Procédures modérées

688 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit la pose chirurgicale d'une chambre implantable et d'un cathéter, une injection sous-cutanée quotidienne jusqu'à vingt jours, une infection bactérienne et jusqu'à quatre prélèvements sanguins, pour évaluer des traitements contre les biofilms qui colonisent les cathéters. Le porteur décrit les nuisances attendues comme la chirurgie et une possible infection avec perte de poids et douleur. Il écarte le remplacement in vitro au motif qu'il ne reproduirait pas la complexité d'un "organisme entier" et sa réponse immunitaire.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le travail de notre laboratoire visant à mieux comprendre la physiologie distincte des bactéries grandissant au sein d’une communauté de biofilm, et ce afin de mettre au point des méthodes efficaces pour contrôler les infections dues aux biofilms. Les communautés bactériennes en biofilms sont particulièrement difficiles à éradiquer car elles sont à la fois protégées de l’action du système immunitaire par la structure physique du biofilm (présence de matrice extracellulaire) ainsi que de l’action des antibiotiques par la présence, au sein du biofilm, de sous-populations de bactéries particulièrement tolérantes aux antibiotiques, les bactéries « persistantes ». Ce projet vise donc à identifier chez certaines bactéries pathogènes les fonctions responsables de la colonisation de cathéters centraux, d’évaluer des traitements de type préventifs ou curatifs pour éviter la formation de biofilms ou éradiquer des biofilms existants, et enfin de déterminer si le traitement de ces biofilms par des antibiotiques peut entraîner la sélection de résistance à ces antibiotiques. Les connaissances qui seront acquises au cours de ce projet permettront de fournir de nouvelles pistes sur les traitements à utiliser pour lutter contre les infections liées aux biofilms tout en prenant en compte le facteur sélection de résistance aux antibiotiques.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont la compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la formation de biofilms sur des cathéters centraux par certaines bactéries pathogènes et de la réaction de ces bactéries à certains traitements. Nous pourrions mieux appréhender si certaines bactéries peuvent développer des mécanismes de résistance, ou bien si les traitements préventifs ou curatifs appliqués sont efficaces pour éviter la formation de biofilms, ou traiter les biofilms dans le cas où ceux-ci sont déjà formés. Grâce à ces études qu’on peut estimer être pré-cliniques, on peut envisager dans le futur d’adapter certains traitements contre ces infections dues à la colonisation de matériel médical et ainsi réduire le taux de morbidité et mortalité des patients malheureusement infectés.

Procédures

Toutes les interventions en dehors de la contention seront faites sur animaux anesthésiés par anesthésie gazeuse. Chaque rat subira une injection sous-cutanée quotidienne rapide (quelques secondes) sur l’ensemble de la durée des procédures employée (au maximum sur 20 jours). Chaque rat subira une pose de chambre implantable dans le dos et une cathéterisation. L’intervention chirurgicale durera 45 min. Chaque animal subira au maximum 4 prélèvements de sang au niveau caudal chacun à plus de deux jours d’intervalle. Ceux-ci dureront moins de 3 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances causées aux animaux seront liées à la chirurgie nécessaire pour la pose du cathéter central et au possible développement d’une infection bactérienne (perte de poids et douleur dans le respect des points limites).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront tous subis une intervention chirurgicale avec pose d’un implant et été infectés par une bactérie pathogène. Cela implique que 1) leur défense immunitaire sera différente d’autres animaux non exposés à ce même pathogène et 2) ils sont potentiellement devenus porteurs asymptomatiques de cette bactérie pathogène et seraient donc susceptible de la transmettre s’ils étaient réutilisés. De plus, tous ces animaux seront sacrifiés pour analyser des organes vitaux.

Remplacement

Ce projet ne peut malheureusement pas s’envisager dans des systèmes in vitro, qui sont inappropriés pour reproduire la complexité d’un organisme entier et sa réponse à l’infection (système immunitaire). La complexité des facteurs de l’hôte qui peuvent influencer le processus de colonisation des matériels médicaux est notamment trop importante pour être reproduite à ce jour in vitro.

Réduction

D’une part, en amont des expériences conduites chez l’animal nous effectuons de nombreuses expériences in vitro afin de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Pour ce qui est des traitements innovateurs qui seront testés, aucun d’entre eux ne sera évalué in vivo si celui-ci n’a pas d’abord démontré son efficacité in vitro. Les protocoles in vivo sont rédigés en amont pour éliminer le risque de réaliser une expérience non indispensable (rejet d’investigations discutables). Un maximum de 4 souris par groupe sera utilisé afin d’assurer une représentativité statistique minimale. Au maximum 2 répétitions seront réalisées de façon indépendante pour valider les résultats expérimentaux et augmenter la puissance des analyses statistiques. L’outil de bioluminescence sera utilisé pour évaluer l’évolution de l’infection in situ au niveau du cathéter central et en dehors de celui-ci, pour suivre le même animal au cours du temps, limiter les variations inter-individuelles et ainsi diminuer le nombre d’animaux requis.

Raffinement

Les Rats hébergés à 4 maximum par cage. Le fait d'avoir un hébergement de 4 animaux par cage au lieu d'un seul conduit à un meilleur confort pour les rats, moins d’anxiété et moins d’agitation lors des manipulations. Cette cohabitation n’est pas associée à un plus grand risque de difficultés de cicatrisation ni d’ablation intempestive des chambres implantables. Nous ferons une visite quotidienne durant la phase d’acclimatation, même en l’absence de manipulation, puis au moins une fois par 24h durant les jours suivant. Une attention particulière sera donnée après la phase de chirurgie et d’inoculation des cathéters par les bactéries.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce s’est naturellement faite par le type de matériel implantable à utiliser dans nos expériences. Le cathéter intraveineux à chambre implantable de type pédiatrique est directement pertinent pour le traitement d’infections chez les patients dû au diamètre interne du cathéter ainsi qu’au type de matériau qui ont un impact majeur sur la formation du biofilm. Les dimensions d’un cathéter de type pédiatrique ne permettent pas une adaptation à des animaux plus petits comme la souris. Tous les animaux fournis seront des rats mâles de 8 semaines et d’environ 275-300 g. À ce stade, les veines ont atteint une taille suffisante pour faciliter la pose du cathéter, et le système immunitaire pleinement développé pour participer au contrôle des contaminations du matériel implanté.

2 432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une souche de Mycobacterium avium leur est instillée dans le nez, puis elles reçoivent des composés par voie orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale jusqu'à deux fois par jour pendant douze semaines, pour tester des candidats antibiotiques. Le porteur décrit les atteintes attendues d'une infection pulmonaire, perte de poids, respiration difficile, écoulements et baisse d'activité, et reconnaît que les traitements peuvent créer inconfort ou toxicité. Il qualifie de nouvelles options thérapeutiques d'"indispensables" et affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit à ce jour la dynamique bactérienne dans un organisme vivant.

Objectifs

Les mycobactéries non tuberculeuses (MNT) ou mycobactéries atypiques sont des bactéries opportunistes dont le réservoir réside dans l’environnement (sol et eaux). Ce sont des bactéries non pathogènes intrinsèquement pour l’homme, elles sont dites opportunistes car elles vont devenir infectieuses sur un terrain affaibli. Elles vont être responsables d’infections pulmonaires chez des sujets fragilisés, atteints de mucoviscidose, de bronchopneumopathie chronique obstructive ou immunodéprimés. Ces sujets vont alors développer une infection pulmonaire progressive entrainant une insuffisance respiratoire sévère voire la mort si elle n'est pas traitée. Ces maladies pulmonaires dues aux MNT sont en augmentation dans le monde et dans plusieurs pays, dont les États-Unis et le Canada, le taux d'incidence de ces maladies est supérieur à celui de la tuberculose. Avec une moindre incidence, ces bactéries peuvent être responsables d’infections cutanées, toujours sur des sujets affaiblis. Parmi les MNT, le groupe Mycobacterium avium complex (MAC) qui regroupe les espèces avium et intracellulare, est le groupe le plus prévalent lors des infections induites par des MNT. Les traitements existants sont sous forme de bi ou tri thérapie, sur de longues durées avec un risque croissant d’émergence de mutant résistant. De nouvelles options thérapeutiques s’avèrent donc indispensables. L’objectif du projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés dans des modèles d’infection pulmonaire chez la souris induite par des bactéries appartenant au groupe Mycobacterium avium complex. Ces composés auront par ailleurs montré leur efficacité in vitro sur ces mêmes bactéries.

Bénéfices attendus

Les maladies pulmonaires dûes à Mycobacterium avium complex sont en nette progression, les traitements sont majoritairement des cocktails d’antibiotiques sur de longues durées avec un risque certains d’émergence de mutants résistants. Le bénéfice de ce projet est donc de répondre à un besoin thérapeutique non comblé par l’identification d’une ou plusieurs molécules capables de diminuer significativement, voire d’éradiquer la charge de Mycobacterium avium complex lors d’une infection pulmonaire chez la souris et permettant la progression de (s) molécules aux stades ultérieurs de recherche pré-clinique et clinique.

Procédures

1/ Administration des composés à tester ou de leur solvant, par voie orale ou sous-cutanée ou intra-péritonéale, une à deux fois par jour pendant un maximum de 12 semaines, durée quelques secondes à chaque administration. 2/ Instillation en intranasale d’une souche infectieuse, une fois pendant l’étude, durée environ 15 à 30 secondes 3/ Prélèvement sanguin après anesthésie gazeuse, une fois pendant l’étude, durée quelques secondes

Impact sur les animaux

Les nuisances principales et effets indésirables sont ceux d’une infection pulmonaire : Une perte de poids, une respiration difficile et/ou bruyante, des yeux et museau qui coulent, une diminution de l’activité. Les animaux recevront également les différents traitements par gavage oral ou par injection en sous cutané ou en intrapéritonéal, traitements susceptibles de créer de l’inconfort voir de la toxicité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.

Remplacement

A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement, la dynamique bactérienne dans un organisme, la complexité cellulaire impliquée et la cinétique d’absorption et d’élimination d’une molécule. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour évaluer l’efficacité de potentiels candidats médicaments.

Réduction

Nous utiliserons des modèles bien établis dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Dans la littérature, le nombre d’animaux par groupe est compris entre 6 à 10. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Tous les composés qui seront testés dans ce modèle seront sélectionnés sur la base de leurs efficacité in vitro et leur bonne distribution pharmacocinétique. Un grand nombre de composés synthétisés par notre recherche sont éliminés sur la base de ces résultats et ne sont pas évalués in vivo.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière avec administration d’analgésique en cas de besoin. Si les points-limites préalablement établis sont atteints, l’animal sera mis à mort de façon anticipée afin d’éviter toute souffrance. Lors de la mise à mort, les animaux seront placés sous anesthésie profonde. Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu (température, pression, hygrométrie, renouvellement d’air, alternance jour/nuit) relié à un système d’alarme. Pour éviter tout risque de surinfection, les animaux seront hébergés en portoir ventilé. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations et autant que possible, les groupes d’animaux dans les études resteront ceux formés pendant l’acclimatation. L’environnement des animaux sera adapté et enrichi à leur arrivée et pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

L’espèce choisie sera la souris, espèce majoritairement utilisée dans la littérature dans les modèles d’infection pulmonaire. Les animaux seront utilisés à un stade adulte afin d’avoir une maturité pulmonaire

114 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la mycobactérie M. avium au moyen d'un aérosol, puis une partie reçoit des antibiotiques par gavage cinq jours sur sept pendant un à trois mois, pour mettre au point un modèle d'infection pulmonaire proche de celui de l'humain. Le porteur indique n'attendre ni perte de poids ni douleur d'après les données disponibles, et décrit le gavage comme "inconfortable" surtout les premiers jours. Il écarte le remplacement au motif que l'infection touche plusieurs organes et types de cellules, et conclut à la nécessité de l'in vivo.

Objectifs

Les infections à M. avium (MAC) ont une prise en charge complexe, basée actuellement sur une association d’au moins trois antibiotiques pour une durée de 12 mois à 24 mois, avec un taux de succès limité (52 à 70% selon les séries). Ces infections surviennent chez des patients ayant des comorbidités respiratoires :mucoviscidose, bronchectasies… Pour améliorer la prise en charge de ces patients, il faut pouvoir tester, sur un modèle adapté, de nouvelles molécules, mais aussi mieux comprendre la mauvaise réponse au traitement antibiotique, alors que les souches sont sensibles. L’objectif de cette étude est d’évaluer le meilleur modèle d’infection à M. avium en vue d’évaluer de nouvelles associations de traitement antibiotiques ou de nouvelles molécules mais aussi de mieux comprendre les échecs de traitement chez l'homme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont d’obtenir un modèle d’infection à mycobactérie proche de ce qui se passe sur l’homme afin de pouvoir l’utiliser pour tester de nouveaux antibiotiques (qui pourraient être plus efficace et/ou avec moins d’effets indésirables que les traitements actuellement utilisés). L'amélioration du modèle permettra aussi de réduire l'utilisation des animaux dans le cadre de ces études.

Procédures

Six souris de chaque espèce n'auront aucune procédure spécifique. Chacune des 102 autres souris subira une infection unique par voie aérienne (geste non invasif, durée 30 minutes de l'aérosol, avec une durée totale dans le nébuliseur de 1h30) de mycobactéries. 36 souris (18 souris de chaque espèce) sur les 102 infectées auront une administration par voie orale d'antibiotiques de 5 à 10 secondes par jour (5 jours sur 7) pendant 1 mois pour 12 d’entre elles (6 de chaque groupe), pendant 2 mois pour 12 d'entre elles (6 de chaque groupe), et pendant 3 mois pour les 12 dernières (6 de chaque groupe). Les animaux seront hébergés jusque 4 mois après l'infection.

Impact sur les animaux

La nébulisation de mycobactérie pourra induire un stress le temps de l’aérosol (durée totale de 1h30 de cette partie de la procédure). Aucune douleur n’est attendue. Sur l’ensemble des données disponibles sur le modèle murin d’infection à mycobactéries non tuberculeuses, il n’y a pas de perte de poids ou de mobilité après infection. Par précaution, les souris seront pesées de manière bi-hebdomadaire au minimum. Le gavage peut être inconfortable, surtout les premiers jours. Le nombre d'expérimentateur sera limité pour habituer les souris. Les souris seront surveillées de manière systématique après chaque gavage. A la fin de l’étude les animaux seront mis à mort sans sédation préalable (souris donc moins de 150g, et pour éviter de fausser les résultats. Le geste est réalisé par du personnel formé et sera immédiat et sans douleur pour l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements et analyses

Remplacement

Le remplacement du modèle animal par un autre modèle n'est pas possible du fait que l'infection à myobactérie touche différents organes et différents types de cellules. Des premiers travaux peuvent être faits sur cellule, mais néanmoins pour évaluer complètement un nouvel antibiotique il faut ensuite vérifier son efficacité sur les différents organes, ce qui ne peut être reproduit in vitro.

Réduction

Ce modèle permet de mimer mieux l’infection telle qu’elle est chez l’homme et elle a l’avantage de produire une infection homogène au sein des souris, permettant ainsi de limiter le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats scientifiquement solides. Le nombre de souris a donc été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l'analyse statistique

Raffinement

Les souris seront dans des hébergements en groupe. Il sera utilisé un enrichissement dans les cages pour permettre le jeu des souris. Le projet commencera au minimum 15 jours après leur arrivée dans l’animalerie pour permettre aux souris de s’habituer aux nouveaux locaux. Deux personnes seulement pratiqueront l'apport des antibiotiques par voie orale afin de permettre l’habituation des souris. Les souris seront surveillées tous les jours sur différents aspect (poids, comportement, allure) pour vérifier leur bien être

Choix des espèces

Les souris possédent un système respiratoire proche de l'homme. Elles entreront dans l'étude au stade de jeunes adultes, soit 6 semaines (infection à mycobactéries principalement chez les adultes chez l'homme)

5 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une instillation de bléomycine dans la trachée déclenche une fibrose pulmonaire, puis les animaux reçoivent des traitements chroniques, pour tester les molécules de clients contre cette maladie respiratoire. Le porteur indique que le modèle provoque des difficultés respiratoires et une perte de poids massive qui mène généralement à la mort, une perte allant jusqu'à 30 % étant tolérée avant l'exclusion. Sur le remplacement, il reconnaît l'existence de cultures et de coupes de poumon in vitro en cours de mise en place, mais les juge insuffisantes et conclut au recours à l'animal "entier".

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique est une cicatrisation anormale du tissu pulmonaire (bronchioles, alvéoles et vaisseaux sanguins pulmonaires) à la suite à une agression violente (par exemple une infection virale ou bactérienne) et/ou chronique. Le tissu pulmonaire s’épaissit et se rigidifie et des cicatrices non fonctionnelles apparaissent que l’on appelle fibrose. La conséquence est principalement l’insuffisance respiratoire puis dans des stades plus avancés une insuffisance cardiaque droite. Elle peut nécessiter à terme la transplantation pulmonaire et/ou cardiaque. Aujourd’hui les causes de la maladie ne sont pas connues, d’où le terme idiopathique, mais la pollution semble être un facteur privilégié. Elle concerne aujourd’hui 5500 patients et 1800 nouveaux patients sont concernés par an en France. La maladie touche davantage les hommes et le risque augmente avec l’âge et les maladies métaboliques. Les deux traitements actuellement sur le marché, la pirfénidone et le nintedanib, ont pour but de ralentir la progression de la fibrose et donc de la maladie mais n’atténue pas les symptômes. Il est donc nécessaire de mettre en place des modèles animaux d’études précliniques dans le but de développer de nouvelles thérapies mais également comprendre les mécanismes moléculaires mis en place.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes mis en place dans le développement de la maladie, tout comme le développement de nouvelles thérapies

Procédures

Afin d’induire le développement de fibrose pulmonaire, nous devons instiller dans la trachée des souris, sous anesthésie gazeuse, la bléomycine, un anti-cancéreux utilisé en clinique actuellement et qui induit de la fibrose pulmonaire chez l’homme. Les animaux contrôles seront instillés avec de la solution saline. Les animaux sont ensuite replacés au milieu de leurs congénères dans leur cage d’origine placée sur un tapis chauffant. Une surveillance particulière est réalisée jusqu’au réveil de l’animal afin de déceler au plus tôt tout signe de souffrance ou de douleur (étouffement, détresse respiratoire, etc.). Tous les animaux du projet seront soumis à ce geste. Afin de tester les molécules de nos clients, les souris seront traités de façon chronique afin de montrer l'efficacité des dits traitements. Tous les animaux du projet seront soumis à cette phase de traitement.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont des difficultés respiratoires des animaux et la perte de poids massive qui est telle qu’elle mène généralement à la mort et le stress chronique liée à l'administration chronique des traitements. La perte de poids observée dans ce modèle est corrélée significativement au niveau d’atteinte pulmonaire et reste un criète à la fois d'acceptation de la pathologie et un critère d'exclusion si celle ci devenait trop importante.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure.

Remplacement

Des alternatives non animale sont envisageable aujourd'hui comme la mise en place de culture de cellules pulmonaires in vitro mais ce modèle reste limitée car ne mime par l'organisation structurelle et cellulaire du poumons comme décrit dans un organisme. Cette dernière technique va être testée puis mise en place au sein de l'entreprise dans les prochains mois. Les tests de molécules peuvent être réalisé sur des coupes de poumons issue de l'animal évitant ainisi de traiter chroniquement ces derniers. Cependant, avec cette technique, la pathologie doit être induite chez l'animal vivant avant de réaliser les coupes de poumons. Bien que ces alternatives existent, elles ne sont pas suffisantes pour démontrer l'efficacité des traitements de façon complète. Comme la plupart des maladies et la validation des nouveaux traitements il est nécessaire d’utiliser des animaux à des fins expérimentales. En effet, les maladies qui se développent sont souvent la conséquence d’altérations multi-organes qui nécessitent l’utilisation d’un organisme dans son entier. De plus, ceci permet d’évaluer les conséquences des nouveaux traitements sur l’état général d’un individu et les possibles atteintes de certains organes.

Réduction

Afin d'obtenir des résultats interprétables et de montrer l'efficacité d'un traitement, il est nécessaire d'avoir un nombre d'animaux par groupe égale à 10 minimum.

Raffinement

La perte de poids tolérée pour ce modèle est de 30%. En effet, comme mentionné ci-dessous il s’agit d’un critère important pour évaluer l’atteinte pulmonaire. La mesure du poids étant faite 3 fois par semaine, le suivi est rapproché.Pour limiter la souffrance liée à la perte de poids, afin de faciliter la prise alimentaire, des croquettes humidifiées seront positionnées en fond de cages. Pour les souris âgées et obèses, des mangeoires suspensdus seront utilisés pour favoriser la prise alimentaire. Un ajout d'aspen brik permettra au souris âgées et obèses d'user leur dent et de favoriser la prise alimentaire. Pour favoriser la nidification et permettre une bonne régulation de la température corporelle souvant dérégulée en cas de perte de poids, de l'enirchissement supplémentaire sera apporté (sizzlenest, coton). Après l’instillation et pendant la phase de réveil, les animaux sont placés sur tapis chauffant. Enfin, lors de l'euthanasie, pour limiter la souffrance lors du prélèvement terminal du sang effectué par ponction intracardiaque ou en veine cave sera réalisé de deux possibles façon: en option 1, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane, une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision et une injection de buprénorphine en sous cutanée 60 minutes avant; en option 2, les animaux seront anesthésiés avec un mélange kétamine/xylasine en i.p. et une injection de lidocaine sera effectué en sous cutané à plusieurs endroits le long de la zone d'incision.

Choix des espèces

Trois types de souris seront utilisées : Des souris C57Bl6 mâles âgées de 8 semaines. Des souris mâles sont utilisées car la fibrose pulmonaire touche plus les hommes que les femmes. L’utilisation de souris jeunes permet d’avoir un modèle de souris moins fragiles pour subir l’instillation. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 semaines et rendues obèses par ingestion d’un régime gras pendant 16 semaines. En effet, les maladies métaboliques comme l’obésité sont des facteurs de risques du développement de la maladie. Des souris C57Bl6 mâles âgées de 22 mois. Afin de limiter le transport de souris trop âgées, elles seront livrées à 18 mois puis hébergées jusqu’à 22 mois dans nos locaux. L’utilisation de souris âgées est totalement adaptée car le risque de fibrose pulmonaire est accru lorsque l’on vieillit. Tous les animaux seront utilisés à l’âge adulte afin de se rapprocher de ce qui est observé chez l'homme à l'âge adulte.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une chirurgie d'environ une heure et demie, elles subissent des tests d'aversion et des tests comportementaux répétés avec application de composés, pendant lesquels une voie nerveuse est stimulée, parfois sans soulagement de la douleur, pour déterminer si cette stimulation déclenche un mouvement moteur ou une douleur. Le porteur indique que la chirurgie provoque stress, douleur et perte de poids passagère, et cherche justement à savoir si l'activation de cette voie est aversive et douloureuse. Sur le remplacement, il affirme que ces neurones parmi les plus longs de l'organisme ne peuvent être ni cultivés ni modélisés et doivent être étudiés intacts chez l'animal.

Objectifs

La stimulation, chez la souris, des neurones qui relient le cortex à la moelle épinière (neurones corticospinaux) entraîne un mouvement de la patte arrière. Nous cherchons à identifier si ce movement correspond à une commande motrice portée par ces neurones, ou est une conséquence d’une perturbation des informations sensorielles reçues par l’organisme, qui entraînerait une « gêne », voire une douleur. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle des neurones corticospinaux dans la motricité.

Bénéfices attendus

La voie corticospinale est atteinte dans plusieurs pathologies (sclérose latérale amyotrohique, lésion traumatique de la moelle épinière, etc.) sans que l’on sache précisément son rôle en situation physiologique. Notre projet permettra de caractériser les conséquences de l’activité de ces neurones, et ainsi de poser des hypothèse sur les conséquences de leur dysfonctionnement.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie durant environ 1,5 heure, puis deux semaine après un ou des tests expérimentaux comme suit : Un groupe subira l’expérience d’aversion sur 5 jours d’affilés (chaque session quotidienne au maximum de 30min). Le 4ème jour, ils recevront une application (crème ou injection) de composé pharmacologique à tester. Les autres animaux effectueront un test comportemental d’une durée max de 30 min, une fois par jour pendant 2 jours, puis après 24h de repos, à nouveau 1 test/j pendant 2 jours en présence d’un composé pharmacologique appliqué juste avant le test ; enfin, après 48h de repos, à nouveau 1 test/j pendant 2 jours en présence d’un autre composé pharmacologique appliqué juste avant le test.

Impact sur les animaux

Les chirurgies entrainent inévitablement un stress et des douleurs chez la souris. Une perte de poids est souvent constatée les jours suivant la chirurgie mais l’animal récupère son poids initial en 3-4 jours. Les sutures peuvent aussi entrainer une gêne ou des démangeaisons qui poussent l’animal à se gratter et, très rarement, à endommager sa cicatrice. Cette gêne disparait également en quelques jours. L’activation de la voie corticale entraîne un mouvement dont nous ne savons pas encore s’il est le signe d’une commande motrice ou d’une perturbation sensorielle voire d’une douleur. Ce projet a pour objectif de répondre à cette question, et il y aura donc des expériences consistant en une stimulation de cette voie, en présence, mais aussi en absence de soulagement de l’éventuelle douleur, car nous chercherons justement à identifier si cette activation est aversive et douloureuse (soulagée par des analgésiques).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement.

Remplacement

Le projet porte sur les neurones corticospinaux, qui sont parmi les plus longs de l’organisme, allant du cortex à la partie lombaire de la moelle épinière. Ils sont impossibles à reconstituer avec des techniques de remplacement de type culture cellulaire et doivent être intacts pour pouvoir être étudiés. Ils sont impossibles à modéliser numériquement car leurs cibles sont encore méconnues. Nous devons donc recourir à l’animal pour atteindre les objectifs du projet.

Réduction

Les mesures pour réduire le nombre d’animaux ont été étudiées en adéquation avec le projet. Le nombre d’animaux utilisé a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement valides. Nous utiliserons des individus des 2 sexes afin de réduire le nombre d’individus à produire et produire des résultats spécifiques de genre.

Raffinement

Les souris sont hébergées en cohorte, elles font l’objet d’observations quotidiennes et l'enrichissement des cages est systématique (bâton à ronger, matériaux de nidification). Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire et la température de l’animal est maintenue grâce çà un tapis chauffant thermostaté relié à une sonde rectale. Les yeux sont hydratés avec un gel oculaire. L’état de santé des animaux est surveillé quotidiennement après la procédure chirurgicale et estimé selon une grille de score pondérée qui évalue l'apparence générale de l'animal, l'apparence de la plaie, le comportement spontané, le comportement provoqué et le poids. Des points limites ont été établis pour chaque item permettant de soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

L’étude de la communication entre le cortex et les circuits locomoteurs spinaux requiert l’utilisation de mammifère. La souris est un modèle largement utilisé dans l’étude du cortex moteur, et des comportements locomoteurs. De plus, de nombreuses connaissances sont établies sur l’organisation des projections corticospinales chez la souris. Animaux utilisés à partir de 30 jours après la naissance, car c’est l’âge où la voie corticospinale a fini son développement.

150 poules vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intramusculaires d'un antigène couplé à un adjuvant sur soixante-trois jours, puis sont tuées, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur indique que les injections avec adjuvant complet de Freund peuvent provoquer ulcérations, fièvre et baisse de mobilité, et présente le prélèvement des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace et que l'immunité de l'animal vivant est "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (perchoir, miroir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...).

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

108 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur mâchoire inférieure est opérée pour y créer un défaut osseux, puis la régénération est suivie au microscanner cinq fois sur deux mois avant la mise à mort pour analyses histologiques, afin de tester des biomatériaux de comblement destinés à la chirurgie dentaire. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur et une difficulté à mastiquer les premiers jours, compensées par une nourriture ramollie et des analgésiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro n'évalue ces matériaux et que le test sur petit animal est un préalable obligé avant l'humain.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses en chirurgie orale représentent un réel défi. Les moyens de reconstruction actuels font souvent appel à des greffes autologues qui sont disponibles en quantité limitée et peuvent être source de complications post-opératoires pour les patients. L’ingénierie tissulaire osseuse cherche à développer de nouveaux substituts osseux d'origine naturel pour pallier aux inconvénients de l'autogreffe. A titre d'exemple, dans le cadre de la pose d’un implant dentaire, il est souvent nécessaire de régénérer l’os manquant pour stabiliser l'implant. Cette régénérations peut employer différents dispositifs médicaux tels que : (i) des matériaux de comblement qui remplacent l'os ou favorisent la régénération osseuse et/ou (ii) des membranes qui jouent un rôle barrière pour prévenir l’infiltration cellulaire des tissus mous et préserver les cellules osseuses pour régénérer l’os.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux implantables (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vue d'être utilisé en clinique.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie au niveau de la mâchoire inférieure (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés de 2 semaines. L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale maxillo-faciale. Cette chirurgie engendra une douleur pour les animaux et une éventuelle difficulté lors de la mastication pour s'alimenter lors des premiers jours post-opératoires. Une surveillance sera établie afin de pallier à ces inconvénients (administration dans les premiers temps de nourriture ramollie pour faciliter la mastication). Les animaux seront aussi imagés à intervalle de temps régulier. L'évolution du défaut ossuex pourra ainsi être suivi et si des complications venaient à être observées, des mesures seront prises pour éviter toute souffrance.

Devenir

Suite à la chirurgie, les animaux seront suivis par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après les temps pré-définis (2, 4 et 8 semaines après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique et angiogénique du biomatériau étudié.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux. Les matériaux doivent au préalable être testés dans un modèle de petit animal (ici le rat). Si les résultats obtenus sont satisfaisants d'autres essais seront envisagés permettant de valider tous les aspects nécessaires à une future application chez l'Homme. Ces différentes phases ne peuvent être remplacées actuellement dans le processus de validation d'un nouveau dispositif médical.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur l'aspect cinétique du processus, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations. Ce nombre a également été choisi pour s'affranchir des variabilités inter- et intra-individu concernant la régénération de l'os.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine sera respectée avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par groupe. Une cage après l’autre sera amenée à la salle de chirurgie, séparée de la zone d’hébergement pour éviter toute source de stress des animaux opérés et des animaux à opérer. Avant la chirurgie, les animaux recevront une dose d'analgésique pour prévenir toute douleur liée à l'opération. Ils seront ensuite anesthésiés lors de la chirurgie. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage individuelle chauffée à l'aide d'un tapis chauffant afin d'éviter tout contact avec des congénères non anesthésiés. Les animaux seront surveillés par l'expérimentateur le temps de leur réveil. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage d’origine. De la nourriture préalablement humidifiée sera mise à sa disposition directement dans la cage afin de faciliter sa mastication après la chirurgie. Pour pallier à la douleur de l'intervention, un traitement quotidien pendant 3 jours sera administré à l'animal. Son bon rétablissement sera observé sur une période de 5 jours. Concernant les compétences des expérimentateurs, ceux-ci possèdent les qualifications nécessaires, la formation réglementaire et des formations continues (formation à l'expérimentation animale de niveau expérimentateur et/ou concepteur). La maîtrise de la contention et des différents types d'injections à appliquer sont également maîtrisés par les expérimentateurs. Le personnel de l'animalerie possède toutes les compètences pour s'assurer du bien être et du suivi des animaux au quotidien. Un raffinement est également mis en place lors de l'hébergement : les animaux sont avec leurs congénères, présence de litière en copeaux de peupliers et de jouets, ainsi que des bâtons à ronger sont mis régulièrement dans les cages.

Choix des espèces

Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses alvéolaires. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l'os alvéolaire de la mandibule. L'utilisation du modèle Rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. En cas de résultats satisfaisant et supérieur à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, le processus de validation pourra se poursuivre. Des rats Sprague Dawley adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 300-350 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance.

130 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, ils subissent une cœlioscopie de deux heures pour vaporiser une chimiothérapie dans l'abdomen puis la pose d'une sonde de dialyse péritonéale, avec prélèvements répétés de sang et de liquide péritonéal sur vingt-deux jours avant la mise à mort, pour tester la méthode PIPAC contre les métastases du cancer de l'estomac. Le porteur détaille les nuisances postopératoires et l'isolement en cage lié aux cathéters, et précise que cette étude est exigée par la réglementation avant un essai de phase 1 chez l'humain. Il justifie le recours au porc par une anatomie et un système immunitaire proches de l'humain, qu'aucun petit animal ni modèle in vitro ne remplacerait pour cette technique.

Objectifs

En 2018, plus d’un million de patients dans le monde ont développé un cancer de l’estomac. La même année, il a été estimé que les décès suite à un cancer de l’estomac représentent 8,2% de tous les décès par cancer. Parmi ces décès, 40-50% des patients ont développé des métastases péritonéales. Pour ces patients-là, en l’absence de thérapie, l’estimation moyenne de survie est de 3 mois. Même si la chimiothérapie palliative en intraveineux est un traitement standard pour les formes de cancer non résécables dans le monde entier, ce traitement n’améliore la survie médiane en cas de cancer de l’estomac qu’à 7 mois pour les patients atteints de métastases péritonéales. Les survivants à long terme sont exceptionnels. D’un point de vue médical, il est donc important d’améliorer les traitements des métastases péritonéales du cancer de l’estomac et de dévelloper des traitements qui améliorent la durée de la survie et la qualité de vie des patients. Une avancée récente dans le traitement du cancer de l’estomac non résécable a été l’approbation des Inhibiteurs de points de Contrôle Immunitaire (ICI) qui représente une voie attrayante comme thérapie. En effet, une tumeur peut utiliser des points de contrôle pour se protéger contre les attaques du système immunitaire. Inhiber ces points de contrôle permettrait donc de rétablir la fonction du système immunitaire. Toutefois, l’effet de l’immunothérapie intraveineuse est resté faible chez la majorité des patients avec un taux de réponse très limité (12% maximum). Ainsi, à ce jour, le traitement avec les seuls ICI est insuffisant. En 2021, des modèles murins ont démontrés que combiner un traitement avec un ICI et une molécule immunostimulation intrapéritonéale efficace permet de surmonter ces limitations. Mais aucune donnée n’est disponible sur un modèle de gros animal. Le but de ce travail est de se mettre dans les mêmes conditions que les patients humains sur un modèle animal porcin afin d’avaluer dans un permier temps la distribution intrapéritonéale des molécules anticancéreuses cibles, notamment immunologiques, suite à la réalisation de la méthode PIPAC. Cette méthode consiste à vaporiser de la chimiothérapie et permettra d’améliorer l’efficacité des molécules anti cancéreuses administrées directement au niveau des métastases et pas dans la circulation générale sans détériorer la qualité de vie des patients. Cette étude est nécessaire règlemenairement pour déposer une demande d'étude de phase 1 chez les êtres humains.

Bénéfices attendus

L’utilisation de la PIPAC présente des avantages pharmacologiques par rapport à d’autres méthodes de traitement des métastases péritonéales (MP) associés à certains cancer comme les cancers digestifs ou gynécologiques comme la chimiothérapie intrapéritonéale hyperthermique (HIPEC) et à la chimiothérapie IP conventionnelle basée sur un cathéter. Ces avantages sont: une meilleure homogénéité de la distribution du principe actif, une pénétration plus profonde et une concentration plus élevée du principe actif dans le tissu cible. L'indication actuelle de la PIPAC est le traitement palliatif des MP dans les tumeurs gastro-intestinales et gynécologiques. La PIPAC est réalisable chez la grande majorité des patients, est sûre, ne provoque pas de toxicité significative pour les organes et est bien tolérée. La PIPAC peut être une intervention ambulatoire. La PIPAC n'entraîne pas de détérioration de la qualité de vie. Les autres avantages de la PIPAC sont les longs intervalles sans traitement, la possibilité de répéter l'intervention, le potentiel de combinaison avec un traitement systémique et la possibilité d'évaluer la réponse au traitement par des biopsies en série.

Procédures

Les interventions seront soumis aux procédures suivantes. Mise en place de la chimiothérapie avec méthode PIPAC (sous cœlioscopie) et de la sonde de dialyse péritonéale sous anesthésie générale et antalgique: durée 2h00 une seule fois le premier jour. Prélèvement de sang et de liquide péritonéal sous anesthésie générale durée 30 minutes le 1er, 2eme, 3ème , 4ème, 8ème et 15ème jour. Le dernier prélèvement de fera au 22ème jour lors de la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

En principe, toute anesthésie générale représente une contrainte pour l'ensemble de l'organisme et comporte des risques qui sont dans ce cas minimes du fait du choix d'un protocole d'anesthésie approprié et d'une analgésie postopératoire. Voici la liste des nuisances qui pourraient affecter le bien être des animaux avec l’intensité associée de cette nuisance. 1) Prémédication / Injections intramusculaires (anesthésie, antibiothérapie, éventuellement analgésie): douleur faible liée à l’injection. 2) Intervention chirurgicale (PIPAC) - sous anesthésie profonde et analgésie : douleur absente pendant la durée de l’intervention. 3) Douleurs de la plaie postopératoires - avec régime analgésique: faible à moyen en fonction de l’analgésie. 4) Sédation/anesthésie courte: faible nuisance. 5) Prélèvements sanguins veineux: absence de douleur lors des ponctions car animal sédaté. 6) Prélèvements de liquide péritonéal: absence de douleur lors de la collecte car animal sédaté. Nb : ce prélèvement se fait chez l’humain conscient sans douleur. 7) Maintien en isolement post-opérative en assurant un contact social indirect voir directs (contacts olfactifs, auditifs, visuels) entre les lieux d’hébergement : faible nuisance. 8) Effets secondaires systémiques de la substance: effets non connus mais avec impact faible à moyen. 9) Port de cathéters et de bandages: faible nuisance. 10) Maintien des animaux en cage individuelle avec contact olfactif, visuel et auditif avec les congénères: nuisance modérée. La classification de la gravité de l'exposition selon l'annexe VIII de la directive 2010/63/UE doit être considérée comme globalement moyenne (annexe VIII, section III, point 2c).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l’étude. Cependant, les animaux utilisés pendant ce projet pourront être réutilisé pour des TP d’autopsie pour la formation de docteur vétérinaire. De même, des echantillons biologiques pourront être prélevés et servir à répondre à d’autres problématiques scientifiques sans avoir à utiliser d’autres animaux.

Remplacement

Les molécules étudiées dans cette étude sont essentiellement immunomodulatrices. Cela signifie qu'elles déclenchent une réponse immunitaire humorale et/ou cellulaire. Différents modèles permettent de répondre à différentes questions que ce soit des modèles in vitro et in vivo. Cependant, l'immunité innée et adaptative ne peut être étudiée que sur un être vivant. Par ailleurs, une recherche bibliographique approfondie a été menée avant de mettre en place cette procédure. Une recherche dans la base de données ZEBET sur les alternatives à l'expérimentation animale pour cette question (efficacité et toxicité locales versus systémiques) n'a donné aucun résultat. Des études in vivo existent mais uniquement sur des modèles murins. Ces études montrent une toxicité locale et systémique acceptable. Cependant, la procédure PIPAX ne peut pas être réalisée sur des modèles petits animaux et aucune donnée n'est disponible sur un modèle de gros animaux. Le porc a donc été choisi comme modèle pour les expériences prévues, car il est le mieux adapté en tant que mammifère similaire à l’homme du fait de son anatomie, de son système immunitaire et de sa physiologie. C’est d’ailleurs le modèle de référence aujourd’hui pour cette technique dans les études précliniques. En particulier, la surface péritonéale est comparable à celle d'un humain adulte dans la catégorie de poids choisie. Il en va de même pour les similitudes de l'immunité innée et réactive.

Réduction

Nous utilisons le nombre le plus réduit possible d’animaux notamment en réalisant une étude pilote sur seulement 3 animaux par groupe avant de débuter la phase de test réalisés sur le seul groupe retenu au préalable. Le groupe de l’étude test intégrera les résultats obtenus pendant l’étude pilote. L’interprétation des résultats sera réalisé à l’aide de statistiques descriptives en comparant les moyennes des paramètres biologiques.

Raffinement

Les animaux sont acclimatés à l’animalerie et maintenus en groupe tant que c’est possible. L’hébergement des animaux s’effectue dans un milieu enrichi avec des jeux afin de distraire les animaux et dans la mesure du possible sur copeaux afin de répondre à leur comportement d’animal fuisseur. Ils ne sont isolés que lorsqu’ils sont équipés de cathéters. A ce moment-là, on maintient entre eux un contact visuel, auditif et olfactif et notre équipe continue d’entretenir un contact social. Les catheters sont régulièrement entretenus pour éviter qu’ils ne se bouchent. Les animaux sont vus et soignés au moins deux fois par jour ce qui contribue à les apprivoiser. Toutes les phases douloureuses sont anticipées par des traitements analgésiques. Des points limites ont été mis en place et sont objectivés à l’aide d’une grille de scoring de la douleur (voir la procédure). Au terme de la procédure, des prélèvements biologiques peuvent être réalisés afin de créer une banque qui pourra être utilisée dans d’autres études. Le plan de prélèvements sanguins est conçu de sorte à ne jamais prélever un volume de sang supérieur à 7,5% du volume circulant de l’animal. De même, les administrations parentérales ne dépasseront pas les recommandations communément admises dans « A Good Practice Guide to the Administration of Substances and Removal of Blood, Including Routes and Volumes ».

Choix des espèces

Le porc a été choisi comme modèle pour les expériences prévues, car il est le mieux adapté en tant que mammifère similaire à l’homme dans de nombreuses propriétés anatomiques. C’est d’ailleurs le modèle de référence aujourd’hui pour cette technique dans les études précliniques. En particulier, la surface péritonéale est comparable à celle d'un humain adulte dans la catégorie de poids choisie. Il en va de même pour les similitudes de l'immunité innée et réactive. L'expérience prévue n'est pas possible sur des animaux plus petits, parce que la technologie et les paramètres physiques (conditions de pression) seraient surdimensionnés et inapplicables pour des animaux aussi petits. Les animaux devront avoir un poids corporel similaire à celui d’un homme (70kg) ou d’une femme (60kg) adulte, et donc être en phase de croissance : les porcs seront agés de 3-4 mois pour un poids de 70 kg environ et présenteront un volume de distribution plasmatique équivalent à celui d’un adulte.