douleur) sont donc normalement séparées. En conditions pathologiques, par exemple lors d’une allodynie, l’information tactile devient capable d’activer des neurones nociceptifs, grâce à un circuit qui implique plusieurs cellules. Le tact va alors devenir douleur (allodynie mécanique). Ce processus va provoquer l'activation de plusieurs populations neuronales et implique également une population spécifique de cellules gliales, les astrocytes. Cependant, peu de choses sont connues sur ces cellules et leur implication dans le déclenchement de l’allodynie .L’objectif de ce projet va consister à étudier l’implication des astrocytes et plus précisément des canaux potassiques astrocytaires dans un modèle de migraine chronique .Ce projet combinera des études comportementales et d’expression protéique. Il présente donc un intérêt fondamental, et également un intérêt plus appliqué en permettant éventuellement de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques visant à diminuer les douleurs pathologiques chez l’homme.

Bénéfices attendus

La migraine est une pathologie qui a un fort impact sur la santé publique (12-15% de la population touchée). Les traitements proposés ont une efficacité limitée, surtout au stade chronique de la maladie. Le développement et l'évaluation des effets antalgiques de nouvelles molécules est indispensable pour l’amélioration des thérapeutiques.

Procédures

Les injections intra péritonéales (fréquence: 1 injection tous les 2j pendant 9j/ durée: 30s) et les perfusions (fréquence: 1/ durée 30min/ sans réveil) seront réalisées par du personnel formé et compétent, sous la responsabilité des membres de la Structure du Bien Etre Animal. Après une phase d'habituation, des tests comportementaux (test d'allodynie suite à l'application d'un filament au niveau de la face) seront réalisés (habituation+test: 35min/ test de la face tous les 2 jours).

Impact sur les animaux

Les résultats obtenus des travaux des autres laboratoires avec le modèle NTG ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux autre que la développement d'une allodynie. Ce modèle a été réalisé sur des rats mâles, dont les nuisances sont le développement de l'allodynie mécanique au niveau de la zone péri orbitale après l'application de filament de vF (modérée). Les rats doivent pouvoir continuer à se mouvoir, se toiletter, exercer leurs gestes habituels.

Devenir

A la fin des procédures d'études comportementales, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort: pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une quantification protéique ou une analyse immunohistochimique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après injection de NTG.

Réduction

Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales et moléculaires est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc il est préférable de prévoir 10 animaux par groupe: habituation, injection,comportement, prélèvements et préparation des échantillons. C'est un modèle que le laboratoire veut mettre en place, donc, pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. D’abord, un test de significativité sera réalisé afin de déterminer si les données suivent une distribution normale, puis un test d’égalité des variances avant de confronter les valeurs avec un test paramétrique. Dans le cas où le test de normalité soit significatif ou les variances ne puissent pas être considérées égales, nous allons donc utiliser des tests non paramétriques. La significativité sera définie pour une valeur de p≤0,05. Les groupes non stimulés (NS) seront réalisés en priorité; si les résultats obtenus sont significatifs, nous ne réaliserons pas les groupes stimulés (St).

Raffinement

Préalablement à toutes études comportementales, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats seront préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Les points limites des animaux sont identifées par une liste définie. Si au cours de l’expérimentation, l’animal a de grosses difficultés à se déplacer, se relever pour se nourrir, l’animal sera euthanasié par dose létale de pentobarbital.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 7-10 semaines, pour comparer avec les données du laboratoire.

Des anticorps prélevés chez des patients sont injectés dans le cerveau de rats, par une chirurgie de trente minutes qui pose aussi une pompe délivrant un traitement en continu pendant dix à quinze jours. 480 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des études histologiques, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'exposition est répétée à trois stades, au douzième jour de gestation, au douzième jour après la naissance et à l'âge adulte, pour voir si la kétamine protège des convulsions et des troubles du comportement provoqués par ces anticorps. Le porteur écrit que les tests comportementaux employés "ne provoquent pas de douleurs et sont peu contraignants", sans en nommer un seul, alors qu'ils servent à mesurer des convulsions et des séquelles.

Objectifs

Les anticorps sont des protéines produites par le système immunitaire pour assurer la sécurité de l’organisme et lutter contre les infections. Malheureusement, dans certaines situations, la production par le système immunitaire d’anticorps anormaux qui attaquent des protéines présentes à la surface des neurones entraînent des maladies neurologiques et psychiatriques graves. L’expression aberrante d’anticorps s’attaquant aux certains récepteurs du glutamate est par exemple la cause d’une forme très sévère encéphalite (inflammation du cerveau). Ces anticorps provoquent de l’épilepsie, des maladies mentales, et de l’autisme chez l’enfant. Ils peuvent entraîner des séquelles irréversibles. La prise en charge actuelle de cette maladie repose sur l’administration d’immunosuppresseurs et d’antiépileptiques qui restent malheureusement peu efficaces. L’administration de kétamine, un anesthésique qui bloque ces mêmes récepteurs, pourrait représenter un traitement prometteur de cette maladie grâce à son activité antiépileptique et ses effets contre l’anticorps lui-même. Malheureusement, les mécanismes d’action de la kétamine et son efficacité dans le traitement des encéphalites sont encore mal connus. L’objectif de ce travail est d’étudier à différents stades du développement neurologique, l’effet protecteur potentiel de la kétamine sur les convulsions et les troubles du comportement causés par les auto-anticorps. Pour mimer la maladie, nous allons exposer le cerveau de rats à des anticorps de patients à trois stades différents du développement cérébral: au 12ème jour de gestation pendant le développement embryonnaire (correspondant au 2ème trimestre de grossesse chez l’Homme), au 12ème jour postnatal pendant la période critique du développement cérébral, et à l’âge adulte après le 60ème jour post-natal. L’administration de kétamine en parallèle permettra de tester son effet protecteur potentiel. Nous analyserons pour cela l’impact des anticorps et les bénéfices escomptés de l’administration conjointe de kétamine sur le comportement et la survenue de convulsions chez les animaux traités. Les approches comportementales de ce projet pour mesurer les séquelles nécessitent d’utiliser des animaux.

Bénéfices attendus

La prise en charge actuelle de cette maladie repose sur l’administration d’immunosuppresseurs et d’antiépileptiques qui restent malheureusement peu efficaces. L’administration de kétamine, un anesthésique qui bloque ces mêmes récepteurs, pourrait représenter un traitement prometteur de cette maladie grâce à son activité antiépileptique et ses effets contre l’anticorps lui-même.

Procédures

Injection dans le péritoine d’anticorps (5minutes) et de traitements(21 jours). 1 chirurgie d’injection Intra-cérébrale et implantation d’un système de délivrance de traitement en continu.1 chirurgie (durée 30 min) d’injection Intra-cérébrale et implantation d’un système de délivrance de traitement en continu (delivrance pendant 10 à 15 jours).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire, ce risque est compensé par l’analgésie 2/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental

Devenir

Mise à mort à l'issue des procédures pour effectuer les études histologiques

Remplacement

L’objectif du projet est de comprendre le rôle néfaste joué par les anticorps dirigés contre des protéines présentes à la surface des neurones, et d’évaluer l’effet protecteur de la kétamine sur les symptômes causés par ces anticorps. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d’administration intracérébrales et sous-cutanées, avec des tests comportementaux, des enregistrements cérébraux, et de l’imagerie et l’activité des neurones. Le recours à l’animal est indispensable pour répondre à ces objectifs.

Réduction

La règle des 3R a été mise en place dans la conception de notre projet et une planification précise des expériences a été établie afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, tout en ayant des groupes suffisamment importants pour obtenir des statistiques solides. Nous proposons ainsi un projet portant sur 480 rats (réduction), avec un nombre de 12 animaux par groupe

Raffinement

Une attention permanente sera portée au bien-être des animaux avant et tout au long des protocoles (raffinement), notamment en assurant un enrichissement adéquat de leur milieu: papier tressé pour les mères, tunnels en carton dans des cages d’hébergement conçues pour qu’ils puissent exprimer leur comportement naturel. Ils seront surveillés quotidiennement par des personnels compétents et formés. Les douleurs consécutives à la chirurgie seront soulagées à l’aide des molécules les plus adaptées au protocole et à l'état des animaux. Aucune des données recueillies sur les molécules à visée thérapeutique injectées par voie intrapéritonéale ne prédisent que ces injections seront douloureuses. Néanmoins, l’état des animaux sera particulièrement surveillé durant le temps de ces injections et des mesures adaptées seront prises dans la cas contraire. Les tests comportementaux utilisés dans ce projet ne provoquent pas de douleurs et sont peu contraignants pour les animaux. Des points limites suffisamment prédictifs sont définis pour limiter la souffrance tout au long de la vie de l'animal. En cas de souffrance ou de détresse persistante, les animaux seront mis à mort dans des conditions qui évitent souffranc

Choix des espèces

Le rat est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est assez proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes synaptiques à une échelle moléculaire. L’impact des anticorps contre une population des protéines à la surfaces des neurones excitatrices et le potentiel protecteur de la kétamine seront évalués à trois stades du développement cérébral: - entre le 10ème et le 18ème jour de gestation, correspondant au 2ème trimestre de grossesse chez l’Homme où se forment les réseaux neuronaux. - entre le 10ème et le 15ème jour post-natal, correspondant à une fenêtre critique du développement cérébral chez l’enfant. - chez l’adulte de plus de 60 jours, à un stade ou le cerveau est arrivé à maturité. Les conséquences de ces expositions seront systématiquement caractérisées à l’aide de tests comportementaux appropriés à l’âge adulte.

Réformées de l'élevage plutôt qu'élevées pour l'expérimentation, quatorze brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe trois heures sous anesthésie générale pendant que des chirurgiens entaillent cinq de ses disques intervertébraux lombaires et y posent trois types de biomatériaux à tester, avec radiographies et IRM du rachis. Quatre sont tuées au bout d'un mois, dix au bout de six mois après deux passages supplémentaires sous anesthésie pour l'imagerie, afin de prélever leurs soixante-dix disques lombaires pour analyse histologique et tests mécaniques. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative à l'utilisation de l'animal" pour cette évaluation préclinique, une étude préliminaire sur des disques prélevés après la mort ayant déjà confirmé la faisabilité de la pose de l'implant.

Objectifs

La lombalgie est un problème de santé publique majeur, ayant des conséquences socio-professionnelles et économiques considérables. Il est estimé qu’environ 80 à 90% de la population mondiale souffrira de lombalgie à un moment donné au cours de la vie. Entre 8 et 20% des lombalgies chroniques sont associées à une hernie discale (HD), survenant lorsque le disque intervertébral (DIV) ne joue plus son rôle essentiel d’amortisseur dans la biomécanique de la colonne vertébrale. En effet, le DIV est composé de deux tissus, le noyau pulpeux NP en son centre, et l’anneau fibreux (AF) en périphérie. Avec le temps, des microfissures et des déchirures de l’AF peuvent amener le NP à faire saillie dans le canal rachidien : il s’agit d’une hernie discale, ayant pour conséquence une compression de la moelle épinière et/ou de racines nerveuses à l’origine de douleurs d’intensité variable. Lorsque les traitements antalgiques ne suffisent pas pour garantir le confort du patient, il est possible de pratiquer une intervention chirurgicale afin de retirer la partie herniée du NP exerçant une compression sur les structures nerveuses adjacentes. Toutefois, les lésions de l’AF persistent : le risque de récidive de HD est élevé et le DIV entre dans un processus dégénératif accéléré pouvant rapidement conduire à la perte totale de ses compétences biomécaniques. Dans ce projet, nous proposons d’évaluer une nouvelle stratégie de médecine réparatrice reposant sur la réparation de la déchirure de l’AF par comblement à l’aide d’un biomatériau électro-tissé. Ce biomatériau présente une structure fibreuse mimant celle de l’AF et servira de tuteur à sa colonisation cellulaire et sa réparation. Avant de pouvoir envisager des études cliniques chez l’Homme, nous souhaitons évaluer son efficacité à moyen terme dans un modèle ovin de réparation discale à l’aide de radiographies, d’imageries par résonance magnétique (IRM), d’analyses histologiques et d’une évaluation biomécanique des DIV ainsi réparés. 14 brebis seront utilisées afin d’évaluer 3 types d’implants différents en deux temps : une première phase d’une durée de 1 mois concernant 4 animaux et une seconde phase d’une durée de 6 mois concernant 10 animaux.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à développer une nouvelle approche de médecine régénératrice pour traiter les patients atteints de hernie discale. L'objectif n'est pas seulement de combler le défaut de l'anneau fibreux (AF) et d'atténuer la douleur, mais aussi de stimuler la réparation de l'AF, restaurant ainsi le disque intervertébral (DIV) dans son état fonctionnel. À court terme (première phase de 1 mois), ce projet vise à évaluer la sécurité, la stabilité et les premiers signes de réparation de l’AF après mise en place des implants dans la déchirure de l’AF (3 types d’implants différents seront utilisés). À moyen terme (deuxième phase de 6 mois), il vise à évaluer l’efficacité de ces mêmes implants dans un modèle ovin de lésion de l’AF. Enfin, à long terme, nous espérons mettre en place une étude clinique chez l'Homme, en nous appuyant sur les résultats prometteurs obtenus dans notre étude animale préclinique. Cette étape ouvrirait la voie à un nouveau paradigme thérapeutique pour le traitement de la hernie discale.

Procédures

4 brebis seront manipulées 3 fois sur une période de 1 mois (une fois pour le prélèvement sanguin, une fois pour la chirurgie et une fois pour l‘euthanasie) et 10 brebis seront manipulées à 5 reprises sur une période de 6 mois (une fois pour les prélèvements sanguins, une fois pour la chirurgie, deux fois pour l’imagerie seule et une fois pour l’euthanasie). L’ensemble des procédures à l’exception de la prise de sang sera réalisé sous anesthésie générale : - à J-1 (n=14, animaux vigiles, durée de la manipulation = 2 minutes) : prise de sang, - à J0 (n=14, durée de l’anesthésie = 3h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, randomisation des DIV lombaires (5 conditions expérimentales), réalisation des défauts de l’AF dans les DIV concernés et mise en place des 3 différents biomatériaux évalués, - à 1 et 3 mois (n=10, durée de l’anesthésie = 1h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, - à 1 (n=4) ou 6 (n=10) mois : euthanasie des animaux, radiographies et IRM du rachis lombaire (les DIV étant des tissus non vascularisés, leur aspect à l’IRM reste inchangé pendant plusieurs heures après la survenue de la mort), prélèvement de la totalité des DIV du rachis lombaire. Par ailleurs, les animaux seront soumis à un examen clinique quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation, sur leur site d’hébergement (pas de déplacement prévu pour les animaux). L’examen clinique se fait dans un premier temps à distance (temps mis à profit pour que les animaux s’habituent à la présence humaine) puis de manière rapprochée et individuelle (quelques minutes par animal, sans douleur).

Impact sur les animaux

La chirurgie, réalisée sous anesthésie générale, entraîne un risque réduit de douleur ou de lésion neurologique. La technique chirurgicale choisie est peu invasive, supprimant la manipulation des muscles ou des nerfs dorsaux. Le risque de douleur postopératoire ou de lésion nerveuse est ainsi significativement réduit. La procédure sera réalisée par des chirurgiens du rachis expérimentés dans ce type d'intervention sur ce modèle animal. Des douleurs modérées et transitoires peuvent être ressenties par les animaux dans les jours suivant l'opération, et l’administration d’anti-douleur est prévue si nécessaire. Le risque infectieux associé à cette chirurgie est très faible car elle sera réalisée en salle d'opération dans des conditions stériles et dans un temps réduit. L'implant utilisé sera stérile. Pour minimiser le stress sur les animaux, tous les examens d'imagerie médicale programmés pendant la période de suivi de 6 mois seront réalisés sous anesthésie générale. Les animaux seront sédatés dans leur enclos et puis transportés vers les salles d'imagerie seulement après que la sédation a pris effet.

Devenir

L’euthanasie des brebis aura lieu à la fin du premier mois (n=4) ou du sixième mois (n=10), c’est-à-dire à la fin de la procédure. Cette euthanasie est indispensable afin de pouvoir réaliser les analyses histologiques et immunohistochimiques ainsi que les tests mécaniques sur l’ensemble des DIV lombaires des brebis concernées par l’expérimentation (70 DIV au total). Ces résultats permettront de caractériser la tolérance des biomatériaux par le DIV ovin, tant au niveau de ses propriété biomécaniques qu’au niveau cellulaire et moléculaire (informations non disponibles par d’autres techniques, notamment d’imagerie médicale).

Remplacement

Ce projet correspond à une étude préclinique d’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un nouveau dispositif médical in vivo, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de l’animal. Toutefois, nous avons choisi de faire appel à des animaux de production réformés plutôt qu’à des animaux élevés spécifiquement pour l’expérimentation animale. Une étude préliminaire réalisée sur des DIV isolés (DIV prélevés sur des animaux après leur mort) a d’ores et déjà confirmé la faisabilité de l’installation d’un implant. Une phase d’étude chez l’animal vivant est incontournable pour vérifier que l’implant est correctement colonisé par des cellules à long terme.

Réduction

Une étude statistique préliminaire nous a permis de calculer le nombre de DIV lombaires à inclure dans notre étude : 70 DIV au total. L’animal étant son propre témoin (5 DIV lombaires par animal répartis au hasard parmi les 5 conditions expérimentales), nous réduisons le nombre total d’animaux utilisés à 14 (5x14=70) tout en garantissant la validité des analyses statistiques qui seront réalisées après obtention des résultats. De plus, la réduction du nombre d’animaux est également assurée par la mise en place de procédures raffinées (anesthésie, suivi et soin des animaux, prise en charge de la douleur, alimentation et enrichissement) limitant les pertes animales et l’atteinte de points critiques en cours de protocole. La méthode de suivi choisie (par imagerie médicale et ne faisant appel qu’à une euthanasie terminale) limite également le nombre d’animaux utilisés (par comparaison avec des procédures où des animaux seraient euthanasiés à chaque temps de suivi). Enfin, la première phase de la procédure décrite dans ce projet, concernant 4 animaux, sera réalisée dans un premier temps : les résultats obtenus seront analysés et la seconde phase, concernant 10 animaux, ne sera effectuée que s’ils sont favorables aux dispositifs médicaux étudiés. Nous réduisons ainsi le nombre total d’individus utilisés à 14 (4 animaux à 1 mois et 10 à 6 mois).

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe (espèce grégaire) dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement et à volonté au foin et à l’eau. L’alimentation est complétée par des granulés et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille adaptée à l’espèce ovine (intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture - debout, couchée-, port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres pelviens, confort global). Procédure expérimentale : L’ensemble des manipulations est réalisé sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. La technique chirurgicale choisie pour ce protocole limite le risque de lésion nerveuse et de douleur chirurgicale par comparaison à d’autres (absence d’ouverture de la cavité abdominale, absence d’exposition de la moelle épinière ou des racines nerveuses). La chirurgie est effectuée par un chirurgien expérimenté qui maitrise les gestes, ce qui permet de réduire le temps d’intervention et le risque infectieux. Par ailleurs, les implants utilisés sont stériles et l’intervention est réalisée dans un bloc chirurgical en conditions stériles. La gestion de la douleur pendant et après la chirurgie est assurée par un vétérinaire qualifié qui suit les règles en vigueur afin d’assurer un confort optimal pour l’animal. Des anti-douleurs seront administrés pendant la chirurgie ainsi que les 5 jours suivants. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-opératoire.

Choix des espèces

L’espèce ovine est un modèle animal de défaut de l’AF couramment utilisé. Les similitudes avec l’Homme concernent la biomécanique du disque, la physiopathologie de la dégénérescence du DIV et de la hernie discale, les anomalies détectées à l’IRM au niveau des DIV atteints et l’évolution clinique. Ainsi, la brebis est un modèle classiquement utilisé en médecine régénératrice du DIV. Par ailleurs, la taille des animaux facilite la réalisation des techniques chirurgicales (taille relativement proche de celle de l’Homme) et leur hébergement en stabulation est aisé (contrairement aux porcs par exemple). Nous avons choisi d’utiliser des brebis adultes (maturité squelettique) âgées de 1 à 3 ans chez lesquelles il est peu probable que des lésions de dégénérescence discale soient déjà présentes (contrairement à des brebis plus âgées).

Les souris utilisées sont athymiques, dépourvues de thymus et donc incapables de rejeter les cellules tumorales qu'on leur implante. 625 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est injectée sous la peau du flanc sous anesthésie, puis viennent une injection intraveineuse de nanoparticules lipidiques, deux prélèvements de sang par incision du bout de la queue sur souris vigile, une injection de luciférine et dix à quinze minutes d'imagerie sous anesthésie, la tumeur pouvant gêner les déplacements et la toilette. Le calendrier est celui d'une société privée, cinq études de vingt-cinq souris par an pendant cinq ans, pour mesurer où se logent des nanoparticules destinées à transporter des médicaments.

Objectifs

Ce projet est centré sur l'adressage sélectif de nanoparticules lipidiques vectorisés (LNP-V) vers des tumeurs afin d’en améliorer leur diagnostic/traitement. L’imagerie par bioluminescence permet la détection et la quantification/accumulation in vivo de conjugués ou de cellules développées pour présenter une activité bioluminescente. L'objectif principal de ce projet est donc d’utiliser cette technique pour étudier les effets de l'utilisation de différents vecteurs sur la biodistribution et l'accumulation plus spécifique dans les tumeurs de LNP-V en limitant leur accumulation non spécifique dans les autres tissus. En effet un ARNm codant pour l'enzyme luciferase sera encapsulée dans les LNP-V et servira de read out de l'accumulation des différents LNP-V dans les tumeurs.

Bénéfices attendus

L'utilisation de nanoparticules lipidiques vectorisées (LNP-V) permets de protéger la molécule thérapeutique de la dégradation et de permettre une distribution plus spécifique. D'un point de vue médical, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos molécules constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Chaque souris sera implantée avec un modèle de cellules tumorales par une injection en sous cutanée sur le flanc de l’animal anesthésié. Après croissance tumorale, les souris recevront une injection par i.v. de nanoparticules lipidiques (LNP) vectorisées (V) contenant un ARNm codant pour la luciférase (protéine émettant de la lumière en présence de son substrat la luciférine), en solution isotonique stérile, sous anesthésie gazeuse. Après administration des petits prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés sur animaux vigiles en contention par une micro-incision de l’extrémité caudale, 3 à 5 gouttes de sang (≤50μl) suffiront pour quantifier la 1/2 vie plasmatique de nos conjugués. Au maximum seront réalisés 2 prélèvements de maximum 50μl, pour un volume total n’excédant pas 10% de la volémie. Vingt-quatre heures après, pour induire la bioluminescence, une injection intrapéritonéale de luciférine sera réalisée sous anesthésie, juste avant l’imagerie. Les imageries bioluminescentes dureront environ 10-15min et les animaux seront maintenus sous anesthésie pendant la totalité de l'acquisition.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les souris sont principalement le stress causé par la capture, l'implantation des cellules tumorales en sous-cutanées (réalisé une seule fois) sous anesthésie, les injections en i.v. des molécules (réalisé une fois) et en i.p du susbtrat Luciferine (réalisé une fois) sous anesthesie, les prélèvements sanguins intermédiaires ( 2 prélèvements (≤50μl) /individus, n’excédant pas 10% de la volémie), ainsi que le développement de la tumeur primaire chez l’animal en tant que pathologie. Ce developpement de la tumeur en sous cutanée peut entrainer une gène physique, avec de possibles grattages et demangeaisons. Les animaux seront soumis à la mesure bi-hebdomadaire des volumes tumoraux. La pousse de la tumeur peut eventuellement entrainer chez l'animal une gêne physique au déplacement ou à la toilette par exemple. Les LNP-V peuvent (éventuellement) causer des effets secondaires observés post-administration comme des chocs immunitaires (anaphylactique), des réactions allergiques, des détresses cardio-respiratoires et des troubles comportementaux.

Devenir

A l'issue de chaque procédure d'imagerie les animaux seront mis à mort et certains organes seront prelevés afin de valider ex vivo la biodistribtuion des LNP-V.

Remplacement

Toute étude de mesures physiologiques en temps réel, de ciblage thérapeutique ou pharmacocinétique, impliquent tôt ou tard l’utilisation d’animaux. Il n'existe à l'heure actuelle aucune alternative qui permet d'avoir accès aux grandes fonctions mécaniques et physiologiques des mammifères proches de l’homme. Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières approches précliniques. La partie développement de nos LNP-V ne peut être réalisée que par une approche in vivo pour réellement en mesurer le bénéfice. L'utilisation de rongeurs (ici, n= 125 souris/an) impose la prise en compte de la règle des 3 R, la conformité vis à vis des recommandations et cahier des charges.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été réduit au minimum requis pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Le nombre total de souris pour cette étude s'élève à 625 souris. Il tient compte du suivi des modèles expérimentaux développés dans le projet et de la variabilité de développement des tumeurs qu’il peut exister dans les différents modèles. L’optimisation de nos vecteurs in vitro nous permet aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure. Le nombre total d’animaux répartis sur des études necessitants 25 souris chacune sera de 625 souris décomposé en 5 études de 25 individus/an sur 5 ans. Ce nombre sera suffisant pour appréhender la détection et l'accumulation de nos molécules dans les tumeurs. Cette estimation a été faite d’après les données bibliographiques et/ou les résultats antérieurs obtenus par la société. Ce nombre d'animaux pour ces procédures nécessaire à l'obtention d'une significativité statistique a été défini en déterminant le test statistique et l'effet biologique et la dispersion escomptés.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel permettent d’avoir suffisamment de recul pour appréhender tout signe et/ou comportement caractéristique d’une douleur ou gène chez l’animal, appuyés si besoin par la présence sur site d’un pharmacien, personne dument qualifiée, pour exercer dans le respect des 3R. Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation qui regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux. Dès leur arrivées les souris sont placées dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), avec la même cage (taille standard pour portoir ventilé+couvercle à filtre), un maximum de 5 individus par cage, litières (copeaux de bois) et alternance d'enrichissement, dômes, tubes, fibres pour faire des nids. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Une personne compétente (formation en experimentation animale) réalisera les injections des cellules tumorales qui se feront sous anesthésie gazeuse (Sévoflurane). Une observation bi-hebdomadaire des animaux par les expérimentateurs (poids, douleurs/souffrance) sera faite ainsi qu'une surveillance du volume des tumeurs, en plus de leur observation quaotidienne par les animaliers. Toute perte de poids, signe de douleur (analgésiques prévus en cas de nécessité) ou souffrance notable (cardiaque, respiratoire) de l'animal éveillé après anesthesie ou au cours du developpement tumoral constituera un point limite. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs de deux fournisseurs extérieurs.

Choix des espèces

- Facilité d'utilisation en général, espèce athymique (sans thymus) comme modèle in vivo, pour faciliter la mise en place et la prise de tumeurs solides (facilité et maîtrise de l’injection, déficience du système immunitaire), ainsi que pour le suivi de leur croissance. - Modèle d’injection de lignées tumeurs en sous-cutanée bien décrit dans la littérature et déjà utilisé dans le passé par des membres du laboratoire ou membres du projet collaboratif. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de lignées cancéreuses, c’est à dire des souris athymiques « jeunes adultes » âgés de 6 semaines au moment de l’implantation de la lignée tumorale et 10 à 12 semaines au moment du traitement (injection du candidat imagerie) en fonction de la taille des tumeurs.

60 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chirurgie stéréotaxique de deux à quatre heures pour implanter des électrodes dans le cerveau ou y injecter des vecteurs viraux, jusqu'à dix prélèvements sanguins en quarante-huit heures, ponctions de liquide céphalorachidien, imagerie de trois heures sous anesthésie, séances quotidiennes d'une à deux heures en chaise de contention, et injections d'harmaline pour provoquer des troubles moteurs. Ce travail relève d'une "activité pré-clinique de service" menée pour des clients qui font tester électrodes et molécules avant un passage éventuel chez l'humain. Le porteur justifie le recours au macaque en écrivant que "l'éthique spéciste actuelle interdit l'utilisation d'approches neurobiologiques invasives chez l'homme", et retient cette espèce pour sa proximité anatomique avec l'espèce humaine.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde (DBS) est une procédure neurochirurgicale pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement notamment dans la maladie de Parkinson (MP). La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans le cerveau pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de MP tel que les tremblements, rigidité ou autres fluctuations motrices. Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la MP et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée également pour d'autres conditions, comme l'épilepsie et la dépression. Ceci explique le développement permanent de nouvelles sondes DBS capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles afin de contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux ou non viraux (peptides, anticorps...) ou plus génériquement d’inocula. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs tout comme la DBS reste l’approche chirurgicale par stéréotaxie. Si la validation de nouvelles sondes DBS passent par des enregistrements des signaux, la mesure des effets des inocula se fait par des analyses biochimiques sur des prélèvements biologiques puis cellulaires après mise à mort. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils (sondes pour la DBS ou inocula) chez le primate non humain (PNH). Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs qu’ils soient porteurs d’une molécule «contrôle» ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique et d’autre part de nouvelles sondes DBS chez le PNH.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament ou d’un nouveau dispositif médical (électrode), indispensable avant les essais chez l’homme. Le développement de nouvelles électrodes sur les animaux visant à améliorer l’impact de la DBS dans les troubles neurologiques sont fondamentaux pour confirmer que les prototypes atteignent les niveaux de sécurité, d’efficacité et d’ergonomie attendus et pourrait permettre à terme de maximiser le temps du patient "en thérapie". Ce projet est mené obligatoirement sur l’animal. En effet, il n’est pas envisageable d’implanter un nouveau dispositif médical ou d’administrer un nouveau composé à l’homme - sain ou malade - compte tenu des risques non connus susceptibles d’apparaître. A terme, nous souhaitons démontrer l’efficacité et la tolérance d’outils de thérapie génique chez un modèle de grand animal, pour demander par la suite une autorisation d’essai clinique chez des patients atteints de formes génétiques (en particulier) des maladies neurodégénératives.

Procédures

Les animaux sont soumis aux différentes étapes décrites dans la procédure. - Prélèvements sanguins sur animal anesthésié ou vigile (10 min), fréquence max en 24/48 h = 10 prélèvements et volume max sur une semaine entre 5 à 7 ml/kg / semaine - Prélèvements LCR, sur animal anesthésié, 1 ml max sur un mois (10 min) - Imagerie (3 heures) sur animal anesthésié (2 à 3 max. selon la durée du suivi longitudinal) - Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). - - Traitement prophylaxique par gavage (fréquence variable, max 2 fois par jour) sur animal vigile pour une durée entre une semaine et 10 jours. Ceci afin de conserver un score inférieur à 5 sur l’«Échelle d'évaluation du bien-être PNH». - Tache en chaise avec enregistrements électrophysiologiques et/ou stimulation (séances quotidiennes de 1-2h, sur jour ouvré pendant toute la durée du projet) sur animal vigile en absence ou en présence de fluctuations motrices (induites par l’harmaline, max 1 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour l’aspect comportemental : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique d’harmaline entrainant les fluctuations motrices. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport. Bien que les vecteurs viraux soient réputés pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de les détecter. Une échelle d’évaluation du bien-être décrite en annexe 1 est applicable pour ces points limites.

Devenir

L'ensemble des animaux à la fin du projet seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité pré-clinique de service. Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du PNH, vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs); 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. Dans bien des cas par exemple les immunothérapies testées ne peuvent interagir qu’avec des tissus provenant de PNH, ce qui impose souvent l’utilisation du modèle primate.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux (ici électrodes de stimulation/enregistrement) avec un nombre estimé de 3 études par an, comprenant 4 animaux maximum par étude, soit un total de 60 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 4 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Les inocula auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) par nos clients pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques nécessitant un apport supplémentaire d’animaux. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical (électrode), la chirurgie implantatoire peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée. et l’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le PNH a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Adultes afin que de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

Pour mettre au point des traceurs d'imagerie de la fibrose pulmonaire et tester des traitements, 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La fibrose est induite à la bléomycine, suivie d'injections de traceurs radioactifs, de jusqu'à cinq séances d'imagerie de quarante minutes sous anesthésie, d'un gavage quotidien de J8 à J28 ou d'injections intrapéritonéales quotidiennes, puis d'une ponction dans le cœur. Pendant la phase d'inflammation, les souris peuvent perdre du poids, se déshydrater, respirer difficilement et rester prostrées, sans analgésie, le porteur indiquant que les antidouleurs interféreraient avec le développement de la fibrose. Le nombre de souris par groupe a été fixé d'après l'expérience de l'équipe, le porteur précisant qu'aucune approche statistique n'a été utilisée.

Objectifs

Ce projet porte sur l’étude de la fibrose pulmonaire qui se caractérise par une modification de la structure du tissu pulmonaire qui devient plus rigide. Elle résulte de l’accumulation excessive de protéines comme le collagène et mène à des défauts de fonctionnement des poumons. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode permettant un diagnostic précoce et le suivi de la progression de la maladie. Peu de traitements sont disponibles car les mécanismes menant à la fibrose sont peu connus. Ces traitements permettent uniquement de ralentir la progression de la maladie mais ne permettent pas de la stopper. De plus, il n’existe, à l’heure actuelle, aucun moyen de suivre l’efficacité de ces thérapies chez les patients. Ce projet est donc construit avec un triple objectif: 1/ Mettre en place de nouveaux traceurs d’imagerie pour le diagnostic précoce et le suivi de la progression non-invasif de la fibrose pulmonaire, 2/ évaluer l’action de ces traceurs pour le suivi de l’efficacité de traitements anti-fibrose et enfin 3/ évaluer les effets de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

La découverte de biomarqueurs pour la FPI en est encore à ses débuts et il n'existe pas de consensus dans ce domaine, en particulier pour l'imagerie moléculaire. L'imagerie actuelle de la FPI repose uniquement sur le scanner haute résolution et n'a que peu d'impact sur le diagnostic précoce et la survie. En outre, l'efficacité des thérapies actuellement approuvées pour la FPI dans l'ensemble de la population atteinte de FPI reste incertaine et les outils permettant de contrôler l'efficacité des thérapies font cruellement défaut. Ce projet permettra donc de développer et d’évaluer des traceurs d’imagerie qui pourraient être des biomarqueurs d'imagerie pour la FPI. Un nombre important de patients atteints de FPI doivent subir une biopsie pulmonaire pour obtenir un diagnostic définitif. Cependant, l'hétérogénéité spatiale des lésions fibrotiques dans le poumon de la FPI rend difficile l'échantillonnage précis de la zone pulmonaire malade afin d'obtenir une décision de diagnostic fiable. Le développement de sondes radiomarquées spécifiques des zones pulmonaires affectées par la FPI, telles que les sondes développées dans notre projet, pourrait aider les cliniciens à prendre des décisions thérapeutiques. En outre, ce projet fournira des outils innovants pour la détection de voies biologiques spécifiques impliquées dans la fibrose pulmonaire. Dans ce contexte, les sondes développées dans le cadre de ce projet constitueront une première étape dans le développement de thérapies personnalisées pour les patients atteints de FPI, ce qui n'est pas le cas actuellement, en identifiant les répondeurs potentiels ou les non-répondeurs aux thérapies évaluées dans ce projet. Notre projet ambitieux favorisera donc le développement de thérapies ciblées qui sont inexistantes pour le traitement de la FPI.

Procédures

Intervention subies par les animaux : - Injection de traceur radioactifs par voie IV sous anesthésie (100µl, 2 minutes, 1 à 4 injection par animal) - Prélèvement sanguins sous anesthésie (2 minutes, 4 par animal, n=30 (procédure 1 seulement)) - Imagerie in vivo sous anesthésie (40 minutes maximum, 1 à 5 imagerie par animal) - Traitement par gavage sur souris vigile (procédure 3 uniquement, 200µl, gavage quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Traitement par injection IP sur souris vigile (procédure 4 uniquement, 100µl, quotidien de J8 à J28, 1 minute) - Prélèvement de sang terminal sans réveil par ponction intracardiaque sans thoracotomie sur animal anesthésié (1 minutes).

Impact sur les animaux

Durant la phase d’inflammation de J0 à J7 les animaux peuvent subir une perte de poids importante et présenter des signes cliniques caractéristiques tels que la déshydratation, l’augmentation de la fréquence respiratoire (associé à une difficulté respiratoire) et un comportement de prostration et d’isolement. Toute observation anormale sera répertoriée et suivie de mesures.

Devenir

A l’issue de chaque procédure la totalité des animaux seront mis à mort afin de mesurer et quantifier la fibrose pulmonaire par des méthodes ex vivo classiques (histologie, dosage de protéine) et les comparer avec nos techniques d’imagerie in vivo.

Remplacement

L’étude de la fibrose pulmonaire ainsi que l’effet d’un traitement sur celles-ci ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement complexe et pluricellulaire présent physiologiquement, ni la fonction pulmonaire (rigidité, stress mécanique dû à la respiration…) dans son ensemble. Néanmoins, les molécules qui seront évaluées dans ce projet auront été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Puisqu’il est impossible dans un système in vitro de déterminer toutes les propriétés d'une substance, car aucune circulation sanguine ou système excréteur n'est présent, la seule alternative reste l’utilisation d’animaux.

Réduction

Dans le cadre de cette étude, les traceurs/composés seront évalués à l'aide de techniques d'imagerie préclinique in vivo couplées à des techniques de comptage de la radioactivité ex vivo. Ces techniques étant particulièrement sensibles et spécifiques, seuls de faibles effectifs sont nécessaires pour obtenir des données fiables et précises tout en réduisant le nombre d’animaux au maximum. De plus l’imagerie in vivo permet d’évaluer les traceurs/composés à plusieurs stades de fibrose sur les mêmes animaux limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été déterminée suivant notre experience de ce type de manipulation et aucune approche statistique n'a été utilisée. De plus, le nombre d’animaux utilisé pourra être revu à la baisse pour certaines procédures en fonction des résultats obtenus lors des procédures précédentes.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages, en groupe (10 maximum par cage), suivant un cycle jour/nuit inversé avec accès illimité à l’eau et la nourriture. Les litières des cages seront supplémentées par un enrichissement de type « SIZZLE PAD ». Les gestes de ce projet (injection, imagerie, mise à mort) se dérouleront tous sous anesthésie et sur lit chauffant réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Les animaux recevant de la bléomycine seront observés une fois par jour pendant la phase aigüe d’inflammation (de J0 à J7) puis trois fois par semaine de J8 à J28 pendant la phase de progression de la fibrose. Le développement de la fibrose reposant sur l'induction d'une phase d'inflammation, il n'est pas possible d'utiliser des analgésiques qui pourraient interfèrer avec le bon développement de la fibrose. En dehors des effets induits par le modèle, aucun effet indésirable n’est attendu mais des points limites adaptés ont été définis. Toute observation d’un signe de souffrance excédent les points limites sera suivie de l’arrêt immédiat du protocole et de la mise à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles de choix pour l’étude de la fibrose pulmonaire. La souris est l’espèce la plus utilisée et la plus connue notamment pour le modèle à la bléomycine, permettant ainsi une extrapolation à l’homme et une comparaison à de résultats antérieurs. Les souris débuteront les études à un âge de 8 semaines, déterminé en fonction de résultats déjà publiés. Cet âge correspondant à un stade de développement adulte de l’animal.

Pour chercher pourquoi certaines personnes réagissent au cannabis par des symptômes psychotiques, 6 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Selon les protocoles, elles subissent jusqu'à sept injections dans l'abdomen, des chocs de 0,4 mA aux pattes, des injections de chlorure de lithium qui provoquent un malaise d'environ une heure, une restriction de nourriture ou d'eau, ou une chirurgie du cerveau d'environ 90 minutes pour injecter un virus ou implanter une fibre optique. En dehors des conditionnements opérants, par chocs ou par récompense alimentaire, et de deux protocoles de 19 et 25 jours désignés par des sigles, les tests comportementaux ne sont pas nommés. Si une souris présente deux jours de suite un état anormal, perte de poids, ataxie, baisse d'activité ou pelage négligé, le porteur prévoit d'en informer le vétérinaire et de décider avec lui de la suite.

Objectifs

Ce projet de recherche veut mieux comprendre comment fonctionne notre cerveau quand on pense au quotidien, et comment des problèmes dans ce fonctionnement peuvent être liés à des troubles mentaux. On regarde surtout comment les substances dans le cannabis interagissent avec la dopamine, et comment cela influe sur notre façon d'apprendre de manière fortuit et de faire la distinction entre la réalité et l'imagination. Les premiers résultats montrent que ces substances ont une influence intéressante, surtout sur les associations qu’on faire au quotidien et les symptômes psychotiques. On cherche à savoir pourquoi les réactions varient d'une personne à l'autre, et surtout pourquoi certaines réagissent de façon psychotique au cannabis. On essaye aussi de trouver des moyens pour protéger le cerveau des effets néfastes du cannabis. Plutôt que de suivre les méthodes habituelles, on explore l'idée d'utiliser des substances qui pourraient aider à contrôler les récepteurs dans le cerveau influencés par le cannabis. En fin de compte, ce projet pourrait nous aider à mieux comprendre comment fonctionne notre cerveau, et aussi à créer de nouveaux traitements pour les problèmes mentaux graves.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche se concentre sur le rôle du récepteur CB1 dans les processus d'apprentissage et de mémoire, en mettant particulièrement l'accent sur son implication dans les processus mentaux d'ordre supérieur. En explorant la signalisation endocannabinoïde, nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes moléculaires liés à des fonctions complexes telles que l'imagination et les croyances. L'objectif global est de dévoiler comment des altérations dans ces processus peuvent contribuer à des troubles psychopathologiques tels que les psychoses et les troubles de la consommation de drogues, qui ont un impact significatif sur la santé publique. Nous examinons également le rôle du système endocannabinoïde dans la modulation de la perception sensorielle, soulignant son lien potentiel avec les états psychotiques. En dévoilant ces mécanismes neurobiologiques, notre recherche vise à approfondir notre compréhension des circuits neuronaux impliqués chez la souris. À plus long terme, nous anticipons que ces découvertes pourraient poser les bases de nouveaux concepts thérapeutiques pour traiter des conditions neuropsychiatriques importantes. En résumé, ce projet offre une opportunité tangible d'approfondir nos connaissances sur le cerveau et de développer des perspectives thérapeutiques novatrices.

Procédures

Les injections intra-peritoneales (i.p) se font dans toutes les procédures. La nuisance provoquée par les injections i.p. est un stress et la douleur de l’injection (qui est modérée). Les injections ont une durée de 2 secondes environ et elles se font avec les animaux en vigile. Pour un test les animaux subiront 6 injections (une par jour) et dans le cas des expériences avec les agents pharmacologiques, une injection de plus pour administrer l’agent. Dans les cas des autres test, les souris vont recevoir seulement une injection dans le cas d’administration d’un agent pharmacologique. . Pour la chirurgie et l’injection d’un virus ou de l’implantation d’une fibre optique (durée 90 minutes environ dans les deux cas), les animaux seront d'abord placés dans une boîte contenant 5% d'anesthesique pour l'induction d'une anesthésie générale pour éviter toute douleur.

Impact sur les animaux

Les procédures utilisées dans ce projet varient en fonction de leurs effets sur les souris. Nous utiliserons des protocoles comportementaux et des chirurgies. Quelques souris vont subir une expérience longue [19 jours pour AF/25 jours pour RT]. Cela peut entrainer une perte de poids aux souris. Dans ce protocole aussi les injections de LiCl produisent du malaise aux animaux pendant environ une heure. Pour le protocole de conditionnement opérant aversif, certains souris reçoivent pendant une seconde des chocs au pied [0,4mA] pour induire le conditionnement. Cela leur produit une douleur et du stress également. Dans le cas du protocole opérant appétitif, la nourriture sera restreinte avant de commencer l’expérience et les souris peuvent avoir une perte de poids. Les autres test comportamentaux n’impliquent pas un risque ou aucune nuisance aux souris, sauf le stress de leur manipulation et déplacement de leur cage à la structure où elles doivent faire la tache comportementale. Pourtant, la nuisance peut être due à l’injection intra péritonéale. Cela peut induire du stress aux souris. Les chirurgies entrainent une perte de poids, de la douleur et du stress à la souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des toutes les procédures, car les procédures entrainent une plasticité cérébrale et apprentissage qui empêchent pouvoir utiliser ces animaux à nouveau.

Remplacement

A ce jour, notre connaissance de l'organisation des circuits neuronaux chez les mammifères, y compris l'homme, ainsi que leur plasticité, ne nous permet pas de concevoir et de réaliser des simulations numériques fiables pour étudier les changements qui se produisent. En outre, l'utilisation d'invertébrés, dont le système nerveux est complètement différent, serait inappropriée. Dans ce contexte, le recours à des expériences sur les mammifères reste nécessaire. Le but du projet est d'étudier un phénomène comportemental qui ne peut pas être reproduit par des études in-vitro (dans des cultures cellulaires) car il s’agit de tests comportementaux. De plus, les symptômes de type psychotique sont très complexes et ne peuvent pas être étudiés dans d'autres modèles animaux comme le poisson zèbre, le cobaye...etc. L'utilisation de souris comme modèles animaux pour reproduire certains des symptômes a été le pilier de la littérature.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux ne doit pas dépasser 10 animaux, c'est-à-dire le nombre minimum d'échantillons permettant l'application des tests statistiques classiques dans le domaine et également décrits dans la littérature scientifique sur le sujet. Les chiffres attendus garantissent une bonne interprétation des résultats. Toutefois, si l'expérience montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Pour le R de raffiner, tous les protocoles sont optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux tout au long de cette étude. Les animaux sont logés dans des cages collectives avant et après la manipulation, avec un environnement enrichi (matériel de nidification) et un accès libre à l'eau et à la nourriture. Nous attendons au moins 1 semaine (7 jours) pour permettre aux animaux de s'adapter au cycle jour/nuit de notre animalerie expérimentale. Pour le point limite, nous le définissons par un état anormal constaté sur deux jours consécutifs (perte de poids de 15%/jour, ataxie, hypolocomotion, pelage non soigné). Si ce point est atteint, le vétérinaire en sera informé et nous prendrons une décision ensemble pour le bien-être de l’animal. Ensuite, les souris vont subir les protocoles expérimentaux avec accès à la nourriture et à l'eau. Elles seront soigneusement surveillées comme mentionné avant. Dans le cas des expériences de restriction d'eau, le poids et le bien-être des animaux seront soigneusement surveillés. Si des procédures douloureuses sont utilisées (p. ex. chirurgie stéréotaxique), l'utilisation appropriée d'un anesthésique et d'un analgésique est prévue. De plus, les animaux seront logés dans des cages collectives avant et après la manipulation. Les souris sont hébergées avec du matériel de nidification en coton dans des conditions optimales de température, d'humidité et de lumière. Les souris sont observées quotidiennement par du personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs formés conformément à la réglementation en vigueur, afin que des mesures d'analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. L'établissement des points limites est basé sur une évaluation de l'état général et du comportement des animaux, comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, tant préopératoires que postopératoires, comprennent également l'utilisation d'analgésiques pour la gestion de la douleur et doivent être effectuées par des expérimentateurs formés à la chirurgie des rongeurs, conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

À ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères, y compris l'homme, et surtout leur plasticité, ne permet pas de concevoir et de mettre en œuvre des simulations numériques fiables permettant d'étudier les changements qui se produisent. De plus, l'utilisation d'invertébrés dont le système nerveux est complètement différent serait inappropriée. Dans ce contexte, l'expérimentation animale reste nécessaire. La souris est le modèle idéal pour ces trois raisons 1) Possibilité d'étudier des mutants pour une protéine donnée (dans ce cas le récepteur CB1), 2) Reproductibilité et comparabilité avec d'autres résultats obtenus dans le laboratoire et la communauté scientifique au sens large. 3) Les installations sont équipées pour les études sur les rongeurs. Les animaux seront âgés de 8-17 semaines pour l’étude des comportements. Les animaux qui vont subir les protocoles comportementauxdoivent être adultes, donc ils devront avoir 10-13 semaines. Pour les animaux qui vont avoir l’une des deux chirurgies, les chirurgies vont être faites à l’âge de 8 semaines, et après une convalescence de quelques semaines, les tests comportementaux seront réalisés. Par conséquent, l’étude avec ces animaux se fera quand ils auront 12-17 semaines.