Procédures modérées

1 920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime riche en graisses pendant seize semaines pour devenir obèses, un protocole de course sur tapis de huit semaines et des tests de tolérance au glucose avec prélèvements de sang répétés. Le porteur ne décrit comme nuisance qu'un risque d'irritation aux points d'injection, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'étude vise à préciser le rôle d'une protéine adipocytaire dans l'obésité, sans bénéfice thérapeutique annoncé au-delà d'une hypothèse.

Objectifs

Ce projet concerne l'étude d'une protéine cible de l'hypoxie et induite en réponse aux stress. Nous étudieorns son implication dans le développement de la résistance à l'insuline induite par un régime riche en graisses et nous déterminerons si la délétion de cette protéine dans les adipocytes potentialise les effets bénéfiques de l’activité physique. Ce projet ne duplique pas d'études déja publiées.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir d'une part, le rôle d'une protéine adipocytaire dans le développement de l'obésité et de la résistance à l'insuline, et d'autre part si son invalidation peut avoir des effets bénéfiques sur le traitement de l'obésité.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines afin d'induire une prise de poids. Les souris seront soumises à un protocole d'exercice d'endurance (tapis de course adapté à la souris) pendant 8 semaines. Certaines souris obèses seront renourries avec un régime normal afin de réverser les effets de l'obésité. Les souris seront soumises à des prélèvements de sang sur souris vigiles lors des tests de tolérance au glucose (GTT) ou à l'insuline (ITT). Lors de ces tests, une goutte de sang est prélevée pour mesurer la glycémie au cours du temps (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes). Un prélévement de sang sur souris vigile sera effectué à la semaine 6, 14, 20, 22, 24 et 28 (max 100µl) de la procédure 1 et à la semaine 6, 20, 26 et 29 de la procédure 2.

Impact sur les animaux

Lors des injections en intra-péritonéale (lors des GTT, ITT ou tamoxifène) il pourrait y avoir un risque d'irritations et d'infection aux zones d'injection.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer les organes.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, nous avons réalisé des études sur des cellules adipocytaires cultivées in vitro et nous avons montré que la protéine d'intérét est impliquée dans le développement de la résistance à l’insuline in vitro. Pour comprendre l’implication de cette protéine chez l’Homme, il est maintenant nécessaire de l’étudier sur l’animal car il n’existe pas de méthodes alternatives permettant de tenir compte de la physiologie et de toutes les interactions existantes entre cellules et organes dans un organisme.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer trop d’animaux en excès. Chaque procédure utilise un nombre d’animaux minimum mais nécessaire à des études statistiques pertinentes. Le nombre d’animaux a été calculé pour limiter les variations inter-individus et atteindre un niveau statistique validé par une analyse prédictive. Les procédures seront répétées 3 fois. Cependant, si une différence statistiquement significative est observée après 2 répétitions, nous ne ferons pas la troisième répétition.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux (par les expérimentateurs ou l'équipe zootechnique), ce qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal-être ou une souffrance.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal facile à utiliser grâce à sa natalité importante, son faible coût d’élevage et notre expertise nous permettant d’avoir des locaux d’hébergements et des conditions d’expérimentation appropriés à cette espèce. D’autre part, la similitude de leur patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet de pouvoir, dans la mesure du possible, extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les données in vivo de la littérature sont réalisées sur des souris et cette espèce nous permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques et génomique et histologique. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. Seules les souris adultes seront utilisées dans ce projet. Pour l’étude du métabolisme, les souris seront mises sous régime alimentaire à 6 semaines. Ceci permet de diminuer la variabilité inter-animaux et donc de réduire les effectifs.

77 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leurs ovaires sont retirés par chirurgie pour reproduire l'ostéoporose post-ménopause, puis elles reçoivent des injections tous les deux jours pendant jusqu'à huit semaines et deux prélèvements de sang. Le porteur admet une mortalité chirurgicale acceptée jusqu'à 10 %, et une mise à mort finale pour analyser les tissus osseux. Le test porte sur une famille de molécules développée avec des chimistes, dont l'effet reste à consolider.

Objectifs

L’ostéoporose est une problèmatique de santé publique. Cette pathologie, qui touche près de 40% des femmes et 15% des hommes de plus de 65 ans dans le monde, se traduit par une perte excessive de la masse osseuse et une diminution de la résistance des os, induisant une augmentation considérable du risque de fractures (377 000 nouvelles fractures dues à l’ostéoporose sont recencées chaque année en France). Il en résulte un important impact pour la société en raison des prises en charges hospitalières et thérapeutiques nécessaires à ces patients. Dans le cadre du développement de traitements contre l’ostéoporose nous avons développé, conjointement avec une équipe de chimistes, une famille de molécules agissant à la fois sur les symptômes directs de la maladie associés au remodelage osseux (pertes osseuses) mais également sur les phénomènes inflammatoires associés. L’objectif de ce projet est donc de consolider les données dores et déjà acquises sur l’effet biologique de ces molécules, en étudiant la restauration du phénotype osseux associé à leurs emplois, dans un modèle murin d’ostéoporose induit chez l’animal par le retrait des ovaires (ovariectomie). Cette approche expérimentale permet de récapituler les changements majeurs intervenant dans le cadre de la survenue de la ménopause et impactant l’homéostasie tissulaire osseuse (ostéoporose post-ménopause). Ce travail permettra donc, à terme, de proposer de nouvelles molécules pour lutter contre l’ostéoporose.

Bénéfices attendus

L’ostéoporose se traite actuellement par des moyens non médicamenteux et médicamenteux. La prise en charge non médicamenteuse fait ainsi appel à l’optimisation de la prise de calcium, le plus souvent d’origine alimentaire, une activité physique adaptée et régulière, couplées à la réduction de tous les facteurs favorisant la perte accélérée du capital osseux et les facteurs favorisant les chutes. Les traitements médicamenteux de l’ostéoporose se basent essentiellement sur des médicaments bloquant la résorption osseuse ou des substituts hormonaux, mais toutes ces approches thérapeutiques doivent être adaptées en fonction de différents facteurs de risques. En traitement de première intention, si certaines molécules bloquent la formation et l’activité des cellules qui dégradent naturellement l'os limitant ainsi la perte osseuse, cette approche thérapeutique ne permet pas de récupérer de la densité osseuse car elle bloque également à terme la reformation osseuse. Par ailleurs de nombreux effets secondaires sont associés à ces différents types de traitements : douleurs musculo-squelettiques et troubles digestifs auxquels s’ajoute un risque de destruction des os de la mâchoire avec certaines molecules. L’approche proposée vise à l’obtention d’une efficacité similaire à celle de ces molécules via des modes d’actions différents, laissant présager de ne pas reproduire leurs effets indésirables principaux, favorisant la prise en charge des patientes souffrant d’ostéoporose post-ménopause.

Procédures

Les animaux recevront une intervention chirurgicale de 30min sous anesthésie générale visant au retrait de leurs ovaires, puis des injections tous les 2 jours pendant 8 semaines au maximum sur animaux vigiles, sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale. Les animaux auront également deux prélèvements sanguins (100µL chacun) à la queue, sous anesthésie générale, le premier en pré-opératoire et le second à 4 semaines post-opératoires.

Impact sur les animaux

Toute approche chirurgicale implique un risque non négligeable de mortalité. Une mortalité en lien avec la réalisation de la chirurgie de 10% est le maximum acceptable au-delà duquel la procédure complète sera abandonnée. Un gonflement, une perte de liquide et une irritation, susceptibles d’engendrer une diminution de l’activité de l’animal, peuvent nuire à la bonne alimentation et donc mener à une perte de poids voire à un comportement de repli. Une légère perte de poids des animaux, classiquement constatée en post-opératoire, est attendue dans les premiers jours.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés suite à la nécessité de réaliser un prélèvement sanguin puis de prélever les tissus osseux et observer la microarchitecture osseuse par scanner et analyses histologiques et immunohistochimiques afin de pouvoir évaluer l'efficacité des traitements.

Remplacement

A notre connaissance il n’y a pas d’alternative non animale efficace pour étudier la perte osseuse induite par chute des taux hormonaux, mimant l’ostéoporose post-ménopause chez l’Homme. Les modèles d’organes isolés ne peuvent pas, à notre connaissance, fournir une réponse pertinente. Les mécanismes complexes de régulation en cascade des différents tissus, chacun contenant plusieurs types cellulaires, et du système immunitaire notamment via la mise en place d’une mobilisation augmentée des cellules résorbant l’os par exemple n’est pas réalisable en dehors de modèles in vivo impliquant un animal complet. Les données sur ces régulations complexes et multifactorielles sont encore trop minimalistes en l’état actuel des connaissances scientifiques pour envisager une modélisation numérique susceptible de répondre à notre hypothèse.

Réduction

Des analyses à mi-parcours avec dispositif d’arrêt de l’expérience si l'expérmentation ne peut statistiquement pas donner de résultat seront appliquées. Une logique d’arrêt de la procédure est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe des points limites, la procédure sera interrompue. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables sur le plan statistique, un nombre minimum d’animaux sera utilisé. Nous proposons donc d’effectuer une première série de 5 animaux par groupe, avec une analyse statistique intermédiaire permettant de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour obtenir une puissance statistique satisfaisante dans la limite de 10 animaux par groupe au maximum. Des tests statistiques adaptés aux effectifs de cette étude seront ensuite utilisés.

Raffinement

Lors de leur arrivée à l'animalerie, une période de quarantaine d’une semaine sera appliquée afin que les souris s'acclimatent à leur nouveau lieu d'hébergement. Les cages seront enrichies d’abri et roues ainsi que de matériaux (morceau de coton ou de sopalin, tube en carton…) permettant aux animaux d'améliorer leur milieu. A chaque intervention les animaux seront anesthésiés si nécessaire afin de limiter le stress et la douleur. Du fait de l’approche chirurgicale, une douleur post-opératoire sera anticipée avec l’injection préventive et curative d’antidouleurs. Un suivi rapproché (2 fois par jour) sera effectué sur les trois jours suivants la chirurgie et dès les premiers signes d’inconfort détectés. Le suivi des animaux se fera tous les deux jours lors des injections de façon à contrôler l'absence de points limites tout au long de l'étude. Les molécules choisies seront injectées sur animaux vigiles sauf détection de stress ou d’inconfort des animaux qui nous inciterai à réaliser ce geste sous anesthésie générale (afin de réduire le stress des animaux) tous les deux jours pendant 28 à 56 jours. Le poids des animaux sera mesuré à chaque temps de traitement. Les animaux seront finalement euthanasiés sous anesthésie générale gazeuse.

Choix des espèces

La réalisation de ces études chez la souris via le modèle est décrite et validée. Les expériences antérieures de l’équipe ont donné des résultats exploitables concernant les traitements dans d’autres champs d’application. La souris étant un animal de petite taille, son hébergement en groupe sociaux de plusieurs individus est facilité au sein de notre établissement utilisateur en regard du matériel à disposition. Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines à l’initiation de la procédure.

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie abdominale de quarante minutes qui dérive le canal lymphatique, puis un gavage d'une formule riche en oméga-3 et une collecte de lymphe pendant six heures en cage individuelle. La dérivation étant irréversible, tous sont tués en fin de protocole, leurs organes servant aussi à d'autres analyses. Le porteur relie ce travail à des recommandations nutritionnelles et à la "valorisation" de matrices alimentaires pour les consommateurs.

Objectifs

Une meilleure compréhension de la biodisponibilité des nutriments permet de fixer des recommandations nutritionnelles appropriées pour un effet santé. Les données scientifiques relatives à l'amélioration de la biodisponibilité des oméga-3 sont éparses. Ce projet vise à déterminer l'ensemble des facteurs susceptibles d'améliorer l'absorption intestinale et la biodisponibilité des oméga-3 pour des effets santé avérés. Il s'agit d'un sujet de fond qui permettra d'acquérir des données scientifiques originales utiles à la valorisation des nutriments lipidiques dans des matrices alimentaires innovantes ciblant la santé et le bien-être des consommateurs.

Bénéfices attendus

Ce sujet permettra d'acquérir des données scientifiques pour valoriser des nutriments lipidiques d'interet tels que les omega-3 pour des bienfaits santé et le bien-être des consommateurs. Egalement ces données permettront d'acquérir des arguments scientifiques pour appuyer les recommendations et besoins nutritionnels chez l'Homme. C'est un sujet de santé publique en lien avec les recommendations nutrtionelles.

Procédures

La technique chirurgicale de dérivation du canal lymphatique est réalisée sur les animaux et dure environ 40 minutes sous anesthésie générale. Les animaux reçoivent une seule intubation gastrique de l'une des formules lipidiques riches en oméga 3. Cette manipulation ne dure pas plus de 30 secondes , sous la réalisation de personnel qualifié. Les animaux sont ensuite placés en cage individuelle où ils disposent à volonté d'eau tout au long de l'expérimentation. La lymphe s'écoule et recueillie au travers de la canule placée a demeure vers un tube entreposé dans la glace sur les 6 heures suivantes.

Impact sur les animaux

La technique de micro chirurgie implique une incision large de l'abdomen. Après la pose d'une sonde à demeure, l’animal est suturé. Au reveil cela peut induire une douleur à l’animal, ce qui est anticipé par l’injection en amont et après la chirurgie d’un anti douleur ( analgésique). En outre, le recueil de la lymphe, nécessite une immobilisation de l'animal dans une cage individuelle, le temps de l'expérimentation (6 heures post prandial). Pour éviter tout stress, les animaux sont isolés au calme sous une température de 24°C. Enfin, l’administration des formules lipidiques, par gavage gastrique peut induire un stress chez l’animal. Ces volumes sont calculés de sorte à ne pas dépasser 1mL par animal pour limiter le temps de manipulation. En outre, la manipulation de gavage est réalisée par les techniciens de laboratoire, formés, habilités à le faire et qui en l’occurrence maitrisent parfaite le geste technique pour limiter tout stress à l’animal.

Devenir

L'intervention permet de dériver le canal lymphatique. Or après dérivation il n'est pas possible de replacer le canal lymphatique dans le circuit général, et sans quoi les animaux ne peuvent pas vivre "naturellement". Ceci implique l'euthanasie de l'ensemble des animaux en fin de protocole expérimental.En outre les organes sont également recueillis en vue d'autres études et pour limiter le nombre d'animaux en rechercher expérimentale pour du prélevement d'organes.

Remplacement

L'absorption intestinale et le métabolisme des lipides ne peuvent être directement estimés chez l'Homme. Le rat est le modèle de choix dans ce type d'étude car il les systèmes digestif et intestinal sont semblables à ceux observés chez l'Homme. Les méthodes alternatives type cultures cellulaires ne peuvent être envisagées car elles ne présentent pas à ce jour les mêmes caractéristiques que celles observées chez le rat et l'Homme. Notamment les cellules intestinales utilisées en recherche sont issues de cellules cancéreuses et ne présentent pas les caractéristiques impliqués dans l'absorption intestinale des lipides chez l'Homme et le rat.

Réduction

La taille de la population cible est calculée à partir de données avec une marge d’erreur, acceptable de 5% et un niveau de confiance : 95% . Cette ta taille l’échantillon est calculée via un logicile qui prend en compte les données. En conséquence, une taille d'échantillon totale de 8 rats par groupe a été obtenue.

Raffinement

Pour éviter toute douleur liée à l'intervention, les animaux recoivent un analgésique pour prévenir de la douleur juste avant l'intervention. Une grille de suivi et d'évaluation de la douleur est mise en place pour chaque animal en post chirurgie. Selon le score obtenu dans cette grille, de nouvelles injections d'analgésique peuvent être réalisées afin de limiter la douleur aux animaux. Les animaux sont placés dans des cages individuelles jusqu'au réveil où ils disposent d'eau à volonté, dans une pièce d'isolement au calme, dont la température est maintenue à 24°C pour leur éviter tout stress.

Choix des espèces

Le modèle rat est le modèle le plus utilisé dans les études d'absorption et de métabolisme des lipides dans l'organisme, en vue d'une extrapolation chez l'Homme. Ce modèle a l'avantage de possèder les mêmes systèmes digestif et enzymatiques que ceux observés chez l'Homme. D'autre part depuis près de 30 ans nous avons cumulés des données obtenues à partir de ce modèle, ce qui nous permet de poursuivre nos investigations sur la base de précédentes études mais aussi de mettre en régard nos données à celles d'autres travaux de recherche à l'internationnal. Les animaux sont reçus à 8 semaines au stade de jeunes adultes. Nos études reflètent l'absorption de lipides d'interet chez les adultes ( pour la population saine adulte en général) et nos animaux sont des jeunes mâles adultes. Les animaux sont acclimatés 1 semaine avant de rentrer dans le protocole expérimental.

688 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une hypothyroïdie leur est induite par un régime carencé et un antithyroïdien, associée à une chirurgie cérébrale et à un hébergement en obscurité constante ou en cycle jour-nuit atypique, en cage individuelle. Le porteur attend une bradycardie, une température abaissée et un état d'anxiété supérieur à la normale, évalué par des tests comportementaux, avant la mise à mort pour prélèvement de tissus. Les débouchés annoncés pour les patients, une luminothérapie ou des thérapies comportementales, restent conditionnés à la mise en évidence d'un dérèglement de l'horloge interne.

Objectifs

L'hypothyroïdie correspond à un déficit en hormones thyroïdiennes. Toutes causes confondues, l'hypothyroïdie touche près de 10% de la population. Les patients souffrent de fatigue chronique, de bradycardie, d'une sensibilité accrue au froid, et de prise de poids. Ils présentent aussi des troubles liés à l'humeur tels qu'irritabilité, anxiété ou dépression, dont l'étiologie reste mal comprise. Plusieurs observations sur des patients et des modèles animaux suggèrent que l'hypothyroïdie pourrait perturber l'horloge circadienne. Cette horloge biologique coordonne les rythmes physiologiques et comportementaux avec le cycle jour-nuit. Comme le dérèglement de l'horloge cause des troubles de l'humeur tels que ceux observés chez les patients hypothyroïdiens; il est tentant de supposer un lien de causalité entre ces troubles et les rythmes biologiques au cours de l'hypothyroïdie. Nous souhaitons tester cette hypothèse dans un modèle murin d'hypothyroïdie induite.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de mieux comprendre l'étiologie des troubles de l'humeur souvent associés à l'hypothyroïdie, et d'envisager des approches thérapeutiques au-delà du traitement hormonal de substitution. En effet, la prise d'hormone thyroïdienne est efficace pour le traitement de l'hypothyroïdie sur le long terme, mais définir et ajuster la dose optimale de chaque patient s'avère souvent très long et laborieux. La mise en évidence d'un dysfonctionnement de l'horloge circadienne ouvrirait de nouvelles possibilités d'accompagnement des patients dysthyroïdiens pendant cette période d'ajustements hormonaux, par exemple par la mise en place d'une luminothérapie ou de thérapies comportementales pour resynchroniser les rythmes biologiques.

Procédures

Induction d'une hypothyroïdie par régime hypo-iodé et traitement anti-thyroïdien. Maintenue pendant 2 à 3 semaines. Prélèvement unique de 3µl de sang, à la pointe de la queue de souris vigiles. Chirurgie cérébrale ciblée, sous anesthésie générale. Hébergement en cycle jour-nuit atypique (11.5 heures de lumière, 11.5 heures d'obscurité; ou obscurité constante pendant 2 semaines). Hébergement en cage isolée, avec contacts sociaux visuels.

Impact sur les animaux

La présence d'un agent anti-thyroïdien dans l'aliment hypo-iodé le rend moins appétant. Les souris mangent moins mais continuent à prendre du poids, et se stabilisent à environ 90% du poids des souris nourries avec l'aliment contrôle. Les souris hypothyroïdiennes présentent aussi une température corporelle légèrement abaissée par rapport aux souris contrôles (uniquement pendant leur phase d'inactivité), ainsi qu'une bradycardie (ralentissement de la fréquence cardiaque d'environ 25%). Comme cela est le cas chez les patients, nous nous attendons aussi à un état d'anxiété supérieur à la normale, qui sera évalué au travers des tests comportementaux. Le fonctionnement de l'horloge interne sera testé par mesure de l'activité locomotrice volontaire en absence de repères temporels (suppression du cycle jour-nuit). Cette étape requiert un hébergement des souris en cages individuelles équipées d'une roue d'activité, dans l'obscurité constante pendant une vingtaine de jours. Un prélèvement sanguin unique sera réalisé pour évaluation du statut thyroïdien par dosage hormonal. Cela nécessite la collecte d'une goutte de sang suite à une incision à la pointe de la queue (

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement de tissu.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour étudier l'impact d'une perturbation systémique (l'hypothyroïdie) sur le fonctionnement du cerveau et ses conséquences en terme de comportement. La souris constitue un excellent modèle d'étude des rythmes circadiens chez les Mammifères, pour lequel la physiologie générale, les comportements, et le fonctionnement de l'horloge interne sont suffisamment bien décrits pour servir de référence dans le cadre de ce projet. Notre objectif sur le long terme est d'établir un modèle mathématique suffisamment riche et prédictif pour anticiper le devenir de l'horloge circadienne dans différentes situations physiopathologiques en complément/remplacement des modèles animaux. Les données que nous obtiendrons dans ce projet s'inscrivent dans cette ambition et serviront à préciser et compléter une version initiale du modèle que nous avons proposé.

Réduction

La taille des groupes expérimentaux impliqués dans les tests comportementaux a été estimée par un calcul de puissance a priori (n=26 souris par groupe). Chaque souris sera évaluée de façon longitudinale dans plusieurs tests, permettant de réduire le nombre total d'animaux. Pour la procédure d'imagerie in vivo, chaque souris sera testée sous régime contrôle et sous régime hypothyroïdien. Chaque souris étant son propre contrôle, le nombre d'animaux impliqués sera réduit. Notre expérience démontre qu'il faut opérer 6 à 8 souris pour obtenir n=4 souris avec un signal suffisamment fort afin de décrire le fonctionnement de suffisamment de neurones horloges dans une condition donnée (un minimum de 10 neurones visibles dans le champ optique par animal.

Raffinement

Dans un souci de raffinement du protocole, nous avons préféré mettre en oeuvre un modèle d'hypothyroïdie induite plutôt que de réaliser une ablation chirurgicale de la glande thyroïde. Cette approche ne nécessite pas d'adaptation particulière des conditions d'élevage. Toutefois, l'apport de matériel de nidification sera renforcé afin de permettre aux souris hypothyroïdiennes (en légère hypothermie) de mieux maitriser la température de leur environnement. Les animaux seront habitués à être manipulés par la personne en charge des tests comportementaux. En vue d'évaluer le statut thyroïdien de façon la moins invasive possible, nous avons développé un protocole de dosage ultra-sensible de l'hormone TSH, à partir d'un volume extrêmement faible de sang total (3 µl, à comparer avec 50 à 100 µl pour les kits commerciaux). La chirurgie préparatoire à la procédure d'imagerie est conduite sous anesthésie générale, avec médication post-opératoire pendant 48 heures. Toutes les souris hébergées en cage isolée conserveront un contact visuel avec d'autres congénères. L'hébergement dans les cages à roue constitue un enrichissement très apprécié, et la mesure de l'activité locomotrice volontaire fournira un index de l'état général des souris : toute souris parcourant une distance inférieure de 50% à celle parcourue par les souris contrôles sera pesée et observée. En cas de perte de poids supérieure à 10% du poids initial, de prostration ou de poil hérissé, les souris auront accès à de la nourriture hydratée et/ou un anti-inflammatoire non-stéroïdien pendant 24 à 72 heures. Nous ne nous attendons pas à un degré de souffrance justifiant la mise à mort des animaux, mais si une souris devait atteindre un poids inférieur de 15% à son poids initial, alors elle sera mise à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix dont l'horloge circadienne et la physiologie thyroïdienne reposent sur les mêmes principes moléculaires et cellulaires que l'espèce humaine. Cette espèce donne accès à un large éventail d'outils génétiques et moléculaires pour manipuler les systèmes biologiques (ex : nous utiliserons ici des lignées exprimant des allèles modifiés de gènes de l'horloge), ou pour mesurer l'activité neuronale par imagerie in vivo. Jeunes adultes de 6-7 semaines en début d'expérimentation.

1 124 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une douleur chronique leur est infligée par chirurgie de la patte, entretenue de cinq à douze semaines, avec jusqu'à vingt-cinq tests comportementaux par animal pour la mesurer. Le porteur indique que cette douleur ne peut pas être soulagée puisqu'elle est l'objet même de l'étude, menée pour tester un plasma riche en plaquettes. Les bénéfices annoncés pour les patients, prévention et soulagement de douleurs neuropathiques et post-chirurgicales, restent renvoyés au conditionnel et à un usage clinique futur.

Objectifs

La douleur neuropathique est par définition consécutive à une lésion ou une maladie affectant le système somatosensoriel. Chez la plupart des patients, elle a une origine périphérique, par exemple à la suite d'une lésion des nerfs périphériques. La douleur post-chirurgicale chronique quant à elle est définie comme une douleur qui persiste au-delà de 2 mois après la chirurgie sans autre cause potentielle de douleur telle qu’une infection. Généralement chroniques et invalidantes, ces 2 grands types de douleurs, fréquemment rencontrés dans la population, affectent fortement la qualité de vie des patients et ont un impact socio-économique important par leurs répercussions sur la vie professionnelle. La prise en charge de ces douleurs constitue donc un enjeu important de santé publique. D'un point de vue thérapeutique, ces douleurs sont cependant difficiles à traiter. Certains antidépresseurs et anticonvulsivants sont actuellement les meilleures thérapies disponibles mais leur utilisation clinique est limitée par des effets indésirables. Il en est de même pour les douleurs post-chirurgicales chroniques habituellement traitées avec des opiacés qui entraînent de nombreux effets indésirables et parfois même une addiction. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements et/ou approches thérapeutiques pour soulager ces types de douleurs chroniques. Dans ce contexte, un nouvel outil thérapeutique autologue a été développé ces dernières années : l'injection de plasma riche en plaquettes (PRP) qui est un concentré sanguin plaquettaire autologue contenant une concentration naturelle de facteurs de croissance et de cytokines. Cette technique, largement utilisée en rhumatologie ou en médecine du sport reste encore peu utilisée dans le domaine de la douleur chronique. L'intérêt médical de cette préparation est que les plaquettes concentrées vont favoriser une augmentation des facteurs de croissance libérés au niveau du site de lésion, favorisant ainsi le processus de guérison. Cependant, le mécanisme d'action du PRP reste peu clair. Pour aller au-delà des connaissances actuelles, nous proposons d'évaluer le potentiel thérapeutique du PRP dans un modèle murin de douleur neuropathique induite par une compression du nerf sciatique, de généraliser cette évaluation à une autre étiologie de douleur couramment rencontrée : la douleur post-chirurgicale et d'étudier les mécanismes d'action sous-jacents.

Bénéfices attendus

Nous postulons que le PRP pourrait non seulement avoir un potentiel thérapeutique dans le soulagement de la douleur neuropathique installée, mais pourrait également être bénéfique dans la prévention de son initiation et de son maintien. Le PRP pourrait également être efficace pour traiter d’autres étiologies de douleurs comme les douleurs post-chirurgicales qui sont actuellement mal soulagées par les analgésiques acutels (patients non répondeurs ou présentant trop d'effets indésirables). Nous espérons, avec ce projet, proposer un outil thérapeutique pour empêcher le développement des douleurs neuropathiques et post-chirurgicales. A l’issue de ce projet, nous espérons pouvoir proposer ce traitement chez l’Homme en clinique afin de prévénir et de soulager les douleurs neuropathiques et post-chirurgicales. Cette avancée pourrait également permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique allant de 5 semaines pour la douleur post-chirurgicale à 12 semaines maximum pour la douleur neuropathique. Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Un groupe d’animaux recevront du plasma riche en plaquettes (PRP) au niveau du site de lésion pendant la chirurgie et un autre groupe d’animaux recevront du PRP par administrations lombaires sous anesthésie gazeuse (5 administrations maximum espacées de 24h, la durée d’une injection intrathécale est de 5 min environ) une fois la douleur chronique installée. Ces animaux subiront également plusieurs tests comportementaux (maximum 25 tests par animal avec un délai de 24h minimum entre chaque test) afin d’évaluer leur douleur (durée des tests allant de 2 min à 20 min avec l’habituation). La durée totale du projet sera de 14 semaine pour la douleur neuropathique et de 7 semaines pour la douleur post-chirurgicale.

Impact sur les animaux

Il y a présence de douleur qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Mais l'objectif de l'étude est d'évaluer l'effet analgésique préventif et curatif du PRP, celui-ci devrait donc avoir un effet bénéfique sur la douleur. Suite à la chirurgie neuropathique ou incision de la patte, une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie. Les chirurgies neuropathiques ou incisionnelles vont induire une réponse inflammatoire classique et attendue qui permet la mise en place de ces modèles. Certains animaux vont subir des injections intrathécales lombaires. Les animaux subiront toute une batterie de tests comportementaux nociceptifs sur lesquels ils gardent le contrôle (retrait de la patte).

Devenir

A l’issu de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour prélèvements.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l'analyse de l’effet thérapeutique du PRP dans un modèle de douleur neuropathique ainsi que dans un modèle de douleur post-opératoire nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 14 souris mâles et 14 souris femelles, le risque de variabilité lié à l’activité intrinsèque du PRP étant inconnu et non négligeable. Un calcul statistique a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d'analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la Société du Bien-Etre Animale (SBEA) de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, font de la souris un modèle pertinent. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie du crâne d'environ une heure trente pour l'implantation de capteurs intracérébraux, puis deux tests comportementaux et un régime cétogène, afin de suivre le glucose et le lactate du cerveau chez l'animal éveillé. Le porteur choisit le rat plutôt que la souris pour sa taille, seule capable de porter le dispositif miniature fixé sur la tête. Il présente les effets neuroprotecteurs du régime au-delà de l'épilepsie comme des hypothèses, l'apport immédiat restant la mise au point d'un système de mesure sans fil.

Objectifs

Le jeûne induit des adaptations métaboliques qui produisent des effets bénéfiques sur la santé, notamment mentale. Au fil des jours de jeûne, l’organisme puise son énergie dans les réserves de graisses du tissu adipeux et les corps cétoniques issus de leur dégradation, remplacent en partie le glucose dans le sang et le cerveau. Cet état métabolique, appelé cétose, peut-être reproduit par un régime dit cétogène, riche en graisse et dépourvu de sucres. Certains effets neuroprotecteurs du jeûne sont reproduits par le régime cétogène, notamment l’effet anti-épileptique, d’autres sont encore à l’état d’hypothèse, comme des effets anti-neurodégénératifs et protecteurs vis-à-vis de la maladie d’Alzheimer ou de Parkinson. Cependant, les effets de ce régime sur le métabolisme cérébral sont encore mal connus. Malgré l’absence de sucres dans la nourriture ingérée sous régime cétogène, le foie reste capable de produire du glucose. Cependant l’évolution des concentration intracérébrales de glucose au cours d’une diète cétogène reste inconnue, tout comme celle du lactate. Or le glucose et le lactate sont les principaux métabolites énergétiques du cerveau et la compréhension des effets du régime cétogène sur le métabolisme cérébral commence par une connaissance de ses effets du le glucose et le lactate cérébraux. Le but de ce projet est de monitorer les concentrations interstitielles de glucose et de lactate dans le cerveau au cours des premiers jours d’un régime cétogène grâce à des biocapteurs électrochimiques. Ce projet est aussi un défi technologique car la détection du glucose et du lactate repose sur des capteurs dont la durée de vie in vivo n’excède par 12h. Un nouveau procédé de fabrication qui permet d’obtenir une sensibilité stable pendant 5 à 7 jours a été mis au point. Ce projet permettra aussi de valider le concept d’un monitorage de plusieurs jours chez l’animal vigil, grâce à ces nouvelles microélectrodes.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ce projet permettra d’évaluer comment la diète cétogène affecte le métabolisme cérébral. D’un point de vue méthodologique, ce projet permettra de mettre au point un système sans fil innovant, embarqué sur la tête de l’animal et qui rendra possible les études du métabolisme cérébral chez l’animal vigil. Sachant que l’anesthésie générale perturbe largement le métabolisme et notamment la régulation du glucose et du lactate intracérébral, cette innovation permettra une meilleure compréhension des mécanismes régulant le métabolisme cérébral. L’effet du régime cétogène sur le métabolisme cérébral une thématique importante du laboratoire pour laquelle un autres financement a déjà été obtenu de la FRC, la possibilité d’étudier ces effets chez l’animal vigil sans anesthésie représente un progrès considérable.

Procédures

Une chirurgie initiale durant environ 1h30 avec implantation de capteurs intracérébraux Deux tests comportementaux chez l'animal vigil et modification de l’alimentation. Les animaux seront hébergés individuellement pour pouvoir suivre leur prise alimentaire.

Impact sur les animaux

Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à une chirurgie au niveau du crâne qui peut occasionner des douleurs qui seront traitées par l’administration de buprénorphine pendant les premières 24h, puis de carprofène pendant 12h supplémentaires. Ensuite, l’animal sera soumis à des protocoles des stimulations sensorielles très peu invasives. Le régime cétogène présente aussi peu d’effets secondaires, ceux-ci incluent une constipation ou des diarrhées peu fréquentes. Sur l’ensemble du projet la nuisance principale représente le réveil après la chirurgie du crâne, ce qui justifie un niveau de gravité modéré.

Devenir

La survie des animaux impliquerait une deuxième chirurgie pour la désimplantation des électrodes et probablement des souffrances consécutives à l'intervention

Remplacement

Le régime cétogène induit des adaptations lentes du métabolisme dès le changement de régime alimentaire. Ces adaptations impliquent l’ensemble de l’organisme : intestins, foies, pancreas, circulation sanguine, reins, cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir recours à l’animal vivant pour étudier ce phénomène. Le remplacement par des approches in vitro n’est pas possible actuellement.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre des analyses statistiques fiables. Au cours de ce projet, les analyses statistiques consisteront à comparer les données obtenues pendant la phase de diète standard 36h-48h après chirurgie, à celles obtenues après 3 jours de diète cétogène. Des tests de t de Student appariés seront appliqués après une analyse de normalité par le test de shapiro-Wilk. Dans le cas d’échantillons de données non normales, des tests de Mann-Whitney seront pratiqués. Les effectifs sont calculés sur la base de 10 animaux par groupe. Des mâles et des femelles seront inclus à part égale dans l’étude et nous disposerons de 5 comparaisons pour pouvoir détecter d’éventuelles différences liées au sexe. Les analyses statistiques seront pratiquées dès que six animaux auront été enregistrés. S’ils sont significatifs ou si des calculs de taille d’échantillon par des test beta révèlent qu’aucune différence claire n’apparaît, les expériences seront interrompues sans utiliser l’effectif annoncé au départ, ce qui peut réduire l’effectif.

Raffinement

Tout au long de ce projet, les animaux seront hébergés par paire dans des cages enrichies avec des matériaux de nidification et des baguettes de bois à ronger, afin d’améliorer leur bien-être général. Pendant la phase de réveil après chirurgie, le bien-être de l’animal sera évalué par une grille de score et la douleur sera traitée par des analgésiques. Tout au long du projet, des interactions régulières avec la cellule bien-être et la vétérinaire référente permettront éventuellement d’intégrer des mesures supplémentaires permettant d’améliorer le confort des animaux (par exemple un allongement de la période d’administration des analgésiques au-delà des premières 36h).

Choix des espèces

La plupart des études sur les effets du régime cétogène ont été effectuées chez le rongeur, qui représente le modèle animal de prédilection dans ce domaine, ce qui permet de s'appuyer sur un corpus bibliographique conséquent. Par rapport à la souris, le rat présente une taille et une masse musculaire plus importantes. Seul cet animal pourra porter le poids du potentiostat miniature évalué à moins de 10 g. Rats adultes de 10 semaines (environ 330g chez les mâles et 240g chez les femelles). L'étude concerne des animaux adultes

6 000 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois avec adjuvant, et des prélèvements de sang pouvant aller jusqu'à quatre par jour, pour produire des anticorps destinés à des tests de diagnostic et des médicaments. Hébergés seuls alors que l'espèce est sociale, ils sont tués en fin de protocole, un prélèvement de sang final important rendant leur maintien en vie impossible selon le porteur. Celui-ci reconnaît que la production d'anticorps in vitro existe mais affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques).

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 2 mL répartis sur 4 à 8 sites maximum pour la voie sous-cutanée, 0.5 mL sur 4 sites maximum pour la voie intra-musculaire, 5 mL/kg pour la voie intraveineuse, 2mL sur 40 sites maximum pour la voie intra dermique. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique mais seront au maximum espacés d’un à deux jours sur une durée totale d’un mois. En cas de durée supérieure à un mois, la structure en charge du bien-être animal sera contactée pour évaluer le bénéfice / risque. Concernant les prélèvements, les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale de 5 minutes. Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à une anesthésie générale par injection d’un anesthésique par voie intraveineuse ou à une anesthésie locale répétée par application d’une pommade anesthésiante. Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, la contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Il est en effet impossible de : réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre protocole d’immunisation, réutiliser ces lapins dans le cadre d’un autre projet effectué par l’établissement utilisateur. Lors du prélèvement final de la procédure, un volume significatif de sang est récupéré et cela rend incompatible la réutilisation de l’animal.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

Également, à travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les lapins sont hébergés individuellement en gardant un contact visuel et olfactif avec leurs congénères. De l’enrichissement est mis à leur disposition (balles de cellulose et/ou foin, anneau en plastique, mousqueton…) Un cycle jour nuit est présent en zone d’expérimentation (12h/12h). Les animaux sont observés de manière quotidienne par du personnel formé et compétent et pesés toutes les semaines. Durant cette pesée, un examen approfondi de l’état clinique des lapins est effectué par le technicien (e.g. : vérification des points d’injection, maux de patte éventuels, dentition…). Également, durant ce processus, des caresses aux animaux sont prodiguées. Des points limites intermédiaires associés à des actions spécifiques et des points limites terminaux sont en place. Par exemple, en cas de perte de poids ≥ 20% sur une semaine, une nourriture appétante est proposée à l’animal. Également, en cas d’apparition de certains signes cliniques (exemples : masses sans douleur pour l’animal, abcès sans lésion, fécalome) des protocoles de soins validés par un vétérinaire sont prodigués aux animaux. Certains gestes douloureux (injections intra-dermique) sont réalisés sous anesthésie générale et les injections répétées sont effectuées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisées que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique. A chaque abord d’une voie vasculaire, un point de compression sera effectué le temps suffisant pour assurer l’arrêt du saignement. Une observation de l'animal sera réalisée au retour dans sa cage pour s’assurer de sa récupération immédiate. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Choix des espèces

Le lapin est l'animal le plus utilisé pour la production d’anticorps étant l’espèce animale la plus adaptée pour cela, de par la production de volumes suffisants d'antisérum qualitatif et à titre élevé. Cela permet donc d’utiliser moins d’animaux pour l’objectif scientifique requis. Age minimum des lapins : 10 semaines. A cet âge, les lapins ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.

86 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une injection intracérébrale de vecteurs viraux pour surproduire la neuromélanine, puis jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie et un essai de traitement par ultrasons, avant mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur indique que l'injection peut provoquer douleur et perte de poids, et qu'un syndrome parkinsonien progressif peut mener à l'apathie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit la complexité du cerveau nécessaire à l'étude de la maladie de Parkinson.

Objectifs

La neuromélanine, qui joue un rôle dans le développement de la maladie de Parkinson, est principalement contenue dans une structure cérébrale appelée substance noire qui est fortement impactée dans la maladie. L’imagerie par résonance magnétique permet de mesurer in vivo le volume de certaines structures cérébrales, incluant la substance noire, ainsi que de mesurer la présence de neuromélanine. L’objectif du projet est de mesurer le niveau de neuromélanine par imagerie par résonance magnétique dans un modèle rat de la maladie de Parkinson afin de mieux comprendre le lien entre cette molécule et le développement de la maladie. Un essai thérapeutique par stimulation mécanique des tissus par ultrasons focalisés transcrâniens sera également réalisé dans l’objectif de réduire la concentration intracellulaire de neuromélanine et de ralentir le processus dégénératif.

Bénéfices attendus

Ce projet participera à la recherche contre la maladie de Parkinson avec de nombreux bénéfices à court et long-terme. Dans un premier temps, les résultats de la première étude permettront de mieux comprendre le développement de maladie de Parkinson en étudiant la corrélation entre les niveaux de neuromélanine dans la substance noire, les symptômes moteurs et les caractéristiques histopathologiques des neurones dopaminergiques. Selon notre hypothèse, un seuil de neuromélanine pathologique sera établi à la suite de cette étude. Dans un second temps, notre projet permettra le développement et l’évaluation in vivo du traitement par ultrasons transcrâniens focalisés sur un modèle pertinent. Nous attendons de ce traitement qu’il ralentisse l’apparition du syndrome parkinsonsien chez les rats. Nos données présentant plusieurs fenêtres thérapeutiques seront alors une base solide pour la conception d’un essai clinique. En supplément de ces bénéfices directs, le projet permettra une meilleure caractérisation du modèle rat utilisé. Ces résultats, qui pourront être valorisés à travers des publications dans des revues scientifiques, seront utiles à toute la communauté scientifique travaillant sur ces problématiques. Par ailleurs, les images acquises en imagerie par résonance magnétique et les échantillons cérébraux issus de rats modèles de la maladie de Parkinson à différents âges, pourront par la suite être réutilisés dans de futurs projets.

Procédures

Le projet inclut les interventions suivantes : - Injection intracérébrale de vecteur viraux induisant la surproduction de neuromélanine : 86 rats (tous les animaux). Sera pratiqué une seule fois par animal, sous anesthésie générale avec prise en charge analgésique pour une durée de 30 min. - Imagerie par résonance magnétique sensible à la neuromélanine : Sera pratiqué sur 86 rats entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sous anesthésie générale pour une durée de 2h30. - Test comportemental (observation du rat dans une cage propre) : Sera pratiqué entre 1 et 5 fois par rat en fonction des groupes expérimentaux (temps de maintien plus long), avec un minimum d'1 mois entre deux sessions. Pratiqué sur animaux vigiles pour une durée de 5 min. - Traitement par ultrasons focalisés : Pratiqué sous anesthésie générale en même temps qu'une session d'imagerie de 30 min sur 30 rats 1 fois par semaine pendant 3 semaines.

Impact sur les animaux

Les rats recevront une injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la tyrosinase humaine. Suite à cet acte, les rats sont susceptibles de montrer des signes de douleur et une perte de poids qui devrait durer une semaine maximum. Les sessions d’imagerie et de traitement ne nécessitent pas de chirurgie et aucune nuisance n’est attendue après réveil. Enfin, les tests comportementaux prévus (observation d’un rat dans une cage propre pendant 5 min) seront réalisés sur des rats vigiles. Ces tests pourraient générer un léger stress qui devrait s’estomper rapidement après retour du rat dans sa cage d’hébergement. Le phénotype des rats exprimant la tyrosinase humaine n’est pas considéré comme dommageable dans la limite d’âge attendue. Le développement du syndrome Parkinsonien chez les rats exprimant la tyrosinase humaine, très progressif, pourrait cependant mener à terme à une perte de poids due à une apathie et inactivité des rats.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leurs tissus cérébraux et d’analyser les neurones dopaminergiques de la substance noire. Ces données nous permettront de mieux comprendre les liens entre le niveau de neuromélanine, les troubles moteurs, et la dégénérescence neuronale dans ce modèle de la maladie de Parkinson.

Remplacement

Il n’existe à ce jour aucun moyen de modéliser in vitro ou in silico la complexité du cerveau nécessaire à l’étude des mécanismes à l’origine de la maladie de Parkinson.

Réduction

Un calcul de puissance statistique d’après nos précédents résultats a montré un nombre minimal de 8 rats nécessaires dans chaque groupe expérimental pour pouvoir répondre à la question scientifique posée. Afin de garantir que la perte d’un animal pour une quelconque raison ne puisse pas compromettre les analyses statistiques de l’étude, ce nombre a été porté à 10 rats par temps d’observation (5 temps x 10 rats = 50 rats). La conception de l'étude permet de réduire le nombre d’animaux utilisés en effectuant un suivi longitudinal plutôt que l’établissement d’une nouvelle cohorte pour chaque âge étudié. De plus, afin de garantir le bon déroulement de l’étude principale , celle-ci sera précédée d’une étude préliminaire permettant d’optimiser les protocoles d’injection et d’imagerie. Un nombre de 6 rats est prévu dans cette procédure pour pouvoir ajuster notre protocole avant le lancement de l’étude comportant un nombre important d’animaux, dans le cas où le protocole initial ne serait pas satisfaisant pour répondre à la question scientifique. De plus, cette étude principale permettra d’identifier la fenêtre temporelle la plus pertinente pour l’évaluation d’une thérapie. Cela permet de réduire le nombre d’animaux qui auraient dû être utilisés pour tester le traitement à différents temps post injection. Au total un nombre de 86 rats sont donc inclus dans les procédues expérimentales.

Raffinement

Les rats seront hébergés par 2 en portoir ventilé, dans un environnement à température contrôlée, avec cycle diurne-nocturne de 12h. L’eau et la nourriture seront fournies ad libitum. Un environnement enrichi par un système de nidification périssable renouvelé lors du change hebdomadaire sera fourni aux animaux. Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant toute manipulation des animaux lors de leur arrivée. Les animaux seront ensuite examinés quotidiennement par le responsable du projet. Une surveillance et une fréquence de pesée accrues seront mises en place en cas d’approche d’un point limite, en particulier en cas de perte de poids corporel constatée lors du suivi hebdomadaire. Lors des injections intracérébrales, les rats âgés de deux mois seront anesthésiés et recevront une analgésie 20 minutes avant l’injection intracérébrale. La température corporelle des animaux sera maintenue avec un tapis d’eau chaude circulante thermo-régulée. De l’ocrygel sera placé sur les yeux pour éviter tout dessèchement. Une crème analgésique locale sera également appliquée au niveau des points de contact du cadre stéréotaxique. Suite aux actes chirurgicaux, une prise en charge analgésique sera réalisée pour la prise en charge aigüe, puis des analgésiques seront mélangés à la boisson pendant 24h. Le suivi hebdomadaire du poids corporel des rats nous permettra d’instaurer un point limite de nuisance au bien-être des animaux. Suite aux actes chirurgicaux, ou en cas de perte de poids des animaux, une surveillance accrue sera mise en place avec un suivi renforcé à trois fois par semaine. La plaie sera surveillée. En cas d’infection, la plaie sera nettoyée et une pommade cicatrisante sera appliquée quotidiennement. L’utilisation d’ultrasons transcraniens est une mesure de raffinement en elle-même puisqu’elle permet une approche thérapeutique sans ouverture crânienne. Lors des examens d'imagerie, les rats seront anesthésiés et fixés par un cadre stéréotaxique au lit de l’appareil d'imagerie. Une analgésie locale sera appliquée par gel au niveau des oreilles pour minimiser la douleur induite par le cadre stéréotaxique.

Choix des espèces

Les rats sont de bons modèles pour l’étude du cerveau par imagerie par résonance magnétique, car leur taille permet de les examiner dans des imageurs à résonance magnétique à haute performance, avec de nombreux modèles pathologiques disponibles. De plus, de nombreux tests comportementaux permettent d’évaluer les altérations cognitives et motrices dans ces modèles. En particulier, le modèle utilisé permet de reproduire de nombreux aspects de la maladie de Parkinson. Les animaux seront utilisés à l’âge de deux mois, au début de l’âge adulte, idéal pour l’injection des vecteurs viraux et passage à l’imagerie par résonance magnétique.

96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le parasite de la leishmaniose est injecté dans l'oreille, puis les lésions sont suivies pendant plusieurs mois, le porteur indiquant que des ulcérations peuvent se développer et durer jusqu'à douze semaines. Il étudie le rôle d'un récepteur immunitaire dans cette maladie et situe le bénéfice, une thérapie, à long terme. Il affirme que les mécanismes inflammatoires ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un organisme entier.

Objectifs

Les leishmanioses sont des pathologies causées par le parasite leishmania qui font de plus en plus de ravages autour du monde. Aujourd’hui plus d’un milliard de personnes vivent dans des zones endémiques et peuvent donc contracter le parasite et développer la maladie. Les manifestations cliniques des leishmanioses cutanées chez l’homme peuvent varier de nodules, pustules, ulcères, jusqu’à atteindre des défigurations au niveau du visage et parties externes du corps. La nature de la réponse immunitaire dans la physiopathologie des leishmanioses cutanées joue un grand rôle dans la résolution ou la persistance de la maladie. La reconnaissance du pathogène par le système immunitaire se fait grâce à des recepteurs présents sur les cellules immunitaires. L’objectif principal de notre projet est d’étudier l’interaction du parasite avec un récepteur immunitaire pour comprendre le rôle que joue ce dernier dans cette pathologie et suivre la réponse immunitaire qui peut en résulter.

Bénéfices attendus

Les leishmanioses cutanées peuvent être contractées par l’homme de tout âge, comme par l’animale. Plusieurs tentatives ont été faites pour développer des traitements efficaces mais à ce jour il n’existe pas de traitement effectif pour cette pathologie. Il devient donc de plus en plus urgent de se pencher sur cette pathologie car cette dernière risquerait de se propager rapidement dans les prochaines années. Cela serait dû à plusieurs facteurs dont le réchauffement climatique. L’objectif à long terme est de développer une thérapie efficace en ciblant des récepteurs présents sur des cellules immunitaires afin de réduire et limiter ainsi l’invasion parasitaire.

Procédures

-1 Injection dans l'oreille pendant 15 secondes -Suivi hebdomadaire de l'évolution des lésions pendant 15 mois

Impact sur les animaux

Suite à l’injection de parasites, les souris peuvent présenter une douleur modérée, une inflammation localisée au site de l’injection. Par la suite, des ulcérations peuvent se développer à partir de la semaine 2-3 et peuvent durer jusqu’à 12 semaines. La manipulation de souris pour le suivie s’effectuera à partir du moment de l’injection jusqu’à la semaine 20 post injection.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocol expérimental afin de réaliser diverses prélèvements (tissus, sang, organes...)

Remplacement

Ce projet s’intéresse à la compréhension du rôle du récepteur CD32a dans la réponse inflammatoire dans le cas des leishmanioses cutanées. La pathologie étant cutanée, le développement de lésion est le symptôme dominant observé dans cette pathologie. Ainsi, les mécanismes physiologiques et immunologiques complexes aboutissant à cette inflammation ne peuvent être étudiés de façon intégrée que dans un contexte d’organisme entier, dans des modèles in vivo.

Réduction

Un total de 96 animaux est demandé pour la réalisation de ce projet permettant de réaliser 3 études de 6 groupes (groupes contrôles et groupes infectés) avec 6 animaux par groupe (pour les groupes infectés) et 4animaus (pour les groupes contrôles) sur une durée de 2 ans. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable de 5. La nourriture, et l’eau de boisson seront fournies. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être ainsi que de l'enrichissement (batonnet de bois, coton, maison en cellulose). Au moment de leur entrée, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation (une semaine) et seront habituées à la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière-obscurité (12h – 12h), d’une température (20 - 24°C). Les souris seront surveillées tous les jours pour vérifier l’absence de souffrance. Toutes les injections sont réalisées sur animaux sous anesthésie gazeuse général et avec un analgésique. Les injections sous la peau seront réalisées avec grand soin pour éviter d’atteindre le muscle. On a mis en place une fiche de scoring comme point limite fafin de prendre en charge l’animal au cas où il y a atteinte à son bien-être et pour éviter la souffrance animal.

Choix des espèces

Deux modèles murins sont choisis pour étudier le rôle du récepteur, des souris sauvages qui n’expriment pas le récepteur et une lignée transgénique de souris exprimant ce récepteur. La souris adulte, agée entre 6 et 8 semaines, est le modèle le plus utilisé dans l'étude de la leishmaniose cutanée puisque c'est un mammifère et qu'il est aussi bien connu. En plus de cela, le comportement de la souris est bien étudié ce qui nous permet de lui administrer les soins nécessaires pour limiter et réduire sa douleur.

21 porcelets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont inoculés par voie veineuse avec la bactérie Streptococcus suis, puis soumis à des écouvillonnages des amygdales et des prises de sang hebdomadaires, avant mise à mort pour prélèvements. Le porteur indique que l'infection peut provoquer de la fièvre, des troubles articulaires et des symptômes méningés, et prévoit d'ajuster la dose à la dose minimale infectante. Il étudie la transmission de cette bactérie entre porcelets et présente le porc comme la "seule espèce adaptée", en tant que cible naturelle de l'agent.

Objectifs

Ce projet est dans le prolongement d’une précédente saisine dont l’objectif était d’évaluer l’efficacité d’un autovaccin (visant une streptococcie à sérotype 9) administré à des truies en gestation sur leurs descendances. Si nos investigations ont permis de mettre en évidence une transmission horizontale directe de Streptococcuis suis sérotype 9 entre les porcelets issus de truies inoculées avec la bactérie et/ou vaccinées avec un autovaccin, la transmission de la bactérie entre des porcelets Exempts d’organismes pathogènes spécifiés (EOPS) issus de truies elles mêmes EOPS n’a à ce jour jamais été étudiée. Ces connaissances sont nécessaires afin de valoriser le travail réalisé depuis plus de 3 ans par notre laboratoire sur cette bactérie responsable de troubles méningés caractéristiques chez le porc. L’objet de cette présente saisine est donc d’évaluer la transmission horizontale directe de Streptococcus suis sérotype 9 chez des porcelets EOPS issus de truies EOPS. Une seule procédure expérimentale sera conduite. L’expérimentation sera menée sur 21 porcelets au total répartis dans 4 groupes : un groupe de porcelets inoculés par voie veineuse avec une souche de sérotype 9 (Groupe « Inoculé »), un groupe de porcelets placés au contact direct des porcelets du groupe « Inoculés » (Groupe « Contact »), un groupe de porcelets inoculés hébergés dans une animalerie indépendante (Groupe « Contrôle ») et un groupe de porcelets témoins hébergés dans une animalerie indépendante (Groupe « Témoin »).

Bénéfices attendus

Streptococcus suis est une bactérie dite zoonotique, ou transmissible à l’Homme, répandue dans les élevages porcins. Elle est responsable de graves affections (méningite, septicémie et polysérites) pouvant entraîner des pertes économiques importantes (réduction des performances zootechniques des animaux affectés, détérioration de la qualité des carcasses, élévation du taux de pertes et de saisies à l’abattoir, etc.). Cette bactérie est généralement enveloppée d'une capsule recouverte d'antigènes. En fonction de la nature de ces antigènes, 29 sérotypes ont été décrits au sein de l'espèce Streptococcus suis. Le sérotype le plus souvent impliqué dans les infections à Streptococcus suis (ou Streptococcie) en France est le sérotype 2. Cependant, une émergence du sérotype 9 a été observée ces dernières années sans que l’on puisse réellement l’expliquer. Le contrôle de l’infection des animaux par cette bactérie est généralement difficile et les mesures de prévention aléatoires. En élevage, l’antibiothérapie constitue un des élements de l’arsenal thérapeutique. Cependant, son utilisation doit être limitée en raison de résistances développées par les bactéries vis-à-vis de certains antibiotiques. Une des méthodes alternatives pour lutter contre Streptococcus suis repose sur la vaccination et plus précisément, dans la mesure où aucun vaccin commercial n’est disponible, sur l’utilisation d’autovaccins. Ces derniers sont préparés à partir de germes pathogènes isolés d’un sujet malade d’un élevage et sont administrés aux animaux de ce même élevage. Les autovaccins sont utilisés pour prévenir les infections à Streptococcus suis chez les truies ou les porcelets sans que leurs efficacités ne soient clairement démontrées. Quelles que soient les stratégies utilisées, médicamenteuse ou vaccinale, les porcs ayant survécu à l’infection et séjournant dans l’élevage, continuent à héberger la bactérie au niveau des voies respiratoires supérieures et des amygdales (portage amygdalien). Ces porcs cliniquement sains et porteurs de Streptococcus suis représentent un danger pour leurs congénères mais également le personnel en contact avec les animaux (éleveurs, vétérinaires, personnel d’abattoir). Acquérir des connaissances sur la transmission de cette bactérie pathogène apportera des éléments pour comprendre la dynamique de contamination au sein de groupes d’animaux et ainsi aider à mieux gérer cette zoonose dans les élevages.

Procédures

Tous les animaux (n=21) seront inoculés par voie veineuse avec soit du diluant stérile soit l'inoculum bactérien : une seule fois au cours de la procédure, et en moins de 10 secondes. Pour ce qui concerne les prélèvements sur animal vigile, des écouvillonnages amygdaliens seront réalisés sur chacun des porcs une fois avant le jour de l’inoculation, puis 1 fois par semaine pendant 3 semaines (soit 4 interventions). A chaque jour de prélèvement, un écouvillonnage amygdalien sera effectué sur les porcs inoculés par Streptococcus suis et les porcs contacts et témoins (n=21 animaux). Des ponctions sanguines seront réalisées une fois par semaine à compter du sevrage jusqu’à la fin de l’expérimentation pour suivre la séroconversion et deux fois au cours de la première semaine suivant l’inoculation (suivi de la bactériémie), soit 7 interventions au total. Afin de limiter la contention des animaux, les écouvillonnages amygdaliens seront réalisés en même temps que les ponctions sanguines. La réalisation d’un écouvillonnage amygdalien et d’une prise de sang est effetuée en moins de 30 secondes.

Impact sur les animaux

L’infection expérimentale avec Streptococcus suis est généralement symptomatique chez les porcelets de 6 semaines. Ils peuvent présenter de l'hyperthermie, des troubles articulaires et des symptômes méningés. Cependant la sévérité clinique peut être limitée lorsque la dose d’inoculation est ajustée à la dose minimale infectante. C’est la dose que nous utiliserons dans cette procédure expérimentale. Toutefois, un soin particulier sera apporté au suivi clinique quotidien de chaque porc. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’inoculation. Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin. Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour. Dans les cas où l’infection conduirait à une altération importante de l’état de santé, à une atteinte des points limites préalablement définis, les porcs seront mis à mort afin qu’ils ne souffrent pas.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par une méthode permettant la récolte de prélèvements de bonne qualité.

Remplacement

L’expérimentation consistant à étudier la transmission horizontale de l’agent infectieux par contact direct, il n’y a aucune possibilité de remplacement du modèle animal par une étude in vitro ou in silico.

Réduction

L’expérimentation conduite sera faite dans le respect de l’éthique et du bien-être des animaux. Ce protocole expérimental est pensé de façon à minimiser le nombre de porcs utilisés tout en menant une étude suffisamment puissante pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Nos études antérieures montrent qu’il est indispensable d’avoir au minimum trois porcelets inoculés et des groupes de 6 porcelets pour considérer la variabilité inter-individuelle des animaux pour avoir une pression d’infection suffisante pour reproduire une colonisation des amygdales et/ou la maladie. Dans la mesure où nous avons déjà mis en évidence une exacerbation de l’infection lorsque des animaux inoculés sont en contact direct avec d’autres qui ne le sont pas, un groupe « Contrôle » constitué uniquement d’animaux inoculés est inclus dans cette procédure expériementale. Ce projet impliquera au total 21 porcs EOPS.

Raffinement

Les porcs seront élevés en groupe stable, bénéficieront d’un enrichissement social et auront à leur disposition des objets manipulables (jouets type boule fixée à l’extrémité d’une chainette, tourniquet et mordilles). Ils seront nourris et abreuvés à volonté. Les animaux feront l’objet d’un suivi clinique rapproché. Ils seront examinés a minima au cours de deux visites quotidiennes pendant les 10 premiers jours suivant l’inoculation. Des visites supplémentaires seront instaurées autant que de besoin en fonction de l'évolution de l'état de santé des animaux. Au-delà de ces 10 jours, si l’état de santé des animaux le permet, ils seront examinés une fois par jour. En cas d’atteinte de points limites préalablement définis, les porcs seront mis à mort afin qu’ils ne souffrent pas. Un système de récompense sera proposé aux porcs une fois l’ensemble des prélèvements réalisés afin d’associer un moment positif aux manipulations opérées pour les besoins du projet (distribution de sirop de grenadine grâce à une seringue drogueuse).

Choix des espèces

Le porc est l’espèce cible de Streptococcus suis. Il est donc la seule espèce adaptée aux objectifs et aux conditions de la procédure expérimentale. Les animaux impliqués dans la procédure auront en moyenne 4 semaines de vie au début de l’étude et entre 6 et 7 semaines de vie au moment de l’inoculation. Le modèle expérimental a été précédemment validé à cet âge ce qui permet de s’affranchir d’une étape de validation.