Procédures modérées
Etude de l’activation des cellules myéloïdes dans les maladies d’inflammation vasculaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Les souris dont la douleur ne cède pas au traitement analgésique sont tuées, l'atteinte d'un point limite entraînant l'arrêt du protocole. 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur sang et leurs organes. Les modèles de vascularite rénale et pulmonaire qui leur sont imposés peuvent provoquer une insuffisance rénale, une gêne respiratoire, un affaiblissement général et une perte de poids, et chaque souris subit selon le protocole des injections dans le péritoine à l'état vigile, trois injections derrière l'œil sous anesthésie, une instillation dans le nez et jusqu'à huit heures en cage métabolique. Les retombées annoncées tiennent à des molécules ciblant deux récepteurs, déjà en développement pour d'autres maladies, dont le porteur écrit qu'elles pourraient ouvrir des perspectives dans les vascularites.
Objectifs
Les vascularites, maladies inflammatoires des vaisseaux sanguins, représentent un groupe hétérogène de maladies systémiques avec des mécanismes physiopathologiques distincts et des stratégies thérapeutiques distinctes. Les vascularites sont classées selon la taille des vaisseaux affectés et peuvent conduire à l’altération d’autres organes tels que les poumons et les reins. Ces pathologies se caractérisent par la présence d’un infiltrat inflammatoire, composé particulièrement de cellules immunitaires, qui viennent envahir la paroi aortique, entraînant un remodelage de cette dernière pouvant aller jusqu’à l‘occlusion du vaisseau. Une meilleure compréhension des facteurs impliqués dans la régulation des cellules inflammatoires et aortiques est indispensable. Les objectifs du projet est d’étudier le rôle de deux récepteurs présents à la surface des cellules immunitaires, les monocytes/macrophages, et leur modulation au cours des maladies inflammatoires. Les modèles murins de maladies inflammatoires étudiés seront des modèles de vascularites rénales, pulmonaires et des gros vaisseaux, et un modèle de réponse inflammatoire systémique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence l’implication potentielle de deux récepteurs membranaires présents à la surface des monocytes/macrophages dans la physiopathologie de maladies inflammatoires, notamment les vascularites affectant les vaisseaux de gros et petit calibre, entraînant l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Des molécules venant cibler ces récepteurs sont en cours de développement dans d’autres pathologies, et les travaux réalisés pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans les vascularites.
Procédures
Prélèvement à la queue (1fois 30sec) sur souris vigile, une injection intra-péritonéale (10 secondes, nombre d'injections variant selon le protocole), une injection rétro-orbotaire sous anesthésie (15 secondes, 3fois), une instillation intranasale sous anesthésie (1fois), une injection intraveineuse (45sec, nombre d'injections variable selon le protocole), un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie (45 sec). Cages métaboliques : inférieur à 8h avec accès à l'eau.
Impact sur les animaux
Les différents modèles peuvent induire un affaiblissement général de l’animal, asthénie, perte de poids, insuffisance rénale (modèle de glomérulonéphrite et vascularite rénal), gène pulmonaire (modèle de vascularite pulmonaire). L’ensemble des modèles peut induire des douleurs de courtes durées et peu intenses liées aux injections. Enfin, un stress chez les animaux peut survenir subissant des contentions et manipulations répétées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever le sang et les organes pour y réaliser des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les vascularites et maladies systémiques impliquent des réponses immunitaires complexes au sein de divers organes. Actuellement, les modèles in vitro ne permettent pas de reproduire finement l’environnement physiopathologique dans lequel la réponse immunitaire est mise en jeu. L’expérimentation animale est indispensable afin de se rapprocher de la physiopathologie de ces maladies observées chez l’Homme. Les systèmes et protocoles d'imagerie ont été optimisés et caractérisés sur des objets physiques de forme, géométrie, composition connus permettant ainsi de comparer images obtenues et réalité, avant de passer chez l'animal.
Réduction
Les paramètres expérimentaux ont été définis selon des études déjà publiées (temps de traitment, doses et voies d’administration). Nous avons déterminé un nombre d’animaux restreint au maximum, de sorte à obtenir des résultats permettant d'obtenir la puissance statistique nécessaire pour y ttirer des conclusions biologiquement pertinentes. Pour chacune des expériences nous avons maximisé les prélèvements et analyses biologiques. Les méthodes d'imagerie étant non invasives et non douloureuses, les animaux pourront être suivis au cours temps et les paramètres étudiés seront mesurés à chaque passage pour chaque animal. Des analyses statistiques seront effectuées sur chacune des expériences.
Raffinement
Les injections intra-péritonéales seront réalisées sur animal vigile tandis que les injections rétro-orbitaires et pulmonaires seront réalisées sur animal anesthésié et posé sur un tapis chauffant pour le confort de l’animal. Pour les injections répétées nous alternerons les points d’injections afin de maintenir le confort de l’animal. Une évaluation générale de l’animal, basée sur son apparence physique et comportemental, sera faite grâce à l'établissement de points limites. Le poids corporel sera relevé tous les 3 jours pour les traitements inférieurs à 10 jours et 1 fois par semaine pour ceux supérieurs à 10 jours. Les animaux seront élevés dans des cages enrichies et regroupés en groupe sociaux pour éviter tout isolement. Le personnel qualifié assure un suivi quotidien et tout comportement anormal sera reporté au responsable du projet. L’atteinte d’un point limite établi entrainera une mise à mort anticipée de l’animal et l'arrêt du protocole. Nous aurons recours à de l’imagerie non invasive afin de monitorer les lésions inflammatoires dans le cas d’apparition de vascularites spontanées, et de pouvoir suivre l’évolution de ces modèles de la manière la moins invasive possible. Pour toutes les analyses d'imagerie, les animaux seront sous anesthésie générale. Les examens d'imagerie au centre du projet sont non invasifs et atraumatiques et impliquent au maximum l'injection d'un agent de contraste ou fluorescent. Les animaux seront surveillés tout au long de l’expérience afin d’observer leur comportement. En cas de signes de souffrance, des traitements analgésiques seront utilisés. En cas d'échec de réduction de la douleur, les manipulations seront arrêtées et les animaux mis à mort.
Choix des espèces
Le modèle animal nous permet de réaliser des expériences de physiopathologie d’inflammation vasculaire et systémique (induit ou spontané) de mammifère en prenant en compte l’ensemble des paramètres physiologiques existant in vivo. Les analyses in vitro ou in sillico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l’inflammation vasculaire et systémique car trop de paramètres physiologiques entrent en jeu. Les pathologies induites décrites précédemment font l’objet de protocoles publiés.
Etude de la stéatose hépatique non alcoolique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des dommages hépatiques sévères provoqués par une molécule, un régime riche en graisses maintenu des semaines, jusqu'à huit injections, un gavage et trois prises de sang : 2 340 souris subissent ces procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Le porteur décrit chacune de ces atteintes en une ligne et qualifie de légères la douleur des injections comme la contrainte du gavage, la seule mention de sévérité portant sur les dommages au foie qu'il induit délibérément. Il ajoute que les souris deviendront un peu moins actives en prenant du poids, et qu'une mise à jeun de six heures leur imposera une sensation de faim. Toutes sont tuées en fin de procédure pour récupérer des prélèvements qu'il juge "indispensables" à la compréhension de la stéatose hépatique.
Objectifs
La stéatose hépatique non-alcoolique est une maladie chronique caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie associée à une inflammation. Elle est plus fréquente chez les personnes atteintes d’obésité et/ou du diabète de type 2. Dans notre projet, nous visons à utiliser des modèles de souris pour comprendre le développement et les facteurs contribuant à cette maladie et proposer des solutions thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche permettra une meilleure compréhension des mécanismes gouvernant l’inflammation du foie et pourrait permettre de définir de nouvelles approches thérapeutiques dans la stéatose hépatique non-alcoolique et ses complications.
Procédures
Injections sous anesthésie locale (maximum 8, durée 1 minute). Gavage (n=1, durée 1 minute). Prélèvements de sang (n=3, durée 2 minutes).
Impact sur les animaux
Régime riche en graisse (HFD) long-terme : les souris vont prendre du poids au fur et à mesure des semaines et devenir un peu moins actives. - Injection : douleur légère. - Mise à jeun de 6 heures: Les animaux n’auront plus accès à la nourriture, ils pourront subir une contrainte due à la sensation de faim. - Gavage : contrainte légère due à la contention et à la sonde de gavage. -Induction de dommages sévères au foie par une molécule.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récupérer tous les prélèvements nécessaires pour mettre en oeuvre les trois grandes techniques qui nous sont indispensables à la compréhension des mécanismes que nous souhaitons explorer dans ce projet.
Remplacement
Les modèles cellulaires alternatifs in vitro, in silico ou ex vivo ne permettent pas d’appréhender le comportement cellulaire dans le foie dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux régimes et traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, endocrine…). Pour réaliser les tests métaboliques et analyser la signalisation inter-organe, les modèles in vivo sont indispensables. Seul un animal vivant peut permettre d’étudier dans sa globalité le comportement des macrophages du foie soumis à différentes régimes.
Réduction
Le nombre de souris est réduit a son minimum. De nombreux tissus et cellules seront collectés apres la mise a mort, afin d'approfondir les études moléculaires, cellulaires et transcriptomiques. Chaque souris génèrera donc de nombreuses données. De plus nous avons determiné un nombre de souris par groupe, suivant les procédures, en fonction de données de la littérature ou grâce a l'utilisation d'un outil statistique (calcul de puissance) pour le calcul des effectifs. En détail, nous avons déterminé le nombre de souris par régime et par génotype grâce à l'utilisation d'un outil statistique pour le calcul des effectifs avec un test de puissance . Concernant les résultats, une analyse statistique sera réalisée en tenant compte de la variabilité intra-groupe ainsi que test d'analyse de variance sur mesures répétées par les valeurs d'enzymes hépatiques et les poids des souris.
Raffinement
Les souris seront sous surveillance quotidienne de la part de l’équipe de recherche pour évaluation clinique adaptée à chaque procédure, et mise en place d'actions correctives pertinentes. Des traitements antalgiques seront mis en place pour soulager les animaux en procédure. Des point limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Toutes les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent dans notre étude car elle se rapproche physiologiquement des pathologies humaines. En effet, selon la littérature, les modèles murins sont utilisés dans les études de l’obésité alimentaire et l’insulinorésistance. De plus, notre modèle murin (souris invalidées pour le gène d'intérêt) a déjà été validé dans des travaux publiés précédents. Les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront entre 8 et 10 semaines au début de la procédure, il s’agit de souris adultes car la pathologie humaine se développe chez le jeune adulte et chez l'adulte.
Étude de l’homéostasie et fonctionnement de cellules immunitaire et de leurs rôles dans la réponse immunitaire contre des tumeurs solides
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 428 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur par voie intraveineuse, sous la peau ou directement dans la paroi intestinale lors d'une chirurgie de quinze minutes, d'autres sont infectées par une entérobactérie, et certaines sont maintenues endormies deux à quatre heures pour de l'imagerie après une opération de trente minutes. Le porteur estime que les souris rencontrent peu d'effets indésirables et que la localisation de la tumeur ne semble affecter ni leur mobilité ni leur comportement, tout en fixant comme points limites le poil ébouriffé, la prostration et la diarrhée. Aucune ne peut être réutilisée, replacée ou adoptée, ayant reçu des cellules tumorales ou subi une chirurgie viscérale qu'il décrit comme non opérable.
Objectifs
L’objectif du projet consiste à étudier le développement des cellules lymphoïdes (ILCs), ainsi que leurs fonctions dans l’homéostasie tissulaire et dans l’initiation et le maintien de la réponse immune contre des tumeurs et l’infection bactérienne. D’une part, nous analyserons les mécanismes de développement permettant la génération des différents types d’ILCs. Cette étude consistera à déterminer les signaux activateurs et inhibiteurs permettant la génération, le maintien et la régulation fonctionnelle de ces cellules. D’autre part, nous étudierons leurs rôles et leurs interactions au sein du système immunitaire lors de la réponse anti-tumorale et antibactérienne.
Bénéfices attendus
Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules lymphoïdes innées dans un modèle tumoral et infectieux. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire dans des conditions normales et pathologiques. Ainsi, la compréhension du mécanisme qui régule les premières phases de l'immunité innée contre la progression tumorale et infectieuse pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir l’infection bactérienne ou améliorer l'espérance de vie après la tumorigenèse.
Procédures
Certains animaux recevront une greffe tumorale qui consistera à une intervention chirurgicale de 15 minutes. Les injections instantanées seront réalisées i.v, i.p, et/ou intra lamina propria intestinale. Certains animaux subiront une intervention chirurgicale de 30 minutes pour effectuer l’imagerie et seront maintenus endormis pendant 2 à 4h.
Impact sur les animaux
Notre projet propose, d’une part d’étudier les cellules lymphoïdes innées (ILCs) infiltrant une tumeur et nécessite la greffe intraveineuse, sous-cutanée ou intestinale de tumeur aux souris et d’autre part d’étudier l’infiltration des ILCs dans le tissu infecté par une entérobactérie. Notre connaissance suggère que les souris rencontrent peu d’effets indésirables causés par la pousse tumorale ou l’infection bactérienne. La localisation de la tumeur ne semble pas impacter leur mobilité, leur alimentation, leur pelage et leur comportement et l’infection aura des effets transitoires sur le poids de la souris. Nos précédentes expériences montrent que l’injection de molécules (anticorps) que nous proposons d’étudier dans ce projet n’aura pas d’effets indésirables dans la période expérimentale. Injection des tumeurs par voie i.v. : effets légers Injection des tumeurs par vous sous-cutanée : effets modères Injection des tumeurs intestinale : effets modères Infection des souris avec des entérobactéries : effets modères
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront reçu initialement des cellules tumorales ou une chirurgie viscérale non opérable.
Remplacement
Nous avons recours aux animaux afin de décortiquer le mécanisme d’action des ILCs car les modèles in vitro actuels ne permettent pas de récapituler la complexité des réponses immunitaires ayant lieues in vivo. Néanmoins, nous ne réaliserons que les tests in vivo les plus nécessaires (emplacement spatiale des ILCs dans les tumeurs/métastases et la croissance des tumeurs/métastases. Par contre, afin de caractériser la fonctionnalité de l'ILC, nous remplacerons les expériences in vivo par des tests in vitro afin de réduire le nombre des animaux dans les expériences.
Réduction
D'après notre expertise issue des projets précédents et notre collaboration avec le département de statistiques, nous avons déterminé́ le nombre d'animaux par groupe qui nous permettront d'utiliser les tests statistiques robustes. Le nombre de souris nécessaire à l’expérimentation a été déterminée en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Les animaux ne pourront pas être réutilisés car ils seront porteurs de tumeur(s) ou infectés par des bactéri es. L'utilisation cytométrie spectrale nous permet de réduire le nombre d'animaux utilisé car cette technologie permet d'acquérir plus de paramètres que la cytométrie classique à partir d’un un même animal. Dans la mesure du possible, les expériences de cytométrie, séquençage, et d’immunohistochimie seront effectuées sur les même animaux afin de limiter leur utilisation.
Raffinement
Modèles tumoraux : Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures. Nous utilisons ces modèles de tumeurs depuis plusieurs années et nous connaissons leur tumorigenèse dans des souris contrôles et immunodéficientes (absence des cellules lymphoïde adaptatives et innées). D’après notre expérience et la littérature, nous estimons que le développement tumoral dans les souris mutantes comprises dans ce projet se situera entre ces deux extrêmes. Cependant, nous prévoyons les mesures suivantes et dans l’ordre dès apparition d’un signe clinique : l’ajout du gel hydrique dans la cage pour faciliter la réhydratation et prise de nourriture, réhydratation sous-cutanée, amélioration de la température (plaque chauffante ou chaufferette) de la cage et si pas amélioration mise à mort. Dans le cadre de la tumorigenèse pulmonaire et intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après la mise à mort. Le nombre de cellules tumorales injectées est établi depuis plusieurs années afin de contrôler la pousse tumorale et de pouvoir comparer des résultats de diffèrent projets. L’injection se faisant intraveineuse, sous-cutanée ou intra tissulaire (face intestinale externe), l’animal qui n’aura aucune difficulté à bouger ou à s’alimenter. Modèle infectieux : Pour épargner toute douleur, les animaux seront suivis fréquemment et des points limites (perte de poids, poil ébouriffé́, prostration, diarrhée) sont établis pour raffiner les procédures. Nous utilisons le modèle bactérien depuis plusieurs années et nous connaissons son développement dans des souris contrôles et immunodéficientes (absence des cellules lymphoïde adaptatives et innées). D’après notre expérience et la littérature, les souris utilisées dans la procédure auront une infection proche de celle observée dans les souris controles. Cependant, En cas de souffrance observé, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Le développement lymphocytaire et les réactions immunitaires sont des processus complexes. De façon générale, l’immunité nécessite plusieurs types de lymphocytes participants chacun dans une ou plusieurs interaction(s) directe(s) ou indirecte(s) avec un ordre spatio-temporel. De ce fait, les systèmes de culture in vitro actuels ne permettent pas de modéliser cet environnement complexe. De plus, il n’existe, pour le moment, aucune lignée cellulaire murine ou humaine de cellules lymphoïdes étudiées (NK/ILC1, ILC2, ILC3). Par conséquent, l’étude de ces processus nécessite pour l’instant l’utilisation d’animaux vivants. Cependant, la compréhension du mécanisme de développement cellulaire faite in vivo, nous permettra probablement d’établir de nouveaux modèles in vitro utilisant des lignées cellulaires afin de réduire la contribution animale. Par conséquent, le modèle murin est essentiel dans notre domaine de recherche. Le nombre de souris est calculé en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’animaux tout en garantissant l’obtention de résultats statistiquement significatifs dans les différentes conditions expérimentales. Cette évaluation est déterminée grâce à nos données préliminaires et/ou antérieurs et à la bibliographie scientifique. Elle tient également compte de la faisabilité de nos expériences. En effet l’analyse post-mortem nécessite un temps de préparation conséquent, ce qui nous contraint à analyser de petits groupes d’animaux et d’augmenter la répétition des expériences pour une analyse statistique satisfaisante. Cependant, nos résultats précédents ont permis d’estimer les variabilités biologiques et expérimentales et ainsi minimiser la répétition expérimentale.
Photobiomodulation (PBM) : Évaluation à moyen terme de la sécurité et de l’efficacité d’un nouveau dispositif médical en vue de traiter par PBM l’ischémie/ reperfusion cardiaque aigüe sur un modèle porcin.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le thorax ouvert ou une sonde poussée dans les artères du cœur, une coronaire bouchée pendant une heure pour provoquer un infarctus, sept heures d'anesthésie générale au total : 100 porcs adultes de 55 à 70 kilos subissent ces procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Chacun est ensuite suivi trois mois, avec réveil, douze à dix-huit heures en cage de contention, alimentation par perfusion, IRM et prises de sang répétées. Le porteur indique que l'instabilité cardiaque du modèle conduit à des massages cardiaques et des défibrillations, et que dans 30 % des cas la réanimation échoue, la mort étant prononcée après cinquante minutes. Tous les porcs sont tués pour prélever leur cœur, et le porteur écrit qu'aucune approche statistique n'a été réalisée pour fixer l'effectif de 100 animaux.
Objectifs
L'infarctus du myocarde (IDM) se définit comme la nécrose d'une partie du muscle cardiaque, suite à un manque d’oxygène. Cette situation provoquée par une sténose (rétrécissement) partielle ou totale des artères du cœur est traitée par ouverture de la sténose. La réouverture appelée « reperfusion » est nécessaire mais entraine une instabilité du myocarde, qui engendre d’autres problèmes et provoque des phénomènes de mort tissulaire jusqu’à plusieurs jours après la reperfusion. Des approches thérapeutiques ont été développées sans succès. La prise en charge de l'infarctus reste donc un problème de santé publique. La thérapie par Photobiomodulation (PBM) se définit comme une irradiation lumineuse athermique et non ionisante aux longueurs d’ondes visible et proche infrarouge. Les photons émis agissent sur la mitochondrie et améliorent les échanges gazeux intracellulaires en optimisant la consommation d’oxygène en phase d’hypoxie. Ils modulent ainsi la réponse cellulaire et tissulaire afin d’améliorer la cicatrisation des tissus et réduire l’inflammation. Nous développons un dispositif médical innovant utilisant les principes de la PBM. Nos travaux préliminaires en phase aiguë ont montré des résultats pertinents en termes d’efficacité de notre protocole thérapeutique. L’objectif de cette étude est d’évaluer la sécurité et l’efficacité à moyen terme (3 mois de suivi) de notre dispositif médical pour le traitement par PBM des lésions de reperfusion induites dans un modèle pathologique porcin d’IDM. Pour cette étude, 100 porcs seront nécessaires pour fournir les informations suffisantes pour envisager une étude clinique humaine. Deux modèles pathologiques seront étudiés : - Ischémie/Reperfusion (I/R) cardiaque à thorax ouvert, 50 porcs : modèle chirurgical utilisé dans notre étude préliminaire en phase aigüe - I/R cardiaque à thorax fermé, 50 porcs : modèle mini-invasif (sans intervention chirurgicale et donc moins traumatique) que nous maitrisons et qui répond à une stratégie plus adaptée pour la phase chronique : L’étude comporte plusieurs phases préparatoires du modèle ischémique, pour un suivi du traitement de la pathologie sur 3 mois. Pour la période de réveil et de soins intensifs, notre expérience antérieure nous permet d’assurer le suivi des animaux dans des conditions appropriées au confort des animaux, dans le respect de l’éthique et du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra : - de valider les effets de la PBM sur l’amélioration et la restauration du muscle cardiaque ischémié en regard de porcs non traités. L’adjonction du lot témoin renforce l’étude préclinique qui présente un modèle pathologique en regard du lot traité. Nous apporterons un regard tout particulier aux animaux pour limiter les souffrances physiques. - de déterminer le taux de survie des animaux de chaque lot. - de vérifier que le dispositif médical n’a pas provoqué d’effets secondaires (bénéfice/risque). Ces résultats seront décisionnels pour passer à une étude clinique chez l’homme, objectif fondamental en regard des critères définis par l’article L1123-7 du code de santé Publique (CSP) et en conformité des comités de Protection des Personnes (CPP)
Procédures
L’étude comprend : - une procédure invasive (50 porcs) et mini-invasive (50 porcs) pour la phase d’ischémie /reperfusion cardiaque avec ou sans traitement PBM. Ces procédures sont réalisées 1 seule fois (à J0) sous anesthésie générale (AG). Les animaux seront prémédiqués (environ 15 minutes), intubés (environ 5 minutes) et anesthésiés durant toute l’intervention (IRM basale 1h, abords vasculaires 30 minutes, chirurgie 1h, ischémie 1h, traitement PBM et suivi post-reperfusion 1h30, fermeture des sous-plans musculaires 30 minutes, IRM post-reperfusion 1h30, soit au total 7 h sous AG). - Une procédure d’acquisition d’images par IRM pour l’analyse de la fonctionnalité cardiaque. Elle sera réalisée sous AG à J0 et à 3 mois de suivi longitudinal (environ 1h30 à 2h sous AG par session) . - Les prélèvements sanguins seront réalisés 3 fois sous AG à J0, puis 1 fois en vigile (via le cathéter veineux central mis en place à J0) à J1, J2, J3, J21 et à 3 mois de suivi (3 minutes par prélèvement sanguin) - Les prélèvements tissus et organe seront prélevées sous AG au moment du sacrifice (durée des prélèvements tissulaires de 45 minutes à 1h environ).
Impact sur les animaux
Des douleurs physiques aigues sont possibles au cours des 48h post-opératoires. Dans tous les cas les antalgiques sont maintenus durant les 4 jours post intervention. Les douleurs seront prises en compte et notifiées dans une fiche d’évaluation de la douleur avec un score qui fera l’objet de discussions et d’une prise de décision par les porteurs du projet pour apporter une solution éthique appropriée. Bloc opératoire : les animaux sont sous anesthésie générale (AG). Tout événement inhérent au modèle pathologique d’infarctus du myocarde, caractérisée par une instabilité hémodynamique, arythmies, fibrillations auriculo-ventriculaires, nous amène à pratiquer des réanimations : massages cardiaques, défibrillations, médications appropriées. Les décès seront prononcés après 50 minutes de réanimation non efficace (30% des cas selon notre expérience). Aucun réveil ne sera effectué si l’animal n’est pas en capacité de survivre (fonctions biologiques instables, organes défaillants…). La phase de réveil est une étape clé pour la survie et le suivi des animaux dans cette étude longitudinale. Le réveil de l’animal n’est décidé qu’au moment où sa respiration et ses fonctions hémodynamiques sont totalement restaurées (débit et fréquence cardiaque, pression artérielle…). Dès que l’animal cherche à se lever, il est mis en cage de contention pour une durée d’environ 12 à 18 heures. La cage de contention est suffisamment grande pour que l’animal puisse être libre de ses mouvements. Une surveillance continue est assurée pour prévenir et intervenir sur les conséquences ischémiques. Durant cette période, l’animal est nourri par voie parentérale. Avant le réveil, l’innervation intercostale est protégée par une injection de Naropeine. Les antalgiques sont maintenus durant les 4 jours post intervention. Avant le départ vers l’animalerie, des prélèvements sanguins et traitements (antalgiques, antiinflammatoires, antibiotiques…) sont pratiqués. A la phase du suivi sur 3 mois : période 1 des 3 premières semaines de suivi en loge individuelle et période 2 de suivi jusqu’à 3 mois en loge collective. Pour la période 1 seront pris en compte i) suivi de l’état général de l’animal, soins post opératoires ii) médications pour réduire la souffrance et éviter l’infection et les conséquences ischémiques. Pour la période 2, les animaux retournent en loge collective. Après 3 mois de suivi longitudinal, retour au site d’expérimentation pour IRM sous AG. L’animal sera ensuite euthanasié
Devenir
Tous les animaux seront placés sous AG pour être euthanasiés afin de prélever le cœur qui sera observé macroscopiquement lors de l’explantation. Si un animal doit être euthanasié durant la période de suivi longitudinale il sera au préalable anesthésié avant l’euthanasie. Des échantillons seront ultérieurement étudiés par analyse histologique et biologique afin de nous permettre d’observer d’éventuelles lésions tissulaires, de quantifier la zone à risque et d’évaluer ainsi la sécurité de notre dispositif médical implanté in vivo.
Remplacement
Cette étude sur l’efficacité d’un traitement par PBM des lésions de reperfusions induites par un infarctus du myocarde est un long cheminement qui a débuté, avant de passer à l’utilisation de modèles animaux, par une validation in vitro sur des cellules cardiaques en cultures et in utéro sur des embryons de poulet. Il s’est poursuivi par des études in vitro de respiration mitochondriale (dans un oxygraphe à haute résolution de type Oroboros) de cardiomyocytes porcs et humains soumis à la PBM. Cet ensemble de résultats justifient nos études animales pour passer de l’animal à l’homme mais sans nul doute de passer aussi de l’homme à l’animal. En effet la pratique vétérinaire qui s’enrichit des techniques qui sont pratiqué chez l’homme en particulier pour les animaux de compagnie peut avoir un réel intérêt. D’autant plus que la pratique vétérinaire s’est beaucoup enrichi ces dernières années de la luminothérapie dans la pratique clinique.
Réduction
Pour cette étude notre cheminement a tenu compte et cherché à maitriser une technologie innovante et prometteuse, en utilisant des animaux qu’à des étapes clés de l’évolution de notre projet de recherche. Les animaux ont été utilisés pour nous permettre de disposer d'éléments suffisants pour montrer la sécurité, l’efficacité du traitement PBM et la performance de notre DM, étapes indispensables pour déposer un dossier pertinent pour remédier à un vrai problème de santé publique. A cette étape, aucune approche statistique n’a été réalisée. L’expérimentation a été menée en collaboration avec des partenaires académiques pour partager certains de nos travaux et expériences dans une structure expérimentale commune. Nous partageons ainsi notre expérience pour la mise au point du modèle pathologique avec une autre équipe afin de réduire le nombre d’animaux ; certains prélèvements pourront éventuellement servir pour les besoins d’autres études non liées à ce protocole et ainsi éviter d’utiliser des animaux supplémentaires. Nous portons un intérêt à publier nos résultats pour apporter les preuves de concept et enrichir la communauté scientifique pour utiliser nos travaux.
Raffinement
Pour réduire le mal être et la souffrance de l’animal lors de nos interventions : - L’entrée des porcs dans la structure expérimentale est programmée de façon à fournir aux animaux un environnement optimum (mise en loge d’expérimentation au minimum 7 jours avant l’intervention, avec un enrichissement du milieu). - Les porcs sont hébergés dans les conditions adaptées à leur espèce, logés sur copeaux, en groupes sociaux, avec jeux à leur disposition. Un suivi quotidien leur est apporté. Un vétérinaire assure le suivi sanitaire - Pour le transport vers le site d’expérimentation, l’animal déjà isolé dans un box de l’animalerie, à proximité de ses congénères la veille de son départ (pour la mise à jeun inférieure à 12 heures), est tranquillisé par un sédatif - Les animaux sont placés sous anesthésie générale pendant toute la procédure chirurgicale et d’imagerie ; pendant ces procédures, la douleur induite par l’ischémie est assurée par des perfusions continues et lentes d’antalgique. - Durant la procédure sous anesthésie générale, la température corporelle des animaux sera maintenue grâce à une couverture chauffante ou des bouillottes d’eau chaude (dont l’eau chaude sera régulièrement renouvelée). - Lors de la période de réveil, un protocole utilisé et validé chez l’homme et parfaitement maitrisé par notre équipe de chirurgiens cardiaques permet d’éviter la souffrance post chirurgicale. - Lors de la période post-opératoire, toute situation pouvant être invalidante et douloureuse sera prise en compte et notifiée dans une fiche d’évaluation de la douleur avec un scoring qui pourra faire l’objet de discussions et d’une prise de décision par les porteurs du projet pour apporter une solution éthique et appropriée. Le personnel animalier de l’EU sera formé au suivi comportemental de l’animal et au remplissage de cette fiche d’évaluation. - Pour la mise à mort, l’animal est toujours placé sous anesthésie générale avant induction d’une surcharge de barbiturique.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour notre étude est le porc adulte de taille réduite âgés de >24 mois, 55-70kg). Ce stade physiologique et cette taille "adulte" est nécessaire pour tester notre dispositif médical et être au plus près des conditions humaines. L'anatomie vasculaire est à ce stade plus proche de l’homme, ce qui en fait un modèle parfaitement adapté pour nos essais précliniques. Cette lignée nous permet de faire notre étude sur des porcs adultes représentatifs de l’âge où surviennent les accidents vasculaires cardiaques. Selon notre expérience, le porc charcutier (de type Large White) est moins intéressant, car pris à un âge très jeune (de 3 à 4 mois et pesant de ce fait 40/60 kg) pour avoir un poids manipulable, il présente une anatomie vasculaire plus éloignée et moins prédictive de ce qui se passe chez l’homme adulte. Nous utiliserons des porcs adultes de taille réduite, d’âge supérieur à 2 ans, de sexe mâle (castré) ou femelle, ayant un poids compris entre 55 et 70 kg. L’éleveur est le fournisseur exclusif de cette souche de porcs. Nous avons des données expérimentales importantes sur la lignée elle-même et sur ce type d’expérimentation nous permettant de limiter le nombre d’animaux à utiliser dans de nouveaux protocoles. Les résultats obtenus sur les animaux de cet âge sont convaincants et suffisants dans nos études. Ce modèle animal nous permet : - De travailler sur des animaux représentatifs de l’âge où surviennent les pathologies chez l’homme. - D’utiliser un dispositif médical qui sera l’exacte copie du DM utilisé en clinique humaine - De transposer les connaissances acquises vers une utilisation en clinique humaine.
Effets combinés de contaminants biologique et chimique sur l’anguille européenne
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pêchées à l'entrée des estuaires puis élevées quinze à dix-huit mois en aquarium, avec un taux de survie estimé à 30 %, 3 000 civelles sont collectées pour que 720 anguilles européennes entrent dans les procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est exposée à l'une de quatre doses de bisphénol S et reçoit, sous anesthésie, une intubation gastrique qui l'infeste d'un ver parasite se nourrissant de son sang. Elles sont tuées par groupes vingt, quarante et soixante jours après le début de l'exposition, les surnuméraires étant relâchées dans leur milieu d'origine. L'anguille européenne est classée en danger critique d'extinction depuis 2008, et le porteur en tire argument pour écrire qu'il n'est pas possible de recourir à des méthodes de remplacement de cette espèce.
Objectifs
Dans leurs environnements naturels, les animaux aquatiques sont exposés à une variété de contaminants biologiques et chimiques. Parmi les contaminants biologiques, les parasites affectent par définition la physiologie de leurs hôtes, les obligeant à réallouer leur énergie pour mieux résister. Parmi les contaminants chimiques, les agents plastifiants, tels que les dérivés du bisphénol, sont des polluants émergents potentiels, présents dans les débris plastiques et les eaux usées industrielles, qui contaminent l'environnement aquatique et induisent de multiples problèmes de santé qui nuisent à la survie des animaux exposés. Bien que de nombreuses études aient rapporté les effets de l'un ou l'autre, les mécanismes immédiats qui sous-tendent les effets néfastes induits par les parasites et les polluants organiques, agissant en combinaison, sur les organismes aquatiques n'ont pas encore été tous examinés. Dans ce projet, nous nous concentrerons sur 1) un ver parasite connu pour être pathogène de l’anguille européenne, espèce sentinelle des milieux aquatiques, menacée d’extinction (depuis 2008, UICN) mais non protégée et, 2) un agent plastifiant, le bisphénol S (BPS), polluant émergent particulièrement préoccupant à l’heure actuelle car de plus en plus utilisé dans l'industrie comme alternative au bisphénol A interdit en France dans tous les contenants alimentaires depuis 2015. L'objectif premier du projet est d'étudier les effets du BPS et/ou du ver parasite sur la physiologie de l’anguille européenne afin de répondre aux questions suivantes : 1. L'exposition à des doses croissantes de BPS rend t’elle l'anguille européenne plus vulnérable au parasite supposé impliqué dans son déclin ? 2. L'infestation par le parasite diminue t’elle la capacité de l'anguille à faire face à l'effet du BPS ? Enfin, au delà de l’apport de connaissance scientifique relatif à l’étude de l’impact combiné de ces deux contaminants, notre deuxième objectif est d’étudier le potentiel du mucus cutané de l’anguille (le mucus est la 1ère barrière des organismes aquatiques face à l'environnement extérieur) pour appréhender de manière non létale l'état de santé/stress de ce poisson.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de répondre aux exigences et recommandations prévues dans les plans de gestion de l’anguille européenne à savoir : 1) améliorer les connaissances sur les mécanismes induits par une double contamination chimique et biologique des anguilles et identifier la réponse de ce poisson vis-à-vis des 2 contaminants ciblés (BPS et le ver parasite individuellement ou en combinaison), 2) développer des biomarqueurs à partir du mucus cutané de l'anguille afin d'évaluer son état de santé/stress à l'aide de méthodes qui ne nécessitent pas de tuer les animaux et, 3) évaluer la potentielle menace, actuelle ou future, induite par le BPS sur l’anguille afin de proposer des recommandations pour sa conservation (niveau seuil de BPS dans l’environnement).
Procédures
Exposition à 4 doses différentes de Bisphénol S et à une infestation unique par un ver parasite (intubation gastrique), cette dernière étant effectuée sous anesthésie. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales à 3 pas de temps après le début des procédures soit 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou infestation.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables auxquels on peut s’attendre seront à priori assez réduits dans la mesure où les doses de contaminants chimique (BPS) et biologique (parasite) utilisées dans les procédures sont des doses relativement faibles et environnementales et que la durée de la procédure est assez courte (60 jours). Cependant, on peut toutefois s’attendre à une légère anémie des poissons infestés par le ver parasite qui se nourrit du sang de l’anguille ainsi qu'à de potentielles modification de comportement, réduction de vivacité ou diminution de l'embonpoint à la plus forte dose du contaminant chimique.
Devenir
Les animaux soumis aux procédures expérimentales seront successivement euthanasiés 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou contamination.
Remplacement
Ce projet visant à évaluer l’impact de 2 contaminants (chimique émergeant, le BPS, et biologique pathogène, le ver parasite Anguillicola crassus) sur la physiologie de l’anguille européenne (espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008 par l’UICN), il n’est pas possible d’utiliser des méthodes de remplacement de cette espèce.
Réduction
Le taux de survie des juvéniles d'anguille, après collecte et au début de leur mise en élevage en aquarium, estimé à 30%, ainsi que les potentiels échecs des infestations expérimentales par le parasite et/ou des contaminations chimiques nous contraignent à collecter et élever 3000 juvéniles d'anguille pour la bonne réalisation de l’ensemble du projet (720 juvéniles d'anguille feront l'objet des procédures expérimentales). En effet, la nécessité du maintien des civelles en élevage pendant 15 à 18 mois avant la mise en œuvre des procédures expérimentales sont des contraintes fortes qui imposent cette démarche. A la fin du projet, les anguillettes surnuméraires n’ayant pas fait l’objet des procédures expérimentales seront relâchées dans leur milieu d’origine.
Raffinement
Dans le cadre de notre projet, plusieurs mesures seront prises pour limiter inconfort, stress et souffrance des individus depuis leur collecte jusqu’à la fin des procédures expérimentales. La manipulation des juvéniles d’anguille sera effectuée à l’aide d’une épuisette à maille fine afin de ne pas les blesser, en pratiquant des gestes lents et délicats afin de ne pas les stresser tout en permettant une collecte rapide et non traumatisante. Par ailleurs, les juvéniles d’anguille étant grégaires et fuyant la lumière, des tuyaux en PVC alimentaire seront placés dans les aquariums pour que ces jeunes stades puissent s’y regrouper et s’y cacher. De même, un éclairage indirect sera privilégié pendant les temps d’éclairement afin de réduire au maximum tout stress induit par une intensité lumineuse trop forte sur les aquariums et de simuler au sein de ceux-ci des zones moins éclairées, refuges naturels pour ces animaux qui se cachent durant la journée. L’alimentation des juvéniles d’anguille sera également adaptée afin de les habituer progressivement à passer à une nourriture artificielle inerte. De plus, toutes les mesures (poids et taille) ainsi que les infestations expérimentales par le ver parasite s’effectueront sous anesthésie, optimisée pour ces jeunes stades de vie.
Choix des espèces
L'anguille européenne joue un rôle écologique majeur et revêt une valeur économique importante. Suite à la diminution drastique de sa population, elle est classée comme espèce en danger critique d’extinction par l’IUCN (2008) mais non protégée. Parmi les facteurs potentiellement responsables de l'effondrement de sa population figurent les contaminants chimiques (dont le BPS) et biologiques (parasite Anguillicola crassus, pathogène de l’anguille). Dans ce contexte de fort déclin et volonté de contribuer à sa préservation (R(CE) 1100/2007), il convient en 1er lieu de combler le manque de connaissances lié à l’impact de ces contaminants agissant en combinaison (conséquences physiologiques du stress induit). Il devient également urgent de tenter de développer un outil non létal de l'état de santé/stress de ce poisson pour en assurer le suivi en conditions naturelles (développement de protocoles non létaux inscrit dans le Plan de Gestion pour les Poissons Migrateurs 2022-2027, volet anguille). Les individus qui feront l’objet des procédures expérimentales sont des juvéniles d’anguille qui auront été maintenus en élevage pendant 15 à 18 mois après leur collecte dans le milieu naturel. En effet, nous devons collecter des individus d’une même cohorte (même âge) à leur entrée dans les eaux de transition (estuaires, lagunes…) afin qu’elles soient exemptes du parasite, dont nous voulons étudier l’impact, avant le début de l’expérience (dans les conditions naturelles, elles s’infestent dans les eaux de transition). En outre, la période d'élevage de 15 à 18 mois avant le début de l’expérimentation est nécessaire pour permettre aux anguillettes d'atteindre une taille suffisante pour être infestées expérimentalement par le parasite (intubation gastrique).
Évaluation de l’effet thérapeutique du transfert adoptif de lymphocytes T humains optimisés dans le traitement de tumeurs solides humaines dans un modèle de souris immunodéficientes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
400 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules cancéreuses humaines dans le flanc puis, pendant trois semaines, une injection intraveineuse hebdomadaire de lymphocytes T modifiés. Une tumeur pousse dans leur flanc. Toutes sont tuées par dislocation cervicale après anesthésie, dès qu'un signe clinique sévère ou trois signes notables apparaissent, pour des analyses effectuées sur des prélèvements post mortem. Le porteur cherche des preuves de concept susceptibles de justifier ces immunothérapies chez l'humain, alors que les essais cliniques déjà menés avec ces cellules ont montré une efficacité anticancéreuse qu'il qualifie lui-même de trop limitée.
Objectifs
L’immunothérapie, devenue une thérapie de référence pour certains cancers, consiste à améliorer les mécanismes de défenses spécifiques du patient pour éliminer le cancer. Parmi les différentes stratégies, l'immunothérapie par transfert adoptif de cellules immunitaires repose sur l’administration à un patient de ses propres cellules immunitaires reconnaissant et éliminant spécifiquement les cellules cancéreuses, appelées « lymphocytes T cytotoxiques ». Des essais cliniques d’injections de ces cellules immunitaires ont déjà été réalisés chez l’humain et, s’ils ont montré une bonne tolérance, leur efficacité anti-cancéreuse est encore trop limitée. Ce programme de recherche préclinique vise à évaluer la faisabilité et l’efficacité thérapeutique, dans le traitement du cancer de la peau et du cancer colo-rectal, d’immunothérapie par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés. Afin que cette étude soit la plus représentative possible de la pathologie humaine, des souris immunodéficientes (n’ayant plus de système immunitaire) recevront dans un premier temps une greffe de cellules cancéreuses humaines puis dans un second temps des injections de ces lymphocytes T humains optimisés. Cette optimisation passe par des modifications génétiques qui ont pour but de potentialiser les fonctions anti-cancéreuses de ces lymphocytes T.
Bénéfices attendus
L’objectif principal de ce programme est d’obtenir, à l’aide de ces modèles "in vivo", des preuves de concept précliniques pouvant justifier la mise en place d’immunothérapies par transfert adoptif de lymphocytes T cytotoxiques optimisés, dans le traitement de cancers. En fonction des données de faisabilité et d’efficacité obtenues, ces travaux pourront aussi permettre de prioriser le ciblage de certaines molécules exprimées par ces lymphocytes T.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection en sous-cutanée de tampon salin (avec ou sans cellules cancéreuses) dans le flanc au premier jour de l’étude dans chaque procédure. La procédure d’injection des cellules cancéreuses dans le flanc sera réalisée sous anesthésie. Dans les procédures 2, 3 et 4, les animaux seront également soumis à des injections hebdomadaires (à partir du 7ème jour de l’étude) en intraveineuse d’un tampon salin (avec ou sans cellules immunitaires optimisées) pendant 3 semaines. Ces injections en elles-mêmes sont de l’ordre de la minute.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis aux nuisances ou effets indésirables suivants : - une douleur intrinsèque à l’injection (piqûre) dans le flanc ou en intraveineuse, de cellules dans un volume donné de tampon salin. - un refroidissement des souris lors de l’anesthésie. - le développement d’une grosseur tumorale dans le flanc.
Devenir
Tous les animaux inclus dans le protocole seront mis à mort, car des études ex-vivo seront effectuées à partir de prélèvements post-mortem effectués sur les animaux.
Remplacement
Remplacement : Les paramètres observés dans cette étude ne peuvent pas à ce jour être remplacés par des procédures "in vitro". L'évaluation chez l'humain du bénéfice thérapeutique de l’administration de cellules immunitaires, dans le cadre de traitements anti-cancéreux, nécessite le développement d'études précliniques permettant de vérifier la faisabilité de ces thérapies et de détecter la survenue de premiers effets secondaires délétères. Concernant ces immunothérapies anti-cancéreuses, il est établi que les cellules cancéreuses se comportent différemment "in vitro" et "in vivo", en terme de croissance, de résistance à la mort cellulaire et de capacité à instaurer un environnement délétère pour le système immunitaire. Notre étude permet d'évaluer l'efficacité du traitement proposé en conditions physiologiques (notamment en termes de migration des cellules immunitaires injectées au niveau des cellules cancéreuses), et de définir les modalités optimales d’administration de ces cellules immunitaires. Compte-tenu de la difficulté de mise en place d’essais cliniques et de recrutement de patients éligibles, il paraît clair que les informations obtenues suite à ces travaux précliniques, couplées aux données obtenues "in vitro", auront une importance capitale lors du transfert en clinique.
Réduction
Réduction : Le nombre d'animaux a été réduit à des lots de 5 souris (procédure 1) et de 10 souris (procédures 2, 3 et 4). D'un point de vue éthique, le nombre d'animaux utilisé ici est réduit au minimum tout en permettant d’obtenir des différences statistiquement significatives. En effet, plusieurs études publiées dans notre domaine de recherche, et nos propres études antérieures avec des modèles animaux similaires décrivent l'utilisation de 5 animaux par lot pour le développement de greffes de cellules cancéreuses humaines, et 10 animaux par lot pour l’évaluation du bénéfice thérapeutique de l’administration de différents types de lymphocytes T.
Raffinement
Raffinement : Pour leur confort, les animaux seront hébergés dans des cages adaptées (groupe de 5 souris par cage maximum), avec un enrichissement par frisottis et/ou dôme et un accès libre à l’eau et à la nourriture. De façon à diminuer le stress, les différentes procédures seront réalisées sous anesthésie. Le bien-être des souris sera surveillé tout au long de l'étude avec une évaluation des signaux généraux (visite 3 fois par semaine en présence d’un signe clinique notable et visite quotidienne en présence de deux signes cliniques notables. De plus, en présence de trois signes notables ou un signe sévère : les animaux seront mis à mort après une anesthésie, par dislocation cervicale. Les signes cliniques sont basés sur le comportement/mouvement, l’aspect physique extérieur, la manipulation, la consommation de nourriture, l’excrétion, l’évolution du poids, l’évolution de la tumeur, l’aspect de la tumeur).
Choix des espèces
Les souris sont des modèles d'étude pertinents, notamment en immunothérapie pour le traitement des cancers, de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, ...). Le développement de greffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de sujets immunodéficients pour éviter le rejet de greffe, tels que les souris NSG. Ces souris permettent la croissance de nombreuses lignées tumorales humaines et l'utilisation thérapeutique de cellules immunitaires d'origine humaine. Les souris seront utilisées à partir de 9 semaines (période où le poids se stabilise), pour des raisons de maturité du développement squelettique, facilitant non seulement le geste lié aux greffes de cellules cancéreuses et de lymphocytes T, mais renforçant aussi la pertinence des effets thérapeutiques.
Evaluation des mécanismes de devenir des oligodendrocytes dans un modèle d’atrophie multisystématisée
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une heure trente de chirurgie intracérébrale pour injecter un virus qui fera exprimer une protéine toxique dans les cellules de soutien du cerveau, puis quatre à cinq prises de sang à la queue : 320 rats Sprague-Dawley subissent ce protocole dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélever leur cerveau. L'induction de la maladie ralentit leur activité locomotrice et dégrade leur motricité fine. L'objectif déclaré est de comprendre les mécanismes de l'atrophie multisystématisée, maladie neurodégénérative sans traitement, et d'identifier des marqueurs sanguins qui seront ensuite vérifiés chez des patients. Le porteur annonce deux tests comportementaux répétés quatre à six fois sur des rats vigiles, l'un de trois minutes sur trois jours, l'autre d'une heure, sans indiquer à aucun moment lesquels.
Objectifs
L'atrophie multisystématisée est une maladie neurodégénérative fatale avec un handicap moteur sévère. Il n'existe actuellement aucun traitement disponible pour atténuer la gravité des symptômes ou la progression clinique de cette maladie orpheline. Elle se caractérise au niveau cellulaire par l'accumulation et l'agrégation d’une protéine dans les oligodendrocytes (cellule de soutien essentielle à la fonction et à la survie des cellules nerveuses) entrainant une neurodégénérescence. Dans ce projet, des rats recevront une injection de virus permettant l’expression de cette protéine spécifiquement dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires responsable du dysfonctionnement des oligodendrocytes et aboutissent à leur perte de fonction dans le cerveau en utilisant des approches comportementales (évaluation motrice), histologiques et cellulaires. De plus les prélèvements de sang réalisés chez les animaux à différentes étapes du développement de la maladie permettront d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour lesquelles des stratégies pourraient être développées afin de prévenir ou de corriger les altérations qui touchent les oligodendrocytes, dans le but de restaurer leur fonctionnement normal. Les marqueurs d'oligodendrocytes qui pourront être identifiés dans le modèles précliniques seront ensuite validés chez des patients atteint d’atrophie multisystématisée.
Bénéfices attendus
Le projet actuel propose d’identifier les mécanismes moléculaires responsables du dysfonctionnement des oligodendrocytes et la mise en évidence de biomarqueurs au niveau sanguin. Ces résultats de recherche amélioreraient considérablement la compréhension de la physiopathologie de l’atrophie multisystématisée d’une part et auraient des implications considérables pour les soins aux patients et le développement thérapeutique et de biomarqueur dans l’atrophie multisystématisée d’autre part.
Procédures
- Pour 320 animaux : test comportemental 1 d’une durée de 3 minutes sur 3 jours et test comportemental 2 d’une durée d’1h sur une journée. Ces tests comportementaux sont réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (4 à 6 fois maximum en fonction des lots de rats) sur animaux vigiles. - Pour 320 animaux : prélèvement sanguin au niveau de la queue sur animaux anesthésiés d’une durée de 3 minutes (4 à 5 fois maximum en fonction des lots de rats) - Pour 320 animaux : chirurgie intracérébrale réalisée sur animaux anesthésiés et sous couverture antalgique périphérique et locale, d'une durée d'1 heure 30. - Pour 160 animaux : perfusion intracardiaque réalisées sur animaux anesthésiés par une double dose d'un mélange d'anesthésique et antalgique permettant également une couverture antalgique périphérique.
Impact sur les animaux
- La chirurgie stéréotaxique peut induire une légère perte de poids et un stress notamment au réveil, la douleur occasionnée est soulagée par des antalgiques pendant et après la chirurgie. - L’induction de l’AMS va induire un ralentissement global de l’activité locomotrice et des difficultés de motricité fine. - Prélèvements de sang peuvent ponctuellement induire un hématome au niveau de la veine caudale. - Petit inconfort de la contention ou léger stress lors de la pesée hebdomadaire.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort en fin afin de récuperer les ceveaux et de réaliser des analyses histologiques, cytologique et transcriptionnel.
Remplacement
Malgré des recherches sur des modèles cellulaires dans l’atrophie multisystématisée, dans le cadre de ce projet basé sur la compréhension du développement de la maladie et de ces effets comportementaux ainsi que l’analyse de biomarqueurs sanguins le modèle animal entier ne peut pas être substitué car nécessite l’intégrité des réseaux neuronaux et ne peut donc pas être réalisée in vitro, ni in silico.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque groupe expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance. Ces critères impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 20 animaux par condition expérimentale par suivi longitudinal et par sexe soit 320 rats afin d'obtenir des résultats statistiques interprétables.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (actes réalisés par du personnel expérimenté, médicamentation définie avec le vétérinaire référent et les tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec surveillance de la température corporelle, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgique. Le traitement antalgique sera poursuivi au lendemain de la chirurgie voire 48h post- opératoire si l'état de l'animal le nécessite. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale de ceux-ci. Des critères d'arrêt de souffrances, appelés points limites terminaux sont définis. Les animaux sont hébergés deux par cage autant que possible (isolement de maximum 7 jours après la chirurgie restant une démarche de soin exceptionnelle), avec eau et nourriture ad libitum. L’hébergement en animalerie est réalisé en portoir ventilé, dans des pièces à température et hygrométrie régulées et contrôlées selon les normes en vigueur. Un enrichissement (bâtons à ronger et baguette de papier compressé) est disposé dans les cages d'hébergement. Un tunnel sera également rajouté si les animaux nécessitent un isolement. Les animaux sont manipulés au minimum de façon hebdomadaire tout au long du projet permettant une habituation à un binôme d’expérimentateurs, qui reste le même tout au long de l’étude. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus) de souche Sprague-Dawley. Il s’agit de l’espèce la plus pertinente pour l’étude de l’atrophie multisystématisée. La lignée Sprague-Dawley a été choisie en raison des données déjà disponibles dans la modélisation de la maladie et de la similitude avec la pathologie humaine. Les animaux utilisés seront des animaux adultes (8 semaines au début des tests comportementaux réalisés avant la chirurgie) de façon à se rapprocher du stade de développement de l’atrophie multisystématisée.
Pharmacothérapies pour améliorer la structure-fonction artérielle dans des conditions physiopathologiques liées à des altérations des fibres élastiques (1/2).
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Placées quatorze jours dans une atmosphère appauvrie en oxygène, ou traitées trois mois par un composé mêlé à l'eau de boisson, ou injectées trois fois dans la veine de la queue, 2 475 souris subissent ensuite des mesures de pression artérielle à l'état vigile, trois fois par jour pendant trois jours, puis une échographie cardiaque de trente minutes sous anesthésie. Les procédures vont d'un niveau de souffrance léger à sévère. Deux tiers des souris portent une délétion du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1 qui altère leurs vaisseaux dès la naissance et peut provoquer des sténoses ou des anévrismes, et celles maintenues jusqu'à vingt-quatre mois pour former les groupes âgés peuvent se retrouver seules quand leurs congénères meurent de vieillesse. Aucune ne sort vivante de ce projet : toutes finissent par un prélèvement d'organes vitaux mené sous anesthésie sans réveil, destiné à l'artériographie, à l'histologie et à la culture de cellules musculaires lisses.
Objectifs
L'élasticité des grosses artères est essentielle pour permettre une perfusion correcte des tissus. Les fibres élastiques, responsables de l'élasticité artérielle, sont composées à 90% d'élastine (Eln) et à 10% de microfibrilles riches en fibrilline-1 (Fbn1), et ne sont produites que jusqu'à la fin de l'adolescence, ne faisant ensuite que fonctionner tout en se dégradant (avec perte d'élasticité artérielle) jusqu'à la fin de la vie. Cette dégradation de l'élasticité artérielle a des conséquences délétères majeures sur la fonction cardiaque, la pression et la circulation sanguines, et la perfusion des organes. C'est ce qui advient au cours du vieillissement normal, mais aussi dans les maladies génétiques liées à l'organisation anormale des fibres élastiques : syndrome de Williams-Beuren (rétrécissements artérielles dûs à la déficience en Eln) et syndrome de Marfan (anévrismes dûs à la déficience en Fbn1). Des études récentes ont également montré que l'altération des fibres élastiques et les dysfonctions artérielles correspondantes (dont la rigidification artérielle) sont associées à l'hypoxie intermittente générée par le syndrome d'apnée obstructive du sommeil, qui concerne 10-20% de la population générale et jusqu'à 30-50% des personnes âgées. Il a préalablement été démontré que 3 traitements pharmacologiques, administrés à des souris, peuvent, dans des situations fixées, protéger et/ou restaurer la production des fibres élastiques et diminuer la rigidité artérielle. Ces 3 traitements n'ayant jusqu'alors pas été appliqués dans les mêmes situations pathologiques, ce projet propose de comparer de manière systématique chez les mêmes souris l'efficacité des 3 traitements, dans trois modèles pathologiques présents au laboratoire, en fonction du sexe et de l'âge. Le but ultime est de proposer le traitement le plus efficace pour chacune des trois pathologies, chez les patients humains. Le projet sera mené dans 2 établissements utilisateurs qui apporteront chacun l'accès à des techniques spécifiques différentes.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche est motivé par l'importance en santé publique de la dégradation des fibres élastiques artérielles dans différentes situations physiopathologiques comme le vieillissement, la déficience génétique du gène de l'élastine ou de la fibrilline-1, ou l'hypoxie intermittente causée par le syndrome d'apnée du sommeil. Ceci conduit à des dysfonctions artérielles et à l'hypertrophie et l'insuffisance cardiaques induites, couplée à une hémodynamique altérée, une mauvaise perfusion et une dysfonction des organes. La réparation des fibres élastiques dégradées est donc un enjeu thérapeutique majeur. La littérature fait état de nombreux travaux à ce sujet (plusieurs milliers, mots-clefs: elastic fiber artery), montrant l'intérêt général pour comprendre les mécanismes et améliorer ou restaurer l'élasticité artérielle. Les résultats obtenus sur ces modèles de souris permettront de vérifier et de comparer les efficacités des trois traitements pharmacologiques dans le maintien ou l'amélioration de l'élasticité artérielle et des paramètres physiologiques associés chez des animaux modèles de 3 pathologies humaines. Suivant la pathologie, le traitement le plus efficace pourra s'avérer ne pas être le même, et nos résultats permettront donc de proposer une nouvelle stratégie thérapeutique la plus appropriée chez les patients atteints par chacune de ces trois affections.
Procédures
1/3 des animaux seront exposés à la normoxie ou à l'hypoxie durant 14 jours avant leur mise à mort. Les autres animaux (2/3) ont un gène délété qui altère, dès la naissance, la plasticité et l'élasticité de leurs vaisseaux : 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de l'élastine ou seront les animaux témoins de ceux-ci, et 1/3 des animaux seront déficients pour le gène de la fibrilline-1 ou seront les animaux témoins de ceux-ci. Dans chacun de ces 3 groupes d'animaux, les effets de 3 traitements pharmacologiques seront étudiés : un premier tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le premier traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), un deuxième tiers des animaux de chaque groupe sera traité durant 3 mois avant la fin de l'étude par le deuxième traitement pharmacologique (dans l'eau de boisson), et le dernier tiers des animaux de chaque groupe sera injecté dans la veine de la queue 3 fois à 5 jours d'intervalle juste avant la fin de l'expérimentation avec le troisième traitement pharmacologique ou du sérum physiologique (durée de l'injection 30 secondes). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jours pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives, par sphygmomanométrie à la queue (tail-cuff). La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de l'ensemble des procédures, des prélèvements d'organes seront réalisés sous anesthésie et analgésie, entrainant la mort des animaux. Ces organes seront utilisés par la suite dans des expériences de physiologie, de biochimie, d'histologie et de biologie moléculaire, et pour réaliser des cultures de cellules musculaires lisses vasculaires. De plus, les animaux mis en vieillissement pour former les groupes des souris âgées de 24 mois auront, par conséquent, un hébergement de longue durée. Les expériences d'échographie sur animal anesthésié seront réalisées dans l'EU2 ; toutes les autres expériences seront réalisées dans l'EU1, porteur principal du projet.
Impact sur les animaux
La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Les animaux en hébergement longue durée pour du vieillissement pourraient se retrouver isolés si leurs congénères venaient à mourir de vieillesse. La mise en hypoxie des animaux entraine une perte de poids les premiers jours le temps de l'adaptation à la restriction d'air de façon récurrente et répétée et une diminuation de leur prise alimentaire. Les animaux génétiquement modifiés ont une perte l'élasticité et de plasticité de leur vaisseaux pouvant conduire à des sténoses ou à des anévrismes. L'administration des traitements testés devraient limiter les effets délétaires de l'hypoxie ou celles induites par les modifications génétiques, voire améliorer la plasticité et l'élasticité vasculaire.
Devenir
Tous les animaux se verront appliquer un prélèvement d'organes vitaux terminal au cours d'une procédure sans réveil. Aucun animal ne restera donc en vie à la fin des procédures expérimentales. Ces prélèvements d'organes permettront des études d'artériographie de pression, d'histologie classique ou en microscopie synchrotron, de biologie moléculaire (expression des gènes et protéines liés aux fibres élastiques) et, concernant l'aorte, pour généréer des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires.
Remplacement
Remplacer : la mécanique et la réactivité vasculaires reposent sur une interaction fonctionnelle des systèmes nerveux et vasculaires, ainsi qu'une interaction entre les signaux circulants et les différents types cellulaires vasculaires, aussi bien que sur l'interaction entre les différents types de cellules vasculaires structurées de manière très précise dans la paroi, nécessitant forcément une approche in vivo. Aucune méthode alternative ne peut donc se substituer à l’utilisation des animaux pour la réalisation de notre projet car il requiert une approche intégrée.
Réduction
Réduire : Sur la base des résultats de nos expériences publiées antérieurement et du niveau de dispersion des données constaté chez les souris, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre l’interprétation statistique de nos résultats : 12 animaux par groupe chez les adultes (16 par groupe à mettre en vieillissement pour obtenir 12 animaux agés, du fait du taux de décès spontané avant 24 mois) sont prévus mais le maximum de procédures expérimentales non-sévères seront réalisées sur tous les animaux, ce qui permet de ne pas devoir recourir à des groupes d'animaux séparés/additionnels pour réaliser des procédures différentes, sauf nécessité absolue due à l'impossibilité de réaliser de multiples études de physiologie sur différents organes vivants en même temps. Aussi, nous aurons besoin de constituer des groupes témoins non-traités pour chaque traitement, sans pouvoir les mutualiser de manière générale. Cependant, deux des traitements pharmacologiques étant tous deux simplement ajoutés à l'eau de boisson des animaux, nous constituerons des groupes témoins mutualisés pour ces deux traitements (animaux buvant de l'eau de boisson normale), ce qui permettra une réduction sensible du nombre d'animaux utilisés. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo et in vitro post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, un certain nombre d'expériences de signalisation cellulaire seront menées sur des primocultures de cellules musculaires lisses vasculaires issues de nos souris, ce qui permettra de réduire encore le nombre des animaux nécessaires pour atteindre nos objectifs.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions de l'hébergement de longue durée des animaux en vieillissement, seront particulièrement surveillées afin de limiter au maximum les risques de décès spontané liés à l'âge. L'organisation des cages sera optimisée (mise en place d’enrichissement supplémentaire pour les animaux âgés en situation d’isolement, croquettes mouillées au sol dans les cages pour les animaux âgés). Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Aussi, les lignées de souris génétiquement déficientes pour l'élastine ou la fibrilline-1 sont à phénotype dommageable car les individus homozygotes meurent quelques jours ou semaines après la naissance. Les animaux homozygotes n'étant pas un objet de notre étude, ils ne seront pas produits, en n'effectuant que des croisements d'animaux de type sauvages avec des animaux hétérozygotes. En raison d'une mortalité intra-utérine partielle des animauxhétérozygotes pour l'élastine, les mères seront particulièrement surveillées en période périnatale (deux fois par jour au lieu d'une) de façon à détecter au plus vite tout problème et appliquer les mesures de soin ou critères d'arrêt définis. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement.
Choix des espèces
Nos travaux évalueront l'efficacité réparatrice de trois traitements pharmacologiques sur les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme (déficits génétiques responsables des syndromes de Williams-Beuren et de Marfan, et hypoxie intermittente due à l'apnée obstructive du sommeil), en fonction de l'âge et du sexe. Notre étude concerne la physiologie cardiovasculaire et les fibres élastiques artérielles altérées dans des situations physiopathologiques existant chez l'Homme. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche fondamentale dans ce domaine, ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec nos résultats antérieurs et avec la littérature. Les souris utilisées dans le cadre de ce protocole sont âgées de 6 mois (jeunes adultes) et de 24 mois (âgées), ce qui correspond aux âges ciblés pour une vérification optimale des potentialités thérapeutiques des trois traitements pharmacologiques sur nos modèles murins physiopathologiques.
FLAVORESIST : Phénotypage de la résistance à la flavobactériose d’une population de truites commerciales pour une amélioration progressive par sélection génétique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Les truites qui atteignent le point limite défini par le projet sont sorties du protocole et tuées par surdosage d'anesthésique. 3 710 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures dont le niveau de souffrance déclaré va de léger à sévère. Après une mise à jeun de vingt-quatre à quarante-huit heures, les alevins de un à dix grammes sont infectés par la bactérie de la flavobactériose, par bain ou par une injection calibrée pour en tuer la moitié, l'infection provoquant une septicémie hémorragique, une nage erratique et une nécrose au point d'injection. Le porteur reconnaît qu'aucun élément concret d'appréciation de la souffrance éprouvée pendant la maladie ne figure dans la littérature. La finalité est commerciale : fournir aux entreprises des marqueurs génétiques de résistance et permettre la vente d'œufs de truite moins sensibles à la bactérie.
Objectifs
Le développement de l’aquaculture est freiné par l’impact de maladies infectieuses. La mise au point de stratégies innovantes permettant d’améliorer la santé des animaux d’élevage et de limiter le recours aux antibiotiques est essentielle à l’avenir du secteur. L’étude porte sur la bactérie responsable de la flavobactériose d’eau froide qui provoque chez les salmonidés une septicémie hémorragique et peut conduire à des mortalités considérables dans les piscicultures. Cet agent pathogène est l'une des causes les plus courantes de maladie bactérienne en production aquacole de truite arc-en-ciel en eau douce. Aucun vaccin n'est actuellement commercialisé et le traitement repose uniquement sur l’antibiothérapie. Il existe donc une marge de progrès évidente, non seulement du point de vue de la rentabilité économique des entreprises mais aussi pour des raisons de durabilité environnementale et de perception de la qualité des produits par les consommateurs. L'objectif du projet est de réduire les lourdes pertes dues aux infections dans les piscicultures (mortalités, coût des traitements…), mais également de participer à l’amélioration de l’image de marque de la pisciculture en réduisant les traitements médicamenteux. Bien que justifiée scientifiquement par l’impact positif global qu’elle peut générer sur la santé animale, la mise en œuvre de la sélection génétique de la résistance nécessitera de soumettre un nombre important d’animaux à des infections expérimentales. Néanmoins, l’ensemble du projet restera en accord avec la demande sociétale pour le respect du bien-être animal qui est forte et le besoin de développer des méthodes innovantes respectant le principe des 3R évident. Les objectifs du projet sont de consolider les connaissances acquises sur la résistance à la flavobactériose, afin de fournir aux entreprises en fin de projet une stratégie optimale d’intégration des caractères génétiques de résistance dans leurs schémas de sélection. Les zones du génome impliquées dans la variabilité du caractère de résistance seront comparés pour 2 souches bactériennes responsables des épisodes infectieux grâce à la réalisation d’infections sur une population commerciale de truites. D’autre part, une méthode alternative de caractérisation, conforme aux principes de raffinement, sera évaluée.
Bénéfices attendus
LLes résultats attendus en fin de projet sont les suivants : - L’évaluation de l’impact du type de la souche bactérienne, utilisée pour la sélection sur les caractères de résistance identifiés. - L’identification et la validation expérimentale de marqueurs génétiques de résistance pour une population commerciale. Ces connaissances permettront, à très court terme, la commercialisation d’œufs de truite ayant une résistance améliorée, avec un impact direct de réduction des épisodes infectieux de flavobactériose dans les entreprises de production de truite. - L’évaluation dans des conditions opérationnelles d’une méthode de mesure de la résistance basée sur un paramètre précoce (avant la mort due à l’infection). Cette méthode de raffinement des procédures pourrait permettre une avancée importante, en réduisant la souffrance animale lors des futurs essais de sélection de la résistance à la flavobactériose.
Procédures
Les infections expérimentales réalisées par injection sont réalisées sous anesthésie et par une seule injection par poisson en moins de 15 secondes. Le nombre total d’animaux soumis à des infections par injection sera de 240 ou 2640 poissons suivant le mode d’infection défini pour le challenge de sélection (2400 poissons). En effet, celui-ci sera réalisé par bain si le pré-challenge confère une mortalité comprise entre 30% et 70% sinon par injection d’une dose conférant 50% de mortalité (1 seule et sous anesthésie).
Impact sur les animaux
Les manipulations (tri, pesée, transfert, injection) ainsi que la mise à jeun 24 ou 48 heures avant l’infection engendrent un stress chez les animaux. Aucun élément d’appréciation très concret de la souffrance éprouvée lors de l’évolution de la maladie n’est disponible dans la littérature. Cependant, le niveau de douleur sera considéré nul chez les contrôles non infectés en bonne santé, et modéré à sévère chez les animaux infectés chez qui l’infection peut conduire à la mort. L’infection peut également conduire certains individus à une perte d’appétit, un excès d’excrétion de fèces, une nécrose au point d’infection et une nage erratique.
Devenir
Tous les animaux de ce projet entreront dans un protocole d'infectiologie et ne pourront être réutilisés pour d'autres finalités, ils seront donc mis à mort en fin d'expérience.
Remplacement
L’étude des caractères génétiques impliqués dans la résistance aux maladies infectieuses chez le poisson nécessite d’établir des liens entre génétique du poisson et caractère de résistance/sensibilité à l’agent pathogène. Le projet que nous menons chez la truite arc-en-ciel ne peut être réalisé sur cultures cellulaires, car il est nécessaire, pour identifier les marqueurs génétiques de résistance, de soumettre les animaux à des épreuves d’infections expérimentales permettant d’obtenir des profils individuels de résistance/sensibilité. Il n’existe pas, à l’heure de test in vitro permettant l’obtention de ce type de données.
Réduction
Les résultats des expérimentations sont traités selon une méthodologie statistique qui prend en compte les performances des individus testés pour estimer les valeurs génétiques des autres animaux du même lot (frères/sœurs) et permettre de les classer entre eux. Pour que ces estimations soient suffisamment précises, elles nécessitent un grand nombre de données et donc d’individus testés. Toutefois, le nombre d’animaux est réduit au seuil de la pertinence statistique et scientifique pour les approches utilisées. Les plans expérimentaux sont conçus selon des simulations qui ont permis de déterminer les effectifs d’animaux minimums à tester permettant des estimations de valeurs génétiques suffisamment précises.
Raffinement
Tout au long de leur vie, les poissons sont élevés dans les meilleures conditions possibles. Ils sont nourris 2 fois par jour. Ils sont toujours en présence de congénères et les biomasses maximales sont rigoureusement respectées. La qualité de l’eau est optimale et surveillée en permanence. Les animaux sont observés au moins deux fois par jour. Les individus atteignant le point limite défini dans le projet sont sortis du protocole et euthanasiés (surdosage d’anesthésique par bain). Une anesthésie par bain est réalisée avant de procéder à l’injection. Une partie du projet est dans une optique de raffinement des protocoles utilisés en infectiologie (euthanasie et prélèvement des animaux avant l’apparition des signes cliniques).
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel est le modèle classique de la pisciculture continentale européenne : c’est la principale espèce d’élevage en France et c’est l’hôte naturel de la bactérie pathogène étudiée dans ce projet. Il est nécessaire de travailler sur des poissons vivants issus des partenaires privés afin de mettre en place une mesure individuelle de la résistance au pathogène et permettre in fine une sélection des individus génétiquement liés conservés dans le noyau de sélection de leur population commerciale. Pour l’évaluation de la sensibilité/résistance à l’infection par la bactérie d’intérêt, les animaux sont utilisés au stade alevin, soit à des stades relativement précoces (env 1-5 gr pour les infections par bain et 5 à 10g pour les infections par injection) où la sensibilité à des infections est maximale. C’est à ce stade que les animaux sont le plus sensibles dans les élevages à cette pathologie.
Induction de la pathologie TDP-43 chez des souris à partir de protéines pathologiques issues du système nerveux central de patients atteints de Sclérose Latérale Amyotrophique sporadique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une semaine d'acclimatation, puis une injection dans le liquide céphalorachidien chaque semaine pendant huit semaines, sous anesthésie générale à chaque fois, et entre deux injections des tests de motricité et de force musculaire de dix minutes chacun. Un test de mémoire intervient au deuxième ou au troisième mois, des prélèvements de sang ont lieu en cours d'étude, et un mois après la dernière injection les 396 souris sont tuées pour prélever des structures de leur système nerveux central. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et le porteur écrit qu'il est probable que les souris injectées perdent peu à peu leur mobilité et leur masse musculaire, la mise à mort devant intervenir avant qu'elles ne puissent plus se déplacer, s'alimenter ni boire. Ce qui leur est inoculé provient du système nerveux central de patients atteints de sclérose latérale amyotrophique, dans l'espoir de reproduire chez elles une maladie dont le porteur dit qu'aucun modèle animal fiable n'existe.
Objectifs
La Sclérose Latérale Amyotrophique (ou maladie de Charcot) est une maladie neurodégénérative qui touche les neurones du cerveau et de la moelle épinière, responsables du mouvement. La maladie débute en moyenne à l’âge de 60 ans et est responsable d’une paralysie progressive, de troubles de la parole et de la déglutition, et de difficultés respiratoires aboutissant au décès en 2 à 5 ans. Il n’existe, à ce jour, aucun traitement de la maladie, et la faible connaissance des mécanismes physiopathologiques impliqués associée à l’absence de modèles animaux fiables freinent la recherche sur la SLA. Deux formes de SLA existent, les formes héréditaires causées par des mutations génétiques (moins de 10% des patients), et les formes dites sporadiques qui représentent plus de 90% des patients et pour lesquelles l’origine de la maladie reste inconnue. Un acteur semble toutefois jouer un rôle central dans la maladie : la protéine TDP-43, qui s’accumule de manière anormale dans les neurones des patients atteints de SLA et semble jouer un rôle dans la propagation de la maladie au sein du système nerveux en se propageant de neurone en neurone. Des modèles animaux portant les mutations génétiques responsables de SLA familiales existent mais ne représentent que moins de 10% des patients. Il est donc indispensable de générer de nouveaux modèles représentatifs des 90% des patients atteints de la forme sporadique. Plusieurs équipes de recherche ont récemment tenté de reproduire la maladie en injectant la protéine TDP-43 issue de patients atteints de SLA dans le cerveau de souris. Ces études ont permis de reproduire des symptômes semblables à ceux présentés par les patients, et l’accumulation anormale de TDP-43 au sein des neurones des souris a été retrouvée comme celle observée chez les patients. Si ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes, les modalités d’induction de la maladie restent pour le moment très invasives pour les animaux (injections intracérébrales) et difficiles à réaliser. Afin de pallier ces contraintes, nous souhaitons mettre au point un protocole d’induction de la maladie plus facile et moins invasif pour les animaux. L’objectif du projet est de répondre à l’absence de modèles animaux fiables dans la recherche sur la SLA en générant un modèle animal de SLA sporadique (inexistant à ce jour limitant les progrès de la recherche) pour permettre la compréhension des mécanismes physiopathologiques impliqués et appliquer des stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Si les souris développent une pathologie similaire à la SLA chez l’Homme, alors elle pourra être étudiée sur un modèle fiable de la maladie pour identifier les mécanismes physiopathologiques impliqués afin de mieux comprendre la genèse et la propagation de la maladie, et enfin permettre d’identifier et de tester de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront manipulés par des personnes qualifiées et formées. Les souris subiront une injection par semaine pendant 8 semaines sous anesthésie générale courte. L’anesthésie générale dure en moyenne 15 minutes. La procédure démarre par environ une semaine d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement. Une semaine après chaque injection, et avant l’injection suivante, les animaux subiront des tests comportementaux. Ces tests sont au nombre de 2 et visent respectivement à évaluer la motricité et la force musculaire . La durée de ces tests est d’environ 20 minutes par souris (2 tests différents de 10 min chacun avec des temps de récupération entre chaque). Un test de mémoire sera réalisé entre 2 et 3 mois après le début de l'expérience ( test d'environ 10 minutes par souris). Une fois le modèle mis en place, les animaux recevront une substance test de manière aigue ou de manière chronique au cours de l’expérience. Classiquement, les administrations durent quelques secondes pour chaque animal. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés en cours d'étude (1 à 2 prélèvements avec au minimum une semaine d'intervalle, chaque prélèvement dure quelques secondes). Un mois après la dernière injection, les animaux seront euthanasiés pour prélèvements post-mortem et études biochimiques et d’imagerie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, les administrations par voie intrathécale et la procédure terminale de prélèvement peuvent induire un léger stress chez l'animal, du fait de l'anesthésie générale (total de 9 anesthésies sur 12 semaines). Les tests moteurs peuvent induire un léger stress chez l'animal. Si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive (entrainant une perte de poids). L'administration de nouveaux candidats médicaments par voie systémique ou orale peut également conduire à un léger stress chez l'animal vigile. Ces interventions peuvent générer un stress transitoire lié à la contention et une légère douleur comparable à l'introduction d'une l'aiguille selon l'art et la pratique vétérinaire. Il n'est pas attendue de douleur ou souffrance spécifique par les candidats médicaments eux-mêmes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des 2 procédures pour exploration de la propagation de la maladie par des études biochimiques et histologiques. Ces analyses impliquent le prélèvement de structures du SNC et ne permettent donc pas le maintien en vie des animaux.
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle cellulaire car à ce jour il n’existe pas de méthodes alternatives pour étudier le rôle de la protéine TDP-43 dans l’induction et la propagation de la Sclérose Latérale Amyotrophique. En effet la physiopathologie de la SLA met en jeu l’organisme entier et plus particulièrement le système nerveux central. Les modèles cellulaires ne permettent d’évaluer le mode d’action qu’au niveau moléculaire et sub-cellulaire sans pour autant apporter des informations extrapolables à l’organe ou à l’organisme entier. Aussi, il n’existe pas de modélisation mathématique ou d’alternatives non animales dans ce domaine.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum tout en permettant l’obtention de résultats exploitables au niveau statistique. Les tests statistiques ont été choisis de manière à répondre le plus précisément possible aux questions scientifiques
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages aux normes suivant l’âge et le poids des animaux (4 à 6 souris par cage car ce sont des animaux sociaux), et les animaux évolueront dans un environnement enrichi (coton, tunnel, etc…). Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l’animalerie et/ou les techniciens. La douleur susceptible d’être induite par les injections sera limitée car elles seront réalisées sous anesthésie par isofluorane. En revanche, si notre modèle permet d’induire une pathologie semblable à la SLA, il est probable que les souris du groupe expérimental présentent peu à peu une réduction de la mobilité et une perte musculaire progressive. Les animaux seront euthanasiés avant qu’ils ne développent des symptômes trop sévères les empêchant de se déplacer correctement et donc de s’alimenter et de boire correctement (point limite lié à ce protocole).
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour l’étude des maladies humaines car l’organisation de son ADN et l’expression de ses gènes sont similaires à celles de l’Homme. La souris est donc un outil précieux dans la plupart des domaines de recherche médicale et permet d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à de nombreuses pathologies humaines. De plus, c’est un modèle facile à entretenir, bien décrit et documenté. C’est un modèle utilisé dans le monde entier permettant ainsi de comparer les résultats entre les laboratoires de recherche. Les souris C57BL/6J seront âgées d’environ 4 mois, l’âge moyen pour avoir des animaux adultes et matures car la SLA est une maladie qui touche des adultes.
Etude de la physiopathologie hépatique à l’aide de modèles murins
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
1 415 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur foie et de leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection de virus dans une veine, d'anti-œstrogènes ou d'un agent chimique qui fait apparaître des tumeurs du foie, ce dernier chez des souriceaux de 14 jours, puis en moyenne huit échographies sous anesthésie, des injections d'anticorps tous les trois jours pendant deux mois au plus, une toxine qui provoque une hépatite ou une chirurgie abdominale terminale. Ces tumeurs peuvent conduire, selon le porteur, à une encéphalopathie mortelle sans perte de poids. L'équipe veut comprendre pourquoi une même mutation donne deux types de tumeurs du foie, résistantes à l'immunothérapie, et en tirer des pistes de traitement. Le porteur affirme qu'il est "crucial de travailler sur des modèles murins pertinents", tout en prévoyant de mettre au point des cultures de tumeurs en trois dimensions pour tester de futurs médicaments.
Objectifs
Ce projet s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais une majorité des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie.
Bénéfices attendus
En aidant à la compréhension des mécanismes moléculaires, métaboliques et immunitaires de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.
Procédures
1) En premier geste, les animaux pourront subir soit : a) une injection intraveineuse unique de virus sous anesthésie générale en 30s b) une injection intrapéritonéale unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles sous contention en 30s c) une injection intrapéritonéale unique d'un agent chimique induisant des tumeurs du foie sur animaux vigiles sous contention en 30s 2) En second geste, les animaux pourront subir: a) une échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne) b) une chirurgie abdominale terminale sous anesthésie générale et analgésie pendant 15min c) une injection intrapéritonéale d’anticorps ciblant le système immunitaire sur animaux vigiles sous contention tous les 3 jours en 30s (pendant 2 mois maximum) d) une injection intrapéritonéale unique de toxine induisant une hépatite sur animaux vigiles sous contention en 30s 3) Le dernier geste étant un prélèvement sanguin suite à une injection intrapéritonéale unique d’anesthésique sous contention sur animaux vigiles en 30s.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, la nuisance principale est liée au développement de tumeurs hépatiques pouvant conduire à une encéphalopathie létale sans perte de poids. Les injections intraveineuses de virus adéno-associés et les échographies réalisées sous anesthésie peuvent entraîner un stress thermique et un inconfort au réveil. Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress lors de la contention et une douleur de courte durée lors de l‘introduction de l’aiguille.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet sera euthanasié pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs
Remplacement
Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. C'est pourquoi il est crucial de travailler sur des modèles murins pertinents.
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. 585 animaux sur les 1415 nécessaires nécessaires au projet suivront ce protocole. Nous suivrons le développement des tumeurs pour 200 animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Les tests statistiques utilisés seront des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables. Pour les études à court terme, seuls 15 animaux par lot sont nécessaires. De plus, nous souhaitons mettre au point des cultures in vitro de tumeurs murines pertinentes pour les cancers du foie qui nous permettront à terme de tester de nouvelles drogues anti-tumorales et ainsi de ne tester chez l’animal que les molécules préalablement efficaces sur ces cultures. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de cancer basé sur l'édition génique qui permet de générer moins d'animaux.
Raffinement
Nous suivrons le développement des tumeurs en échographies, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite la souffrance due à un développement tumoral important (raffinement). Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée. Les injections stressantes et échographie seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum. Dans la fenêtre de temps où le phénotype délétère lié à l'activation de la beta-caténine peut avoir lieu, un suivi accru sera mis en place. Au cours du suivi échographique, si les points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Au cours de ce suivi, l'euthanasie des animaux ayant atteint le point limite peut conduire à des animaux isolés dans les cages pour lesquels un suivi accru sera mis en place et le milieu enrichi (nids, tunnels, bois à ronger).
Choix des espèces
Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèles murins. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de carcinogenèse chimique nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.
Etude du rôle de l’enzyme Alox15 sur la fonction endothéliale lymphatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
440 souris, en grande majorité des femelles de 5 semaines, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune peut subir jusqu'à trois interventions en sept semaines. Éveillées, elles reçoivent d'abord cinq jours d'injections dans le ventre d'un inducteur qui désactive le gène d'une enzyme, Alox15, dans leurs vaisseaux lymphatiques. Viennent ensuite une injection de cellules tumorales, une chirurgie qui provoque un lymphœdème ou une procédure d'inflammation que le résumé ne décrit pas, puis, pour certaines, une lymphographie par injection dans les pattes, sous une anesthésie dont elles ne se réveillent pas. Le porteur annonce des douleurs modérées dues aux chirurgies et aux tumeurs, pour des retombées qu'il présente comme de "nouvelles pistes d'exploration" contre les métastases et le lymphœdème après un cancer du sein.
Objectifs
Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence l’absence de lipides spécialisés dans la résolution de l’inflammation générés par l’enzyme ALOX15. Dans cette étude, nous proposons de traiter les animaux avec ces lipides afin de déterminer lesquels sont responsables de l’inflammation chronique. En parallèle, nous étudierons si l’absence de ces lipides peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de la résolution de l’inflammation associés au système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra d’établir comment réduire l’apparition des lymphoedèmes post-cancer à l’aide des médiateurs de la résolution de l’inflammation.
Procédures
Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 interventions au total. Ensuite, l'inhibition de l'expression de la 15-lipoxygenase est effectuée par injection intraperitonéale d'un inducteur en vigil pendant 5 jours consécutifs. Après, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée
Impact sur les animaux
Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.
Remplacement
L’inflammation chronique fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car l'invalidation génique de l’enzyme Alox15 a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant à une invalidation de Alox15 de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.