Procédures modérées

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour porter une mutation liée à l'autisme, elles sont génotypées, une partie des femelles gestantes tuée pour prélever les embryons et d'autres perfusées sous anesthésie terminale, pour caractériser l'effet de cette mutation sur le développement du cerveau. Le porteur signale que la lignée présente un "phénotype dommageable", avec une mort subite entre quatre et six mois sans signe annonciateur, un poids réduit et un cœur plus petit. Il affirme que seule une étude in vivo permet d'identifier l'effet de la mutation et qu'aucun autre modèle ne reproduit la maladie.

Objectifs

La mise en place des connections entre les neurones (synapses) sont des évènements critiques pour le développement et la fonction du cerveau. Nous travaillons sur un gène qui est essentiel pour le développement du système nerveux et la mise en place des synapses. Ce gène est un nouveau gène à risque pour l’autisme et la déficience intellectuelle. En effet, les patients ayant une mutation dans ce gène présentent une déficience intellectuelle ainsi que des troubles du spectre autistique. Pour mieux comprendre l’impact de cette mutation sur le fonctionnement cérébral, seule une étude in vivo permettra d’identifier comment elle perturbe le développement normal du cerveau. Dans ce but, nous avons créé un modèle de souris génétiquement modifiée porteur de cette mutation. Nous allons caractériser cette souris d’un point de vue morphologique et comportemental. De telles connaissances seront essentielles pour mieux comprendre les étapes du développement neuronal perturbés par la mutation, qui pourraient expliquer l’autisme et la déficience intellectuelle des patients. Cela permettra d’améliorer la prise en charge médicale des patients et d’identifier des cibles thérapeutiques pour cette pathologie pour laquelle il n’existe aucun traitement. Le but du projet est de comprendre si les problèmes de comportement et d’apprentissage observés chez les patients sont dus à l’impact de la mutation sur le développement neuronal embryonnaire qui aboutirait à des connections neuronales non fonctionnelles. Ce projet se déroulera dans deux Etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

La souris permet l’utilisation d’approches génétiques pour reproduire les mutations trouvées chez l’homme. Le modèle transgénique que nous venons de développer n’existe pas et représente un outil très important pour pouvoir mimer la pathologie humaine de l’autisme. C’est le premier modèle de cette pathologie particulière. Grâce à ce projet, nous allons pouvoir déterminer quel est l’impact de la mutation identifiée chez les patients sur le développment neuronal embryonnaire et chez l’adulte. Personne ne connait les étapes du développement du système nerveux affectées par cette mutation. Une meilleure compréhension de l’effet de cette mutation aura un réel impact pour une meilleure prise en charge des patients et sur la recherche de cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux en élevage seront soumis uniquement à un tatouage pour identification et une biopsie pour génotypage. Une observation approfondie de leur bien-être sera réalisée. Types d'interventions auxquels seront soumis certains animaux: i) isolement temporaire des mâles (maximum 3 semaines). Leur environnement sera enrichi (coton, cabane) pour diminuer leur inconfort; ii) prélèvements d'embryons avec mise à mort de la femelle gestante. Cela concerne 210 femelles; iii) perfusion sanguine réalisée sous anesthésie terminale. Cela concerne 84 animaux.

Impact sur les animaux

Cette lignée nouvellement créée présente un phénotype dommageable. En effet, nous avons observé une mort subite chez ces animaux, dont nous ne connaissons pas la cause. Cette mort subite intervient entre 4-6 mois d'âge, mais les animaux ne présentent aucun signe avant-coureur permettant de prédire leur décès. On peut noter que les souris ont un poids inférieur à la normale, ainsi qu'un coeur plus petit. Pour les gestations datées, les mâles seront isolés de façon temporaire (maximum 3 semaines).

Devenir

A l'issue de la procédure 1, les animaux seront transférés sur les sites d'expérimentation. A l'issue des procédures 2 et 3, les animaux seront euthanasiés, car nous prélèverons des organes afin de réaliser des analyses immunohistochimiques.

Remplacement

Le modèle animal ne peut pas être remplacé, car seule une étude in vivo permet d’identifier l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. De plus, il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu d’utiliser au maximum 1200 souris sur une période de 5 ans, ce qui représente le nombre nécessaire d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats. Seules les expériences considérées comme absolument indispensables seront réalisées. Nous utiliserons des mâles et des femelles dans nos procédures expérimentales, afin de réduire au maximum le nombre d'animaux produits et non-utilisés.

Raffinement

Les souris seront hébergées selon la règlementation obligatoire. Pour réduire la douleur et soulager l’inconfort des animaux, ils seront observés quotidiennement , ce qui permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée si des signes de souffrance sont détectés. Enfin, tous les gestes techniques seront réalisés par un personnel formé. Les animaux que nous allons perfuser recevront d'abord une anesthésie générale.

Choix des espèces

Seuls les modèles murins génétiquement modifiés permettent de cibler l’effet de la mutation identifiée chez les patients sur le développement neuronal et le fonctionnement cérébral. Il n’existe pas d’autre modèle animal qui puisse mimer la maladie. Nous étudierons ce modèle du stade embryonnaire tardif jusq'à l'adulte

1 584 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité tuées à l'issue et 28 réutilisées. Immunodéficientes, elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome sur le flanc, puis des injections intraveineuses trois fois par semaine, jusqu'à seize prélèvements sanguins et une chimiothérapie, pour tester un anticorps bloquant une protéine du cancer. Le porteur décrit une possible nécrose de la tumeur à la surface de la peau, une cachexie avec forte perte de poids et une fragilisation des veines par les injections répétées. Il affirme que l'in vitro ne fournit ni microenvironnement tumoral ni hôte complexe, ce qui rend selon lui l'in vivo nécessaire.

Objectifs

Une protéine a été identifiée dans la survenue, la survie et la résistance du glioblastome, cancer très agressif d’un type de cellules du cerveau. Il sera vérifié ici ces rôles avec notamment le traitement par des anticorps bloquant la protéine.

Bénéfices attendus

Le cancer du cerveau étudié dans cette étude est l’une des plus fréquentes tumeurs originaire du cerveau, et en dépit des efforts de la recherche, cette pathologie reste incurable. Les traitements actuels sont très délétères et la survie des patients après diagnostic est de 14-15 mois. Cette étude apporterait une solution thérapeutique supplémentaire pour la prise en charge de ces patients. Par ailleurs, plus de 90% de la mortalité des patients atteints de cancer est attribuée à la résistance aux médicaments utilisés. Cette étude pourrait apporter une alternative dans les cas de résistance observée lors de traitement par chimiothérapie activant le suppresseur de tumeur.

Procédures

Les animaux recevront une greffe de cellules tumorales dans le flan (1x, 40sec). A la suite de cette injection la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine au maximum, l’animal est maintenu immobile environ 30 sec. Les composés sont administrés par injection intraveineuse (3x par semaine de traitement, 1min dont 3sec d’injection). Des prélèvements sanguins sont réalisés (16x maximum, 2 min dont 2x3sec d’insertion de l’aiguille de la seringue dans la queue). L’une des chimiothérapies sera injectée par voie intra-péritonéale (3x par semaine, 1min dont 5sec d’injection).

Impact sur les animaux

Un stress peut être observé lors de la contention des animaux (greffe, administration de composés, et pesées). Lorsque les animaux présentent des tumeurs sur le flanc, il est possible d’observer des phénomènes de nécrose des tumeurs à la surface de la peau. Plus rares sont les phénomènes de métastases pour la greffe de certaines lignées de cancer du cerveau qui seront mis en évidence par la perte de poids. Pour les traitements avec chimiothérapie, une cachexie chez certains individus (associée à une forte perte de poids) pourrait être observée. Les veines caudales peuvent finir par être fragilisées aux points d'injections des anticorps dû au caractère répétitif de ces injections.

Devenir

Les souris sont mises à mort pour le prélèvement - des tumeurs en vue d’analyses biomoléculaires, - d’organes pour évaluer la toxicité des molécules injectées. Les souris qui n’auront pas développées de tumeurs seront mises à mort, car elles ne peuvent pas être considérées comme naïves.

Remplacement

Les travaux menés in vitro montrent que la stratégie de blocage de la protéine X induit la mort des cellules cancéreuses. Mais ces tests ne bénéficient pas d’un microenvironnement tumoral et d’un environnement hôte complexes. Aussi il est nécessaire d’avoir recours à l’in vivo pour étudier la capacité du nouvel outil thérapeutique à atteindre la tumeur, pour analyser son comportement dans cet environnement complexe, évaluer son efficacité et pouvoir valider cet outil. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux lors de l’analyse pharmacocinétique du traitement, pour laquelle il y a besoin de prélever des échantillons sanguins sur plusieurs temps, une même souris sera être prélevée à 3 temps différents. De plus, chaque lot de souris permettra d’analyser 4 anticorps différents, en respectant un temps d’attente de 15 jours, nécessaire pour reconstituer le volume sanguin initial de la souris et éliminer le précédent anticorps. Par ailleurs, les différentes expériences se feront de façon séquentielle. L’optimisation des greffes pour chaque lignée cellulaire permettra de choisir la condition assurant le bon développement des tumeurs pour la réalisation des tests d’efficacité. Les lignées cellulaires qui ne pousseront pas seront exclues de l’étude ce qui réduira le nombre de souris utilisées dans ces tests. Un maximum de 5 anticorps candidats parmi les 8 analysés dans ces études sera étudié dans les tests d’efficacité. Ces tests d’efficacités permettront de sélectionner un seul anticorps sur les 5, soit celui qui aura la plus grande efficacité anti-tumorale avérée. Cet unique anticorps sera utilisé en combinaison avec la chimiothérapie. Le nombre d’animaux ainsi comptabilisé est le nombre maximum dans le cas où toutes les lignées cellulaires pousseraient, que 5 anticorps candidats seraient sélectionnés, et qu’il serait nécessaire de reproduire certaines expériences dû à des problèmes techniques.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur formé à cette technique. Il est important de noter qu’une surveillance adaptée (3 fois par semaine) permettra la détection et notation des signes de souffrance grâce à une feuille de scoring contenant des points d'arrêt objectifs, reproductible et standardisés et qui conduiront à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux si nécessaire. Les analyses de croissance des tumeurs seront non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d’injection d’anesthésiant.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules, tout en permettant de faire des suivis de croissance tumoraux dans le cadre d’essais de nouveaux traitements. Par ailleurs les schémas d’administration des chimiothérapies sont biens standardisés (voie, doses, posologies...) contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. Les expérimentations seront effectuées sur des femelles de 6 à 7 semaines, âge où la prise de greffe est la plus efficace et la plus homogène. De plus les femelles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de la constitution de groupes expérimentaux homogènes.

180 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit des injections intracérébrales sous anesthésie, douze autres injections, une contention de trente minutes destinée à provoquer un stress avec prélèvements sanguins répétés, et un test de mémoire spatiale en piscine, pour étudier le rôle de nouveaux neurones dans la mémoire au cours du vieillissement. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut entraîner douleur, perte de poids ou infection de la plaie. Il affirme qu'une approche intégrée impose l'animal vivant et écarte tout modèle in vitro ou in silico.

Objectifs

Il est maintenant bien établi qu’il existe une formation de nouveaux neurones tout au long de la vie dans l’hippocampe des mammifères (y compris l’Homme), et que ce phénomène joue un rôle dans la mémoire spatiale. L’hippocampe est une structure clé impliquée dans les processus mnésiques. Les nouveaux neurones nés à l’âge adulte s’intègrent aux réseaux des neurones formés au cours du développement. Ces nouveaux neurones, appelés néo-neurones, sont cruciaux pour l’apprentissage et la mémoire. Au cours du vieillissement, certains individus présentent un déficit de mémoire beaucoup plus précocement que d’autres. Ces individus sont dits vulnérables, en comparaison aux individus résilients chez qui les capacités mnésiques sont préservées. La compréhension des processus qui sous-tendent ces différences interindividuelles est une étape clé pour le développement de stratégies innovantes visant à prévenir les troubles cognitifs liés à l'âge. Un des processus permettant d’expliquer ces différences serait la capacité des nouveaux neurones créés à l’âge adulte dans le gyrus dentelé de l’hippocampe, à s’intégrer totalement (individus résilients) ou partiellement (individus vulnérables), dans le réseau de neurones du gyrus dentelé au cours des processus de mémoire. L’objectif de ce projet est de regarder si la stimulation des nouveaux neurones améliore la mémoire spatiale des animaux dit vulnérables.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif associé au vieillissement, dont la maladie d'Alzheimer est la forme la plus extrême, représente un problème de santé majeur auquel la société occidentale est confrontée. Compte tenu de l'augmentation du nombre de personnes âgées, le fardeau économique de ces troubles est élevé ; il s'agit actuellement du problème de santé le plus coûteux dans l'UE. Il est donc de plus en plus important de comprendre les changements cognitifs qui accompagnent le vieillissement aussi bien normal que pathologique. L’une des plaintes cognitives les plus courantes chez les personnes âgées est l'altération de la mémoire. Aussi, comprendre pourquoi certains individus conservent de bonnes capacités de mémorisation, alors que d'autres présentent une perte de mémoire impactant leur vie quotidienne, est essentiel pour développer de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre les troubles cognitifs liés à l'âge. Notre stratégie de recherche consiste à tirer parti de ces différences interindividuelles pour identifier de nouveaux mécanismes de préservation du fonctionnement mnésique au fil du vieillissement. Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle des néo-neurones nés à l’âge adulte dans la préservation des capacités de mémoire et d’apprentissage au cours du vieillissement. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s’intéressant aux maladies neurodégénératives touchant la mémoire, comme la maladie d’Alzheimer, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

6 gestes techniques seront réalisés : *Composition corporelle : Après une acclimatation de 30 minutes dans l’appareil à Résonnance magnétique nucléaire, les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention en plastique durant le temps de l’examen qui dure 3 min. *Prélèvement de sang à la queue : les animaux vigiles sont placés dans un tube de contention pendant 30 min pour induire un stress. Immédiatement après, le sang est prélevé (2 min). L’opération est renouvelée 30, 60 et 120 minutes plus tard (3x2 = 6min). *Injections intracérébrales : Geste chirurgical réalisé sous anesthésie gazeuse (durée moyenne 50 min). *Injections autres : Elles sont réalisées sur animal vigile. Les animaux reçoivent au total 12 injections (durée totale préhension de l’animal + injection =36min) *Test de la mémoire : les rats nagent dans une piscine et apprennent à localiser une plateforme immergée. Lors de l’habituation, ils passent 2x60s (2min) dans la piscine sans la plateforme. Lors de l’apprentissage, ils font chaque jour 4 essais, pendant 8 jours. Pour chaque essai, les animaux passent 90s maximum dans l’eau (temps maximum passé dans l’eau au cours d’une session = 4 x 90s = 360s = 6 min). Au fil des jours, les animaux apprennent et le temps passé dans l’eau diminue : temps moyen passé dans l’eau au cours de ce test 40s x 4 essais par jour soit 160s = 2min40 (durée totale moyenne passée dans la piscine : 8x160s = 1280s = 21min20s). *Euthanasie : Les animaux sous anesthésie gazeuse sont euthanasiés (induction 5min + maintien 3-4min jusqu’à confirmation euthanasie) par injection intrapéritonéale d’une dose létale d’euthanasique.

Impact sur les animaux

Comme tout projet incluant des contentions, des injections et des gestes chirurgicaux (stéréotaxie, incision de la queue), il est possible que des effets indésirables surviennent malgré notre vigilance et la mise en place de procédures adaptées. Tout d’abord concernant la contention lors de la mesure de la composition corporelle, celle-ci sera la plus légère possible et de durée relativement courte (3min) de manière à induire le moins de stress possible. S’agissant de la contention afin d’étudier la réactivité cérébrale en réponse à un stress, nous savons que cela sera forcément générateur de stress puisqu’il est nécessaire à l’étude. Ensuite, même si cela est relativement rare, il est possible que les sites d’injection ou les plaies chirurgicales s’infectent ou deviennent douloureux. De même dans les 2 jours suivants la chirurgie stéréotaxique, il est possible que les animaux perdent du poids ou présentent des signes de douleur. Enfin, au sujet de l’isolement certes les animaux seront hébergés en cage individuelle mais les nuisances liées à cela seront limitées. En effet l’hébergement ne se fait pas en portoir isolé ainsi les animaux restent en contact visuel, olfactif et sonore.

Devenir

A l’issue de toutes les expériences, les animaux seront mis à mort en vue d’analyses réalisées sur leur cerveau.

Remplacement

Dans ce projet, nous souhaitons étudier in vivo l’impact d’une stimulation des néo-neurones du Gyrus denté au cours du vieillissement. Il s’agit d’une approche intégrée nécessitant les capacités cognitives de l’animal. Un tel travail ne pourrait être effectué par une approche in vitro, ou in silico, et nous ne pouvons donc recourir à des techniques de remplacement.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrions rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problèmes au cours de la chirurgie, variations anatomiques interindividuelles entraînant l’injection du virus en dehors de la région cérébrale ciblée, problèmes lors de la dissection), ainsi que des problèmes de santé inhérents au vieillissement (les animaux développant arthrites, tumeurs, cécités, cataractes étant exclus). Une analyse préalable de la normalité des données sera réalisée afin de vérifier la possibilité de poursuivre l’analyse sur des statistiques paramétriques. Les effectifs ont été déterminés de façon à pouvoir effectuer des tests statistiques sur un nombre de rats suffisant pour obtenir des résultats cohérents.

Raffinement

Hébergement : Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés par 2 en cages collectives (grande taille) enrichies afin de réduire l’ennui et le stress. Les rats seront observés quotidiennement par le personnel zootechnique et manipulés mensuellement jusqu’à leur euthanasie. Ils seront hébergés dans une animalerie dont la température et le taux d’humidité seront contrôlés et avec un cycle lumière-obscurité de 12h. L’accès à la nourriture et à l’eau sera à volonté et un changement de litière sera effectué chaque semaine. Gestion de la douleur : En fin de chirurgie, un anti-inflammatoire sera injecté en vue de limiter la douleur post-opératoire. Après la chirurgie et durant 3 jours, les rats seront individuellement manipulés afin de détecter tout problème post-opératoire. Si un animal présente des signes de douleur, nous lui administrerons un analgésique par voie sous-cutanée toutes les 6 à 12h. En cas de signes d’infection de la plaie chirurgicale, nous la désinfecterons et administrerons un analgésique à l’animal toutes les 6 à 12 heures. Si le bout de la queue s’infecte, nous désinfecterons la plaie et ce jusqu’à disparition totale de l’infection. Si les sites d’injections intra-péritonéales ou sous-cutanées s’infectent ou s’enflamment, nous nettoierons la zone avec et administrerons un baume cicatrisant jusqu’à disparition complète des symptômes. Nous utilisons des grilles d’évaluation de la douleur permettant de scorer de façon objective le bien-être de l’animal. Ces grilles sont remplies par l’expérimentateur jusqu’à l’euthanasie des animaux. Plus le score est élevé plus le bien-être de l’animal est menacé et des points limite ont été définis. Si nous n’observons pas d’amélioration de l’état de l’animal après traitement, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. Enfin, en l’absence d’amélioration sous 48h, l’animal sera euthanasié par inhalation de gaz carbonique.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est le rat. La complexité du système nerveux des mammifères et des comportements qu’il sous-tend rend impossible leur reproduction in vitro ou chez des organismes d’une plus faible complexité neurophysiologique (invertébrés par exemple). Le rat est un modèle classiquement utilisé en neurosciences, notamment pour des études comportementales telles que celles réalisées auparavant au sein du laboratoire. De plus, la formation des nouveaux neurones au cours de la vie (néo-neurogénèse) est un phénomène conservé au sein des mammifères, chez le rat, chez le singe et chez l’Homme. Enfin, cette étude vient compléter nos investigations menées depuis plus de 20 ans sur cette espèce, permettant ainsi de s’appuyer sur une solide expertise et une base de données importante (continuité et contrôle des résultats). Les rats seront réceptionnés à l’âge de 10 semaines afin d’être âgés de 12 semaines au moment des injections intracérébrales. Les différentes études seront réalisées 5 à 15 mois après celles-ci. Nous utiliserons ainsi des animaux adultes à différents stades de vieillissement : 1) adulte : 8 mois ; 2) milieu de vie : 12 mois ; 3) fin de vie : 18 mois. Ces âges ont été choisis car ils permettent d’étudier le rôle des nouveaux neurones nés à l’âge adulte dans l’apparition de troubles de la mémoire au cours du vieillissement.

2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules leucémiques, murines ou humaines, leur sont injectées, puis elles reçoivent des composés par de multiples voies avec suivi par bioluminescence sous anesthésie et prélèvements sanguins, dont l'amputation de l'extrémité de la queue, pour évaluer des candidats médicaments contre la leucémie. Le porteur décrit une dégradation possible, baisse d'activité, respiration difficile, perte de poids et impossibilité de s'alimenter à mesure que la leucémie progresse. Il juge le recours à l'animal "incontournable" au motif qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la pharmacocinétique dans un organisme complet.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer de nouveaux traitements pour les leucémies, dont les besoins sont non satisfaits, chez la souris dans des modèles orthotopiques (i.e. injection de cellules cancéreuses au site correspondant à celui de la tumeur d’origine). Pour ces modèles, des cellules cancéreuses soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées à l’animal par voie systémique (i.e. intraveineuse ou intrapéritonéale). En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer le ou les composé(s) à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur, puis à mesurer l’évolution du cancer, les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines et/ou tissulaires du composé d’intérêt. Les mesures de concentrations du composé permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité, de toxicologie réglementaire et enfin de prédire les doses des phases de preuve de concept en développement clinique chez l’homme. Le suivi de l’évolution du cancer permettra d’évaluer l’efficacité du ou des composé(s). Celui-ci sera réalisé par imagerie non-invasive de bioluminescence sur animal anesthésié ou par cytométrie en flux sur des échantillons sanguins (prélèvement non terminal). Des prélèvements tissulaires post-mortem pourront être réalisés pour des analyses ex vivo complémentaires : histologiques, par cytométrie en flux…

Bénéfices attendus

Les leucémies sont des cancers du sang qui ne touchent pas seulement les enfants, mais également les adultes. Il existe plusieurs types de leucémie. La classification se fait selon la rapidité d’évolution de la maladie (aiguë ou chronique) et selon les cellules souches de la moelle osseuse à partir desquelles elle se développe (myéloïdes ou lymphoïdes). Toutes les leucémies prennent naissance dans la moelle osseuse et se caractérisent par une prolifération incontrôlée des cellules. Cette surproduction de globules blancs anormaux envahit la moelle osseuse, empêche les globules blancs normaux d’arriver à leur maturité pour assurer leur rôle. Les globules blancs anormaux finissent par se déverser dans le sang au détriment des globules blancs normaux. Environ 9 000 personnes sont touchées chaque année en France. Les leucémies représentent 29 % des cas de cancer diagnostiqués chez les moins de 15 ans et 14 % des cancers qui se développent à l’adolescence selon l’Institut National du Cancer. La proportion de personnes atteintes dans la population mondiale est de 1 à 2 cas pour 100 000 personnes. Si ces pathologies sont de mieux en mieux prises en charge, elles restent dévastatrices. En effet, selon leur type, les leucémies ne constituent pas un cancer de bon pronostic. La survie des leucémies aiguës est basse (survie de 19% pour les leucémies aiguës myéloïdes à 5 ans). Ce qui souligne l’inefficacité des traitements actuels et la nécessité de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

Les gestes techniques concernant tous les animaux : • Tatouage (1 fois ; 2 min) sur animal vigile • Injection des cellules leucémiques (1 fois) sur l’animal vigile par injection intrapéritonéale (30 sec) ou intraveineuse via la veine caudale (30 sec) ou sur l’animal anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux par voie intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec) • Pesée (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile. Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Administration intrapéritonéale (maximum 1 fois par jour sur la durée du protocole ; 30 sec) sur animal vigile • Suivi de la croissance tumorale par bioluminescence (maximum 3 fois par semaine sur la durée du protocole ; 15 min à 1h) sur animal anesthésié par inhalation d’d’anesthésique gazeux • Prélèvements de sang (30 sec) : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera adaptée en fonction du volume prélevé en accord la législation en vigueur Les sites seront la veine submandibulaire sur animal anesthésié par anesthésie gazeuse, ou veine caudale, ou amputation unique de la queue (coupe 1 à 2 mm sur l'extrémité non innervée de la queue) sur animal vigile. • Administrations des composés à potentiel thérapeutique : la fréquence dépendra là encore des demandes clients mais elle sera en accord avec la législation en vigueur. Les voies envisagées sur animal vigile seront les voies (30 sec) : per os, intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse via la veine caudale ou intramusculaire. Les voies possibles sur animal anesthésié par inhalation d’anesthésique gazeux seront intradermique (1 min) ou intraveineuse via le sinus rétro-orbital (30 sec).

Impact sur les animaux

Ces modèles peuvent engendrer une dégradation de l’état de santé de l’animal pouvant se traduire principalement par une diminution de l’activité motrice mais peuvent aussi également survenir une respiration difficile, une perte de poids, une pilo-érection et/une altération des fonctions normales (impossibilité de s’alimenter). Ces effets apparaissent potentiellement au fur et à mesure de l’évolution de la leucémie. Les animaux peuvent être également soumis à des anesthésies répétées ce qui peut constituer une nuisance.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue des études afin notamment de prélever des organes d’intérêts qui feront l’objet d’analyses (ex : dosage de biomarqueurs, dosage des concentrations des composés à potentiel thérapeutiques …). Les modèles décrits ne permettent pas la réutilisation des animaux.

Remplacement

Principalement 2 approches sont utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basée sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux de laboratoire, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorales. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

L’évolution de la leucémie sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence ou prélèvement sanguin non-terminal. L’utilisation de ces techniques non-invasives permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in sillico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base principalement sur les données de la littérature et peuvent également se baser sur les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des locaux conformes aux standards règlementaires de la directive n°2010/63/UE. Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés sans des cages contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. En cas d’apparition de signe de douleur, un analgésique adapté est donné par voie SC ou en gel alimentaire pour couvrir une période de 24 h. Si les signes devaient perdurer ou si l’utilisation de l'analgésique n’est pas possible (interaction médicamenteuse pour les animaux sous traitement), l’animal serait euthanasié. Au fur et à mesure des données collectées, des points limites prédictifs et spécifiques pour chaque modèle seront définis basés sur l’intensité de bioluminescence et/ou le % des cellules leucémiques et/ou normales. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Une fiche de suivi des signes cliniques a été mise en place. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées. Ainsi, à partir d’un total de 2, les gavages seront suspendus (si applicable), à partir d’un score de 4, un suivi vétérinaire sera mis en place avec une surveillance renforcée des animaux et des mesures complémentaires seraient prises telles que aliment humide au sol, ajout d’enrichissement... et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limite établis, il sera immédiatement euthanasié.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. Des données sur les modèles de leucémie chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1/ sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2/ la biodisponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Adulte : les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer.

702 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est greffée sur leur flanc, puis elles reçoivent sous anesthésie quatre à neuf injections d'un vaccin, d'anticorps ou d'adjuvant, y compris directement dans la tumeur, pour étudier une immunothérapie anticancéreuse à base de complexes protéines-ARN. Le porteur décrit une inflammation transitoire et une gêne modérée liée à la tumeur, et affirme n'attendre aucune toxicité du vaccin. Il conclut qu'un "organisme entier" est nécessaire et qu'aucun milieu artificiel ne recrée la complexité de la réponse immunitaire.

Objectifs

Ce projet a pour but d'étudier une nouvelle classe d'immunothérapie anticancéreuse basée sur des complexes protein-ARNs. Le but est d’optimiser le potentiel thérapeutique d'une autoimmunité ciblée contre la tumeur et de mieux comprendre les conditions requises pour l’efficacité de cette thérapie. Les études mettront en lumière le mode d'action, et aideront à optimiser la formulation de cette nouvelle classe en vue de réaliser des essais ensuite chez l'homme.

Bénéfices attendus

Connaissances fondamentales. Ce projet contribuera à une meilleure compréhension du potentiel thérapeutique des complexes proteines-ARNs et des mécanismes impliqués dans la rupture de la tolérance. Ces résultats bénéficieront à la communauté scientifiques et potentiellement aux immunologistes travaillant sur le cancer et les maladies immunitaires déclenchées par les auto-antigènes. Connaissances appliquées : Le but ultime du projet est le traitement de patients humain.

Procédures

Nuisances modérées: Vaccinations/injections sous anesthésie générale et presence d'une tumeur sur le flan. Toutes les injections se font sur animaux anesthésiés. Injection du vaccin ( A injection durant 1 min par jour. 4 à 9 injections dans la peau au total). Injections d'anticorps dans la cavité abdominale (1 injection durant 1 min par jour. 4 à 9 injections au total ). Injections d'adjuvant et/ou d'anticorps pour mobiliser une réaction inflammatoire dans une tumeur (1 injection durant 1 minute par jour. 1 à 9 injections directement dans la tumeur). Mesure de la taille de la tumeur 2-3 fois par semaine (durée 2 minutes). Prelèvements après euthanasie.

Impact sur les animaux

Le vaccin n'est pas toxique. Une inflammation transitoire peut être observée. La tumeur sur le flan peut povoquer une gêne modérée. Les injections d'anticorps sous anethésie ne crééent pas de nuisance perceptibles sur le plaln clinique, mais seulement des effets mesurable sur le plan cellulaire et moléculaire (comme chez l'homme).

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour prélever les organes (rate, sang, tumeur si présente).

Remplacement

Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans le développement du vaccin. Il n’est pas possible de recréer, en milieu artificiel, la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu dans la réponse immunitaire.

Réduction

Le nombre minimum nécessaire et suffisant a été scrupuleusement déterminé par calcul statistique. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront observés et pesés quotidiennement.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Un mammifère est nécessaire car le système immunitaire des non-mammifères (invertébrés...) est trop différent de l'homme. La souris est l’animal classiquement utilisé pour étudier l’efficacité d’un vaccin thérapeutique antitumoral au niveau préclinique. La souris est aussi le seul modèle où nous disposons de tous les outils appropriés et validés (anticorps et tumeur). Livraison des animaux âgés de 5 semaines et début de l’expérimentation à 6-7 semaines. Ce stade est couramment utilisé dans la littérature ce qui nous permettra de comparer nos résultats avec les données publiées. Des séries d'immunisation sur des animaux âgés de 1 an sont également prévues afin de comparer la sureté et l'efficacité sur des animaux plus âgés et suivre les effets sur l'espérance de vie.

Nourries douze semaines d'un régime standard ou d'un régime riche en graisses qui provoque obésité, diabète de type 2 et stéatose du foie, 640 souris passent ensuite par l'une des interventions prévues : un jeûne de 16 heures, ou six semaines de jeûne intermittent de 16 heures par jour, de régime cétogène, de retour au régime standard ou de régime gras maintenu. Les unes n'expriment pas la protéine PPARa dans le foie, les autres sont utilisées comme témoins, pour mesurer le rôle de cette protéine dans les effets des régimes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Au début et à la fin de chaque intervention, des tests de tolérance au glucose ou à l'insuline imposent six heures de jeûne, un gavage de glucose ou une injection d'insuline, puis sept gouttes de sang prélevées à la queue en deux heures, à raison d'un test ou d'une prise de sang par semaine. Le porteur écrit que le régime obésogène installe ces troubles "sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement", et cite pour le jeûne un risque d'hypoglycémie et d'hypothermie. Toutes sont tuées à l'issue, pour récolter leur sang et leurs organes.

Objectifs

Les maladies métaboliques du foie (stéatose hépatique non alcoolique, ou NAFLD pour non-alcoholic fatty liver disease) sont en expansion dans les pays industrialisés, parallèlement à la prévalence croissante de l’obésité. Le premier stade de la maladie correspond à une accumulation de graisses dans le foie et est bénin mais peut évoluer chez certains patients vers une forme inflammatoire, puis vers une cirrhose, à l’origine d’autres complications sévères telles que le cancer du foie. Les mécanismes de progression de ces maladies sont encore mal compris et aucun traitement médicamenteux efficace n’est disponible à ce jour. Dans une étude non publiée du laboratoire, nous avons récemment démontré que plusieurs stratégies alimentaires sont capables de diminuer l’obésité, le diabète et la stéatose hépatique chez la souris. Nous souhaitons à présent déterminer les mécanismes impliqués dans ces effets bénéfiques. Nous émettons l’hypothèse que la protéine PPARa pourrait être impliquée dans ces effets. PPARa est principalement exprimée dans le foie où elle contrôle la dégradation des graisses, faisant d'elle une bonne cible thérapeutique pour traiter les maladies métaboliques. Nous disposons au laboratoire de souris mâles et femelles chez qui le gène PPARa est non fonctionnel dans le foie. Dans ce projet, nous utiliserons des souris mâles et femelles qui n'expriment pas PPARa dans le foie et comme contrôle, des souris chez qui PPARa s’exprime. Elles seront nourries par un régime gras induisant une obésité, un diabète de type 2 et une pathologie hépatique mimant celle observée chez l’Homme. Une fois la pathologie installée, les animaux seront soumis à différentes stratégies alimentaires : un retour à un régime contrôle, un jeûne aigu ou intermittent, un régime cétogène (presque exclusivement constitué de graisses et contenant très peu de sucre). Les effets de ces différentes stratégies alimentaires seront évalués grâce à des bilans sanguins et des analyses des prélèvements d’organes (foie, tissus adipeux brun et blanc).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de définir l’importance de PPARa spécifiquement dans le foie dans les effets bénéfiques des différentes interventions sur la progression de l’obésité, du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. En conséquence, ce projet pourrait identifier un des mécanismes hépatiques pouvant être impliqué dans les effets de ces différentes interventions. En effet, aucun traitement de référence n’est disponible à ce jour pour les patients atteints de ces maladies chroniques du foie qui représentent actuellement la 2e cause de transplantation de foie du monde.

Procédures

Les animaux seront nourris avec un régime standard ou un régime obésogène riche en graisses pendant 12 semaines. A l'issue de ces 12 semaines, les animaux subiront l'une des interventions nutritionnelles suivantes : une mise à jeun pendant 16h, un jeûne intermittent de 16 h par jour pendant 6 semaines, un régime cétogène riche en gras et pauvre en sucre pendant 6 semaines, un régime standard pendant 6 semaines, un groupe contrôle qui restera nourri avec le régime obésogène pendant 6 semaines. Les animaux seront aussi soumis à des tests de tolérance au glucose (OGTT) ou à l’insuline (ITT) au début et à la fin de chaque intervention. Ces tests consistent en : 6h de jeûne, suivi d'une mesure de la glycémie puis un gavage avec du glucose pour les OGTT ou une injection d'insuline pour les ITT, puis des mesures de la glycémie toutes les 15 min pendant 2h. Pour les OGTT, le glucose est administré par gavage une fois et pour les ITT, l'insuline est administrée par injection une fois. Le gavage et l'injection prennent chacun moins de 30 secondes. Pour les mesures de glycémie, le prélèvement d’une seule goutte de sang (

Impact sur les animaux

Les régimes obésogènes vont induire une obésité et des perturbations du métabolisme associées tels qu'un diabète et une stéatose, sans souffrance visible des animaux ni changement de leur comportement. La mise à jeun peut entraîner une hypoglycémie et une hypothermie. Le prélèvement sanguin et le gavage oral de glucose et d’insuline peuvent entraîner un stress des animaux lié à la contention.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de récolter le sang et différents organes pour effectuer les analyses permettant de répondre à la question scientifique

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux de laboratoire car la pathologie étudiée (stéatose non alcoolique) est complexe et fait intervenir différents tissus agissant en synergie (foie, tissus adipeux, intestin, cerveau, muscle). Il est impossible de mimer ceci par l’utilisation de méthodes alternatives. L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car il est possible de mimer la pathologie étudiée grâce à l’utilisation du régime gras.

Réduction

Le nombre d'animaux pour ce projet est défini pour permettre d'une part de répondre aux questions scientifiques et d'autre part de respecter la réduction du nombre d'animaux au maximum. Ainsi nous utiliserons le plus petit nombre d'animaux possible qui est requis pour répondre à nos questions scientifiques et conduire à des résultats exploitables et statistiquement significatifs. Ce nombre d'animaux a été déterminé par des tests statistiques appropriés (calcul de puissance) et est basé sur des résultats provenant d'expériences antérieures du laboratoire.

Raffinement

Nous veillerons au bien-être des animaux tout au long des expérimentations en leur assurant les meilleures conditions d’hébergement. Ainsi, les souris seront en hébergement collectif et dans un environnement contrôlé (température, hygrométrie). Des enrichissements du milieu de vie (cabanes en inox et ouate de coton ou de cellulose) seront disposés dans la cage afin de pouvoir se distraire, se cacher et fabriquer des nids. Pour un meilleur raffinement et limiter le stress, les animaux seront habitués à l’expérimentateur et les gestes techniques seront réalisés par une personne formée et expérimentée. Nous surveillerons également attentivement l’apparence physique externe, le poids et le comportement des animaux, et nous mesurerons leur consommation alimentaire et hydrique afin de vérifier la bonne tolérance des différentes expérimentations. Des points limites gradés seront mis en place pour l’évaluation de ces différents paramètres (indice 0 = normal ou léger, indice 3 = changements importants par rapport à la normale). Si un animal présente un signe quelconque de souffrance avec un score de 3 après évaluation de ces paramètres, l’animal sera aussitôt retiré de l’étude et replacé dans des conditions d’hébergement standard (régime standard et aucune procédure réalisée).

Choix des espèces

L’utilisation de souris de laboratoire est appropriée car elle permet d’étudier le rôle de protéines spécifiques en utilisant des souris transgéniques. Ces modèles existent uniquement chez la souris. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (7 semaines d’âge minimum) car le développement du foie est terminé et nous nous intéressons au métabolisme chez l’individu adulte.

14 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie cérébrale d'environ quatre heures couplée à une IRM, huit prélèvements sanguins, sept ponctions lombaires, six IRM et quatre électromyogrammes, pour comparer deux méthodes d'injection intracérébrale d'un vecteur de thérapie génique visant la maladie de Huntington. Le porteur décrit les nuisances possibles, douleur crânienne, gêne à la cicatrice, hématomes gênant la mobilité et appréhension envers les expérimentateurs après chaque intervention. Il présente l'usage du primate comme "primordial" pour valider la procédure avant l'humain, au motif que son cerveau se rapproche du cerveau humain.

Objectifs

Certains virus (les AAV : Adeno-Associated virus = Virus associés aux Adénovirus) sont très efficaces pour transporter et exprimer des gènes d’intérêts dans des parties précises du système nerveux central, en particulier dans le cerveau. L’utilisation de ces virus non pathogènes et déja testés dans le cadre de traitements thérapeutiques pour d'autres maladies neurodégénératives constitue une approche de choix pour la maladie de Huntington. Le but de cette étude est multiple. Dans un premier temps elle permettra de tester la possibilité d’une injection au cours d’une séance d’imagerie par résonance Magnétique (IRM) permettant de pouvoir suivre en direct l’évolution, la diffusion de notre injection. Grace à cette étude nous pourrons également comparer la précision de nos injections au niveau de nos sites d’injection, en utilisant deux méthodes d’administration (injection avec produit de contraste comparé à injection avec système de guidage informatique). Enfin cette étude nous permettra d’évaluer la toxicité de l’utilisation du produit de contraste et de comparer la diffusion de ce produit avec la diffusion de notre vecteur médicament. Toutes ces informations nous permettront d’évaluer : •la diffusion de notre médicament dans l’organisme •les zones d’expressions de notre médicament dans l’organisme.

Bénéfices attendus

Les benefices attendus pour ce projet sont : - La détermination de la méthode d’injection optimale - La détermination du volume d’injection optimal - Les informations de diffusion du médicament dans l’organisme - La possibilité de trouver des indicateurs biologiques de la maladie. Le but global de l'étude étant de soutenir la demande d'un essai clinique (chez l’homme) pour les patients souffrant de la maladie de Huntington.

Procédures

Dans ce projet tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale et sous analgésie. Une même anesthésie permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + Ponction lombaire + Electromyographie (EMG) ou Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) selon les temps d’intérets de l’étude). - Une procédure chirurgicale (environ 4h) couplé à une IRM - 8 prélèvements sanguins, 7 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) (prise de sang (5 minutes), prélèvement de LCR (10 minutes), - 6 examens Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 1h30) - 4 Electromyogramme (EMG) (maximum 30min).

Impact sur les animaux

les nuisances possibles pour l'animal sont : - une douleur possible au niveau de la zone crânienne suite à l’intervention chirurgicale, - une gêne au niveau de la cicatrice due à une douleur ou à des démangeaisons lors de la cicatrisation, - une gêne au déplacement suite aux prélèvements de sang et de LCR qui peuvent de temps en temps induire des hématomes pouvant gêner temporairement la mobilité des primates, - une légère douleur liée au prélèvement de LCR, - une gêne au déplacement lors de la remise en cage suite à l’anesthésie (déséquilibre, faible tonus musculaire), -une gene musculaire possible suite à la stimulation électrique pour la réalisation des EMG, - une légère hypothermie lors de la remise en cage (l’animal étant constamment réchauffé pendant l’intervention, le fait de le remettre en cage stoppe cet apport de chaleur complémentaire), - une difficulté d’alimentation post opératoire dû à de possible reflux gastriques, - une appréhension ou méfiance des animaux vis-à-vis des expérimentateurs suite à chaque intervention.

Devenir

A la fin du projet soit 6 mois apres l'injection, les animaux seront euthanasiés pour permettre les études histologiques et de biodistribution composant l'etude et permettant de déterminer la méthode d’injection optimale de notre traitement de thérapie génique.

Remplacement

Toutes les études possibles sans utilisation d’animaux ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des vecteurs médicaments. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme fait l'obligation d'une étude sur son efficacité, sa toxicité et des réactions du corps sur un autre modèle animal que le rongeur, de plus grande taille (ici le primate) pour affiner avant la transposition chez l’Homme. Notre projet a pour but de valider une procédure opératoire en vue d’une application prochaine à l’Homme. L’utilisation du primate est donc primordiale pour valider celle-ci sur un modèle gros animal présentant des caractéristiques structurelles du cerveau proche des caractéristiques humaines.

Réduction

14 animaux au total: 6 animaux pour l’étude de faisabilité (2 doses) 8 animaux pour l’étude de toxicité (2 doses): 3 animaux par dose de médicament-vecteur (2 doses différentes) et 2 animaux controles, c’est-à-dire injecté avec une substance ne contenant pas de médicament-vecteur (2 volumes différents). C’est le minimum pour une étude statistique permettant de repondre à l'objectif du projet. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, Les animaux sont hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté. Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie, l'utilisation de buprénorphine pour les ponctions lombaires pour éviter tout inconfort et enfin des antibiotiques lors de la chirurgie. L'administration intracérébrale d'AAV (Adéno Associated Virus=Virus associé aux Adénovirus) est parfaitement tolérée. Les prises de sang et ponctions lombaires (avec les mêmes volumes et fréquence que décrite dans ce projet) sont menées en routine sur tous les animaux suivis par l'équipe et ne génèrent pas d'effet néfaste sur les animaux. Une observation journalière sera faite tout au long du projet. A la moindre anomalie un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. Si un animal ne présentait pas d'amélioration dans le suivi, il sera euthanasié avec avis vétérinaire.Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement)les procédures sont réalisées par du personnel formé et experimenté notamment la chirurgie d’administration intracérébrale réalisée par un neurochirurgien expert de la technique. Enfin, le nombre d'anesthésie est minimisé en regroupant les procédures (prise de sang (volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire), ponction lombaire) au sein de la même anesthésie.

Choix des espèces

La capacité des vecteurs médicaments à pénétrer dans un organe donné et y faire exprimer un gène thérapeutique permettant de soigner les maladies est dépendante de l'espèce. Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisé et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Les organes du primate non humain en particulier le cerveau, se rapprochent le plus de celui chez l’homme en termes de structure anatomique. L’administration du médicament vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole qui sera réalisé chez l’homme (nombre de sites, volumes, débit, nombre de particules). L'injection de médicament-vecteur chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux seront utilisés entre 2 ans et 15 ans selon la disponibilité en élevage, nous avons besoin d'individus avec un cerveau complètement développé.

1 620 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Fortement immunodéprimées, elles sont greffées avec des cellules leucémiques humaines puis reçoivent des molécules candidates, avec des prises de sang hebdomadaires, pour mettre au point un modèle de leucémie liée au virus HTLV-1 et tester des traitements. Le porteur décrit les effets attendus de la greffe, amaigrissement, perte d'équilibre, difficultés motrices, gonflement du ventre et poils hérissés, suivis par une grille bi-hebdomadaire. Il juge de nouvelles approches thérapeutiques "indispensables" et affirme qu'il n'existe "pas de modèle cellulaire satisfaisant" pour cette maladie.

Objectifs

La leucémie/ lymphome T liée au virus HTLV-1 (ATLL) est une maladie du sang agressive qui est rapidement mortelle dans la majorité des cas malgré des protocoles de traitement intensifs. Ceci est principalement lié à une résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie chez environ 50% des patients. Il est donc indispensable de proposer aux patients de nouvelles approches thérapeutiques. Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATLL dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATLL de patients, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie induite. Par conséquent, il est nécessaire de tester l’efficacité de nouveaux traitements sur d’autres modèles, qui de plus représentent la diversité des mutations cancéreuses observées chez les cellules leucémiques des patients. Ce projet fait suite au précèdent projet dont l’objectif initial était l’établissement de lignées à partir de cellules primaires de patients atteints de lymphome/leucémie lié au virus HTLV-1 ou de cellules sur le même modèle de qui est réalisé dans d’autres maladies du sang. Depuis 2019, une vingtaine de cellules primaires d’ATLL ont été injectées à des souris fortement immunodéprimées. Il a été possible d’obtenir 4 lignées stables (après plusieurs réinjections). De manière intéressante, il a été possible de cultiver in vitro pendant quelques jours (2-3 semaines environ) 3 de ces lignées. Ce projet a un double objectif : 1. Mise au point d’un nouveau modèle de leucémie/lymphome T liée à HTLV pour permettre une meilleure compréhension de la maladie induite (poursuite de l’étude débutée en 2019). 2. Evaluer in vitro et in vivo l’efficacité de nouvelles thérapeutiques potentielles qui seront testées seules ou en association pour contrecarrer la résistance primaire des cellules d’ATLL à la chimiothérapie.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est l’identification d’une ou plusieurs molécules d’intérêt qui a (ont) un effet potentiel anti-tumoral sur les cellules d’ATLL. Cette (ces) molécule(s) fera (feront) l’objet d’études approfondies sur son (leur) mécanisme d’action. Enfin à terme, l’objectif est de proposer une étude clinique étant entendu que l’ATLL est une maladie orpheline qui concerne moins de 50 nouveaux patients par an en France mais environ 1000 cas par an au Japon et que l’ATLL est un modèle pour d’autres maladies du sang.

Procédures

Les souris seront greffées avec des cellules leucémiques d’origine humaine par voie intrapéritonéale, intraveineuse (queue) ou sous-cutanée (durée du geste : quelques secondes). Ce geste ne sera réalisé qu’une seule fois. Des prises de sang (50 microlitres maximum) seront réalisées de façon hebdomadaire pour évaluer la prise de greffe (durée du geste : quelques secondes). Des candidats molécules thérapeutiques seront administrées aux souris selon un schéma propre déjà décrit dans la littérature dans le cadre d’autres études sur d’autres cancers ; les doses injectées et les fréquences décrites n’engendrent pas d’effets secondaires néfastes. Différents modes d’injections seront utilisés (en respectant les volumes maximaux associés à chaque voie) : - Intrapéritonéal (quelques secondes) - Intraveineux : sous anesthésie gazeuse ou médicamenteuse (durée quelques minutes entre l’anesthésie et l’injection) - Gavage (quelques secondes)

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à la greffe de cellules tumorales humaines ont été observés et mesurés au cours du projet précédent et ont conduit au développement d’une grille de suivi spécifique bi-hebdomadaire : amaigrissement, ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, perte de poils ou poils hérissés. L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. Les molécules candidates ont toutes déjà été utilisées dans des modèles murins et la quasi-totalité ont fait l’objet de publications scientifiques. Pour la majorité de ces molécules, il n’est pas rapporté d’événement indésirable notable en lien avec leur administration. Quelques-unes ont conduit à une dégradation de l’état des souris imputé à l’apparition d’un syndrome de lyse tumorale en cas d’administration à un stade de prise de greffe avancé ; pour ces molécules, nous privilégierons leur utilisation dans le cadre d’un traitement avant la prise de greffe afin de limiter ce risque et monitorerons de manière plus rapprochée les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car immunodéficients, infectés par le virus HTLV-1 et développant une tumeur.

Remplacement

Hormis les lignées dérivées historiques de cellules d’ATL (lignées TLOMI et MT1) dont on sait que le comportement est éloigné de celui des cellules d’ATL primaires, il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour l’étude de la maladie liée au virus HTLV-1 (conclusion tirée après concertation entre laboratoires travaillant sur cette pathologie et analyse de la littérature). Les molécules que nous utiliserons auront toutes été préalablement testées et validées in vitro sur des cultures de cellules avant leur administration chez la souris. Cependant, cette étude in vitro, qui permettra de fortement limiter le nombre de molécules candidates à tester, ne peut remplacer une étude préclinique sur modèle animal pour tester leur efficacité in vivo.

Réduction

Nous utiliserons une double stratégie de réduction du nombre d’animaux utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un premier temps, toutes les molécules candidates seront testées in vitro sur des cultures de cellules, et seules les molécules ayant démontré une efficacité sur la viabilité des cellules tumorales in vitro seront utilisés dans le cadre de cette expérimentation. Dans un deuxième temps, nous évaluerons l’efficacité des molécules les plus efficaces dans le cadre d’un traitement avant greffe de tumeurs sur souris. Seules les molécules efficaces dans la procédure 2 seront ensuite éventuellement testées dans le cadre d’un traitement curatif (après la greffe), seules ou en association avec une chimiothérapie. Au niveau statistique, le nombre d’animaux prévu pour les procédures 2 et 3 est compatible avec la mise en évidence d’effets expérimentaux forts, ce qui est l’objectif recherché. Une hétérogénéité est attendue entre les différentes lignées (hétérogénéité génétique selon les patients), donc l’analyse des données devrait faire appel à des modèles statistiques spécifiques.

Raffinement

Une grille d’évaluation spécifique ainsi que des points limites spécifiques ont été développés au cours du projet précédent de génération des cellules, et seront utilisés afin de suivre de manière rapprochée et la plus précise possible la pris de greffe chez les animaux, et d’intervenir précocément en cas de signe de souffrance. Les points suivis sont : l’amaigrissement (grâce à l’aspect de la colonne vertébrale, le poids n’ayant aucune signification lors d’une prise de greffe), l’ataxie (perte d’équilibre), des difficultés motrices, le gonflement du ventre, l’aspect du pelage (perte de poils ou poils hérissés). L’apparition d’un dos voussé ou d’un faciès douloureux est également noté. En lien avec les animaliers chargés du suivi, nous avons développé une grille d’intensité (+, ++ ou +++) de ces symptômes conduisant aux points limites des expériences. Toute observation inhabituelle est également répertoriée et évaluée. En cas d’injection de la tumeur par voie sous-cutanée dans dugel, le volume tumoral sera évalué par mesure au pied à coulisse deux fois par semaine.

Choix des espèces

Le projet précédent a permis d’établir qu’un modèle ce cellule était réalisable dans le cadre de l’ATLL sur des souris femelles immunodéficientes, en conservant la plupart des caractéristiques de la tumeur initiale, ce qui en fait un modèle très pertinent pour étudier la maladie HTLV-1 induite et rechercher de nouvelles cibles thérapeutiques. Nous ne disposons pas à ce jour de modèle d’étude plus proche de la maladie initiale et représentatif de l’hétérogénéité clinique et moléculaire de la maladie. Les souris seront âgées de 7 à 15 semaines au moment de l’injection de cellules de patients ATLL (même stade de développement que dans le projet précédent de développement des lignées, et que dans d’autres projets d’études de leucémies/lymphomes). En l’absence d’apparition de signes de souffrance ou d’atteinte d’une prolifération suffisante de cellules cancéreuses dans le sang des souris, les animaux seront mis à mort au plus tard un an après injection.