Procédures modérées

352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un diabète de type 2 d'origine génétique, reçoivent un médicament hypoglycémiant par gavage ou injection et passent des échographies cardiaques sous anesthésie, avant une injection létale pour prélever le cœur. Le porteur indique que les gavages, injections et prélèvements provoquent douleur et stress, aggravés par la pathologie diabétique. Il teste une molécule censée protéger le cœur diabétique lors d'un infarctus et affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible.

Objectifs

Nous avons récemment développé une molécule inhibant la mort cellulaire et protègeant le coeur au cours de l’attaque cardiaque (infarctus). Les expériences, pour faire cette preuve d’efficacité, ont été réalisées chez des souris saines. Cependant, parmi les patients qui font un infarctus, un grand nombre ont un diabète de type 2 qui est un facteur d’aggravation de l’infarctus augmentant leur risque de décès. De plus, en clinique humaine, les patients diabétiques de type 2 sont traités par un médicament diminuant le taux de glucose sanguin (traitement hypoglycémiant). Notre projet vise donc à explorer l’effet thérapeutique de notre molécule dans le cœur de souris diabétiques de type 2 ayant subi un infarctus et traitées par le médicament hypoglycémiant afin de mimer la situation clinique.

Bénéfices attendus

A ce jour, il n’existe aucune thérapie pharmacologique disponible pour protéger le cœur des patients diabétiques ayant un infarctus. Développer une molécule permettant de protéger le cœur diabétique est donc un enjeu majeur surtout en considérant l’épidémie de diabète qui sévit dans le monde actuellement. Ce type de traitement permettra de diminuer le risque de décès mais également de faire des économies sur les dépenses de santé publique. Nos résultats devraient également apporter une meilleure connaissance des aspects de la cardiopathie liée au diabète, en particulier les mécanismes de mort cellulaire.

Procédures

Un lot recevra le médicament hypoglycémiant par gavage (durée : 2 minutes; une fois /jour pendant 15 jours) et les souris seront pesées 4 fois. Le 2ème lot recevra 1 injection du médicament hypoglycémiant dans le péritoine (durée: 1 minute; une seule fois) et les souris seront pesées 3 fois. Les souris diabétiques ont un fonctionnement du coeur modifié sur le long terme. Cette pathologie sera évaluée par échographie sur animal anesthésié (durée: 35 min; une fois avant le gavage avec le médicament hypoglycémiant et une fois au jour 11 du traitement). Les animaux sont euthanasiés par une injection d’un composé létal dans la cavité abdominale pour prélever le cœur.

Impact sur les animaux

- douleurs et stress des gavages et injection intrapéritonéale (IP) - douleurs et stress des prélèvements sanguins - stress de l’anesthésie pour l’échographie - pathologie du diabète

Devenir

Euthanasie pour prélever le coeur qui sera analysé (coeur perfusé isolé).

Remplacement

Il n’y a pas d’alternatives non-animales disponibles pour ce projet. La cardioprotection par notre molécule se mesure sur cœur entier ex vivo¸ résultant à la fois d’effets vasculaires et musculaires après un traitement au long cours avec un hypoglycémiant (Metformine) pour mimer au mieux la situation in vivo.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront faites sur chaque individu : poids, mesure du taux de glucose sanguin (glycémie), échographie, analyse de la taille d’infarctus et de la mort cellulaire. Ensuite concernant les tests statistiques : prévision à priori du nombre de souris afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs (prévision réalisée grâce à un logiciel statistique).

Raffinement

Les protocoles ont été optimisés de manière à ce qu’ils soient les moins invasifs possibles, gavage et injection unique du médicament hypoglycémiant, échographie, puis une seule injection létale pour prélever le coeur et réaliser une expérience ex vivo (infarctus sur cœur isolé). Des points limites, une grille de score ont été établis afin de prendre en charge les nuisances. De plus, l'utilisation d'anesthésiques permet de limiter la souffrance des animaux pendant les procédures modérées. Raffinement des conditions d’hébergement : Les souris seront hébergées par 3 dans une cage et la litière sera changée fréquemment car ses souris urinent beaucoup. De plus le milieu des cages sera enrichi (maisons en carton) afin de réduire au minimum les nuisances (stress) et favoriser le bien-être des animaux. Concernant le modèle diabétique, il s'agit d'un diabète génétique spontané dans une lignée mutante à la place d'une souris alimentée durant une longue période avec une nourriture riche en graisse et riche en sucre pour induire le diabète.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus a été choisie pour utiliser un modèle de souris génétiquement modifiées reconnu internationalement comme modèle de diabète de type 2. Ce sont des souris déficientes pour le récepteur à la Leptine (hormone de la satiété). Ces souris développeront spontanément un diabète de type 2 par augmentation de la prise alimentaire (hyperphagie) présentant l'avantage de ne pas leur faire subir un régime riche en gras et en sucre sur plusieurs semaines. -Petite taille des animaux. -Les conditions d’hébergement compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences. -l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes similaires donc le choix de la souris est très avantageux pour une étude qui permet d’étudier les effets d’une molécule qui sera appliquée en clinique humaine. Les animaux seront utilisés à 9 semaines et 10 semaines selon les protocoles appliqués.

1 596 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des greffes de cœur, de peau ou d'îlots pancréatiques sous anesthésie, l'implantation d'une pompe diffusant des traitements et jusqu'à neuf prélèvements sanguins, certaines recevant une induction chimique de diabète. Le porteur indique que les chirurgies entraînent gêne et douleur au réveil malgré les analgésiques et des difficultés de mouvement à la cicatrisation. Il étudie le rôle des cellules Natural Killer dans le rejet de greffe et affirme que ce phénomène ne peut être reproduit in vitro.

Objectifs

La transplantation d’organe consiste à remplacer un organe non fonctionnel par un organe provenant d’un donneur de la même espèce mais génétiquement différent. Un des principaux risques après une transplantation est le rejet de l’organe greffé. Celui-ci résulte de la capacité du système immunitaire du receveur à discriminer comme étranger le tissu transplanté. Actuellement, on considère que les lésions de rejet sont principalement le fait des lymphocytes T et des anticorps dirigés contre le greffon (réponse du système adaptatif). Récemment des preuves expérimentales ont montré que le rejet pouvait aussi être induit par l’activation d’une autre population cellulaire : les cellules Natural Killer (NK). Ce type de rejet étant nouveau, les mécanismes exacts ainsi que l’impact des différents immunosuppresseurs utilisés habituellement en transplantation pour prévenir le rejet est inconnu sur ce type de rejet.Les cibles cellulaires et moléculaires du greffon reconnues par le système immunitaire varient selon le type de rejet : cellules des vaisseaux sanguins du greffon ou cellules plus en profondeur du tissu transplanté par exemple. Les objectifs de ce projet qui sera mené chez la souris sont : i) d’acquérir des données nouvelles pour mieux comprendre le rôle des différents effecteurs immunitaires et l’interaction avec leurs cibles cellulaires et ou moléculaires, ii) tester des molécules pour pouvoir retarder le développement des lésions de rejet et prolonger la durée de vie des greffons. Il s’agit d’un objectif prioritaire en transplantation compte tenu de la pénurie d’organe. Ceci pourrait ainsi permettre d’améliorer l’accès à la greffe pour les patients qui le nécessitent. Différents types de greffe (dites vascularisés ou non vascularisés) seront nécessaires pour mettre en évidence les mécanismes impliqués (en termes de cibles cellulaires), ainsi des souches de souris transgéniques différentes afin de mimer les différences moléculaires entre donneurs et receveurs. Ce projet sera découpé en 6 procédures : en effet, chaque type de modèle de greffe (cardiaque, cutané ou pancréatique) sera étudié en vu des objectifs 1 et 2 suivants : 1) La caractérisation des mécanismes moléculaire et cellulaires impliqués dans les rejets de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots et 2) la validation de molécules pour évaluer leurs capacités à réduire le risque de rejet de greffon cardiaque, cutané ou d’ilots sur une durée de 8 Semaines maximum. 1596 souris maximum

Bénéfices attendus

Une meilleure compréhension des mécanismes impliquant le système plaquettaire dans ce type de rejet ainsi que la validation de certaines molécules candidates nous permettraient de proposer de nouveaux traitements pour améliorer la survie du greffon aux patients transplantés

Procédures

Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 1h Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – opération au niveau du cou (total opération 2h) Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon de pancreas : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 30 secondes) Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre 30 sec) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (total opération 2h). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe – Expérience de maximum 49 jours Souris receveuses de greffon cutané : Greffe d’un morceau de peau sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique (4 injections sous la peau 30 sec) au niveau du flanc (total opération 30-40 min). Implantation sous la peau d’une pompe diffusant les traitements (sous anesthésie - injection dans le ventre) 2 fois maximum (total opération 30 minutes). Maximum 9 prélèvements sanguins (max 30 secondes) + 2 avant la greffe Expérience de maximum 49 jours

Impact sur les animaux

Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang (sinus, submandibulaire ou queue) sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cœur, d’ilots ou de peau sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 3 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.

Devenir

Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.

Remplacement

Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Le rejet d’organe ne peut pas être reproduit in vitro

Réduction

Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour que les résultats soient significatifs à 10 animaux par groupe. Nous tenons compte du taux de réussite de 80-90% pour les greffes cardiaques soit 12 initial, et la mise en place du diabète, taux de réussite 70% soit 14 initial pour obtenir 10 souris par groupe au final. Les groupes comporteront donc entre 10 et 14 individus au maximum afin d’avoir au moins 10 animaux analysables par groupe compte tenu des taux de réussite de chaque chirurgie. Au total, le nombre d’animaux nécessaires à ce projet est de 1596 souris (mus musculus).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera analysé et pris en compte tout au long du protocole avec un suivi adapté en termes de fréquence et de détermination des points limites (poids, comportement aspect general). Différents traitements seront administrés pour réduire la douleur (analgésie) et les souris seront sous anésthésie générale pour les chirurgies Analgésie local pour les prélèvements sanguins. Pesée hebdomadaire, et fréquence augmentée à 2 fois par semaine si perte de poids > 10%. Suivi post op à 4-6h post opération, J1 et J2 Aucune chirurgie le jeudi et vendredi pour un suivi à J1 et J2. Mesure de la glycémie pour mesurer la prise de greffe Les animaux seront maintenus en groupes sociaux pour éviter le stress lié à l'isolement (ils ne seront isolés que s’ils présentent une lésion au niveau de la suture de la peau post chirurgie) -anésthésie locale avant l’incision sur la zone à opérer (pompe et greffon) et sur la zone avant suture -antiobiotique durant les 24h post chirurgie La perte du greffon, ilots, peau ou cœur, ne peut entrainer la mort de l’animal en soi. L’utilisation de la pompe permettra de traiter les souris quotidiennement sans avoir recours à des injections IP quotidienne. Les souris sont placées en armoire chauffante après la chirurgie durant 4-6hpuis remise dans leur cage sur portoir Les gestes techniques chirurgicaux sont réalisés par un chirurgien (chirurgie humaine) formée à la chirurgie sur rongeur et ces gestes précis en particulier. Les chirurgies sont réalisées sous hote avec des loupes binoculaires avec du materiel steril En cas d'infection, un traitement antibiotique sera administré. Des points limites précis et prédictifs ont été définis de manière à éviter toute souffrance inutile des animaux.

Choix des espèces

Du fait de leur similarité avec l’homme en termes de génétique, d’anatomie et de physiologie, la souris représente un modèle expérimental privilégié pour l’étude de la réponse immunitaire allogénique, c’est-à-dire entre souris de fond génétique différent. Notre projet nécessite le recours à des animaux génétiquement modifiés précédemment développés et disponibles présentant des défauts immunitaires plus ou moins importants. De tels modèles n'existent que dans l'espèce souris. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées, afin qu'elles aient un système immunitaire mature.

162 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélever les fœtus in utero et une trentaine réutilisées. Les femelles sont accouplées, soumises à des frottis vaginaux puis à trois injections de bleu trypan, un colorant connu pour ses effets sur le développement embryonnaire. Le porteur indique que la substance colore les téguments en bleu sans effet manifeste sur la mère et que la manipulation par des étudiants inexpérimentés peut stresser les animaux. Il présente ce test réglementaire comme un exercice de formation d'agronomes et affirme qu'il ne peut être remplacé par une méthode sans animaux.

Objectifs

Pour initier les étudiants (formation professionalisante en agronomie bac+3) aux procédures expérimentales permettant de tester les effets toxiques et écotoxiques des molécules chimiques, nous avons décidé de réaliser un test de toxicité embryo-foetale tel que décrit dans les directives de l’OCDE (essai n° 414 : « Test de tératogénicité d’une substance ») et repris dans le règlement 2023/464 du 3 mars 2023 de la commission européenne sous la dénomination « test B.31 ». Ce test a été choisi car il reste peu invasif et ne présente pas d’effet délétère sur la femelle à la dose testée. D’un point de vue pédagogique, outre la mise en place des différentes procédures détaillées dans ce document, ce travail permettra aux étudiants de mettre en œuvre des techniques zootechniques de base (contrôle du cycle des femelles et des accouplements, suivi quotidien et entretien des animaux) et de Bonne Pratique de Laboratoire dans le respect des règles éthiques et enseignées par ailleurs. Afin de valoriser au mieux l’utilisation des animaux, en plus des compétences/connaissances techniques acquises, nous utiliserons ce test réglementaire pour faire le lien avec d’autres enseignements plus théoriques et discuter par exemple de questions de biologie de la reproduction et du développement. De plus, les données générées lors de ce travail pratique seront utilisées pour évaluer les connaissances en analyse de données acquises par les étudiants au cours de leur formation. Enfin, ces tests réglementaires de toxicité embryo-fœtale sont contextualisés dans la nécessité de s’assurer, avant obtention de mise sur le marché de produits phytopharmaceutiques, de leur innocuité vis-à-vis de la santé des populations humaines et de la nécessité d’avoir recours à des méthodes de protection des cultures moins impactantes sur l’environnement et la santé, un enjeux sociétal majeur auquel devront répondre les étudiants que nous formons.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus en terme de formation, pour nos futurs techniciens, sont principalement une amélioration de leur compétences techniques par la réalisation de gestes variés en milieu contrôlé (travail en animalerie conventionnel avec le respect des procédures et règles sanitaires ; mise en œuvre de Bonnes Pratiques de Laboratoire ; mise en œuvre des enseignements du suivi du bien-être des animaux; apprentissage de nouveaux gestes techniques). Toutefois, ce travail sera aussi l’occasion d’introduire certains concepts et de faire le lien avec de nombreux autres enseignements : importance mais aussi limites des tests sur animaux dans la cadre de tests de toxicité, notamment dans le contexte de mise au point de nouveaux produits phytopharmaceutiques ; analyses statistiques de données complexes à l’aide d’outils informatiques dédiés ; rappel de biologie de la reproduction et du développement.

Procédures

Les animaux seront mis en accouplement jusqu’à 5 jours successifs et seront soumis à la réalisation d’un frotti vaginal (entre 1 et 5 pour une durée maximale de réalisation d’une minute). Les animaux retenus subiront ensuite 3 injections successives (voie intrapéritonéale, sous-cutanée, per os ou intra rectale) de la mocécule testée. Chaque administration devrait durée moins d’une minute.

Impact sur les animaux

La substance testée est une molécule modèle, un colorant utilisé en histo-cytologie, connue pour avoir des effets sur le développement embryonnaire mais aucun effet manifeste chez la mère à la dose utilisée. La seule manifestation évidente est une coloration bleue des téguments. La douleur anticipée de l'injection est modérée et de courte durée.Il est cependant à noter, que les animaux pourraient être soumi à du stress lié à la manipulation par des étudiants qualifiés mais encore inexpérimentés.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans la procédure seront mis à mort car il est nécessaire de prélever les foetus in utéro afin de ne pas sous-estimer le nombre de foetus atteints d'anomalie congénétale. Néanmoins, il est toujours possible que certains femelles ne se soient pas accouplées (estimation de 5 à 6 femelles par année) et n’aient pas été intégrées dans la procédure. Le cas échéant, elles seront mises à disposition d’autres procédures autorisées au sein de notre structure d’enseignement ou permettront de tester une voie d’administration moins invasive que l’intrapéritonéale.

Remplacement

Les tests de toxicité sur le développement sont destinés à livrer des informations générales concernant les effets de l'exposition prénatale d'une femelle gravide à une substance chimique, sur elle-même et sur l'organisme en développement qu'elle porte en elle. Par conséquent, ils ne peuvent être remplacés par d’autres méthodes ne faisant pas appel à des modèles animaux.D’un point de vue pédagogique, outre la mise en place des différentes procédures détaillées dans ce document, ce travail permettra aux étudiants de mettre en œuvre des techniques zootechniques de base (contrôle du cycle des femelles et des accouplements, suivi quotidien et entretien des animaux) et de Bonne Pratique de Laboratoire dans le respect des règles éthiques enseignées par ailleurs. Afin de valoriser au mieux l’utilisation des animaux, en plus des compétences/connaissances techniques acquises, nous utiliserons ce test réglementaire pour faire le lien avec d’autres enseignements plus théoriques et discuter par exemple de questions de biologie de la reproduction et du développement mais aussi de la nécessité d’avoir recours à des méthodes de protection des cultures moins impactantes sur l’environnement et la santé, un enjeux sociétal majeur auquel devront répondre les futurs agronomes que nous formons.

Réduction

Un test de toxicité embryo-fœtal nécessite le recours à deux espèces de mammifères (une espèce de rongeur et une espèce non-rongeur) et 4 à 5 lots (3 doses différentes et 1 ou deux témoins -conditions zootechniques et le cas échéant, véhicule de la substance testée-) d’un minimum de 20 femelles gravides chacun. Compte tenu de la visée pédagogique de ce travail, le nombre d’animaux sera réduit au strict minimum. Seul le lot correspondant à la dose d’intérêt chez une espèce, le rat, sera réalisé. Aussi, metterons nous 30 femelles en reproduction pour avoir au moins 25 femelles gravides par année (soit 30*5=150 femelles) ce qui correspond, d'une part aux exigences du test réglementaire et d'autres part aux effectifs de nos promotions (50 étudiants, 1 rat par binôme). Les résultats obtenus seront comparés à des données simulés informatiquement à partir de données de la littérature (les fréquences spontanées des principales anomalies congénitales et des résorptions sont en effet connues chez le rat). Dans un souci de raffinement, 12 rats supplémentaires seront utilisée pour tester une voie d’administration moins invasive. Soit 162 animaux sur 5 ans.

Raffinement

Le test de toxicité sera simplifié par rapport aux directives réglementaires pour réduire le nombre d’animaux utilisés. Les étudiants participants ont au préalable obtenu la qualification à l’expérimentation animale pour Applicateur et ont acquis un certain nombre de gestes techniques. La substance testée est une molécule modèle, un colorant utilisé en histo-cytologie, connue pour avoir des effets sur le développement embryonnaire mais aucun effet manifeste chez la mère à la dose utilisée. Le suivi est réalisé conjointement par les étudiants, le personnel de l’animalerie et le personnel enseignant à l’aide d’une grille d’évaluation mise en place par la Structure en charge du Bien-Etre Animal de notre structure. Chaque manipulation conduit à l’attribution d’une amande donnée par l’étudiant ayant réalisé l’intervention à titre de renforcement positif. Nous proposons de mettre en place une étude pilote permettant de définir une voie d’administration la moins invasive possible. Les animaux sont hébergés par groupe de 3 dans des conditions conforment à la réglementation avec un enrichissement varié et adapté ainsi qu'un contrôle quotidien.

Choix des espèces

Le rat est le modèle le plus utilisé après le lapin dans les études de toxicité embryo-fœtale. La forte prolificité de cette souche permet avec un nombre réduit de femelles d’obtenir une grande quantité d’information sur les fœtus. En outre la biologie de la reproduction de cette souche est parfaitement caractérisée facilitant la mise en place de la procédure mais aussi la simulation informatique du lot témoin (les fréquences spontanées des résorptions et des principales anomalies congénitales sont en effet connues). Seules des femelles primipares seront utilisées afin de ne pas confondre les résorptions précoces imputables au traitement avec des traces d’implantation d’évènements de reproduction ultérieurs. Les femelles devront atteindre un poids d’environ 300g pour augmenter les chances de fécondation lors des accouplements.

124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection intracérébrale, une déplétion du microbiote par un cocktail d'antibiotiques et d'antifongiques dans l'eau pendant douze jours, puis un test de motivation alimentaire. Le porteur indique que la chirurgie peut causer douleur, infection et perte de poids et que le traitement peut induire une inflammation intestinale modérée. Il présente cette étude comme une "preuve de concept" préalable à des travaux chez l'humain et affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet ces mesures neuro-comportementales.

Objectifs

L'appétit, la satiété et les préférences alimentaires sont influencés par le microbiote intestinal. Plusieurs études récentes indiquent que l'absence ou l'appauvrissement du microbiote intestinal augmente chez la souris la consommation d'aliments appétents. Néanmoins, les substrats et mécanismes neurobiologiques sous-jacents ne sont pas bien connus. Dans cette étude nous nous intéressons à l'insula, une structure cérébrale responsable de la perception du goût et des saveurs qui reçoit également des signaux viscéraux permettant l'interoception (perception de l'état interne). Les résultats issus de ce projet nous permettrons de tester l'hypothèse selon laquelle le microbiote et les signaux associés influencent le comportement alimentaire à travers des mécanismes dépendant de l'activité de l'insula.

Bénéfices attendus

Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des influences du microbiote intestinal sur l’activité cérébrale (en particulier celle de l'insula) en réaction à des stimuli alimentaires. Cette étude « preuve de concept » chez l’animal est nécessaire pour permettre d’envisager par la suite des études plus appliquées dans des modèles de troubles du comportement alimentaire ou chez l’Homme.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections intracérébrales sous anesthésie générale par chirurgie stéréotaxique (au maximum 1 chirurgie par animal). Le microbiote intestinal des souris sera déplété par prise volontaire dans l'eau de boisson (prise quotidienne) d'un cocktail d'antifongique/antibiotiques pendant 12 jours. La motivation alimentaire des animaux sera testée lors d'un test comportemental dédié (au maximum 2 tests d'1h par animal).

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique peut engendrer de la douleur pendant la chirurigie et en post-opératoire ainsi que des infections ou une perte de poids. Ces effets indésirables sont prévenus par une couverture analgésique appropriée en péri- et post-opératoire et le respect des conditions d’asepsie. L’administration d’un cocktail d’antifongique/antibiotiques pour dépléter le microbiote digestif peut induire des modifications de la motilité intestinale, une augmentation de l’hydratation des selles et une inflammation intestinale modérée. La durée de ce traitement a été limitée à une durée minimale permettant une dépletion efficace du microbiote intestinal.

Devenir

A l'issue des procédures, les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur. L'analyse de l'expression du traceur neuronal et du marqueur de réactivité neuronale nécessite le prélèvement du cerveau et donc l'euthanasie des animaux.

Remplacement

L'activité cérébrale peut être étudiée dans divers modèles incluant par exemple des modèles cellulaires complexes récapitulant une partie de son organisation et de ses fonctions comme les organoïdes. Néanmoins, cette étude comprend des mesures neuro-comportementales et ne peut être ni réalisée in vitro ni modélisée in silico. En effet, l'activité cérébrale qui sous-tend les comportements émerge d'une organisation anatomo-fonctionnelle cérébrale complexe et de l'intégration de signaux provenant d'organes périphériques que seul le modèle animal permet d'explorer. Aucun autre modèle à l'heure actuelle ne peut récapituler ces processus et permettre ces mesures neuro-comportementales. Cette étude nécessite donc l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de déterminer la pertinence de poursuite ou non de la méthode mise au point et de détecter des différences neuro-comportementales entre les groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages contenant un objet leur permettant de se mettre à l’abri et des carrés de cotons ou des sticks en papier pour réaliser un nid. Afin de limiter la douleur et l’inconfort pouvant être générés par la chirurgie stéréotaxique, l’asepsie sera respectée lors de la chirurgie pour limiter le risque d’infection et un protocole adapté de gestion de la douleur sera utilisé en péri- et post-opératoire. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. Pour limiter le stress des animaux, l’administration du cocktail d’antibiotiques/antifongiques est réalisée dans l’eau de boisson (prise volontaire). Les prélèvements pour l’analyse histologique et la densité du microbiote sont post-mortem.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.

2 000 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les cellules tumorales sont injectées par voie carotidienne pour provoquer des métastases cérébrales, suivies de traitements par diverses voies, de rayons ionisants, parfois d'un implant hormonal et de prélèvements répétés. Le porteur indique que la tumeur peut entraîner perte de poids, faiblesse musculaire et troubles de la coordination, la perte de poids servant de point limite. Cette société de recherche préclinique décrit une "demande de plus en plus importante" pour ces modèles et affirme que les méthodes 3D restent marginales et difficilement transposables.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie (Centre international de recherche contre le cancer). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, les cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente aux traitements. D’énormes progrès ont été réalisés en clinique sur les tumeurs dites primaires. En revanche, le pronostic vital des patients peut être énormément dégradé en cas de métastases. On parle de métastases cérébrales lorsqu’un cancer d’un autre organe (cancer primitif) s’est propagé au cerveau. Des métastases s’y développent fréquemment en cas de cancer du sein, de la peau ou du poumon. Parmi les cancers chez les femmes, celui au sein est le plus répandu dans les pays développés. Environ 20 % des cancers du sein développent des métastases cérébrales. Malheureusement, les traitements actuels, par radiothérapie, chimiothérapie et chirurgie, sont majoritairement vains. La présence de métastases au cerveau entraîne un mauvais pronostic de survie (6 mois en moyenne), même si le cancer primitif répond bien aux traitements. En effet, le diagnostic est généralement tardif. Pour répondre à ce besoin de nouvelles approches thérapeutiques l’objectif de ce projet est d’induire directement des métastases dans le cerveau en mimant le cheminement des cellules tumorales jusqu’au cerveau par la voie carotidienne. Ces modèles, permettront de refléter la pathologie humaine et d’évaluer des nouveaux médicaments destinés à traiter les métastases cérébrales chez l’homme. Nous étudierons ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison chez l’animal avant de les tester chez l’homme. Une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale. Nous estimons le nombre de projet à 5 par an soit 25 projets sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Notre société, spécialisée en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Une demande de plus en plus importante se fait pour le traitement des métastases. Plus particulièrement ces demandes sont accès sur les métastases cérébrales qui reste à ce jour sans traitement. Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Grace à ces modèles, il sera possible d’étudier les mécanismes d’expansion ou de nidification des métastases avec des traitements prophylactiques ou de croissance des métastases avec des traitement de deuxième ligne dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme. Il sera possible aussi, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre la progression des métastases.

Procédures

L’induction tumorale est réalisée sous anesthésie générale avec analgésie avec administration d’un anesthésique local et d’un anti inflammatoire (

Impact sur les animaux

La greffe des cellules nécessitera une chirurgie qui pourra engendrer une douleur modérée sur 1-2 jours et un stress modéré. L’évolution de la tumeur pourra entraîner une perte de poids, des difficultés à se mouvoir, une faiblesse musculaire et des soucis de coordination. La perte de poids sera le premier symptôme observé et constituera un point limite. Pour les expériences d’activités antitumorales, les animaux recevront des traitements et/ou seront exposés à des rayons ionisants à visée thérapeutique. Ces traitements pourront entrainer un stress léger et une douleur légère. Il pourra aussi être nécessaire de mettre en place un implant sous cutané de diffusion hormonale pour les tumeurs hormonodépendantes, lors d’une chirurgie stérile sous anesthésie avec analgésie. Cela pourra entrainer une douleur modérée et un stress léger sur 1 jour. Le jour de la randomisation, les animaux seront potentiellement mis avec de nouveaux congénères. Cela pourra engendrer un stress pendant 1-2 jours. Au cours d’une étude, les animaux seront manipulés. Les mesures de poids et de volume tumoral entraînent un stress que l’on peut considérer comme faible, et qui diminue avec l’habituation.

Devenir

Du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, ils seront tous mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte global ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais sont toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme pour étudier les modèles de métastases.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s) (poids ou imagerie). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés : en général un groupe non traité et/ou traité par le véhicule utilisé pour la molécule à évaluer, puis un groupe par schéma de traitement (différentes doses, voies, molécules etc). Au minimum, une étude comportera un groupe avec tumeur, non traité et/ou traité avec le véhicule et un groupe avec tumeur, traité avec le composé à tester. Toutefois, dans la mesure du possible, le maximum de composés sera testé au cours de la même étude afin de ne pas multiplier les animaux contrôles ainsi que les animaux surnuméraires non randomisés. Compte tenu de la chirurgie (risque inférieur de 5% de mortalité chirurgie par des personnels entrainés) et afin de pouvoir former des groupes homogènes il sera en général nécessaire d’inclure jusqu’à 15% d’animaux surnuméraire. En fonction du succès des études pilotes et une fois le modèle totalement acquis, ce nombre d’animaux surnuméraire sera réduit. Le nombre d’animaux par groupe se situera entre 6 à 15 animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement relevant. Il s’agit d’un nombre minimum d’animaux permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt (en général mortalité et nombre/volume de métastases déterminés par imagerie).

Raffinement

Au cours de l’expérimentation, les animaux seront maintenus dans leurs cage avec un enrichissement adapté et dans les conditions standard d’hébergement en terme de surface de cage et de nombre. Les animaux seront pesés au minimum 2 fois par semaine et un suivi adapté (observations, pesées, signes cliniques) sera mise en place post chirurgie avec évaluation des lésions neurologiques 1h post chirurgie et soins post opératoire et antalgie pendant 48h post chirurgie. Cette fréquence sera augmentée pour tous les animaux dès l’apparition des premiers signes cliniques qui pourront amener aux points limites. Un gel nutritif sera placé au fond de toutes les cages dès qu'une perte de poids de plus de 10% sera observée sur certains animaux. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie, la pose d’implants hormonaux seront réalisés sous anesthésie avec incision cutanée et Injection locale d'antalgique. Pour la greffe, une analgésie locale avec dépôt d’anesthésiques locaux en sous-cutané au niveau de l’incision de la peau sera réalisée et les animaux recevront un opiacé et un anti inflammatoire non stéroïdien. Le lendemain, les animaux seront traités avec un antiinflammatoire). En fonction du suivi clinique et sous avis vétérinaire, le traitement à l’antiinflammatoire pourra être prolongé. La greffe sera réalisée en conditions d’asepsie. Les points limites définit par la SBEA seront appliqués.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7-8 semaines lors de leur première manipulation). Toutefois, ils pourraient être reçus à partir de 5 semaines mais ne seront pas manipulés avant 7 semaines minimum. Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales.

60 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, réutilisés d'une étude à l'autre puis tués pour des analyses ex vivo. Chaque animal peut subir une chirurgie du cerveau de deux à quatre heures, l'implantation d'électrodes, l'administration de vecteurs viraux, jusqu'à dix prélèvements de sang en 24 à 48 heures, des ponctions de liquide céphalorachidien et des séances quotidiennes en chaise de contention, avec injection d'harmaline pour provoquer des troubles moteurs. Le porteur teste de nouvelles électrodes de stimulation cérébrale profonde et des vecteurs de thérapie génique dans un cadre de prestation commerciale. Il justifie le recours au primate en invoquant que l'"éthique spéciste actuelle" interdit ces approches invasives chez l'humain.

Objectifs

La stimulation cérébrale profonde (DBS) est une procédure neurochirurgicale pratiquée chez les personnes souffrant de troubles du mouvement notamment dans la maladie de Parkinson (MP). La stimulation interfère avec les signaux pathologiques dans le cerveau pour restaurer les fonctions motrices normales. Cette thérapie a été reconnue comme sûre et efficace pour l'amélioration des symptômes chez les patients atteints de MP tel que les tremblements, rigidité ou autres fluctuations motrices. Cette méthodologie a été une évolution technique majeure pour le traitement de la MP et l’intervention chirurgicale est maintenant explorée également pour d'autres conditions, comme l'épilepsie et la dépression. Ceci explique le développement permanent de nouvelles sondes DBS capables d'enregistrer l'activité cérébrale dans les structures cibles afin de contribuer au développement de nouvelles thérapies chez les patients atteints d’autres affections neurologiques. D’un autre côté, de nouvelles stratégies innovantes basées sur la thérapie génique pourraient également bénéficier aux patients atteints de ces affections. Cette approche utilise des virus modifiés ; ils ont perdu leur pouvoir de se multiplier mais peuvent apporter dans des cellules ou des organes malades, un gène réparé, ou des molécules qui soignent. On parle alors de vecteurs viraux ou non viraux (peptides, anticorps...) ou plus génériquement d’inocula. Pour le cerveau, la voie la plus efficace d’administration de ces vecteurs tout comme la DBS reste l’approche chirurgicale par stéréotaxie. Si la validation de nouvelles sondes DBS passent par des enregistrements des signaux, la mesure des effets des inocula se fait par des analyses biochimiques sur des prélèvements biologiques puis cellulaires après mise à mort. Les études précliniques nécessitent de valider ces outils (sondes pour la DBS ou inocula) chez le primate non humain (PNH). Le projet a donc pour objectif de valider d’une part de nouveaux vecteurs qu’ils soient porteurs d’une molécule «contrôle» ou de protéines d’intérêt à visée thérapeutique et d’autre part de nouvelles sondes DBS chez le PNH.

Bénéfices attendus

Les animaux sont soumis aux différentes étapes décrites dans la procédure. - Prélèvements sanguins sur animal anesthésié ou vigile (10 min), fréquence max en 24/48 h = 10 prélèvements et volume max sur une semaine entre 5 à 7 ml/kg / semaine - Prélèvements LCR, sur animal anesthésié, 1 ml max sur un mois (10 min) - Imagerie (3 heures) sur animal anesthésié - Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). - Traitement prophylaxique par gavage (fréquence variable, max 2 fois par jour) sur animal vigile pour une durée entre une semaine et 10 jours. Ceci afin de conserver un score inférieur à 5 sur l’«Échelle d'évaluation du bien-être PNH» - Tache en chaise avec enregistrements électrophysiologiques et/ou stimulation (séances quotidiennes de 1-2h, sur jour ouvré pendant toute la durée du projet) sur animal vigile en absence ou en présence de fluctuations motrices (induites par l’harmaline, max 1 fois par semaine).

Procédures

Les animaux sont soumis aux différentes étapes décrites dans la procédure. - Prélèvements sanguins sur animal anesthésié ou vigile (10 min), fréquence max en 24/48 h = 10 prélèvements et volume max sur une semaine entre 5 à 7 ml/kg / semaine - Prélèvements LCR, sur animal anesthésié, 1 ml max sur un mois (10 min) - Imagerie (3 heures) sur animal anesthésié - Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour l'implantation, l'enregistrement ou la stimulation d'électrodes intracérébrale ou l'administration d'inoculum sous imagerie par rayons X (durée 2-4 heures). - Traitement prophylaxique par gavage (fréquence variable, max 2 fois par jour) sur animal vigile. - Tache comportementale en chaise avec enregistrements électrophysiologiques et/ou stimulation (séances quotidiennes de 1-2h, sur jour ouvré pendant toute la durée du projet) sur animal vigile en absence ou en présence de fluctuations motrices (induites par l’harmaline, max 1 fois par semaine).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont celles associées aux différentes étapes. Pour la chirurgie : stress de l’anesthésie, hypothermie, douleur post opératoire possible, infection au niveau des points de sutures. Pour l’aspect comportemental : stress et inconfort dus à la captivité et au conditionnement à une tache comportementale, administration systémique d’harmaline entrainant les fluctuations motrices. Pour les prélèvements (sang, LCR) : stress de la contention et de l’anesthésie, hématome, douleur possible. Pour l’imagerie : réaction imprévue à l’administration de produit de contraste, inconfort liée à l’anesthésie durant le transport. Bien que les vecteurs viraux soient réputés pour leur faible toxicité, une surveillance des paramètres biologiques et comportementaux (anxiété, motricité, etc..) permettra de les détecter.

Devenir

A la fin du projet les animaux pourront être réutilisés un autre projet et ceci conformément à l’article 16 de la directive européenne 2010/63 EU, et après avis favorable du vétérinaire référent. Cela concerne les cas où les études n’impliquent pas de prélèvement de tissus et de contrôle post-mortem. Ainsi si une étude de sévérité légère ou modérée ne se termine pas sur un prélèvement de tissus, l'animal pourra être ré-utilisé dans une nouvelle étude. En tout état de cause, l'ensemble des animaux à la fin du projet seront euthanasiés afin de réaliser des analyses ex-vivo. Des organes pourront également être proposés à d'autres équipes de recherche.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité pré-clinique de service. Il recourt exclusivement à l’utilisation du primate non-humain (PNH), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal peut se justifier pour plusieurs raisons éthiques : 1) l’éthique « spéciste » actuelle interdit l’utilisation d’approches neurobiologiques invasives chez l’homme, rendant ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf, bien sûr, lorsque ceux-ci sont non-invasifs); 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces processus causaux; 3) Enfin, dans le cadre des modèles de maladies neurodégénératives, l’objectif à terme (bien que non décrit dans le présent projet) est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (moteur, cognitif) de ces affections qui en tant que telles ne peuvent être étudiées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire. De ce fait, le recours à l’animal et tout particulièrement le PNH (du fait de sa proximité avec l’homme en termes d’anatomie cérébrale, de répertoire comportemental etc.) pour étudier les manifestations comportementales et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Enfin, dans les tests pré-cliniques que nous abordons et dont le but est de se poursuivre chez l’homme, le recours exclusif au rongeur ne peut être satisfaisant. Dans bien des cas par exemple les immunothérapies testées ne peuvent interagir qu’avec des tissus provenant de PNH, ce qui impose souvent l’utilisation du modèle primate.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques ou le développement de nouveaux dispositifs médicaux (ici électrodes de stimulation/enregistrement) avec un nombre estimé de 3 études par an, comprenant 4 animaux maximum par étude, soit un total de 60 animaux maximum sur 5 ans. Bien qu’un nombre de 4 animaux soit faible pour avoir une puissance statistique élevée, il est suffisant pour effectuer des tests statistiques de comparaison. Il est également important de noter que les études de neurophysiologie ou de développement de neurotechnologies sur «gros animal» se limitent généralement à un nombre de 3 à 5 animaux, en raison de la complexité technique et expérimentale inhérente à ce domaine. Il s’agit du nombre généralement attendu par les comités de lecture dans le cadre de l’évaluation par les pairs, qui attendent dans ce cas les résultats individuels sur chaque animal. Les inocula auront été testés préalablement in vitro ou chez le petit animal (rongeur) par nos clients pour déterminer les doses à utiliser et s’affranchir d’éventuels effets toxiques nécessitant un apport supplémentaire d’animaux. Dans le cadre d’une étude de validation de dispositif médical (électrode), la chirurgie implantatoire peut ne concerner qu’un seul hémisphère cérébral, l’autre hémisphère pouvant être utilisée comme contrôle. Ce qui permet de réduire le nombre d’animaux de moitié. Enfin des males comme des femelles pourront indépendamment être utilisés dans nos projets.

Raffinement

Pendant la procédure, les animaux sont maintenus sous anesthésie générale avec une surveillance constante de leurs paramètres vitaux (fréquence cardiaque, pression sanguine, température...). Ceux-ci nous permettent d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des antiarythmiques en cas de risque de fibrillation ventriculaire. Un défibrillateur est toujours disponible en salle d’opération pour éviter la mort précoce de l’animal durant les tests. Pendant l’hébergement, l’animal est placé dans des locaux adaptés, avec les méthodes de raffinement appropriées pour son espèce (groupe social, enrichissement adapté). Pour le transport à la plateforme d’imagerie située à 200 m de l’animalerie, une cage dédiée placée sur un chariot protégée des regards extérieurs par une housse est préparée et l’animal sous sédation légère et dont les constantes sont toujours contrôlées, est maintenu au chaud sous une couverture et bordé d’une bouillote. Le suivi des animaux est quotidien, assurée par du personnel qualifié pour cette espèce sur des critères comme la posture de l’animal, son activité, son interaction, sa nutrition. La surveillance est renforcée durant la période post opératoire et en cas d’apparition de troubles. L’ensemble de ces informations sont reportés dans des fiches de suivi adapté. Cette surveillance permet une intervention rapide auprès du vétérinaire et du responsable de projet pour adapter les soins analgésiques si nécessaire. Si une étape du protocole chronique affecte l’état de santé au point d’atteindre l’un des points limites sans qu’aucune action ne puisse permettre un retour à l’état basal alors le protocole sera interrompu et l’animal mis à mort selon les modalités éthiques. Les volumes de prélèvements de sang comme de LCR sont adaptés au poids de l’animal, et sont réalisé sur animaux sédatés. L’apparition d’hématome au point de prélèvement est surveillée.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme le PNH a été retenu car (i) les modèles sont bien décrits et caractérisés et constituent donc une référence dans la communauté scientifique ; (ii) le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles animaux. De plus, l'anatomie cérébrale du PNH est proche de celle de l’homme en terme de taille. Il existe de plus une forte homologie entre les structures cérébrales du porc et celles de l’homme (basées sur des atlas) ce qui est indispensable dans le cadre de l'étude de la faisabilité de la procédure Enfin, ce passage par le PNH avant la clinique relève d’un principe éthique visant à protéger démontrant la faisabilité de l’approche thérapeutique de l’espèce la plus proche de l’homme. Adultes afin que de pouvoir appréhender un système nerveux central en pleine maturité (2 ans minimum). Au stade défini, la taille et les caractéristiques du cerveau des animaux sont proches de celle de l’homme ce qui permet une évaluation fiable des cibles pour la chirurgie.

1 365 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation puis de une à neuf injections, avec induction de tumeurs, pour étudier le rôle de sous-types de cellules dendritiques dans l'immunothérapie du cancer. Le porteur indique que la croissance tumorale et les traitements peuvent entraîner une perte d'appétit et de poids et que l'irradiation peut causer amaigrissement et diarrhée. Il qualifie d'"indispensable" le recours à la souris et renvoie les retombées thérapeutiques pour les patients à un horizon futur.

Objectifs

La mort cellulaire immunogène est un processus de mort cellulaire qui déclenche une réponse immunitaire. Lorsqu'une cellule meurt de manière immunogène, elle libère des signaux moléculaires qui attirent les cellules du système immunitaire, comme les cellules dendritiques qui jouent un rôle central. Actuellement, différents sous-groupes de cellules dendritiques ont été identifiées mais, à ce jour, leur rôle n’est pas encore clair. Les objectifs de ce projet sont : 1) Découvrir et comprendre quels sous-types de cellules dendritiques sont les plus importants pour garantir un meilleur effet avec la thérapie immunogène anticancéreuse. 2) Etudier comment les chimiothérapies immunogènes et l’immunothérapie affectent les bons sous-types de cellules dendritiques et montrent un meilleur traitement contre le cancer que les autres. Cette recherche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives pour améliorer l'efficacité des approches thérapeutiques immunogènes contre le cancer par amorçage du potentiel des cellules dendritiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Bénéfices attendus

Les recherches dans ce projet peuvent avoir un impact significatif sur le développement de traitements plus personnalisés et efficaces contre le cancer en exploitant le potentiel des sous-populations spécifiques de DC dans la thérapie immunogène. Voici quelques-uns des avantages attendus de ce projet : 1) En étudiant comment la déplétion sélective de certaines sous-populations de DC affecte la réponse immunitaire, nous pourrions parvenir à une compréhension plus approfondie du rôle spécifique de ces cellules dans la thérapie immunogénique du cancer. Cela permettrait de mieux cibler les interventions thérapeutiques pour maximiser leur efficacité ; 2) En comprenant comment les différentes sous-populations de DC interagissent avec la chimiothérapie et l'immunothérapie, nous pourrions optimiser la combinaison de ces approches pour une meilleure réponse immunitaire et une plus grande efficacité dans le traitement du cancer ; 3) Ces recherches pourraient révéler des sous-populations spécifiques de DC qui sont essentielles pour une réponse immunitaire efficace. Cela ouvrirait la voie à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques pour renforcer la réponse immunitaire anticancéreuse.

Procédures

Suivant les groupes, les animaux recevront une irradiation (durée 14 minutes) suivie d'une injection (durée 2 minutes) sous anesthésie locale. Suivant les lots, les souris pourront avoir entre 1 et 9 injections (durée 2 minutes) sous anesthésie locale.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations (préhension, injections) peuvent induire du stress chez l'animal. La croissance tumorale et les traitements (la chimiothérapie et l'immunothérapie) peuvent entraîner une perte d'appétit et une perte de poids. L’irradiation peut induire des atteintes modérées de la santé avec amaigrissement et diarrhée transitoires.

Devenir

Les souris seront euthanasiées afin de prélever des organes et faire des analyses de biologie moléculaire et cellulaire.

Remplacement

L'utilisation de la souris dans la recherche sur la chimiothérapie et l'immunothérapie est indispensable car les maladies traitées par perfusion et immunothérapie, particulièrement le cancer, sont des affections complexes impliquant des interactions entre de multiples voies biologiques et des cellules. Les souris sont des modèles animaux qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec les humains, permettant ainsi de comprendre les mécanismes biologiques et les réponses aux traitements dans un système vivant complet. Les DCs sont d'une complexité biologique considérable, et leur fonctionnement et leurs interactions avec d'autres cellules immunitaires sont encore en cours de découverte. Donc l'utilisation de modèles in vivo dans la recherche sur la biologie des cellules dendritiques est indispensable pour obtenir des informations approfondies sur leur fonction, leur rôle dans la réponse immunitaire, leur contribution aux maladies et leur potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de souris dont le nombre a été déterminé mathématiquement afin permettre une évaluation statistique solide des effets analysés ; nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail comme expliqué dans chaque procédure. De plus, toutes les expériences reposant sur la reconstitution de la moelle osseuse seront réalisées avec des moelles osseuses cryoconservées au lieu de les extraire de nouveaux animaux donneurs, ce qui réduit de moitié le nombre d'animaux.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront en environnement enrichi et stimulant pour les animaux en expérimentation, avec suffisamment d'espace, de matériel et d'interactions sociales, pour améliorer leur bien-être (sizzlenests, tunnels, maisons). Les protocoles expérimentaux sont rigoureux, optimisés et validés, et minimisent la souffrance animale et les manipulations inutiles, tout en fournissant des résultats scientifiquement valides. Le personnel de recherche est formé en continu afin de réduire le stress et l'inconfort des animaux. Il assure également une veille scientifique continue, évitant toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature. Un suivi quotidien est mis en place pour s'assurer de la santé des animaux et mettre en place des mesures correctrices quand c'est nécessaire. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les interventions seront réalisées sous anesthésie locale ou générale et raffinées (utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...).

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, et pratiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Au sein de notre laboratoire, les protocoles expérimentaux d’induction tumorale sont bien établis. - Les souris âgées à partir de 6 semaines seront utilisées dans cette étude afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé). Les paramètres étudiés étant le développement de la masse tumorale après injection de cellules cancéreuses ou l’apparition de lésions cancéreuses induites, une souris juvénile ou trop âgée induirait un biais dans l’expérimentation.

1 191 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une irradiation suivie d'une greffe de moelle osseuse, quatre gavages, des prélèvements de sang et l'implantation d'une pompe osmotique sous anesthésie, pour reproduire une myélofibrose que 100 % des animaux développent. Le porteur indique que la maladie provoque une splénomégalie, une perte d'appétit et un amaigrissement. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut réunir ces paramètres et conclut à la nécessité de la souris pour étudier la maladie dans un "organisme dans sa globalité".

Objectifs

Les néoplasmes myéloprolifératifs sont des cancers du sang caractérisés par la prolifération excessive des cellules myéloïdes tels que les globules rouges, les mégacaryocytes (donnant naissance aux plaquettes) et des granulocytes et peuvent aboutir au développement de leucémies, dont la plus grave est caractérisée par les mutations dans des gènes régulant la production de plaquettes. Elle conduit à une amplification anormale de plaquettes dans la moelle osseuse qui vont s’activer et libérer différents cytokines et facteurs de croissance. Ces derniers vont agir sur les cellules stromales de la moelle osseuse ce qui conduira à la production de collagène en excès et à une dégénerescence par fibrose. Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace dans cette maladie, à l'exception de la greffe de moelle osseuse. Chez les patients atteints de cette maladie, les meiilleurs traitements sont inefficaces.

Bénéfices attendus

Aujourd’hui, il n'existe aucun traitement efficace de la myélofibrose. Ici nous proposons un nouveau modèle préclinique au développement de la MF rapide et homogène (100% d'animaux développent la maladie contre 60% avec les modèles précédemment décrits) qui nous permettra non seulement de décrypter les mécanismes physiopathologies de la maladie mais aussi de tester des drogues identifiées pendant une pédiode courte et sur un nombre d'animaux diminué car ce nouveau modèle est très reproductible. Les bénéfices potentiels sont le développement de traitements pour cette pathologie grave.

Procédures

Gavages 4 fois, durée 1 minute. Irradiations: 1 fois (13 minutes) et greffes (durée 5 minutes), sous anesthésie générale. Prélèvements de sang (nombre 3), durée 2 minutes sous anesthésie générale. Injections des médicaments (1 ou 2 injections) durée 1 minute, anesthésie locale. Implantation de pompes osmotiques, durée 8 minutes, une fois, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Le gavage induit une contrainte légère. Les irradiations suivies de greffe induisent une contrainte modérée pour les animaux: fatigue transitoire, possibilité de diarrhée transitoire. Les injections et les prélèvements de sang induisent une contrainte légère et transitoire du fait de la préhension des animaux. L'implantation de pompes osmotiques est une peite chirurgie légère qui est très bien tolérée. Le modèle proposé conduit au développement de la myélofibrose accompagnée de la diminution de cellules hématopoïétiques au niveau de la moelle osseuse et leur augmentation au niveau de la rate (splénomégalie). Les animaux peuvent présenter des signes cliniques du fait de la perturbation de la formule sanguine, avec perte d'appétit et amaigrissement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur les organes hématopïétiques.

Remplacement

Le développement de la myélofibrose survient dans un environnement qui nécessite la présence de différentes cellules, les cellules hématopoïétiques porteuses de la mutation causale de la maladie, différents types de cellules de l'environnement qui seront activées après la libération de cytokines par les cellules hématopoïétiques et le confinement de la moelle osseuse. Il est impossible de réunir ces paramètres in vitro. De plus, la maladie ne touche pas uniquement la moelle osseuse, on observe la splénomégalie et la fibrose au niveau de la rate. Seuls les traitements de souris mimant les symptômes hématologiques des patients atteints de NMP permettront d’analyser leur efficacité dans l’organisme dans sa globalité, incluant la réponse immunitaire contre les cellules mutées.

Réduction

Le nombre d'animaux par lot a été minimisé et s'est basé sur la littérature et l’expérience du laboratoire sur ce modèle de maladie. Le nombre indiqué ne sera atteint que si tous les médicaments présentent un effet sur la myélofibrose. Si un médicament n'a pas d'effet, le test sera arrêté précocément.

Raffinement

Toutes les interventions (greffes, prélèvement de sang) seront faites sous anesthésie générale. Une surveillance clinique quotidienne sera effectuée pour s'assurer de leur santé physique et comportementale. Une alimentation adaptée sera ajoutée dans les cages en cas de diminution de la prise alimentaire et les points limites précoces seront strictement appliqués. Les animaux bénéficieront d'un environnement enrichi en tout temps (abri en carton, papier, coton, ...).

Choix des espèces

L'utilsiation de souris nous permets dans un temps très court l'obtention d'un nombre d'animaux à expérimenter. Nos modèles miment parfaitement les pathologies humaines (Thrombocytémie Essentielle et Polyglobulie De Vaquez) qui mènent à la myélofibrose. Ce sont donc de bons modèles, statistiquement solides et probant pour les études proposées. Ces souris modèlisent au plus près les conditions pathologiques humaines. Le modèle conduit à un développement rapide de la myélofibrose et ceci de façon très homogène ce qui permet de réduire le nombre d'animaux et le temps de traitement.

75 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur sectionne le nerf sciatique droit sous anesthésie, avant de le réparer par colle biologique ou manchonnage veineux, puis ils subissent des tests fonctionnels à 15, 30 et 90 jours et une évaluation électrophysiologique finale sans réveil. Le porteur indique que la section du nerf provoque une perte des fonctions motrices et sensitives du membre, des douleurs postopératoires et un risque d'automutilation. Il affirme que ce mécanisme nerveux intégré ne peut pas être reproduit de façon satisfaisante in vitro ou in silico et écarte les modèles sur invertébrés.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans la thématique de la réparation nerveuse. Actuellement, la technique de suture associée au manchonnage veineux est considérée comme la technique de référence en termes de réparation nerveuse. La technique de suture associée à l’enveloppement par colle biologique se veut plus simple, puisque moins de points de suture sont à réaliser (seulement deux versus quatre pour la technique de référence). De nombreuses colles biologiques sont utilisées neanmoins, meme si cette technique est admise dans les pratiques, les colles biologiques n’ont pas l’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) pour une utilisation en chirurgie nerveuse peripherique. De plus il n’a jamais ete prouve, dans la litterature, que la colle biologique permettait de prévenir l’apparition de nevrome en post-operatoire. Le névrome correspond à une prolifération anarchique des neurones qui interfère avec la récupération fonctionnelle et peut engendrer des douleurs. Cette étude pré-clinique a pour objectif de déterminer si la colle biologique est aussi efficace que le manchonnage veineux pour prévenir l’apparition de névrome, tout en permettant une bonne repousse nerveuse sur le nerf sciatique droit chez le rat. Il s’agira d’évaluer de façon clinique, électrophysiologique, et histologique la repousse axonale selon les deux groupes : suture/manchonnage veineux et suture/enveloppement par colle biologique.

Bénéfices attendus

Les lesions nerveuses representent une part importante de la traumatologie de la main, environ un million de cas par an dans le monde. Il est decrit de nombreuses techniques pour les reparer. Il existe des risques non negligeables de complications malgre la reparation realisee, et plus particulierement de nevrome. Les nevromes correspondent a une proliferation de tissu nerveux avec une repousse axonale desorganisee, engendrant des douleurs pas exces de nociception, pouvant s’associer a des dysesthesies. Ces nevromes, lorsqu’ils sont constitues, necessitent un second geste chirurgical pour en faire l’exerese, avec risque de perte de sensibilite definitive en aval. Il est admis que l’ajout d’un manchon veineux autour de la suture nerveuse permet l’absence de nevrome dans les suites post-operatoire. Une etude pre-clinique sur le manchon veineux sur le nerf sciatique de chien, ainsi qu’une etude clinique sur le manchonnage veineux sur les nerfs collateraux des doigts, etaient toutes deux en faveur de l’absence de nevrome dans les suites operatoires. A ce jour, certains chirurgiens pratiquent la technique : suture + colle biologique. Cette technique se veut plus simple, avec moins de points de suture et d’apprentissage plus rapide. De nombreuses colles biologiques sont utilisees, neanmoins meme si cette technique est admise dans les pratiques, les colles biologiques n’ont pas l’AMM pour une utilisation en chirurgie nerveuse peripherique,. De plus il n’a jamais ete prouve, dans la litterature, que la colle biologique permettait de prevenir l’apparition de nevrome en post-operatoire. Ainsi, nous espérons que notre étude permettra de prouver que la colle biologique est aussi efficace que le manchonnage veineux dans la prévention des névromes. Si l'étude tend vers une preuve d'efficacité, nous souhaiterions réaliser dans les suites une étude clinique chez l'Homme, afin de développer davantage cette technique et obtenir si cela est possible une autorisation de mise sur le marché (AMM) dans cette indication.

Procédures

Il y a 3 interventions : - La première intervention est la chirurgie de lésion du nerf sciatique droit (J0). Chaque chirurgie sera sous anesthésie générale sous ventilation durera 40 minutes. - La deuxième intervention correspond aux tests fonctionnels sensitivomoteurs, ils seront réalisés à trois temps différents (J15, J30 et J90), chaque test durera environ 20 minutes. - La troisième intervention est l’évaluation électrophysiologique du nerf sciatique droit avec abord chirurgical, réalisée sous anesthésie générale sous ventilation et qui ne devra pas excéder 15 minutes ; suivi du prélèvement du nerf sciatique afin de réaliser l’analyse histologique sans réveil de l'animal.

Impact sur les animaux

La section du nerf sciatique droit entraîner une perte des fonctions motrices du membre inférieur ainsi qu’une perte sensitive allant jusqu’à la patte. Il y aura ainsi des difficultés à se mouvoir avec perte de fonction du biceps fémoral et du muscle gastrocnémien, engendrant des difficultés pour se déplacer, un stress, une possible atrophie du membre inférieur, ainsi qu'une douleur post-opératoire. Théoriquement, il est aussi possible que l'animal ressente une gêne locale liée à des paresthésies. Il est également possible que dans les suites post-opératoires, les animaux s'infligent une automutilation, du fait de la douleur mais également par la gêne occasionnée par une membre non fonctionnel. Néanmoins il n'est pas possible de quantifier la durée de ces effets. Les tests comportementaux pouvant également engendrer un stress à l'animal, nous placerons les rongeurs dans la pièce afin de s'y acclimater, et il sera réalisé des tests d'habituation pour chacun des tests comportementaux lorsque les animaux ne seront pas lésés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort sans réveil afin de récupérer leur nerf sciatique droit. Le nombre total de fibres myélinisées par coupe ainsi que la taille moyenne des fibres et de la gaine de myéline sera mesuré et comparé selon les différents groupes afin de voir les différences entre les traitements. On effectuera différents marquages afin de comprendre la modulation de la cicatrisation nerveuse.

Remplacement

mécanisme physiopathologique hautement intégré qui ne peut pas être reproduit de manière satisfaisante par des expériences in vitro ou in silico. La preuve de la qualité de la restitution de la fonction nerveuse ne peut être attestée qu'en analysant un comportement sensori-moteur : le nerf sciatique est un nerf mixte dont la section représente très bien la complexité d'un rebranchement nerveux (problématique de la syncinésie). Une méthode alternative telle que le "nerve-on-chip" permettrait de tester l'activité de transmission du nerf mais pas de la fonction de transmission sensori-motrice. Réaliser ces expériences chez un animal non-mammofères (i.e. invertébrés) ne permettrait pas d'obtenir des données permettant d'envisager une transition clinique directe. Le modèle utilisé ici présente une chirurgie très similaire à la chirurgie clinique de réparation (e.g. chirurgie de la main).

Réduction

Ce projet s’efforce de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante. Le nombre d’animaux a tout d’abord été évalué à partir des études précédemment réalisées au sein du laboratoire et retrouvé dans la littérature, et dont les statistiques avaient été établies pour réduire au minimum le nombre d’animaux opérés. Les tests fonctionnels seront réalisés à différents time point pour un suivi longitudinal de la cicatrisation nerveuse sans mise à mort des animaux. L'opération est très bien tolérée par les animaux et n'occasionne pas de mortalité. Les protocoles ont été déterminés de manière à réaliser une étude longitudinale afin que chaque animal réalise un maximum d’analyses, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire. Les statistiques ont été réalisées via un logiciel. Le calcul du nombre de sujets nécessaires a été réalisé en comparant deux proportions binomiales, selon une proportion théorique de 0,30 (soit 30% de névrome observé chez l’homme), et une proportion observée supposée de 0,50, avec un test unilatéral. On considère un risque de première espèce alpha de 5% et une puissance de 90%. De plus, la technique chirurgicale étant déjà acquise via l’obtention du diplôme de microchirurgie réalisé sur les rats, cela permet de s’affranchir de la procédure d’apprentissage et donc de réduire au maximum le nombre de rats à utiliser dans ce protocole.

Raffinement

L’ensemble des procédures chirurgicales se déroulera sous anesthésie générale accompagnée de dérivés morphiniques. Une analgésie avec application locale de xylocaïne sera réalisée avant toute incision de la peau. Les rats seront hébergés par trois dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE), placés sous un cycle jour/nuit 12/12h avec accès illimité à l'eau et la nourriture, et avec un milieu enrichi. Le suivi du poids des animaux, de la prise alimentaire, de l’aspect physique externe (état de la peau, de la fourrure, ...) ainsi que l’apparition de sécrétions, d’excrétions anormales, seront minutieusement surveillés et permettront de contrôler l’absence de souffrance, en complément de l’examen du comportement de l’animal (agitation, prostration). Tout au long du projet, du personnel qualifié veillera au bien-être des animaux biquotidiennement 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Dans le cas de l'atteinte d'un point limite, une mise à mort anticipée sera réalisée. L’injection d’antalgiques sera effectuée à titre systématique dans les premiers jours suivant la chirurgie considérée comme algogène. Des compléments seront effectués en fonction de l’évaluation de la douleur selon les éléments suscités. Les conditions d'hébergement, de soins, d’antalgie et les méthodes utilisées seront adaptées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse durables que pourraient ressentir les animaux. Avant chaque expérimentation, chirurgicale ou comportementale, les animaux sont placés dans la pièce dédiée afin de s'y acclimater. La nourriture sera placée dans une mangeoire au sein même de la cage. Pour l'aider à s'abreuver, on placera une tétine plus longue, permettant à l'animal de boire correctement sans avoir à lever sa tête ou à s'appuyer sur ses pattes arrières.

Choix des espèces

Le rat appartient au groupe mammifère le plus proche phylogénétiquement des primates : son degré d’homologie avec l’Homme est donc très élevé. Le rat est un animal couramment utilisé pour modéliser les pathologies nerveuses et le niveau de connaissance en physiopathologie est très avancé. L’anatomie du système nerveux est similaire à celle de l’Homme. Le nerf sciatique du rat est un modèle proche des nerfs digitaux chezl'Homme et un animal résistant sur le plan physique (résistance aux infections, survie) permettant un moindre risque de pertes en cours de projet et donc de mise à mort supplémentaire d’animaux versus perte de puissance statistique. Les techniques de lésion de nerf sciatique sont aujourd'hui bien définies pour le rat et les études fonctionnelles sont facilement mises en place. Les études actuelles sur la régénération axonale du nerf sciatique sont essentiellement réalisées sur modèles murins, permettant à notre étude d’être comparable à celles de la littérature. Selon les données de la littérature et les études réalisées précédemment dans le laboratoire sur la régénération nerveuse, les rats utilisés dans cette étude seront âgés de 2 mois, ce qui correspond à un stade adulte ayant déjà atteint une maturité de leur structure nerveuse.

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le parasite de la leishmaniose viscérale par injection intrapéritonéale, puis reçoivent une injection quotidienne pendant dix jours de molécules candidates. Le porteur indique que la voie d'administration peut provoquer des réactions au point d'injection et prévoit de tuer toutes les souris pour prélever leur foie et leur rate. Il affirme qu'aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne reproduit la leishmaniose dans sa complexité, ce qui rend selon lui l'expérimentation animale 'incontournable'.

Objectifs

Leishmania infantum est un de agents majeurs des leishmanioses viscérales (avec L. major). Les leishmanioses viscérales (LV), également appelées kala-azar, sont mortelles dans plus de 95% des cas en absence de traitement. Elles se caractérisent par des poussées irrégulières de fièvre, une perte de poids, une hépatosplénomégalie et une anémie. La plupart des cas sont observés au Brésil, en Afrique de l’Est et en Inde. On estime que 50 000 à 90 000 nouveaux cas de LV surviennent chaque année dans le monde et que seuls 25% à 45% de ces cas sont notifiés à l’OMS. Les LV demeurent l’une des principales maladies parasitaires à haut potentiel d’épidémie et de mortalité. En 2018, plus de 95 % des nouveaux cas signalés à l’OMS provenaient de 10 pays : Brésil, Chine, Éthiopie, Inde, Iraq, Kenya, Népal, Somalie, Soudan et Soudan du Sud. La leishmaniose viscérale est endémique dans la Région Européenne (au sens de l’OMS), en 2018, plus de 200 cas y ont été signalés (pour l’essentiel sur le pourtour méditerranéen). Ce nombre augmente, en parallèle aux pressions migratoires et au réchauffement climatique et par ailleurs une forte prévalence est retrouvée chez les canidés domestiques dans le pourtour méditerranéen. Le traitement de la leishmaniose dépend de plusieurs facteurs, parmi lesquels la forme de la maladie, les affections concomitantes et l’espèce parasitaire. La leishmaniose est une maladie qui peut être traitée et guérie, mais qui requiert un système immunitaire compétent car les médicaments n’éliminent pas entièrement le parasite de l’organisme, ce qui induit un risque de rechute en cas d’immunosuppression. Par ailleurs, les traitements de choix ont une forte toxicité. Des résistances aux traitements courants se développent progressivement dans les zones d’endémie. Les besoins pour de nouvelles molécules actives sont donc pleinement justifiés. Avant toute tentative de maturation de telles molécules vers un nouveau médicament à usage humain ou vétérinaire, il est indispensable, au-delà des essais in vitro, d’avoir des données de bases sur leur activité in vivo.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet envisagés à long terme sont de : - Permettre le développement d’un médicament vétérinaire capable de traiter les animaux de compagnie (leishmaniose canine en particulier), servant de réservoir parasitaire et présentant donc un risque zoonotique de transmission humaine opportuniste, particulièrement dans les départements français de l’arc méditerranéen. - Permettre le développement d’un médicament à usage humain permettant d’améliorer le traitement de maladies parasitaires rares et négligées. - Permettre de mettre à jour une molécule tête de série pour le développement de dérivés d’hémisynthèse (molécules naturelles modifiées par synthèse chimique afin d'améliorer leurs propriétés pharmacodynamiques et/ou pharmacocinétiques) encore plus actifs, à l’instar de la benzyl pénicilline, tête de série de toutes les pénicillines et céphalosporines utilisées comme antibiotiques humains et animaux depuis des décennies.

Procédures

Tous les animaux infestés recevront l'inoculum de parasites par voie intrapéritonéale (100 microL) en 1 seule injection sur environ 1 min d'intervention. Tous les animaux traités le seront par injection intrapéritonéale (100 microL) à raison d'1 injection par jour durant environ 1 min et ce, pendant 10 jours. Les animaux témoins, c'est-à-dire non infestés et non traités, ne subiront aucune intervention.

Impact sur les animaux

La voie d'administration, intrapéritonéale, est susceptible d'engendrer des réactions au niveau du point d'injection (dépôts de fibrine).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever leur foie et leur rate postmortem.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude est envisagé après de nombreuses études réalisées in vitro sur ces 2 molécules (tests sur lignée d'amastigotes axéniques de Leishmania infantum, modèle in vitro de leishmanies intramacrophagiques, tests sur macrophages, et lignées cellulaires cancéreuses (HepG2) et non cancéreuses (cellules VERO). Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peut mimer la leishmaniose dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour l’analyse statistique appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Par ailleurs, uniquement 2 molécules (1 molécule naturelle et 1 molécule de synthèse) actives in vitro, sélectionnées à partir de 2 projets de recherche différents, seront testées afin de mutualiser les groupes de souris contrôle (1 groupe non traité non infesté, 1 groupe infesté non traité et 2 groupes infestés et traités par 2 doses de traitement de réference, soit au total une réduction de 20 souris comparativement à 2 essais in vivo indépendants). De plus, le fait de tester le traitement de référence sur ce modèle lors de la phase préliminaire, permettra, en cas d'inefficacité dudit traitement, d'avorter l'essai in vivo des molécules à tester.

Raffinement

Les méthodes d’analyses choisies permettent l’étude simultanée d’un grand nombre de paramètres (paramètres cliniques (scores de poids, et de comportement) et charge parasitaire mesurée par 2 techniques). Ceci conduit à réduire la variabilité expérimentale et le nombre de techniques à réaliser, donc le nombre d’animaux à utiliser. Le bien-être de l’animal, outre les considérations éthiques, est aussi un facteur de variabilité expérimentale, qui est pris en compte et réduit. Le bien-être animal sera donc une priorité mise en oeuvre par le suivi rapproché quotidien des animaux par le personnel de zootechnie qui évaluera l'état général des animaux (prise de nourriture, toilettage, comportement, prostration, perte de poids, piloérection, présence de blessures). L'enrichissement et le développement de l'aspect social du groupe seront ménagés. L'expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé de l'animal selon les points limites et les critères d'arrêt définis dans les procédures afin de limiter la douleur, la souffrance ou l'angoisse de l'animal. Par ailleurs, le modèle proposé (évaluation de l’activité des molécules 18 jours après l’inoculation), permet de ne pas entrainer l’apparition de symptômes (hépato-splénomégalie, anorexie, asthénie) douloureux pour les animaux. En effet, en l'absence de traitement, les symptômes apparaissent 30 à 45 jours après inoculation, la leishmaniose étant une parasitose chronique. Lors du sacrifice, les organes ou parties d’organes non requis pour l’expérience en cours, ainsi que le matériel traité non consommé, seront conservés pour d’autres utilisations éventuelles, constituant une bio-banque accessible au collectif, prévenant l’utilisation d’autres animaux. Par exemple, les prélèvements sanguins effectués pourront servir à l'évaluation pharmacocinétique des molécules testées.

Choix des espèces

Dans le cadre de la confirmation, in vivo, de l’efficacité de molécules actives sur les leishmanies, l’utilisation de souris, qui ne sont pas l’hôte usuel de ces parasites, est consensuelle dans la collectivité scientifique. Les souris utilisées seront des souris balb/c femelles en raison de leur moindre agressivité, diminuant ainsi le stress des animaux. Les souris sont utilisées entre 6 et 10 semaines d’âge (ou environ 20-25 g pour une souris). C’est le meilleur compromis pour la qualité de l’inoculation et la présence d’un système immunitaire mature.