Procédures modérées

Des brebis de 2 à 3 ans subissent une mastoïdectomie, ouverture chirurgicale de l'os situé derrière l'oreille, et reçoivent du gadolinium dans l'oreille interne, par ultrasons d'un côté et par injection de l'autre, sous une anesthésie de trois heures dont deux d'imagerie. Une seconde anesthésie de 30 minutes permet de prélever du liquide de leur oreille interne. Au total, 14 brebis, dont 2 en réserve en cas de problème, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Comme effets néfastes, le porteur ne cite que le stress de la contention et un possible hématome à la jugulaire, écrit qu'il n'est "pas à prévoir de conséquences particulières" après la première anesthésie, et se fixe pour objectif de vérifier "l'absence de retentissement sur la fonction auditive". Toutes les brebis sont pourtant tuées à l'issue, mise à mort qu'il justifie par une "perte de la fonction auditive irréversible", des "vertiges incoercibles empêchant une mobilité normale" et une "paralysie faciale empêchant une alimentation normale".

Objectifs

L'objetif principal de notre projet vise à étudier la diffusion de momlécules de gadolinium au sein de l'oreille interne en comparant les injections transtympaniques classiques versus l'utilisation d'ultrasons. Les objectifs secondaires sont de vérifier l'absence de retentissement sur la fonction auditive après la réalisation des séances de ces techniques et à distance (J7 de la délivrance), une conservation de l'quilibre et de la symétrie du visage, et l'absence d'altération de la composition des liquides de l'oreille interne suite à ces procédures.

Bénéfices attendus

Si les résultats du projet sont démontrés, c'est-à-dire une amélioration de la diffusion du gadolinium à l'oreille interne par sonoporation (avec ou sans microbulles chargées) avec absence d'effets indésirables à court et long terme, cela permettra de proposer un nouveau mode de diffusion chez l'Homme. Cette méthode permettrait d'obtenir une meilleure diffusion le long de la cochlée et des concentrations plus élevées d'agents thérapeutiques au sein de la cochlée. Par la suite, il sera nécessaire de développer une sonde spécifique pour l'Homme, de réaliser de nouvelles expérimentation avec d'autres molécules. Cependant, cette étape préliminaire reste indispensable à la poursuite du projet. Cette voie de délivrance par sonoporation à l'oreille interne pourrait par la suite avoir un rôle thérapeutique notamment pour traiter certaines atteintes de l'oreille interne comme la surdité brusque, la maladie de Menière où actuellement les injections transtympaniques sont privilégiées. Il pourrait aussi s'agir d'une voie de délivrance dans le cadre de la thérapie génique pour les surdités d'origine génétique.

Procédures

La majorité des actes auront lieu sous anesthésie générale, il s'agit de la mesure des seuils auditifs, de l'abord chirurgical avec la délivrance de molécule, de l'imagerie et du prélèvement de liquide de l'oreille interne. La durée de la première anesthésie générale sera de 3H (1H de chirurgie et 2 H d'imagerie). La seconde anesthésie générale durera 30 minutes, il sera effecué le prélèvement de liquide de l'oreille interne au cours de cette chirurgie.

Impact sur les animaux

Les brebis incluses subiront deux anesthésies générales. Lors de la première, il sera effectué une mastoïdectomie avec délivrance de molécules. Il n'est pas à prévoir de conséquences particulières suite à cette anesthésie. Lors de la seconde, il sera effectué un prélèvement de périlymphe. La contention effectuée pour l'induction des 2 anesthésies peut engendrer du stress pour l’animal, et l'injection de produit anesthésiant par voie intraveineuse à la jugulaire peut provoquer un hématome.

Devenir

L'ensemble des brebis seront euthanasaniées suites aux procédures compte tenu de la perte de la fonction auditive irréversible, de vertiges incoercibles empêchant une mobilité normale et d'une paralysie faciale empêchant une alimentation normale. Ainsi ces pertes de fonctions auront un retentissement majeur dans la vie quotidienne des brebis.

Remplacement

Des études pré-cliniques chez l'animal sont nécessaires afin de s'assurer de la bonne diffusion des molécules utilisées suite à la sonoporation au sein de l'oreille interne. L'utilisation de modèles animaux autorise aussi la vérification de l'absence d'évènements indésirables, et le prélèvement de liquide de l'oreille interne. Cette étude permettra de s'assurer de la supériorité de la sonoporation pour la diffusion du gadolinium au sein de l'oreille interne et de vérifier l'absence de déficit (auditif, vestibulaire ou de la fonction faciale). Le modèle animal ne peut être substitué par un modèle in-vitro ou in silico à ce jour.

Réduction

Sur la base d'une étude statistique et bibliographique, notre étude nécessite l'inclusion de 12 animaux. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, chaque brebis sera son propre témoin avec un côté où il sera effectué une délivrance de gadolinium par sonoporation et un autre une délivrance par injection en regard de la fenêtre ronde pour vérifier l'hypothèse d'une meilleure diffusion par sonoporation. L'hypothèse d'une amélioration de la diffusion de 60% +/- 30 % du gadolinium par la sonoporation sera vérifiée par un test statistique approprié, ainsi que l'absence de baisse des seuils auditifs. Le calcul d'effectif indique qu'un groupe de 6 sera suffisant pour confirmer cette hypothèse. En métabolomique (pour l'analyse de la périlymphe), il n'existe pas de recommandation sur le nombre minimum de sujets. Cependant nos précédentes études sur le sujet ont montré que l'inclusion de 6 sujets avait permis de faire ressortir des groupes statistiquement différents en utilisant des analyses statistiques adaptées. Notre expérience, sur le prélèvement de périlymphe, nous a permis de le réaliser systématiquement sur une oreille normale jamais opérée. La principale contrainte était le faible volume prélevé qui a été résolu par validation de la technique d'analyse. Ainsi, nous estimons que 12 brebis incluses au total serait raisonnnable pour ne pas augmentrer le nombre d'animaux tout en ayant des résultats si nos hypothèses se vérifient. 2 animaux supplémentaires seront prévus en cas de problème.

Raffinement

Anesthésie : les animaux arriveront la veille de la 1ère anesthésie, et seront mis à jeun 15h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène véhiculant l’isoflurane pour obtenir un relachement musculaire suffisant avant intubation. Chirurgie et Per-imagerie - Anesthésie : Les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de la première anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Les animaux sont logés en cases collectives sur paille, et manipulés dans le calme. Le monitoring des constantes sera effectué lors de l'anesthésie générale afin de détecter une douleur peropératoire nécessitant une adaptation de l'analgésie et/ou de la profondeur de l'anesthésie. La réalisation d'une anesthésie locale à base permettra de minimiser la douleur per opératoire. Ces injections seront être renouvelées en cas de douleur de l'animal . Une table chauffante sera utilisée pendant la durée de l'anesthésie générale pour éviter tout épisode d'hypothermie. La douleur post-opératoire sera aussi monitorée avec l'échelle visuelle en pièce jointe et l'analgésie revue en cas de douleur.

Choix des espèces

La brebis est l'animal que nous désirons utiliser pour ces recherches sur l'oreille interne car elle présente un spectre auditif comparable à l'Homme et une anatomie de l'oreille interne semblable à l'Homme en terme d'anatomie et de dimensions. La chirurgie de la brebis est comparable à celle de l'homme pour l'accès à l'oreille interne. Le sexe féminin est à privilégier compte tenu des difficulté d'accès à l'oreille interne chez le bélier. En effet, l'épaisseur de la corticale du bélier rend le fraisage difficile et très long. Enfin, le volume de liquide endocochléaire prélevé chez la brebis est comparable au volume qu'il est possible de prélever chez l'Homme rendant possible les études en métabolomique sur ce liquide. Les animaux utilisés seront âgés de plus d'un an car à cet âge, la maturation du système auditif est atteinte. Afin de constituer un groupe homogène, les brebis seront âgées de 2 à 3 ans.

348 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le jour de leur naissance, elles reçoivent une injection dans le cerveau, puis subissent à 21 jours un traumatisme crânien provoqué par un impact sous anesthésie, suivi de séries de tests comportementaux et d'IRM, avant d'être tuées par perfusion d'un fixateur. Le porteur présente ce modèle comme reproduisant un traumatisme crânien pédiatrique et renvoie les retombées thérapeutiques à un potentiel futur. Il affirme qu'"aucun modèle in vitro ou informatique" ne permet cette étude et que le projet "ne peut pas se passer de l'expérimentation animale".

Objectifs

Le projet que nous avons développé vise à étudier les changements qui se mettent en place au sein du cerveau à la suite d'un traumatisme crânien léger et qui contribuent aux atteintes comportementales à long terme. Ce projet unique va explorer le potentiel thérapeutique d’une protéine d’intérêt, la cavéoline, en étudiant son rôle protecteur dans le cerveau. Notre équipe utilisera un modèle léger de traumatisme crânien chez la souris, nous permettant d'étudier sur le long cours, à l'aide de tests comportementaux et d'outils d'imagerie innovants, les processus induits sur le système nerveux central avec une définition encore inaccessible chez l'homme. Ces processus chroniques seront étudiés par l’utilisation de souris ayant reçu une injection permettant l’augmentation de notre protéine d’intérêt. Suite à l’induction du traumatisme crânien, ces animaux seront soumis à une évaluation comportementale permettant d’évaluer leurs capacités locomotrices, leur niveau d’anxiété et leur mémoire et nous réaliserons également un suivi au cours du développement par imagerie IRM. Notre étude sur le rôle de cette protéine d’intérêt pourrait nous permettre d’établir la pertinence de cette protéine dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques innovantes.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine CAV1 (CAVéoline-1) représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

1. injection unique dans le cerveau le jour de naissance sous anesthésie générale courte (moins de 15 minutes) adaptée à ce stade de développement. Réalisé une seule fois. 2. trauma crânien léger juvénile (TC): 21 jours après leur naissance, les animaux subiront une anesthésie générale courte (5 minutes) pendant laquelle il recevront un impact léger au niveau du crâne. Animaux contrôles soumis uniquement à l’anesthésie générale. Réalisé une seule fois. 3. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes, 2 tests de coordination motrice d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux de 5 minutes et 2 tests d’apprentissage spatial qui nécessitent des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale s’étalera sur 2 semaines, avec 11 jours où l’animal sera testé sur une durée de 5 min par jour. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure. Réalisé une fois pour un tiers des animaux, 2 fois pour un autre tiers, 3 fois pour le dernier tiers, un jour après le dernier test comportemental. 5. Fixation du tissu cérébral. Anesthésie générale profonde et adaptée. Perfusion d’un fixateur pendant 5 minutes jusqu’à l’arrêt du cœur. Prélèvement des tissus.

Impact sur les animaux

Notre modèle repose sur une injection dans le cerveau à la naissance sous anesthésie très courte. Ce geste peut entraîner une réduction de la température du corps ou un retard de croissance. De plus, nous utiliserons un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Les conséquences possibles incluent des altérations d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de mobilité, d’anxiété ou de douleur. Chaque série comportementale peut entraîner du stress et de la fatigue. L’anesthésie réalisée lors de l’imagerie par IRM peut aussi entraîner une dépression respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de la procédure, soit 348 animaux. Ceci est nécessaire pour les analyses en immunohistochimie et par imagerie IRM qui complèteront et seront essentielles à cette étude.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données scientifiques permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 348 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes lors des tests comportementaux / IRM.

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. La procédure chirurgicale d’injection stéréotaxique chez le nouveau-né sera réalisée avec des protocoles d’anesthésie et d'analgésie permettant de supprimer toute douleur durant et après la procédure. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Le bien-être des animaux sera assuré par des protocoles d’anesthésie et d’analgésie adaptés.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. Dans ce projet, les souris seront injectées en intracérébral le jour de la naissance afin de permettre une transfection robuste 3 semaines plus tard. Les traumatismes crâniens seront donc réalisés sur des souris juvéniles à 21 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à moyen terme.

405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de formulation d'ARNm puis des injections d'un substrat luminescent et des séances d'imagerie, avant d'être tuées pour mesurer l'expression de l'ARNm dans leurs organes. Le porteur revendique l'optimisation de vaccins à ARNm et la réduction de leurs coûts, et signale la douleur liée aux piqûres intramusculaires. Il affirme que les modèles cellulaires ne sont "pas prédictifs" et qu'"aucune méthode de remplacement fiable" n'est disponible.

Objectifs

Le projet a pour objectif l'augmentation de l'efficacité de la vaccination anticancer par ARNm. Les ARNm ne rentrent pas seuls dans les cellules et ont besoin d’être vectorisés pour résister aux nucléases extracellulaires. Les nanoparticules lipidiques (LNP) permettent de délivrer l’ARNm dans les cellules dendritiques pour exprimer l’antigène et induire une réponse immune. Dans le cas de la régénération osseuse, ce sont des cellules ostéoprogénitrices qui sont transfectées. Nous voulons comparer différentes formulations et différentes structures d’ARNm. Il n'existe pas de système permettant de modéliser l'interaction croisée des formulations d’ARNm de différentes structures avec l’organisme. Dans ce projet, nous cherchons à optimiser à la fois l'internalisation cellulaire des ARNm en sélectionnant différentes formules de LNP et leur traduction en protéines en sélectionnant différentes structures d'ARNm. Dans les deux cas l'objectif est de maximiser l'expression de l'ARNm thérapeutique, ce qui est quantifié dans cette demande en mesurant l'intensité du signal bioluminescent. Ces optimisations serviront aux deux applications thérapeutiques de l'équipe, la vaccination par ARN et la régénération tissulaire par ARN. Nous avons synthétisé une bibliothèque de lipides permettant de faire des LNP. Les tests sur modèles cellulaires nous ont permis de retenir 8 types de lipides pour évaluation in vivo. Cette évaluation in vivo est nécessaire car les modèles cellulaires ne sont pas prédictifs de l'activité des LNP dans un organisme. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de sélectionner pour chaque formulation la structure d’ARNm entraînant la plus forte expression in vivo après injection intramusculaire ou intraveineuse. L'optimisation des séquences d'ARNm et de leur formulation permettra de diminuer les quantités d'ARNm injectées et de réduire les coûts des vaccins chez l’homme.

Procédures

Les souris vont recevoir 1 seule injection de formulation ARNm soit en intramusculaire dans chacun des muscles des cuisses (1 injection par cuisse), soit en intraveineuse dans la queue (1 injection unique sur souris).L'injection des formulation se fait sous anesthésie gazeuse. Aucune formulation ne sera injectée dans le lot témoin. Au temps 6h, 24h, 48h et 96h au maximum après l’injection de la formulation (LNP-ARNm), les souris recevront par voie intrapéritonéale le substrat de la luciférase (4 fois au maximum durant l'étude), puis elles seront imagées en imagerie de bioluminescence.( 4 séances de 1 minute au maximum). Les souris seront anesthésiées sous isoflurane (2%) durant le rasage ( 1 fois 5 minutes) et les injections des formulations (1 fois 3 minutes maximum) mais seront vigiles durant l'injection intrapéritonéale du substrat de la luciférase.

Impact sur les animaux

Nous ne nous attendons pas à une douleur suite au rasage et à l’injection des formulations mis à part la douleur induite lors de la piqure liée à l'aiguille et à l’injection de la solution en intra musculaire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort puis des prélèvements seront réalisés pour quantifier l'ARNm dans les organes où le signal a été détecté.

Remplacement

L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines structures augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études sur l'animal entier sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. Etant donné la complexité des processus mis en jeu, aucune méthode de remplacement fiable n’est disponible.

Réduction

L’effectif des souris mis en œuvre est limité au strict minimum permettant d’obtenir des résultats exploitables statistiquement. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive, le suivi longitudinal permettra de diminuer le nombre d'animaux. Nous réaliserons des tests statistiques ANOVA.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement dès leur arrivée. Ils seront hébergés dans une animalerie confinée dans des cages de type 2 à cinq souris par cage avec un accès à l’eau et la nourriture ad libitum, un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Les cages contiendront un enrichissement qui sera soit un tube en carton, soit un cylindre opaque soit une petite maison transparente pour souris. Les méthodes utilisées seront mises en œuvre par du personnel formé. Les formulations seront évaluées par imagerie non-invasive (imagerie de bioluminescence) chez la souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris Balb/c car c'est ce modèle qui a été utilisé dans nos expériences précédentes de vaccination ARNm et de régénération tissulaire. Le modèle souris permet d'évaluer les capacités des formulations ARNm dans une espèce à cycle de vie court où les mécanismes immunitaires sont les mêmes que chez l'Homme mais à des échelles de temps compatibles avec un criblage de formulations et de structures ARNm. Des souris adultes (à partir de 8 semaines) ayant un système immunitaire mature seront utilisées.

120 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque brebis subit une chirurgie osseuse sous anesthésie générale, avec création puis comblement d'un défaut osseux, avant d'être tuée pour analyser les échantillons d'os. Le porteur indique que l'intervention peut provoquer une fracture ou une inflammation prolongée avec douleur locale, la fracture déclenchant un point limite. L'objectif déclaré est de tester un biomatériau destiné à la médecine humaine et d'obtenir les autorisations de mise sur le marché, le porteur affirmant qu'il n'existe "pas d'autres méthodes" que l'animal.

Objectifs

Ce projet fait partie d’un ensemble de programme de recherche qui s’intéressent à l’ingénierie tissulaire et le développement des biomatériaux susceptibles de stimuler la formation de tissus osseux, seuls ou en association avec des cellules de moelle osseuse isolées et/ou de molécules actives. L’objectif de ce projet est de confirmer l’apport de ces biomatériaux sur la cicatrisation osseuse par l’utilisation du modèle brebis. Les résultats in vivo permettrait d’obtenir les autorisations nécessaires pour des études cliniques chez l’Homme ainsi que les autorisations de mise sur le marché (marquage CE, FDA).

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de s’assurer de la tolérance et du comportement de ce biomatériau destiné in fine à un usage en médecine humaine.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale. Après un période postopératoire (plus ou moins longue selon les protocoles), les animaux seront euthanasiés afin de prélever et analyser les echantillons osseux.

Impact sur les animaux

En raison de l’objectif de l’étude, les effets indésirables majeurs sont la survenue d’une fracture ou le développement d’une réaction inflammatoire prolongée au niveau des sites d’implantation pouvant générer une douleur locale et une inflammation chronique. La survenue d’une fracture constitue une atteinte immédiate des points limites. Un retentissement systémique de la réaction inflammatoire prolongée avec baisse d'activité et de l'appétit entraînant une perte de poids constitue également un des points limites lorsqu'un échec thérapeutique à l'administration d'antalgiques et de soins locaux est constaté.

Devenir

A la suite de la procédure,les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prelever et analyser les defauts osseux.

Remplacement

A l’heure actuelle, il n’existe pas d’autres méthodes d'étude de la tolérance de l'hôte permettant d’éviter ou de remplacer l’utilisation d’animaux pour l’approche thérapeutique abordée dans ce projet.

Réduction

Compte-tenu d’études comparables déjà publiées et des travaux précédemment réalisés sur la plateforme, le nombre d’animaux par groupe correspond au nombre minimal requis pour atteindre une significativité statistique. L’animal étant son propre témoin, cela nous permet de réduire la variabilité individuelle, d’augmenter la puissante du test statistique et de travailler sur des faibles effectifs (n=6) sans perdre la validité statistique. Réduction du nombre d'animaux par la mise en place de procédures raffinées (anesthésie, suivi et soin des animaux et prise en charge de la douleur, alimentation et enrichissement) limitant les pertes animales et l'atteinte de points critiques en cours de protocole.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement au foin et à l’eau (ad libitum). L’alimentation est complétée par des granulés spécifiques (Terrena, France) et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille présentée en annexe 1 : intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture (debout, couchée), port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres postérieurs, confort global (sur une grille de 1 à 10). De façon générale, la gestion de la douleur per et post-opératoire est assurée par un vétérinaire qualifié qui suit les règles d’analgésie et d’antalgie en vigueur afin d’assurer un confort optimal pour l’animal. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-opératoire.

Choix des espèces

Le choix de la brebis est fondé sur plusieurs critères : - Animaux adultes car maturité squelettique - La taille des animaux permet une gestion aisée de l’anesthésie et de l’analgésie - Animaux faciles à gérer en stabulation - Modèles de reconstruction osseuse chez la brebis largement répandu décrit dans la littérature Animaux adultes : aspect anatomique (modèle validé)

120 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines puis des injections de lymphocytes modifiés, la croissance des tumeurs étant suivie par imagerie jusqu'à leur mise à mort. Le porteur indique que les tumeurs peuvent atteindre une grande taille, provoquer une détresse respiratoire ou une paralysie des membres arrière avant l'application du point limite. Il affirme que les études précliniques sur animaux sont "incontournables" et qu'il est "nécessaire" de vérifier l'efficacité in vivo.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers agressifs. Ces immunothérapies sont basées sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre des antigènes de la tumeur (ou Adoptive Cell Transfer). Malgré son efficacité dans le traitement de cancers hématologiques, le succès de cette thérapie dans le traitement des tumeurs solides reste encore très limité. Nous avons développé des cellules qui présentent une activité anti-tumorale supérieure aux cellules CAR classiques dans nos modèles in vitro. Nous hypothétisons que ces cellules CAR seront plus efficaces dans les tumeurs hématologiques mais aussi contre les tumeurs solides. Ce projet vise donc à étudier : L’efficacité anticancéreuse des nouveaux lymphocytes humains T activés in vitro et exprimant des récepteur CAR (Chimeric Antigen Receptor) dans un modèle de xénogreffe humaine de lymphome et deux modèles de cancer solide du poumon) et du pancréas. Nous étudierons l’effet de l’injection des lymphocytes T humains (issus des donneurs sains) et exprimant un récepteur chimérique (CAR) dans des souris immunodéprimées supportant une xénogreffe des cellules humaines de cancer du pancréas, lymphome ou de cancer du poumon et qui expriment le gène de la luciférase. Nous suivrons la croissance tumorale par imagerie luminescente.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a pour objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant des cancers agressifs. Nos résultats préliminaires in vitro ont d’ores et déjà démontré que les cellules CAR-T diminuent la prolifération de plusieurs cellules cancéreuses (lymphome, cancer du pancréas et cancer du poumon). Les résultats qui découleront de ce projet permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Les souris seront soumises à une anesthésie gazeuse pendant 10 minutes maximum et recevront une injection sous-cutanée (s.c) ou intraveineuse (i.v) de cellules cancéreuses à l’aide d’une seringue. Cette injection se réalise en 10 secondes par souris. A ce moment, chaque souris entre dans une phase d’expérimentation de 5 semaines maximum avant la mise à mort. Un suivi de la croissance tumorale et du poids des animaux seront réalisés tous les 2 jours, des mesures qui se font respectivement en 10 et 5 secondes pour chaque animal. Le traitement par injection i.v de lymphocytes humains sera administré dans les mêmes conditions. Chacune de ces administrations se fera en 15 secondes maximum par animal, prise de l’animal par l’expérimentateur comprise. Lors du suivi de croissance tumorale par imagerie, les souris seront sous anesthésie gazeuse et placées sur un tapis chauffant pour maintenir leur température corporelle et surveillées au réveil.

Impact sur les animaux

L’injection des cellules cancéreuses par voie sous-cutanée et intraveineuse peuvent occasionner des dommages dans la queue si les animaux venaient à bouger avec la conséquente angoisse. Les injections se feront donc sous anesthésie à l’isoflurane. D’autres nuisance pourront apparaitre si la taille de la tumeur est très grande (plus de 300 mm2 pour les tumeurs sous cutanées), il y a apparition de détresse respiratoire (pour les tumeurs pulmonaires) ou une paralysie des membres arrière est observée (pour la tumeur Raji). Si ces signes sont observés souris seront mises à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale à l’isoflurane.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Lorsque l’effet thérapeutique (disparition ou diminution de la tumeur) est observé, ce qui devrait arriver au plus tard à la quatrième semaine, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront aussi mis à mort sous anesthésie préalable. En effet, compte tenu du fait que les animaux sont porteurs de tumeurs, et même si des régressions tumorales pourront être observées, une reprise de la croissance tumorale après la période d’arrêt des traitements est toujours possible et nécessite la mise à mort de l’ensemble des souris pour se prémunir de la souffrance qui peut en résulter.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’efficacité de la thérapie CAR-T dans notre modèle ainsi que son potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats, nous devons utiliser un modèle murin afin d’étudier notre hypothèse dans l’environnement tumoral. En effet, les études précliniques avec des animaux sont incontournables pour la finalité de ce projet puisqu’il est nécessaire d’identifier l’efficacité in vivo mais aussi les effets indésirables potentiels des traitements.

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permet d’avoir une réelle puissance statistique. Nous avons choisi de mesurer les tumeurs par bioluminescence, ce qui contribue à réduire le nombre d’animaux tout en conservant une puissance statistique suffisante. Les expériences ne seront réalisées que deux fois, les rates et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris disposeront d’une phase d’habituation à être manipulées par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les deux jours pour surveiller leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress. Des analgésiques seront utilisés en cas de douleur (ex : analgésiques locaux type Lidocaïne au point d’injection à la queue ; et/ou antalgiques type AINS). De plus, les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également, des points limites spécifiques seront appliqués. Pour le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs (500 mètres environ), nous transporterons à pied les souris dans des cages filtrées et dans l’obscurité pour limiter le stress causé par le transport. A leur arrivée dans l’établissement utilisateur 2/2, les cages des souris seront changées et placées sur portoir ventilé pour protéger les souris immunodéprimées (phénotype dommageable). Les souris ne seront déplacées qu’une seule fois pour limiter le stress du transport. Ces mesures assureront ainsi le raffinement de l’étude.

Choix des espèces

Il est impossible à nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Etant donné que l’objectif à long terme sera d’évaluer l’efficacité des cellules CAR-T en thérapie anticancéreuse, nous devons utiliser une espèce présentant une physiologie proche de l’Homme, telle que la souris, qui est un modèle de référence en cancérologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une à deux neurochirurgies du cerveau, des prélèvements de sang et des tests répétés de motricité, d'anxiété et de motivation pendant plusieurs mois, dans des modèles reproduisant la maladie de Parkinson qui peuvent provoquer des déficits moteurs et une perte de poids. À l'issue, ils sont tués pour prélever leur cerveau. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative et que l'étude des stades précoces de la maladie ne peut pas être menée chez l'humain.

Objectifs

Notre objectif principal est de mieux comprendre les mécanismes qui sont à l’origine de la mort des neurones dans la maladie de Parkinson afin de développer une stratégie de détection précoce de la maladie et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques, en explorant particulièrement le rôle des marqueurs métaboliques.

Bénéfices attendus

Mieux comprendre l'origine de la maladie de Parkinson pour proposer une nouvelle cible thérapeutique plus efficace que celles existantes.

Procédures

Les animaux subissent une à deux neurochirurgies d'une durée maximale de 1h, anesthésie incluse. Ils subissent 2 à 3 prélèvements sanguins, espacés de plus de 5 semaines et n’excédant pas plus de 10 minutes, anesthésie incluse. Ils sont soumis 2 ou 3 fois à 2 tests moteurs complémentaires (durée maximum 1 heure) et un test d’anxiété (durée maximum 5 minutes), chaque session de tests étant séparée de la suivante d’au moins 6 semaines. Ils sont également soumis quotidiennement à un test pour mesurer la motivation (durée maximal 1 heure) pendant 17 semaines maximum.

Impact sur les animaux

Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter uniquement des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude.

Remplacement

Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.

Réduction

Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.

Raffinement

Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ins sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi biquotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.

Choix des espèces

Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des cycles de jeûne de 24 heures alternés avec 24 heures d'alimentation pendant quatre semaines, des piqûres répétées de la queue pour mesurer la glycémie et un prélèvement de sang terminal, avant la mise à mort pour prélever le foie et d'autres organes. Le porteur étudie le rôle d'une protéine du foie chez des souris modifiées pour ne plus la produire, les bénéfices annoncés se limitant à comparer ces effets avec ceux d'un jeûne unique. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire ce processus par des méthodes sans animaux et conclut que le recours à la souris est "approprié".

Objectifs

Chez les animaux, des épisodes de jeûne sont fréquemment observés en cas de blessure ou de manque de nourriture ou encore lors de l'hibernation, dans le but d'économiser l'énergie et de s'adapter aux différents environnements. Les mammifères sont ainsi capables de tolérer de longues périodes de jeûne grâce à une réponse adaptative de l'organisme. Le foie joue un rôle majeur dans cette adaptation aux situations de jeûne car il permet la production de carburants, nécessaires au fonctionnement du cerveau et du coeur notamment. Cette production de carburants par le foie est primordiale et controlée par des protéines spécifiques. Parmi ces protéines importantes lors de périodes de jeûne figure la protéine PPARα. De nombreuses études examinent les effets sur la santé de différentes stratégies nutrtionnelles qui impliquent des périodes de jeûne. Ces stratégies qui alternent des périodes de jeûne et des périodes d'alimentation ont montré des effets bénéfiques sur plusieurs pathologies, notamment chez la souris. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer le rôle de PPARa dans la réponse au jeûne lorsqu'il est alterné avec des périodes d'alimentation à volonté. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles qui n'ont pas la protéine PPARa dans le foie et leur contrôle, que nous soumettrons à des alternances de jeûne de 24h et d'alimentaion à volonté de 24h sur une période de 4 semaines. Les effets seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes dont le foie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir si PPARa spécifiquement dans le foie joue un rôle dans les réponses induites par des jeûnes répétées. Nous pourrons également comparer les effets avec le rôle connu de PPARa lors d'un jeûne unique.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard à volonté ou soumis à des cycles jeûne de 24h/alimentation à volonté pendant 4 semaines. Les animaux seront pesés toutes les semaines. Chaque pesée prend environ 20 secondes par animal. La glycémie sera mesurée chaque semaine par prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Le jeûne unique et le jeûne répété peuvent induire une perte de poids, une baisse de la glycémie et de la température corporelle. La piqûre de la queue pour prélever la goutte de sang peut entraîner une légère douleur. Le prélèvement de sang terminal peut entraîner un stress des animaux lié à la contention et un épanchement au niveau de la joue.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car le jeûne est un processus physiologique qui fait intervenir différents tissus agissant en synergie, notamment le foie et le tissu adipeux, et plusieurs hormones qui agissent à distance. Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris transgéniques de laboratoire est appropriée car elle permet d'étudier le rôle d'une protéine spécifique.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement (hébergement collectif, environnement contrôlé, enrichissements du milieu de vie) Les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres. Si un critère d'arrêt est atteint, l'animal sera retiré de la procédure, renourri et replacé en conditions d’hébergement standard après examination par la vétérinaire référente.

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

30 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie de remplacement de la trachée par une matrice soutenue par une endoprothèse d'environ 150 minutes, une partie subissant en plus une fibroscopie ou une bronchoscopie rigide. Le porteur indique attendre douleur post-opératoire, risque infectieux et stress, pris en charge par morphine et antibiotiques. Il teste deux matrices de substitution à l'allogreffe artérielle et affirme que le remplacement par une méthode sans animaux n'est pas possible pour une greffe des voies aériennes.

Objectifs

Les tumeurs trachéales sont une pathologie rare (2 à 6 nouveaux cas/100000 personnes chaque année). Le traitement qui assure les meilleurs résultats à long terme de la survie globale est la résection chirurgicale. Pour des résections limitées à moins de 5 cm de la trachée il est envisageable de réaliser une résection et anastomoses des extrémités. Le problème se pose quand la tumeur envahie plus de 5cm de trachée. Dans ce cas il nous faut un substitue trachéale ou trachéobronchique en fonction de l’étendue de la pathologie (extension à l’arbre bronchique ou la carène). La greffe trachéo-bronchique est un véritable défi chirurgical et biologique. Des échecs successifs ont été observés avec les prothèses synthétiques, les bioprothèses, les allogreffes trachéales, et les autogreffes d’organes et tissus divers. Notre équipe a proposé le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle cryopréservée soutenue par une endoprothèse. Cette technique est la seule à avoir prouvé son efficacité et durabilité. Ces résultats ont été démontrés chez l’animal (brebis) et ils ont permis des applications cliniques chez l’homme. L’apparition de néo-cartilage semble se développer à partir des cellules souches mésenchymateuses du receveur, le corps humain agissant comme bioréacteur naturel. Cependant il existe une pénurie d’allogreffe artérielle qui, face à la demande accrue grâce à une technique qui a montré son intérêt et qui se répand dans d’autres pays, devient un problème de disponibilité. Une matrice alternative de disponibilité illimitée et sur mesure représenterait l’avenir d’une chirurgie de remplacement des voies aériennes avec des indications plus vastes. L’objectif principal de ce projet est de tester deux matrices alternatives à l’allogreffe artérielle cryopréservée dans le remplacement des voies aériennes in vivo chez la brebis : une matrice en collagène et une matrice biologique (aorte porcine décéllularisée). Les deux matrices ont été étudiées in vitro par rapport la capacité d’être colonisée par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines et d’en favoriser leur pénétration et prolifération. Il est nécessaire maintenant de tester in vivo chez la brebis ces matrices alternatives. Celles-ci seront comparées à l’allogreffe aortique cryopréservée en termes de propriétés mécaniques, biologiques, capacité de colonisation par les cellules de l’hôte et génération de novo de cartilage.

Bénéfices attendus

Ce projet représente la suite des travaux de recherche concernant le remplacement trachéo-bronchique par une allogreffe artérielle, réalisée chez la brebis, permettant l'utilisation de la technique chez l'homme, avec la formation de nouvelles voies respiratoires. Ce nouveau projet représente une étape fondamentale d’un travail de recherche essentiel qui vise à tester l'efficacité de matrices alternatives à l'allogreffe artérielle afin de proposer des solutions thérapeutiques plus facilement accessibles, de disponibilité illimitée et sur mesure. Cela pourrait représenter l’avenir d’une chirurgie de remplacement des voies aériennes avec des indications plus vastes.

Procédures

Les animaux seront soumis à des interventions exclusivement sous anesthésie générale. Trois types de procédures sont prévues : 1)Les 30 animaux subiront tous la procédure chirurgicale de remplacement trachéal par matrice stentée. La procédure aura une durée moyenne de 150 minutes. 2)Une fibroscopie flexible sous anesthésie générale sera réalisée pour 6 animaux. La procédure aura une durée moyenne de 5 minutes. 3)Une bronchoscopie rigide avec ablation de l’endoprothèse trachéale sous anesthésie générale sera réalisée pour 12 animaux. La procédure aura une durée moyenne de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont le risque anesthésique, la douleur post-opératoire, une infection post- opératoire, une perte de poids temporaire au cours de la période post-chirurgicale, le stress. En fonction du moment per/post opératoire, l’analgésie est obtenue : par injection, lors de l’induction, de chlorhydrate de morphine (par voie intra-musculaire ; morphine Lavoisier, France) renouveler toutes les 4 à 6 heures. Ce traitement analgésique pourra être poursuivi, après évaluation de la douleur de l’animal et examen clinique, pendant les 48 à 72 heures post-opératoires. Une injection de Ketofen 10 % (par voie intramusculaire ; Ceva, France) est réalisée sur l’animal extubé. Ce traitement anti-inflammatoire sera poursuivi sur une période de 3 à 5 jours. Afin de prévenir les infections, un traitement antibiotique prophylactique sera réalisé par injection de Vetrimoxin 48 heures (15 mg d'amoxicilline par kg de poids vif deux fois à 48 heures d'intervalle, par voie intramusculaire, Ceva, France). En cas d’infection post-opératoire, qui peut être décelée par une perte de poids ou rougeur et chaleur au niveau de la cicatrice, le traitement par antibiotique sera renouvelé. Afin de réduire le stress associé à la chirurgie, les animaux seront hébergés deux semaines avant la date de l’intervention et ils seront gardé dans des boxes communs sauf en immédiat postopératoire.

Devenir

A la fin de la période expérimentale (de 1 mois à 12 mois après la chirurgie) les animaux seront mis à mort selon le calendrier prévu. Des prélèvements des matrices et des trachées en contiguïté des greffons seront réalisés afin de réaliser les études d’ histologie et d’immunohistochimie prévues.

Remplacement

Avant l’implantation des matrices chez les brebis les matrices ont été testées in vitro afin d’étudier leurs propriétés biologiques et la capacité d’être colonisées par des cellules souches mésenchymateuses (CSM) humaines et d’en favoriser leur pénétration et prolifération. Néanmoins, le remplacement n’est pas possible car l’étude porte sur la greffe des voies aériennes au sein d’un organisme vivant complexe. Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour ce projet avant la réalisation d’essais cliniques chez l’homme, n’existant pas d’autre méthode alternative. Cette affirmation se base sur : des discussions avec des confrères; des conférences en pneumologie et chirurgie thoracique ; une recherche bibliographique approfondie effectuée sur la période 2010-2023 dans les bases de données en utilisant es mots-clés suivants: replacement, trachea, aorta, alternatives.

Réduction

Un modèle ovin de remplacement trachéal a largement été publié par notre équipe avec un taux de survie postopératoire globale de 90% à 12 mois. L’expérience de notre équipe sur ce modèle animal nous permettra de réduire le nombre d’animaux normalement prévus pour une mise au point chirurgicale. Néanmoins il faudra considérer une mise au point par rapport les matrices alternatives qui seront greffées et la nécessité d’avoir un groupe « contrôle » afin de pouvoir comparer les résultats de la même série d’expériences (validité des matrice alternatives par rapport l’allogreffe artérielle cryopréservée). Le nombre d'animaux a donc été déterminé par une approche statistique qui nous permet de n’inclure que 30 animaux, 10 par groupe. Les paramètres étudiés seront : la tolérance clinique de la matrice, l’apparition de complications postopératoires, les résultats histologiques et immunohistochimique sur les matrices après mise à mort des animaux (l’apparition et l’évolution des structures cartilagineuses issues d’un processus de néochondrogénèse et ré-épithélialisation).

Raffinement

La méthodologie utilisée nous permettra d’assurer l’absence de souffrance inutile et le bien-être des animaux. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi). Les animaux seront laissés dans des boxes communs sauf dans les premiers jours postopératoires afin d’éviter des problèmes au niveau des cicatrices. Le vétérinaire réfèrent du Laboratoire passera une fois par semaine voire les animaux ainsi qu’à la demande des zootechniciens si besoin. Durant les périodes post-opératoires immédiates, le suivi des animaux est quotidien à l’aide d’une grille de suivi des points limites définis a priori (alimentation, perte de poids, dyspnée, douleur). Ces périodes ont une durée variable qui va de minimum 2 semaines jusqu’à que l’animal ne nécessite plus d’une surveillance rapprochée au sein de l’animalerie du Laboratoire. Cette durée est déterminée par le vétérinaire responsable qui doit donner son accord afin que l’animal puisse repartir dans son centre d’origine. Les animaux auront un traitement antalgique adapté. En cas de signes externes de souffrance (perte de poids, cachexie, prostration, fièvre) ou de dyspnée persistante pendant plus de 24h, les animaux seront mis à mort. Les animaux sont maintenus à jeun 12 heures avant l’intervention chirurgicale (alimentation solide) l’eau est laissé à disposition. Un examen clinique pré-anesthésique est réalisé : couleur des muqueuses, temps remplissage capillaire, auscultation cardiaque et pulmonaire, fréquences cardiaque et respiratoire, température, tympanisme gastrique. Les paramètres de surveillance anesthésiques seront évalués toutes les cinq minutes : Couleur des muqueuses et temps de recoloration capillaire ; Tonus musculaire mandibulaire ; Positionnement du globe oculaire (Myosis/mydriase, Réflexe palpébral) ; Fréquences cardiaque et respiratoire ; Oxymétrie de pouls ; Température ; Electrocardiogramme ; Pression artérielle invasive. L’expérience de l’équipe chirurgicale dans ce type de procédures représente un gain au raffinement, en termes de temps d’intervention, gestion et maitrise des risques ; en effet l’intervention de remplacement des voies aériennes est une procédure utilisée en soins courants chez l’homme dans notre centre.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ce projet est l’ovin. La pertinence est justifiée par l’expérience de l’équipe sur ce modèle animal. En effet un modèle ovin de remplacement trachéal a largement été publié par notre équipe. Le modèle animal choisi pour cette étude est la brebis d’un âge moyen de trois mois et d’un poids compris entre 20 et 30 kg. Ce choix est justifié par l’importante expérience de notre équipe sur le remplacement trachéal, de la carène et des bronches sur ce modèle animal. Tous les animaux seront issus du même élevage et recevront des soins en accord avec les principes du « Guidelines on the protections of experimental animals » du Conseil de la Communauté Européenne (1986).