Procédures modérées

648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent différentes molécules par injection quotidienne pendant trois à cinq jours ou par voie orale, pour étudier comment les forces mécaniques régulent le renouvellement de l'épithélium intestinal. Le porteur ne décrit que des désagréments brefs, stress de contention et sensibilité locale de quelques minutes, un contraste avec la gravité modérée déclarée pour le projet. Il indique utiliser en priorité des organoïdes in vitro mais affirme qu'une analyse in vivo reste nécessaire pour tenir compte du microenvironnement de l'organe.

Objectifs

L'épithélium intestinal est un tissu qui se régénère rapidement et qui résiste aux agressions tout en maintenant sa fonction de barrière tout au long de la vie adulte. Bien que nous connaissions certains types de cellules qui le composent, nous ne savons pas comment ces cellules sont capables de se renouveler sans perturber l'intégrité du tissu. Le but de ce projet est d'étudier comment les forces mécaniques régulent le renouvellement de l'épithélium intestinal chez les souris. Nos principaux objectifs sont de caractériser le comportement de types de cellules intestinales rares (cellules de « goblet » et « tuft ») et de comprendre les mécanismes de renouvellement et d'intégrité de l'épithélium dans l'homéostasie intestinale.

Bénéfices attendus

Étant donné le rôle essentiel de l'homéostasie épithéliale dans la (patho)physiologie, la recherche proposée aura de vastes implications et applications dans un certain nombre de domaines. L'extrapolation des données à différents contextes physiologiques ou pathologiques, notamment les troubles inflammatoires de l'intestin, le vieillissement et le cancer, sera déterminante pour la recherche fondamentale et appliquée. • En ce qui concerne la recherche fondamentale, l'identification des mécanismes impliqués dans l'établissement et le maintien du renouvellement épithélial aidera à comprendre le développement et la fonction normale des organes, ainsi que la façon dont la dérégulation de ce processus contribue aux troubles du développement, au vieillissement et, en particulier, au cancer. • Comprendre comment le nombre homéostatique de cellules est préservé dans l'intestin des mammifères est essentiel pour comprendre comment la pathologie peut se produire - le dérèglement du renouvellement épithélial, que ce soit par une prolifération excessive, une migration aberrante ou une extrusion, pourrait conduire au développement de tumeurs. Ainsi, l'élucidation de la manière dont ces processus sont régulés et couplés pour atteindre l'équilibre sera d'un intérêt particulier pour la communauté médicale, qui pourra également bénéficier de nos systèmes modèles et de nos technologies. • L'intégrité de l'épithélium est essentielle pour sa fonction de barrière, qui consiste à isoler le microbiome gastro-intestinal de l'environnement interne ; si cette fonction est compromise, elle peut conduire ou contribuer à une maladie inflammatoire. La découverte des voies de signalisation qui sont activées en réponse à des niveaux physiologiques ou pathologiques de stress mécanique sera utile pour le développement et la thérapie des maladies. • Les études sur l'intégrité épithéliale et la perméabilité de l'intestin sont bénéfiques pour l'industrie pharmaceutique ; de nouveaux médicaments pourraient être testés sur nos modèles ex vivet in vitro, afin d'évaluer leur sécurité avant de les tester sur des modèles animaux et des humains.

Procédures

Les animaux recevront différentes molécules par deux voies d'administration différentes, soit par injection, une fois par jour pendant 5 secondes pendant 3 à 5 jours selon la molécule, soit par administration orale d'une molécule une fois pendant 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris recevront des injections qui provoqueront un stress léger lié à la contention et l’introduction de l’aiguille pendant moins de 30 secondes. Certaines injections peuvent induire une certaine sensibilité locale. Ce désagrément ne dure que quelques minutes au maximum.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à la fin de chaque procédure pour recueillir les tissus.

Remplacement

Pour compléter et réduire les études in vivo, nous avons développé des modèles d'organoïdes intestinaux en 2D ou 3D. Nous les utilisons en priorité par rapport à l’expérimentation in vivo. Toutefois, ces études in vitro devront être complétées par une analyse in vivo pour étudier l'influence du microenvironnement de l'organe et du tissu sur la biologie de l'épithélium intestinal.

Réduction

Afin de limiter le nombre d'animaux utilisés, sur la base de notre expérience antérieure et de tests statistiques, les analyses seront réalisées sur 3 expériences indépendantes, avec toutes les souris en double, ce qui donne une fourchette de 12 à 24 souris nécessaires au total pour 3 expériences indépendantes. Ceci constitue un minimum nécessaire pour obtenir des données statistiquement fiables.

Raffinement

La surveillance renforcée permettra une vigilance accrue pendant l'expérimentation et la détection des atteintes des points limites. Les souris seront quotidiennement observées et pesées par du personnel compétent. Des grilles de scoring seront utilisées pour suivre les animaux en expérimentation afin de mettre en place, lorsque nécessaire, des mesures pour atténuer la douleur, l'angoisse ou le stress.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage, sa reproduction facile et rapide qui permet l’obtention de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. Les modèles transgéniques proposés ont déjà été utilisés avec succès pour étudier le rôle du cytosquelette et des forces mécaniques dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal. Ces modèles nous permettront d'évaluer la contribution des forces mécaniques dans la régulation de l'homéostasie intestinal chez l'adulte, ce qui devient un sujet d'intérêt majeur dans le domaine de la recherche, ainsi que pour la communauté biomédicale. Nous utiliserons des souris adultes (2-4 mois) pour étudier l'homéostasie épithéliale dans l'intestin des mammifères adultes.

496 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après trois mois d'un régime induisant surpoids et troubles métaboliques, elles subissent un test au glucose puis une chirurgie reproduisant un accident vasculaire cérébral, suivie de tests comportementaux non précisés à sept et vingt et un jours. Le porteur indique que le modèle provoque douleur peropératoire, perte sensorimotrice, perte de poids et déshydratation, les souris étant tuées pour prélever les tissus. Il affirme que l'étude de l'ischémie cérébrale dans ce contexte métabolique ne peut s'envisager que dans un "organisme entier" et présente les retombées cliniques comme applicables à l'humain.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont l'une des principales causes de problèmes de santé et de décès chez les personnes âgées, en raison des problèmes de santé associés (vieillissement de leurs artères et troubles métaboliques). Ce projet de recherche se concentre sur l'accident vasculaire cérébral, maladie de plus en plus fréquente chez les personnes de plus de 60 ans. Aujourd’hui aucune thérapie ne permet une bonne prise en charge de la maladie. Chez ces patients, les comorbidités, telles que l’hyperglycémie et l’hyperlipidémie sont des facteurs de risque bien identifiés, aggravant les conséquences de la maladie. L’objectif de ce projet est de mieux comprendre et caractériser le rôle des comorbidités liées à l’âge dans la modulation de la réponse des mécanismes de réparation après la survenue d’un accident vasculaire cérébral. Nous utiliserons un modèle classiquement utilisé et qui est proche de l’accident vasculaire cérébral chez l’Homme. Par ailleurs, la prise en compte des problèmes de santé associés à l'âge est nécessaire pour déterminer l’impact de nouvelles stratégies thérapeutiques. Cette étude, qui sera menée sur 2 établissements utilisateurs, permettra de mieux comprendre les caractéristiques de l'accident vasculaire cérébral dans le contexte de vieillissement et ses problèmes de santé associés dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des comorbidités dans les conséquences de l'accident vasculaire cérébral. Les bénéfices attendus concernent la progression des connaissances scientifiques, connaissances qui pourront être appliquées à l'Homme et ce grâce à la prise en compte de la réalité de la clinique (âge et comorbidités).

Procédures

Après 3 mois d’administration d’un régime riche en protéines et en lipides et pauvre en glucides, les souris suivent un test d’intolérance au glucose (une injection de glucose intrapéritonéale et mesure de la glycémie). Cette première intervention sera réalisée dans un des 2 établissements utilisateur (EU1 et EU2). Puis, nous mimerons l’accident vasculaire cérébral en utilisant un modèle in vivo (chirurgie de 10 min) au sein de l'EU2. Les effets du régime sur la réponse après AVC seront analysés à J7 et J21 après la mise en place du modèle d’AVC à l’aide de tests de comportement.

Impact sur les animaux

L’âge (animaux âgés de plus de 6 mois) et le changement de l’alimentation induit une prise de poids (animaux de 35 – 60g). L’injection intrapéritonéale de glucose et la mesure de la glycémie sont également une nuisance pour l’animal. Le modèle d’AVC induit une douleur peropératoire et perte sensorimotrice. Une perte de poids et déshydratation peuvent également être attendues. Les tests comportementaux peuvent également être une source de stress pour les animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer les tissus et faire les analyses histologiques, protéiques et génomiques

Remplacement

Notre projet a démarré par des études in vitro rapportant les effets d’un modèle de stress métabolique sur les fonctions de cellules endothéliales de vaisseaux cérébraux, notre but est maintenant d’étudier l’ischémie cérébrale dans ce contexte de stress métabolique (comorbidités), qui met jeu en des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier. Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants puisque l'étude des conséquences métaboliques du vieillissement et son retentissement sur le vaisseau et sa fonctionnalité, avec ou sans traitement, ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant en accord avec notre expérience sur ces modèles et un calcul de puissance. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront une analgésie en pré- per- et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 48h. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge et/ou mis à mort selon le score. Enfin, le bien-être animal sera aussi amélioré par l’enrichissement du milieu. Les cages seront pourvues de coton, bâtonnets de bois, igloo. Les souris sont placées dans une pièce au calme. Une chambre de réveil thermostatée sera utilisée en post-chirurgie. Le transport des animaux sera effectué en conditions ventilé et suivi de température.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence du modèle souris pour étudier les maladies cardiovasculaires liées à l’âge et ses comorbidités. Le choix s’est porté sur la souris qui est un modèle reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral (AVC) et pour lequel les outils sont nombreux pour le suivi de cette étude et ultérieurement pour le suivi de cette pathologie (anticorps, imagerie, modèles génétiquement modifiés). L’AVC étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte. Le choix du modèle sera réalisé en utilisant des animaux âgés d’au moins 6 mois, âge permettant de mimer la physiologie du vaisseau à l’âge adulte. Pour prendre en compte les comorbidités liées au vieillissement, les animaux seront préparés par la mise en place d’un régime conduisant à des comorbidités en accord avec les recommandations données par le groupe de réflexion sur les modèles précliniques d’AVC. Les souris C57BL/6J utilisées pour cette étude seront âgées de 24 semaines (6 mois) avant les 3 mois de régime.

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur mammaire humaine triple négative, une injection intratumorale de nanoparticules puis des séances d'irradiation sous anesthésie, avec transfert entre deux établissements. Le porteur indique que l'injection intratumorale est douloureuse, que la tumeur peut se nécroser et que les contentions répétées stressent les souris, toutes tuées pour prélever les tumeurs. Il affirme que "la règle de remplacement ne peut être appliquée" et renvoie les essais chez l'humain à un éventuel futur conditionné par une efficacité démontrée chez la souris.

Objectifs

Le cancer du sein est le plus fréquent des cancers chez la femme et le cancer du sein triple négatif parmi les plus agressifs, avec souvent des échecs aux thérapeutiques classiques du cancer. Le pronostic de ce type de cancer est mauvais et la recherche continue activement pour trouver des nouvelles thérapeutiques. Chez ces patientes, il est important de disposer de médicaments améliorant la survie et leur qualité de vie. Une thérapeutique innovante d’irradiation sélective à basse dose grâce aux rayons X a vu le jour. Elle permet de déclencher un processus de mort cellulaire en cascade grâce à des nanoparticules. Les nanoparticules sont spécifiquement conçues pour agir à la fois comme produit de contraste et agent thérapeutique. Un modèle animal murin pour le cancer du sein triple négatif sera utilisé afin d’investiguer 2 nanoparticules innovantes, pour évaluer l'efficacité thérapeutique après irradiation. Le projet est mené entre 2 établissements utilisateurs .Une injection intra tumorale de la nanoparticule sera réalisée dans des conditions de concentration du produit et de dose d’irradiation restreints, suite de précédentes études. Le développement et l’optimisation doit impérativement se faire chez l’animal pour pouvoir assurer la translation des résultats à terme chez l’être humain. La règle de remplacement ne peut être appliquée.

Bénéfices attendus

Chez les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif , plusieurs stratégies de traitement existent telles que la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l'immunothérapie, mais les résultats sont souvent insuffisants. Au stade localement avancé ou métastatique, le besoin médical, en première ligne (chez les patientes n’ayant pas précédemment reçu de chimiothérapie en situation métastatique), est actuellement mal couvert par les alternatives disponibles. De plus, même si dans certains cas la survie à cinq ans après traitement peut être encourageante, les conditions de vie des patientes se dégradent du fait des effets secondaires des thérapies. De nouveaux traitements spécifiques, moins toxiques, plus puissants et surtout des approches thérapeutiques combinatoires constituées de différentes modalités et donc complémentaires les unes des autres représentent une approche extrêmement prometteuse pour améliorer la survie et la qualité de vie des patients atteints de cancer. L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité thérapeutique de cette nouvelle thérapie et de prouver que l'approche combinatoire offre un bénéfice maximal avec un profil de toxicité acceptable pour les animaux, ce qui justifierait les bases d'études cliniques chez l’homme. A court terme, une efficacité antitumorale démontrée au stade pré clinique dans cette méthode de traitement innovante, permettrait éventuellement d’envisager de futurs essais chez l’homme.

Procédures

EU 1 Anesthésie locale (1x, 30sec): identification des souris _Contention 3x/semaine 25sec- mesure de la taille/pied à coulisse EU 1 et 2 _ EU 2Injection intratumorale sous cutanée 1x 100µL 30sec_Procedure 1 : Injection intratumorale de nanoparticule (1injection, 30sec)_Irradiation : 1x/sem ou 4x/sem_ Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j._Procedure 2 : selon précédents résultats, choix schéma irradiation et nanoparticule (en 1x /sem ou en 4x/sem) en variant dose et concentration._Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j.

Impact sur les animaux

Dans de très rares cas, un phénomène de gêne à la mobilité peut être observé après injection des cellules cancéreuses. Dans de rares cas, une nécrose de la tumeur peut apparaitre . Douleur lors de l'injection intratumorale du traitement ( douleur inférieure à celle procurée par un traitement anesthésique + contention) . Les contentions multiples (lors des mesures au pied à coulisse, des anesthésies, des pesées) de l’animal peuvent générer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, car les tumeurs seront prélevées pour des analyses histologiques.

Remplacement

Une présélection des nanoparticules sera effectuée grâce à des expériences in vitro pour exclure les combinaisons de traitement inefficaces et éviter ainsi des expériences animales inutiles. Pour confirmer l'efficacité in vivo et assurer la possible translation chez l'humain à terme, le modèle murin est nécessaire car les expériences in vitro ne peuvent pas reproduire entièrement le l'environnement complexe de la tumeur

Réduction

La conception des expériences et les procédures par étapes conditionnelles permettent de réduire le nombre d'animaux calculés à l'aide d'un test statistique . De plus, nous testons uniquement 2 nanoparticules sur 4 intialement produites ; ce choix a été basé sur l’ensemble des résultats obtenus par nos précédentes expériences in vitro et celles de nos collaborateurs

Raffinement

Une anesthésie locale est prévue pour l’identification des souris. Une anesthésie générale est prévue lors des sessions d'irradiation avec l’imagerie. De la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. Les animaux seront hébergés par groupe de 5. Une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant l’entrée des animaux en protocole . Surveillance des points limites, et des souffrances possibles, via une grille de scoring établie avec la SBEA. Mesures de raffinement prévues pour le transfert entre les EU ( 5 maximum par cage pour le transport, trajet court,alimentation, abreuvement, aération des cages)

Choix des espèces

Le modèlede cancer du sein triple négatif par greffe de lignées cellulaires humaines de sein immortalisées est un des modèle le plus utilisé pour les études visant à étudier l’efficacité des thérapeutiques anticancéreuses. Les souris immunodéprimées permettent de greffer des tumeurs humaines, ce qui permet de tester la réponse des tumeurs d'origine humaine. Les greffes de tumeurs humaines représentent des modèles cliniquement pertinents de cancer humain, qui simulent de nombreuses caractéristiques du cancer, notamment un microenvironnement tumoral distinct avec des structures vasculaires mal organisées et des régions de cellules hypoxiques, ce qui affecte négativement la sensibilité des cellules cancéreuses aux radiations. Greffe chez des athymic nude femelles à l’âge de 6-7 semaines, ce stade permet d’optimiser la prise de la greffe

8 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin subit une chirurgie d'environ deux heures au cours de laquelle son urètre est sectionné puis reconstruit avec de la veine de cordon ombilical humain, suivie d'endoscopies sous sédation à deux et six semaines avant la mise à mort pour analyse. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer douleur, rétention urinaire et atteinte de la fonction sexuelle. Il justifie le recours au lapin par le calibre de son urètre proche de celui de l'humain et affirme que le fonctionnement du système urinaire et immunitaire exclut une méthode alternative.

Objectifs

Les sténoses urétrales correspondent à un segment rétréci de l’urètre, canal qui permet l’évacuation de l’urine vers l’extérieur. C'est une maladie fréquente (229-627 patients sur 100 000). Elles se manifestent principalement par des difficultés à vidanger la vessie entièrement et engendre des infections urinaires et peut même être responsable d’insuffisance rénale. Pour corriger la sténose de l’urètre, il faut reconstruire l’urètre par chirurgie. Seul un prélèvement de la muqueuse buccale utilisé pour reconstruire l’urètre permet de corriger la sténose à ce jour. Mais cette technique demande souvent plusieurs interventions chirurgicales et le prélèvement de la muqueuse buccale est douloureux et cause des complications. Le cordon ombilical est composé d’une veine et de deux artères. Ces vaisseaux, qui ont entre autre été utilisés pour la régénération nerveuse, pourraient aussi être utilisés pour reconstruire l’urètre rétréci. L’objectif de ce projet est donc de remplacer la muqueuse buccale par un greffon provenant d’une veine ombilicale pour reconstruire l’urètre. Un précédent projet a montré qu’il était possible de greffer de la veine ombilicale sur un urètre incisé. Ici il sera testé une greffe d’un lambeau de tronçon ou d’un tronçon complet de l’urètre ce qui représente un vrai challenge en médecine. Pour cela, des lapins seront opérés, leur urètre coupé puis reconstruit. La cicatrisation sera suivie par endoscopie.

Bénéfices attendus

Actuellement, pour réparer la sténose de l’urètre, il faut la plupart du temps deux interventions chirurgicales espacées de 3 mois. De plus, le fait de prélever de la muqueuse buccale n’est pas sans problème (douleurs, saignements, difficultés alimentaires, troubles de la salivation et du goût, difficulté à articuler). Si la veine de cordon ombilical permet de reconstruire l’urètre de façon tubulaire, cette reconstruction pourra être réalisée en une seule chirurgie, sans prélèvement au niveau de la bouche. Cette technique pourra être utilisée dans d’autres maladies.

Procédures

La chirurgie sous anesthésie générale et antidouleur va s’étendre sur environ 2 heures pendant lesquelles l’animal, après préparation (tonte, désinfection, mise en place du monitoring) va subir une incision d’environ 2-3 cm. Son urètre sera externalisé, sectionné puis réparé avec de la veine de cordon ombilical. L’incision de la peau sera suturée. 2 semaines plus tard l’animal aura une endoscopie de l’urètre pour observer la cicatrisation sous sédation (15 min) et l’introduction d’une bougie calibrée pour vérifier que le diamètre de l’urètre ne diminue pas. Les lapins seront sortis de leur cage pour être pesés 2 fois par semaine. 6 semaines plus tard l’animal sera sédaté pour une nouvelle endoscopie (15 minutes) et sera mis à mort (5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances/effets indésirables sur l’animal sont principalement : * nuisances liées à la chirurgie : - douleur possible au niveau de la zone chirurgicale - rétention urinaire post-opératoire possible - atteinte de sa fonction sexuelle * nuisances liées au suivi : - gêne liée à la présence du mini-drain - endoscopies prévues à 3 et 6 semaines (contention, anesthésie) - pesée deux fois par semaine (stress).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever l’urètre et d’effectuer des analyses histologiques pour vérifier la cicatrisation.

Remplacement

D’après les travaux antérieurs, les vaisseaux issus de cordons ombilicaux humains sont tolérés chez le lapin et le rat. Il reste donc à étudier la cicatrisation dans le cadre de la reconstruction de l’urètre. Bien que la technique ait été validée sur cadavres d’autres projets en amont, le projet nécessite le système urinaire et le système immunitaire fonctionnels et ne peut donc pas être réalisé avec des méthodes alternatives à l’expérimentation animale.

Réduction

Des études préliminaires sur cadavres issus d’autres projets ont déjà permis de valider la procédure chirurgicale sans utiliser de lapins vivants dédiés à cet objectif. La procédure sera réalisée séquentiellement en débutant d’abord par la chirurgie qui engendra le moins de risque de difficulté (remplacement d’un lambeau d’urètre). Si tout se passe bien, le deuxième type de chirurgie (remplacement d’une section d’urètre) sera effectuée. Dans cette première étape, aucune statistique ne sera effectuée. Un effectif maximal de 4 animaux par groupe est prévu dans l’objectif d’obtenir 3 procédures réussies. Par ailleurs, le nombre d’animaux a été réduit grâce à l’utilisation de l’endoscopie, ce qui permettra d’évaluer la qualité de la prise de la greffe dans le temps chez le même lapin.

Raffinement

La technique chirurgicale a été élaborée et sera effectuée par des chirurgiens d’un service d’urologie. L’animal recevra une combinaison de deux anesthésiques locaux (rapide et longue action) durant l’intervention et au moment de la fermeture pour lutter contre la douleur lors de l’intervention et au réveil. Ainsi l’animal ne sentira aucune douleur pendant le réveil, ce qui réduira son stress post chirurgie. A réception, l’hébergement par deux sera testé. Si les animaux sont incompatibles, ils bénéficieront de temps dans un espace de « jeux » plus grand que leur cage comportant cabane, tunnel, hamac... L’état des animaux est évalué par l’observation de leur état physique (ouverture des yeux, orientation des oreilles) et la quantité d’aliment consommée.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal le plus petit permettant de réaliser la reconstruction de l’urètre. L’intérêt de l’urètre du lapin est son calibre proche de celui de l’homme, un trajet droit, la survenue d’érections qui permettra de tester l’élasticité du tissu. D’un point de vue technique, la chirurgie est facile à réaliser dans de bonnes conditions chez le lapin. Une endoscopie de contrôle est facile à réaliser. Les lapins seront choisis par l’éleveur en fonction de leur taille. Nous demanderons des animaux adultes de grande taille afin que l’urètre soit le plus long possible.

6500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et jusqu'à 100 réutilisés pour de la formation ou d'autres études. Un tiers subit une neurochirurgie crânienne d'environ une heure, puis les rats reçoivent des stimulations sonores et des injections de candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour pendant 28 jours, avec des prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les rats sont hébergés seuls après l'implantation, ce qui les isole socialement, et que les molécules testées peuvent provoquer perte de tonus, somnolence ou excitation. Il affirme que ces mécanismes complexes ne peuvent être reproduits par des modèles cellulaires ou informatiques et qu'une preuve d'innocuité chez l'animal est "indispensable" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les maladies neurologiques et psychiatriques représentent un enjeu majeur de santé publique et touchent de plus en plus de personnes du fait de la croissance et du vieillissement de la population mondiale. Développer de nouvelles thérapies ciblant ces maladies est un axe majeur actuellement. L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Les méthodes se basent sur des biomarqueurs utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Parmis eux, les activités oscillatoires de base et les potentiels évoqués sont particulièrement intéressants. Dans ce projet, les activités oscillatoires spontanées et évoquées chez des animaux contrôles et des animaux reproduisant des symptômes de pathologies humaines seront étudiées.

Bénéfices attendus

Afin d'optimiser le développement de nouveaux médicaments et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, la priorité est donnée à la découverte et l'utilisation de marqueurs d'évaluation d'efficacité quantifiables, fiables et facilement transposables enter les études précliniques et cliniques. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l'humain et le rongeur. Dans ce projet nous utiliserons des rats.Nous chercherons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur ces animaux. Ces marqueurs biologiques translationnels permettront de tester de nouveaux candidats médicament.

Procédures

1/3 des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores (2 heures maximum en pulse de stimulation, non continu) qui seront réalisées sur l’animal vigile une à deux fois par semaine. Lors des tests pharmacologiques en courte durée (injections aigues durant quelques minutes), un protocole de stimulation sonore sera appliqué avant et après l’administration d’un candidat médicament. Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits au cours de la procédue expérimentale en fonction du plan expérimental établi. Le volume de prélèvement dépendra de la fréquence de prélèvement : le volume prélevé pourra aller jusqu’à 7.5% de volume sanguin circulant avec une période de récupération d’une semaine (pour un rat de 300g, 1.2 ml), et jusqu’à 10% avec 2 semaines de récupération (pour un rat de 300g, 2 mL). Les prélèvements seront effectués de manière à ne pas dépasser le volume de sang maximm autorisé (1.2 ml sur 1 semaine) pouvant etre fait en prelèvement retro-orbitaire, ou caudal (en fin d'EEG par exemple, ou 200 µl de sang sont prélévés, répatable (si besoin de prelevement à différents temps pour la pharmacocinétique, avec une limite de 3 prélèvements maximum par jour), avec en moyenne 2 EEG par semaine)

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une deshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Lors de la stimulation cérébrale, malgré l'intensité faible utilisée, une réaction comportementale (freezing, sursaut, clignement d'yeux) pourra être induite dans de rares cas. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation dûe au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle (portoir ventilé) après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social.

Devenir

Il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus de tous les animaux engagés dans ce projet. Si toutefois cette vérification n'est pas nécessaire (demandé dans le plan expérimental), les animaux pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien être de l'animal le permet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Dans ce projet, chaque animal est son propore contrôle et chaque animal recoit toutes les conditions pharmacologiques dans un ordre aléatoire (= plan d'étude croisée), ce qui permet de reduire le nombre de groupe d'animaux (évite d'avoir un groupe d'animaux contrôle). Le nombnre d'animaux nécessaire pour avoir des réultats significatifs est calculé avant d'établir le plan expérimental en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Dès réception, les animaux s'acclimatent 1 semaine à leur environnement. Une injection de morphinique sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale volatile. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement. Il sera proposé aux animaux, 1 fois par semaine pendant 30 minutes, un temps de regroupement et de sociabilisation au sein d'une enceinte contenant différents enrichissements.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des rats. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques cérébrales spontanées et induites et ils peuvent être utilisés pour le développement de nouveaux médicaments. Les animaux sont manipulés au minimum à l’age de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications électrophysiologiques chez des animaux adultes, car les circuits, à cet âge là sont matures.

243 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent en sous-cutané un biomatériau libérant du glucose, sont suivies par imagerie sous anesthésie répétée, et 80 d'entre elles subissent une thoracotomie pour visualiser les vaisseaux, avant mise à mort à des temps échelonnés jusqu'à huit semaines. Le porteur indique que la chirurgie d'implantation peut entraîner douleur, stress et infection, et que la taille de certains implants peut gêner l'animal. Il affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit l'environnement complexe de l'implantation et vise à terme une alternative aux autogreffes osseuses.

Objectifs

L’objectif du projet est de limiter la mort des cellules souches post-implantation dans le cas des défauts osseux dont la taille est trop importante pour permettre une réparation osseuse spontanée (défaut osseux de taille critique). Les autogreffes osseuses où le greffon est prélevé directement sur le patient sont la référence clinique. Cependant, ces greffons présentent des inconvénients tels que le recours à une deuxième chirurgie, et une quantité et qualité osseuses limitées. Une alternative développée est donc d’implanter des cellules souches dans le défaut osseux afin qu’elles induisent la formation osseuse soit en se différenciant en cellules osseuses soit en attirant les cellules osseuses environnantes. Malgré des résultats prometteurs, la réparation osseuse reste moins efficace qu’avec de l’autogreffe, à cause de la mort massive des cellules souches implantées (90%) observée lors des 15 premiers jours post-implantation. En effet, l’environnement dans lequel sont implantées les cellules souches est très peu vascularisé et caractérisé par un manque d’oxygène, de glucose et une accumulation de déchets métaboliques. Au laboratoire, nous avons démontré que le manque de glucose était le facteur responsable de cette mort cellulaire. L’objectif de ce projet est donc de limiter la mort des cellules souches transplantées afin de pouvoir augmenter leur contribution à la réparation du tissu lésé et à terme de remplacer les autogreffes. La stratégie développée par le laboratoire consiste donc à placer les cellules dans un biomatériau leur fournissant du glucose en quantité suffisante jusqu’à revascularisation du tissu. Le biomatériau comprend de l’amidon et une enzyme. Le glucose est ainsi fourni par dégradation de l’amidon sous l’action de l’enzyme. La preuve de concept de cette stratégie a déjà été établie in vitro et in vivo sur des temps courts, sans permettre cependant une survie cellulaire à long terme (28 jours). Une 2e version du biomatériau a donc été développée afin d’assurer une libération de glucose sur des temps plus longs. L’enzyme est cette fois-ci encapsulée dans des microparticules afin de ralentir sa libération et donc son effet sur l’amidon. Après une série de tests in vitro démontrant une survie des cellules souches sur du plus long terme, nous devons maintenant valider l’intérêt de cette 2e version du biomatériau sur la viabilité et fonctionnalité des cellules souches in vivo.

Bénéfices attendus

Ces expérimentations permettront dans un premier temps de tester la capacité de notre biomatériau d’assurer la survie des cellules souches transplantées dans un environnement physiologiquement pertinent et plus complexe que ce que permettent les études in vitro. Des résultats positifs permettraient de poursuivre les études en implantant cette fois-ci le biomatériau au sein d’un défaut osseux de taillle critique (chez la brebis, par exemple). L’objectif à long terme est ainsi de proposer une alternative aux greffes osseuses autologues qui présentent des limites comme le volume prélevable du greffon, sa qualité lorsqu’il s’agit de patients âgés ainsi que la nécessité d’avoir recours à un 2e site chirurgical. De plus, dans un cadre plus général d’ingénierie tissulaire ou de thérapie cellulaire, ce projet apportera une réponse au problème majeure que pose la mort massive de cellules transplantées qui sont confrontées à des conditions d’ischémie (transplantation de neurones dopaminergique pour Parkinson, transplantation de cellules souches pour les infarctus du myocarde).

Procédures

Pour tous les animaux (243 souris) : Mise en place des biomatériaux en sous cutané sous anesthésie générale et antalgie (1x, durée 20-30 min). Pour les animaux de l’étude 1 (43 souris) : Acquisition du signal fluorescent sous anesthésie générale gazeuse (8x, durée 5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 2 (100 souris) : Acquisition du signal bioluminescent sous anesthésie générale gazeuse (5x, durée 2x5min, sur 4 semaines). Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l’étude 3 (80 souris) : Infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque par thoracotomie sous anesthésie générale et antalgie (1X, durée 30 min). Pour les animaux de l’étude 4 (20 souris) : Mise à mort des animaux au temps terminal de l’étude par anesthésie gazeuse suivie d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). .

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation en sous-cutané peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée. Enfin, la taille de certains implants peut entraîner une gêne de l’animal. Les anésthésies (gaz anesthésiant) nécessaires à l’imagerie non invasive en fluorescence et en bioluminescence vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience. Les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence.

Devenir

Après implantation, suivi par fluométrie ou par bioluminescence, les animaux impliqués dans les procédures 2 et 3 seront mis à mort au temps terminal prévu (4 semaines) afin de pouvoir explanter les biomatériaux et approfondir les résultats par des analyses histologiques ou histochimiques. Tous les animaux concernés par la procédure 4 seront mis à mort suivant des temps prédéfinis (1, 2, 3 et 4 semaines) afin de suivre la formation des vaisseaux sanguins au cours du temps, car la visualisation des vaisseaux sanguins par agent de contraste nécessite la mise à mort de l’animal. Les animaux de la procédure 1 non impliqués dans les procédures 2,3 et 4 seront mis à mort à 4 et 8 semaines afin de pouvoir explanter les biomatériaux et quantifier la formation osseuse par examen radiologique de l'explant.

Remplacement

L’environnement post-implantatoire choisi est un milieu très peu vascularisé et complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible à ce jour de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses intéractions cellulaires (avec les cellules vasculaires ou les cellules de l’inflammation, par exemple) et moléculaires (par sécrétion d’alarmine, d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des intéractions cellules-cellules, ils n’incluent que 2 ou 3 intéractions (cellules souches/macrophages, par exemple) et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des cellules stromales mésenchymateuses en vue d’une réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, les études 1 et 2 seront des études de suivi longitudinal : les mêmes animaux seront imagés au cours du temps (et non un animal/temps). L’étude 1 permettra de sélectionner les groupes dans lesquels l’enzyme restera sur site d’implantation au moins 7 jours sans fuir hors du site. Ces groupes sélectionnés seront donc ensuite utilisés pour l’étude 2. Pour les études 3 et 4, seuls 2 profils sélectionnnés lors de l’étude 2 seront utilisés. Il s'agit du profil permettant la survie cellulaire la plus longue et du profil présentant une augmentation de la population cellulaire en début d’implantation. De plus, la comparaison avec le biomatériau de 1ère génération se fera en se basant sur les résultats historiques des études précédemment réalisées au laboratoire. En prenant en compte les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants/groupe afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant. Pour les analyses, un test statistique (test paramétrique) sera utilisé afin d'étudier l’effet de la composition des biomatériaux, l'impact de la durée d’implantation et leurs intéractions.

Raffinement

Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. La souffrance liée à l’implantation sous-cutanée sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant 24h. Un gel nutritif sera ajouté lors des 3 premiers jours post-opératoires pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation des animaux. Suite à la procédure chirurgicale, des points surveillés et scorés sur le comportement, l’aspect général (perte de poids) et les signes cliniques spécifiques à l’acte chirurgical (infection du site d'implantation) permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si le score des points surveillés dépasse le seuil limite défini en amont du projet, l’animal sera retiré de l’étude. Pour les protocoles d’imagerie non invasifs, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse puis installées dans la chambre d’imagerie pour acquérir le signal fluorescent ou bioluminescent in vivo. Lors de ces acquisitions, les souris seront maintenues sous anesthésie au masque. Un gel oculaire sera appliqué pour éviter un éventuel déssèchement occulaire.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est la souris immunodéficiente non consanguine. Le modèle souris est le mieux connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non invasive, tel que la fluorescence ou la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L'utilisation de souris immunodéficientes permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d'origine humaine et ainsi d'évaluer le potentiel de cellules d'origine humaine. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30 g et qui permettent d'avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis deux à cinq injections de molécules anticancéreuses, avec un suivi de la croissance des tumeurs sur les flancs, pour étudier la mort cellulaire dite immunogène. Le porteur indique que les tumeurs peuvent gêner les souris et que la chimiothérapie peut entraîner perte d'appétit et de poids, les analyses se faisant sur organes après mise à mort. Il revendique un modèle "complet et fonctionnel" irremplaçable in vitro et présente un algorithme d'intelligence artificielle comme moyen de réduire à terme le nombre d'expériences.

Objectifs

La chimiothérapie est un traitement clé contre de nombreux cancers. Certains médicaments peuvent provoquer un type de mort cellulaire spécifique appelé "mort cellulaire immunogène". Cela déclenche une réponse immunitaire antitumorale tout en protégeant contre la réapparition du cancer. Récemment, des recherches ont montré que bloquer la transcription de l'ARN est crucial pour déclencher cette mort. En utilisant un microscope, nous avons remarqué des changements spécifiques dans le noyau des cellules suite à l'utilisation de médicaments déclenchant la morte cellulaire immunogène. Ces changements sont liés à l'inhibition de la synthèse d'ARN. Nous avons développé un algorithme informatique capable de repérer ces changements dans les cellules sans avoir besoin d'utiliser des colorants. De plus, des études récentes ont montré que les effets secondaires de certains médicaments anticancéreux, comme la toxicité cardiaque ou la stérilité, sont liés aux dommages causés à l'ADN. Cependant, il existe des versions de ces médicaments qui conservent leur efficacité contre le cancer sans provoquer ces effets secondaires. C'est pourquoi nous examinons comment l'arrêt de la transcription de l'ARN et les dommages à l'ADN sont impliqués dans la mort cellulaire immunogène. Ce projet vise à confirmer dans des modèles animaux l'effet stimulant sur le système immunitaire de nouvelles molécules anticancéreuses. Ces molécules ont été sélectionnées soit par des tests sur des cellules évaluant leur impact sur la transcription et l'ADN, soit par des algorithmes informatiques capables de prédire ces effets à partir de leurs caractéristiques chimiques. Nous étudierons également leur effet sur la croissance des tumeurs.

Bénéfices attendus

Les expérimentations précliniques prévues visent à confirmer les effets antitumoraux des nouvelles molécules candidates et à approfondir notre compréhension de la potentielle implication du dommage à l’ADN dans l’immunogénicité. Ces études permettront d’explorer plus en profondeur les mécanismes sous-jacents à ce processus. De plus, nous pourrons évaluer si les molécules issues de l’algorithme d’intelligence artificielle permettant de prédire la capacité des différents composés à induire le dommage à l’ADN et l’inhibition de la synthèse d’ARN, présentent également des propriétés immunogènes. Cette approche constitue un atout en matière de criblage de molécules, offrant la possibilité de réduire considérablement le nombre d’expérimentations nécessaires.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront de 2 jusqu’à 5 injections, d’une durée de moins d’une minute chacune, sous anesthésie générale ou locale, dépendamment des injections. Ils seront manipulés brièvement (

Impact sur les animaux

Certains effets indésirables peuvent être observés chez la souris lors des expérimentations, notamment la manipulation et la contention régulière peuvent leur engendrer un stress léger. Les diverses injections pourraient générer des inconforts transitoires et légers. Les traitements chimiothérapeutiques peuvent entraîner des effets modérés comme une perte d’appétit et donc une perte de poids modérée chez la souris. Les tumeurs qui vont se développer sur les animaux pourront croitre et les gêner modérément au niveau des flancs.

Devenir

Chaque procédure requiert l’injection de cellules tumorales, ce qui implique l’impossibilité de garder les souris en vie à la fin de l’expérience. De plus, des analyses seront effectuées sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Ce projet ayant pour objectif de tester si nos composés induisent une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail (les procédures sont en ordre séquentiel et non mises en oeuvre si l'hypothèse précédente est invalidé). Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque procédure.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, et plusieurs fois par semaine lors de l'expérience décroissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux dispo-seront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par un système de scoring. Des me-sures seront prises pour limiter le stress : plusieurs souris par cage pour un hébergement en groupes sociaux, animaux hébergés au calme. Les interventions seront réalisées sous anesthésie générale ou locale selon le geste à l'écart des animaux hébergés et par des personnes expérimentées. Des points limite ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Le choix d'utiliser la souris dans cette étude repose sur plusieurs raisons importantes. Tout d'abord, la souris est un modèle complet et fonctionnel, offrant des similitudes intéressantes avec le système immunitaire humain, ce qui en fait un modèle utile pour cette recherche. De plus, nous connaissons bien sa génétique, ce qui facilite les études moléculaires et génétiques. Dans notre centre de recherche, la souris est souvent utilisée, ce qui présente des avantages pratiques. Nous disposons d'installations adaptées pour les élever, d’une solide expertise dans les techniques d'expérimentation animale ainsi que dans le suivi vétérinaire et microbiologique. La souris est également largement reconnue dans la communauté scientifique internationale comme un modèle animal standard pour les études précliniques. Son utilisation répandue facilite la comparaison des résultats entre différentes études, renforçant ainsi la validation des observations. Nous utilisons des souris adultes âgées de 8 semaines, car elles possèdent un organisme avec un développement complet et un système immunitaire fonctionnel. Les animaux sont utilisés au stade adulte (8 semaines), afin de disposer d’un organisme dont le processus de développement est achevé et qui possèdent un système immunitaire complet et fonctionnel.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie fixe une ailette métallique sur le crâne, puis chaque souris est maintenue par la tête et imagée éveillée une fois par semaine pendant trois semaines pour valider une méthode d'échographie photoacoustique de l'activité cérébrovasculaire. Le porteur indique que l'ouverture du cuir chevelu peut provoquer une douleur au réveil et que la contention induit un stress qu'il compte atténuer par habituation. Les applications cliniques et l'étude de maladies neurodégénératives sont renvoyées au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de valider l'outil d'imagerie.

Objectifs

Nous souhaitons étudier et valider une approche innovante d'imagerie non invasive de la fonction cérébrale chez la souris éveillée (mâles et femelles) grâce à l'utilisation des ultrasons à haute résolution associé à la photoacoustique.

Bénéfices attendus

Le développement de ce modèle nous permettra de mieux comprendre la fonction cérébrovasculaire chez des animaux éveillés en utilisant des approches novatrices d'imagerie non invasive. Ce modèle pourra être étendu à l'étude de pathologies comportementales ou de neurodégénérescence. À terme, nous pensons que l'imagerie fonctionnelle par échographie photoacoustique permettra d'identifier précocement des biomarqueurs de ces maladies, offrant ainsi un fort potentiel de transfert vers des applications cliniques

Procédures

La mise en place d'une ailette métallique sur le crâne de l'animal nécessitera une chirurgie peu invasive sous anesthésie et analgésie. La période de récupération post-chirurgicale sera de 7 jours. Une période d'acclimatation et d'habituation au système de fixation de l'ailette sur l'appareil de stéréotaxie sera réalisée pendant 7 jours. Cet appareillage permettra de maintenir la tête de l'animal sans entraver ses mouvements de marche. Le protocole d'imagerie par échographie/photoacoustique permettra l'enregistrement de l'activité cérébrovasculaire en réponse à différents stimuli. Ce protocole sera réalisé une fois par semaine pendant 3 semaines et durera de 20 à 30 minutes

Impact sur les animaux

L'intervention chirurgicale, impliquant l'ouverture de la peau du crâne et le placement d'une petite ailette métallique sur le crâne, peut provoquer une douleur chez les animaux au moment du réveil. En revanche, le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution est une approche non invasive et non douloureuse. La fixation de l'animal sur le système peut induire un stress temporaire (d'une durée de 20 à 30 minutes par animal), que nous atténuerons en habituant progressivement les animaux à ces procédures.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du suivi échographique/photoacoustique pour des analyses des organes en biochimie et en histologie.

Remplacement

Malheureusement, il n'existe pas de modèle alternatif (in vitro ou in silico) bien validé pour étudier l'activité cérébrovasculaire dans sa globalité. Il est essentiel d'avoir des neurones connectés aux cellules gliales, au système immunitaire et aux vaisseaux sanguins pour étudier l'activité neurophysiologique au fil du temps. Le modèle d'imagerie sur animal éveillé est largement utilisé, accepté, documenté et adopté par la communauté des neurosciences. Le modèle d'imagerie sur animal éveillé est largement utilisé, accepté, documenté, et est largement adopté par la communauté des neurosciences.

Réduction

Nous avons limité le nombre de souris au minimum nécessaire. Cette étude permettra de faire des analyses en longitudinales répétées sur chaque souris. Les mêmes séries d'animaux seront utilisées pour les explorations fonctionnelles et en histologie pour les explorations moléculaires. Enfin, nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires pour des nouveaux projets.

Raffinement

Pour réduire la souffrance et le stress des animaux, des mesures sont mises en place pour gérer la douleur et le stress, comprenant l'utilisation d'analgésiques jusqu'à la mise à mort. Pour améliorer le bien-être des souris, des matériaux de litière et des structures de repos adaptées, tels que des mouchoirs en papier ou des rouleaux en carton, sont installés dans les cages.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en fonction des modèles nécessaires à notre étude, tout en respectant les principes scientifiques des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) en recherche animale. Les souris sont fréquemment utilisées dans la littérature pour étudier la fonction cérébrale. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour étudier la fonction cérébrovasculaire, car il n'est pas techniquement possible de le faire chez des animaux plus jeunes. De plus, selon la littérature, la réactivité cérébrovasculaire en réponse à différents stimuli est optimale entre 6 et 8 semaines d'âge.

Les souris utilisées portent une modification génétique qui provoque un syndrome de Leigh : perte de poids et retard de croissance vers quatre semaines, difficultés croissantes à se déplacer, puis détresse respiratoire peu avant la mort, vers sept ou huit semaines. 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Dès le sevrage, à 21 jours, elles reçoivent dans leur nourriture deux molécules qui freinent le système immunitaire, et passent un test de coordination sur rotarod à 40 jours, après un entraînement à 30 jours. Le traitement dure jusqu'à la mise à mort, décidée par une grille de score : une perte de poids de plus de 20 %, une détresse respiratoire ou une mobilité fortement réduite suffit à atteindre le seuil de 3 points. Le porteur mesure l'efficacité au retard d'apparition des signes cliniques, et garde donc les souris en vie jusqu'à ce que leur état franchisse ce seuil.

Objectifs

Il n'existe aucun traitement disponible pour la plupart des maladies mitochondriales, maladies génétique du métabolisme entraînant un handicap grave et une mort prématurée. Le syndrome de Leigh en est une des formes plus graves. Il est causé par des mutations dans de nombreux gènes différents affectant la fonction des mitochondries, les centrales énergétiques de nos cellules. Cliniquement, cette maladie affecte généralement le cerveau et les muscles. Une étude récente a rapporté un effet positif de deux médicaments agissant sur l'inhibition du système immunitaire chez un modèle de souris développant un syndrome de Leigh suite à l'inactivation d'un gène mitochondrial particulier. Le but de notre projet est de tester ces deux molécules sur un deuxième modèle de souris du syndrome de Leigh, impliquant un autre gène, afin de déterminer si ces deux traitements peuvent être généralisable à tous les patients atteints par cette maladie.

Bénéfices attendus

Le projet vise à étudier l'implication du système immunitaire en tant que mécanisme principal à l'origine du syndrome de Leigh et la possibilté d'approches thérapeutiques le ciblant . Si les résultats sont solides et montrent des améliorations significatives, cela devrait permettre le développement de traitements cliniques pour le syndrome de Leigh et potentiellement pour d’autres maladies mitochondriales.

Procédures

Traitement pharmacologique: administration de deux molécules thérapeutiques dans la nourriture, de l'âge de 21 jours jusqu'à la mise à mort de l'animal basée sur l'observation de signes cliniques. Basé sur une publication sur un modèle similaire, le traitement pourrait s'étendre sur 6 mois. Test de coordination motrice: les souris seront placées sur une machine (rotarod) permettant de vérifier leur capacité à coordonner les mouvements de leurs pattes. Il y aura une phase d'entrainement à l'âge de 30 jours, puis une phase de mesure à 40 jours. Basé sur des publications scientifiques, les souris restent en moyenne 10 minutes sur le rotarod, par mesure. Trois mesures seront effectuées, espacées de 15 minutes de récupération.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées sur ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (vers 4 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir, et enfin des difficultés respiratoires peu avant le décès (à 7-8 semaines). Les traitements pharmacologiques en question ont été déjà appliqués dans des études scientifiques publiés qui ne semblent pas attribuer effets indésirables spécifiques.

Devenir

Tous les animaux prévus sur ce projet seront mis à mort en fin de protocole expérimental en vue de prélèvements post-mortem

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle en absence d’autre modèles cellulaires qui permettent d’étudier la réponse du système nerveux à des immunotraitements in vivo. De plus, les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique et les effectifs ont été calculés à l'aide d'un logiciel. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les analyses cliniques, pathologiques et moléculaires.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien-être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement. Pour limiter l’inconfort lié aux procédures, les manipulations seront réalisées par des personnes compétentes et expérimentées. Le bien-être des animaux fera l’objet d’un contrôle quotidien par le personnel de l'établissement utilisateur et du laboratoire. De plus, dans le cadre du protocole expérimental, à partir du début du traitement à lâge de 3 semaines, le poids corporel, la température rectale, la consommation alimentaire, l’état clinique seront évalués en aveugle au moins trois fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). Une pesée supplémentaire sera effectuée le dimanche à partir de l’âge de 6 semaines. Un score sera attribué aux signes cliniques selon la grille de points suivante: Perte de poids 20% = 3 points; Détresse respiratoire = 3 points; Diminution de la mobilité: légère = 1 point; modérée = 2 points; sévère = 3 points. Dès que les souris obtiendront un score de 3 points, elles seront sacrifiées (point limite).

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de ses gènes est très similaire à celle de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, cela permettra de tester l'efficacité de molécules thérapeutiques sur le syndrome de Leigh à l'échelle d'un organisme par des observations concrètes sur la survie et l'évolution pondérale. Le début du traitement commencera dès le sevrage des animaux à 21 jours car les molécules testées étant dans la nourriture, il faut que les souris puissent se nourrir seules. Le traitement continuera jusqu'au moment de la décision d'euthanasier les souris, basée sur notre grille de score, car le critère principal d'efficacité du traitement pharmacologique est la survenue plus tardive des signes cliniques pathologiques.