Procédures modérées

624 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules de cancers pédiatriques qui forment des métastases au foie, elles reçoivent jusqu'à sept injections d'anticorps testés et des prélèvements de sang sous anesthésie, avant d'être tuées pour évaluer l'efficacité thérapeutique. Le porteur indique que les effets indésirables liés à la croissance tumorale touchent surtout les groupes témoins non traités. Il décrit un test in vitro concluant sur ces anticorps mais présente le modèle animal comme "indispensable et non substituable" avant les essais chez l'enfant.

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité d’anticorps thérapeutiques ou des anticorps bispécifiques correspondants dans un modèle de souris greffées avec des cellules de cancers pédiatriques. Cette possibilité de combiner les anticorps ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Les versions chimériques (=construit pour être toléré par la souris) de ces anticorps ont déjà été testés lors de précédents projets dans un modèle de souris (immunocompétentes) optimisé et ont prouvé leur efficacité et leur bonne tolérance dans ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser un modèle de souris immunodéficientes afin de tester les versions humanisées (=construit pour être administré chez l'Homme) de ces anticorps thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le meilleur anticorps thérapeutique sera sélectionné et développé pour des essais cliniques. Ces nouvelles biothérapies (anticorps humanisés, anticorps bispécifiques) sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.

Procédures

Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Injection intraveineuse sur animal vigile (7 injections maximum, 3 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + injection, soit 21 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (4 prélèvements maximum, 2 minutes maximum chacun + prélèvement, soit 8 minutes au total).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liée à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration des traitements (injections intraveineuse) Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation de métastases hépatiques, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités par les anticorps (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs métastatiques). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe 1 attachée à cette demande de projet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutique des anticorps et de réaliser également des analyses complémentaires.

Remplacement

Il existe à ce jour un test in vitro nommé ADCC (Test de cytotoxicité à méditation cellulaire) qui permet de contrôler que l’anticorps peut reconnaitre et lier la cellule cancéreuse cible et provoquer sa destruction via des cellules effectrices. Nous avons réalisé ces tests sur les candidats anticorps humanisés notifiés dans cette saisine et les résultats se sont avérés probants. Cette étude donc nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. L’optimisation du modèle syngénique dans un précédent projet, nous a permis d’optimiser les injections, de prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe

Raffinement

Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévères qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 3 à 5 souris par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de lidocaïne sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, l’O-Acétyl GD2 est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 8 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 8 semaines avaient également été utilisées dans des traitements similaires avec d’autres anticorps.

120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus diabétiques, ils reçoivent des injections quotidiennes d'une molécule tenue secrète, la "myokine X", subissent des prises de sang répétées à la queue, un test de mémoire en piscine de Morris et une exposition au froid à 4 °C pendant 24 heures, avant d'être tués pour analyse des organes. Le porteur attend une perte de poids, des désordres intestinaux et une détérioration de la queue liés aux prélèvements. Il compare sa molécule, en cours de brevet, au liraglutide déjà utilisé chez les patients et affirme "indispensable" le recours à l'animal.

Objectifs

Le diabète est une maladie chronique qui se déclare lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d’insuline (diabète de type 1, DT1), ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser correctement l’insuline qu’il produit (diabète de type 2, DT2). Ainsi, dans les 2 cas, il y a un trouble de l’utilisation et du stockage du glucose apporté lors des repas, entrainant une hyperglycémie. Cette dernière peut au fil du temps provoquer des maladies cardiovasculaires, des néphropathies, des altérations cognitives (perte de mémoire) … La régulation de la fonction sécrétoire des cellules à insuline et leur survie jouent un rôle central dans la progression du diabète. Le muscle squelettique constitue l’organe le plus sensible à l’insuline de l’organisme et joue donc un rôle majeur dans l'équilibre glycémique de l'organisme puisqu’il constitue le site majoritaire de stockage du glucose sous l'action de l'insuline. Nous avons mis en évidence l’existence d’une communication croisée entre le muscle squelettique et les cellules à insuline par le biais de facteurs appelés myokines. Nous avons montré in vitro (îlots pancréatiques de Rat et Humain) et in vivo, dans un modèle de transplantation d’îlots chez le rat DT1, qu’une myokine, appelée myokine X, permettait d'améliorer la survie, la fonction des îlots pancréatiques et l’équilibre glycémique des animaux diabétiques transplantés. Par ailleurs, dans une autre étude in vivo réalisée récemment, nous avons montré qu’une injection quotidienne de notre Myokine X chez un modèle de rat DT2, permettait de prévenir l’apparition de cette pathologie. En particulier, les premiers résultats montrent un impact intéressant de la myokine X sur le tissu adipeux brun. Ce dernier représente un intérêt important de par sa capacité thermogénique qui améliore l’homéostasie glucidique grâce à une importante consommation des substrats dont le glucose. Le nom de cette myokine, représentant un intérêt thérapeutique important pour le patient diabétique, reste anonyme car un brevet est en cours de dépôt. Désormais, le premier objectif de cette demande est de déterminer si notre Myokine X pouvait également avoir un effet curatif sur un modèle de Rat DT2 ainsi que sur les complications citées précédemment. Le second objectif de cette étude est de comparer les effets de notre Myokine X avec les effets du Liraglutide, qui est aujourd’hui un antidiabétique largement utilisé chez l’Homme mais qui peut présenter certains effets secondaires.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice de ce projet est d’obtenir un effet curatif du DT2 par la Myokine X. De plus, cette étude permettra de comparer les effets de notre molécule avec ceux du Liraglutide, qui est très largement utilisé chez le patient diabétique. Néanmoins, le Liraglutide peut présenter un certain nombre d’effets indésirables tels que des désordres intestinaux qui peuvent amener le patient à vouloir arrêter son traitement. Par ailleurs, nos études précédentes in vivo menées chez le rat diabétique n’ont pas montré de tels désordres. Ainsi, notre traitement pourrait constituer une biothérapie innovante pour le DT2.

Procédures

Afin d’évaluer l’évolution du diabète, différents tests seront effectués sur l’ensemble des animaux pour suivre la glycémie. Tout d’abord, celle-ci sera mesurée quotidiennement et l’acte ne durera que quelques secondes. Par ailleurs, nous complèterons ce suivi par une prise de sang hebdomadaire afin de mesurer des marqueurs en liens avec la glycémie. La durée de la contention pour la prise de sang est de moins de 2 minutes. Pour évaluer le fonctionnement de l’ensemble des organes impliqués dans la régulation de la glycémie, un test de sensibilité à l’insuline sera réalisé la moitié des animaux et sur l’autre moitié un test de tolérance au glucose sera effectué. Ces deux tests dureront chacun 2h et avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l’eau ad libitum). De plus, nous évaluerons les effets de notre traitement sur les altérations cognitives pouvant être induites par le diabète à l’aide du test de la piscine de Morris. Ce test durera 2 min et sera réalisé 3 fois de suite pendant 3 jours au cours de 3 sessions réparties au cours des 15 semaines de l’étude sur 64 animaux. Enfin, nous étudierons sur 40 animaux l’effet de notre traitement sur l’activation du tissu adipeux en réponse au froid. Pour cela, les animaux seront exposés au froid (4°C) pendant 24h.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids lié au développement du diabète. - Stress lié aux injections quotidiennes de Myokine X et de Liraglutide. - Désordres intestinaux liés au Liraglutide. - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude. - Hypoglycémie. - Hypothermie post test comportemental. - Hypothermie au cours de la mise au froid 4°C–8°C. - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques répétées. - Hémorragie liée au prélèvement sanguin. – Inflammation au point d’injection due aux injections répétées.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Le diabète est une pathologie complexe où de nombreux organes sont impliqués (pancréas, muscles, tissu adipeux…) et communiquent entre eux, ce qui ne peut être modélisé in vitro. De plus, l’impact de la Myokine X a déjà été évalué in vitro sur des ilots pancréatiques. Il est maintenant primordial d’évaluer ses effets dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostaie glucidique sont présents. Pour cela, le recours à une étude in vivo est donc indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux qui sera utilisé par groupe est déterminé selon une étude récente qui a démontré que seulement 75% des rats ZDSD devenait diabétique. Ainsi, pour pallier à ce pourcentage d'obtention de rats diabétiques, à ces variations glycémiques et afin d'obtenir des données statistiquement analysables, nous utiliserons 15 rats par groupe. Par ailleurs, ce nombre est basé sur notre longue expérience obtenu au cours des nombreuses études métaboliques réalisées au laboratoire. Cette étude nécessitera donc 120 rats. De plus, la stratégie d’expérimentation est établie tenant en compte la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Par ailleurs, afin de réduire le nombre d’animaux et le stress que pourrait engendrer l’ensemble des procédures sur chaque animal, une attention particulière est portée sur le fait que tous les animaux ne seront pas utilisés pour l’ensemble des procédures. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque procédure a été défini d’après notre expérience dans le domaine du diabète ainsi que d’après la littérature.

Raffinement

Le raffinement a principalement lieu au niveau de l’hébergement avec un enrichissement des cages à l’aide de cylindres en PVC rouge, qui servent de refuge aux animaux et permet ainsi de diminuer leur stress, ainsi qu’à l’aide de bâtons en bois qui leur permettent de reproduire leur comportement naturel de rongeurs. Le raffinement est aussi présent dans le suivi des animaux réalisé quotidiennement durant toute la durée de l’étude, avec l’utilisation d’une grille d’évaluation adaptée aux procédures, qui permet de détecter rapidement la souffrance, la douleur chez les animaux et de mettre en place les traitements adaptés. Ainsi, les animaux développant un diabète après alimentation enrichie en gras seront traités par insulinothérapie. Un suivi quotidien sera réalisé afin de mesurer la glycémie afin d’ajuster les doses d’insuline à injecter. Si les animaux présentent des signes de douleur, des antalgiques seront administrés en fonction du degré déterminé.

Choix des espèces

Le modèle de rat diabétique utilisé est celui qui mimique le mieux le syndrome métabolique, le diabète de type 2 et l'obésité trouvé chez l’Homme. Les autres modèles de rongeurs actuellement disponibles pour le diabète et le syndrome métabolique manquent de translationnalité à la condition humaine. Ainsi, nous utiliserons ce modèle de rat. L’utilisation en parallèle de rats sains servira de contrôle afin d’évaluer l’impact de notre molécule en situation non pathologique. Ceci nous permettra de comprendre les mécanismes d’action physiologique impliqué notamment dans la régulation de la glycémie de notre Myokine X, encore à élucider à ce jour. Nous utiliserons des rats âgés de 16 semaines au commencement du protocole (Arrivée dans notre animalerie à 14 semaines donc 2 semaines d’habituation). En effet, le DT2 apparaitra à partir de 16 semaines de vie chez les rats de ce modèle. Ainsi, comme le projet consiste à étudier l'effet curatif de notre Myokine X sur le DT2, il faut que les animaux aient au moins 16 semaine de vie avec un statut diabétique établi avant le commencement des traitements.

56 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées puis soumises à un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt-cinq injections sous-cutanées d'un analogue hormonal, un test de tolérance au glucose par gavage avec prélèvements à la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le porteur affirme que le régime carencé n'induit ni faim ni stress anormal chez les jeunes souris. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit un "organisme entier" en contexte de malnutrition et rattache les retombées à la prise en charge des enfants.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études récentes ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté par l'appauvrissement en nutriments et qu'une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permettait de compenser partiellement le retard de croissance dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits dans le contexte de la malnutrition, un déficit en protéines pendant l'enfance résulte en des déficits neurocognitifs, métaboliques et immunitaires sévères qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations métaboliques exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique chronique, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique dans ces conditions, sont encore mal connus. Des études portant sur les cellules productrices d’hormones de l’intestin (appelées entéroendocrines), ont permis d’identifier une sous-population de cellules particulièrement impactée par la malnutrition protéique juvénile. Le but de ce projet est 1) D’évaluer comment les effets bénéfiques d’une intervention probiotique en contexte de malnutrition sont dépendants de ces cellules et 2) de caractériser plus finement les modifications de la signalisation d’une hormone produite par ces cellules dans un contexte de malnutrition protéique juvénile par rapport à un régime contrôle. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d’un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l’étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C’est pourquoi cette étude nécessite l’expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s’agit d’un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi que, pour certains animaux, à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. La moitié des animaux recevra 5 jours par semaine pendant la durée de la procédure une injection sous-cutanée d’un analogue hormonal (soit 25 injections au total). L’autre moitié des animaux recevra, une seule injection sous-cutanée d’un antagoniste de cette même hormone. Un test de tolérance au glucose durant 120 minutes sera réalisé sur les animaux vigiles (voie orale par gavage) et 7 prélèvements sanguins de 2-3 μL (5 prélèvements toutes les 15 minutes puis 2 prélèvements toutes les 30 minutes) et 3 prélèvements de 20 µL post gavage seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer respectivement la glycémie ou l’insulinémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé en fin de procédure. Pour cela, 30 minutes après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. Le prélèvement en veine porte durera deux minutes. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 56 animaux femelles appartenant à deux procédures.

Impact sur les animaux

Ces procédures devraient entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de ces procédures a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’agressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poids sera surveillé de façon régulière et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière quotidienne. Le test de tolérance au glucose implique des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection sous-cutanée peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée. Pour la procédure impliquant des injections sous-cutanées de sémaglutide : les injections sous-cutanées peuvent induire de l’inflammation, les points d’injection seront surveillés quotidiennement.

Devenir

L'ensemble des femelles ayant subi la procédure expérimentale seront mises à mort à la fin de la procédure. En effet, la mise à mort est nécessaire afin de réaliser des prélèvements de sang et d'organes qui seront analysés par la suite.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition, nécessaire pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité entre individus. Le nombre de 7 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité au vu de nos résultats précédents. Dans une optique de réduction, l'ensemble des organes impliqués dans le métabolisme, mais qui ne seront pas directement utilisés dans le cadre de ce projet, seront conservés au congélateur pour d'éventuelles analyses ultérieures. Le protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée en pesant la nourriture présente pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. A la suite des injections, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection sous-cutanée ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés cinq fois par semaine et pourront donner lieu à l’application locale d’antiseptiques le cas échéant. Des points limites suffisamment prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Les animaux recevront une analgésie et une antalgie avant le prélèvement en veine porte.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). L'objectif du projet est d'étudier la signalisation GLP-1 en condition de malnutrition pendant la période juvénile. Il faut donc utiliser des animaux juvéniles après leur sevrage.

15 chiens beagles sains vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, huit réutilisés ensuite pour des travaux pratiques et sept proposés à l'adoption. Chaque animal reçoit trois traitements oraux successifs et subit de nombreuses prises de sang, jusqu'à neuf par journée sur cinq cinétiques réparties sur douze semaines, ainsi que des prélèvements d'urine sous échographie. Le porteur décrit un inconfort limité aux ponctions veineuses répétées et prévoit une sortie d'étude si les veines s'abîment. Il justifie le recours au chien sain par la nécessité d'écarter toute maladie rénale préexistante et compare un antihypertenseur récent, le telmisartan, au bénazépril.

Objectifs

Les maladies rénales chroniques (MRC) sont fréquemment rencontrées chez le chien. Certaines conditions fréquemment associées aux MRC, comme l’hypertension artérielle ou la protéinurie, sont des facteurs péjoratifs en termes de progression de la maladie et nécessitent une prise en charge médicale spécifique. Le traitement repose majoritairement sur des molécules avec divers modes d'action sur la fonction rénale comme le bénazépril ou plus récemment le telmisartan. Néanmoins, ces molécules peuvent avoir des effets secondaires pouvant contre-indiquer leur utilisation et/ou compliquer le suivi des patients atteints de MRC. Pour autant, l’effet du telmisartan sur la fonction rénale n’a pas encore été décrit chez le chien sain, ni n’a été comparé au bénazérpil plus couramment utilisé en cas de MRC à ce jour. Les objectifs de ce projet sont : 1. de décrire l’impact d’un traitement oral d’une semaine à base de telmisartan ou de bénazépril (versus placebo) sur la fonction rénale de chiens sains ; 2. de documenter la persistance dans le temps, après l’arrêt des traitements, des modifications éventuellement constatées ; 3. de comparer les variations observées chez les chiens sains recevant le telmisartan, le bénazépril ou le placebo.

Bénéfices attendus

Cette étude permettrait une meilleure compréhension et la caractérisation des effets cliniques et biologiques inhérents au telmisartan chez un patient sain, en comparaison avec la molécule historique (bénazépril) utilisée dans le contexte des maladies rénales chroniques chez le chien, et contre placébo. Cela permettrait également, dans un contexte clinique réel (insuffisance rénale chronique par exemple) de mieux comprendre et anticiper les variations biologiques présentes lors du suivi de ces patients, comme inhérentes au traitement ou à l’évolution naturelle de la maladie.

Procédures

Administration de 3 traitements successivements : une fois/jour pendant 1 semaine pour les traitements 1 et 2, deux fois par jour pendant 1 semaine pour le traitement 3. Administration d'un marqueur de la fonction rénale par voie intraveineuse : 5 fois soit à chaque début de cinétique plasmatique. Prélèvements sanguins : 9 prélèvements sur une journée * 5 cinétiques réparties sur 12 semaines. Prélèvements urinaires : un à J0 (avant traitement), J7 (fin traitement 1), J28 (fin sevrage 1), J35 (fin traitement 2), J56 (fin sevrage 2), J63 (fin traitement 3), J84 (après traitement).

Impact sur les animaux

Les chiens pourront être soumis à un risque de stress et de douleur lors de la réalisation des prises de sang et d’urines, minimisés par la réalisation d’une contention efficace permettant la réalisation rapide du prélèvement, à l’utilisation d’aiguilles et seringues stériles à usage unique et par un personnel compétent. Les prélèvements d'urine seront réalisés uniquement sous contrôle échographique. L’innocuité de cette procédure a déjà été démontrée et justifie sa réalisation dans l’étude présentée. Au cours de chaque journée de prélèvement, 9 prises de sang seront réalisées avec des volumes totaux de sang prélevés ne dépassant pas 13 mL par journée. Aucun changement majeur dans l’environnement des Beagles ne sera réalisé.

Devenir

Les animaux pourront être réutilisés pour la prochaine sessions de Travaux Pratiques du Service de Physiologie (procédures légères) ou proposés à l'adoption.

Remplacement

Cette étude ne peut être réalisée in vitro compte tenu des interactions métaboliques entre les reins et les autres organes de l’organisme ainsi que de la complexité de la fonction rénale évaluée dans cette étude. Il est nécessaire de travailler avec des chiens sains afin de s’affranchir de l’influence d’une maladie rénale pré-existante sur les variables d’intérêt et donc afin de réaliser cette étude en l’absence de facteur confondant.

Réduction

Les effectifs nécessaires ont été prédéterminés en fonction des données existantes et selon des tests adaptés de puissance statistique.

Raffinement

Les procédures réalisées sur les chiens ne sont pas risquées et peu invasives. La source principale d’inconfort correspond à la réalisation de plusieurs prises de sang sur la journée. Pour limiter la gêne liée à ces actes, seules des personnes expérimentées réaliseront les prélèvements sanguins. De plus, chaque prise de sang sera accompagnée de l’application d’Hémoclar sur la veine jugulaire. Si un chien présente un hématome trop important, la veine contro-latéral pourra être utilisée. Par ailleurs, une sortie d’étude sera considérée si les veines sont considérées trop abîmées et source d’inconfort significatif pour l’animal. La tolérance des prises de médicaments sera évaluée par un bilan sanguin hebdomadaire afin de prévenir l'apparition d'effets secondaires et être en mesure d'écarter l'animal de l'étude avant tout signe d'inconfort ou de douleur.

Choix des espèces

L’étude est conduite sur des chiens qui représentent la principale espèce susceptible de bénéficier des IECA et/ou du telmisartan en pratique clinique. Peu de données sont actuellement disponbile sur l’efficacité comparée de ces deux traitements chez le chien. Le chien d’expérimentation est donc un excellent modèle, directement transposable aux chiens présentés en pratique dans un contexte de maladie rénale chronique. Animaux adultes. Les jeunes animaux (< 1an) ne sont pas inclus compte tenu des différences d’intervalles de référence connues chez les animaux en croissance et de la durée de l’étude s’étalant sur plus d’un mois. Le risque de mettre en évidence des variations dues à la croissance serait alors un biais difficile à compenser. Par ailleurs, épidémiologiquement, les très jeunes adultes sont les moins représentés parmi les animaux présentant des affections rénales.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection unique dans la veine de la queue destinée à faire répliquer le virus de l'hépatite D, certaines développant des tumeurs du foie avant d'être tuées pour prélever le foie et le sang. Le porteur affirme que ces tumeurs n'affectent guère l'animal, le foie étant peu innervé, et qu'il les collecte avant qu'elles ne gênent. Il indique avoir mené le maximum d'expériences sur lignées cellulaires et présente le passage in vivo comme nécessaire à l'étude de l'inflammation hépatique.

Objectifs

Le virus de l’Hépatite D (VHD), infecte le foie humain et cause de profondes modifications de l’organe. Une co-infection avec le virus de l’hépatite B (VHB) mène souvent au développement d’une cirrhose puis d’un cancer du foie (carcinome hépatocellulaire). Ce cancer, dont l’incidence est en constante augmentation, constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde, du fait d’un manque de traitement efficace. Bien qu’il existe un vaccin qui protège contre le VHB et VHD, les personnes déjà infectées (environ 20 millions de personnes dans le monde infectées par le VHD) n’ont aucune option thérapeutique. Le but de notre projet est de développer un modèle de réplication du VHD chez la souris afin de : 1- étudier les perturbations du foie liées à la réplication de ce virus, notamment déterminer les perturbations de la cellule infectée par le virus, l’hépatocyte. 2- évaluer dans ce modèle la pathologie causée par des virus de la même famille, découverts récemment dans plusieurs espèces animales (rongeur et serpent pour ce projet).

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie causé par le virus de l'hépatite D. Ils pourront aussi aider à mieux évaluer les pathologies qui pourraient être causées par les virus de la même famille (retrouvés chez les rongeurs ou les serpents), ce qui n’a jamais été évalué chez l'animal. Finalement, à plus long terme, le développement de ce modèle pré-clinique pourrait contribuer à accélérer le développement d’antiviraux très attendus, qui inhiberaient la réplication de cette famille de virus. Trouver des antiviraux efficaces contre cette famille de virus reste un besoin médical de première importance, sachant qu’aucune molécule actuelle n’arrive à éliminer complètement la réplication du VHD chez les patients infectés.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection dans la veine caudale (15 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets sont, pour certains animaux, le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Les animaux sont évalués quotidiennement (avec une grille d’évaluation) pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies et du sang pour analyses.

Remplacement

Nous avons effectué le maximum d’expériences sur des lignées cellulaires en testant la réplication des réplicons de différentes espèces, il est désormais nécessaire de réaliser les expériences in vivo, notamment pour l’étude de l’inflammation dans le tissu hépatique. Dès que possible, nous rebasculerons sur les lignées cellulaires pour caractériser les perturbations de la cellule induites par la réplication virale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique. Nous avons calculé avec le service de statistiques de notre institut que le nombre minimal d’animaux par groupe doit être de 10. Nous nous sommes limités aux expériences indispensables, notamment en réduisant le nombre de points analysés après l'injection.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement (notamment en suivant les recommandations européennes) et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences précédentes montrent que les procédures expérimentales proposées préservent le bien-être animal. Une grille de score a été mise en place pour l’observation quotidienne des animaux afin de d’euthanasier les animaux et collecter les foies avant le développement éventuel de gêne liée à la présence de tumeurs.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenues par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).

1 010 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et deux cents réutilisées dans d'autres protocoles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent un stress néonatal ou un régime obésogène, puis une chirurgie stéréotaxique injectant un virus dans le cerveau, des prises de sang à la queue et des tests comportementaux avec privation alimentaire. Le porteur attend un comportement anxieux ou dépressif chez les souris stressées ou rendues obèses, objet même de l'étude sur la dépression humaine. Il affirme que l'étude des facteurs environnementaux et du comportement ne peut se faire que sur animal vivant et rattache les retombées aux troubles de l'humeur.

Objectifs

La dépression représente un problème de santé publique majeur. Parmi les facteurs impliqués dans la vulnérabilité à la dépression, l’adversité dans l’enfance et l’obésité associée au mode de vie sédentaire et aux habitudes alimentaires occidentales sont des facteurs de risques importants. Cependant, les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la dépression restent mal connus. Des travaux récents suggèrent que des processus inflammatoires et des dysfonctions du système dopaminergique mesocorticolimbique contribuent à la physiopathologie de certains symptômes dépressifs. L’objectif de ce projet est d’examiner les effets du stress précoce et de l’inflammation liée à l’obésité dans l’apparition désordres émotionnels à l’âge adulte et de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacents. Pour cela nous utiliserons des méthodes de transfert de gènes viraux chez des souris ayant subies un stress néonatal ou rendues obèses à l’âge adulte pour moduler la transmission dopaminergique. Un total de 1010 animaux est envisagé pour ce projet. L’étude de l’impact des facteurs environnementaux et du comportement ne peut être réalisée que sur animaux vivants, rendant impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l’inconfort des animaux.

Bénéfices attendus

Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la perte de motivation associée au stress précoce et à l’obésité, et plus précisément le rôle de la voie GTP-CH1. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte d’obésité.

Procédures

- Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue (7 prélèvements sur 2 heures représentant moins de 100uL de sang) sur une partie des animaux vigiles pour mesurer différents paramètres métaboliques. - Des injections intrapéritonéales seront réalisées pour évaluer la sensibilité des animaux à l'insuline. - L’ensemble des souris sera soumis à une chirurgie stéréotaxique afin d'injecter un virus recombinant dans une région spécifique du cerveau. Cette procédure sera réalisée une seule fois sur chaque animal. - Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire.

Impact sur les animaux

- Un comportement anxieux et/ou de type dépressif est attendu chez les souris soumises au stress précoce et au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. - L’exposition chronique au régime hyperlipidique entraine une prise de poids et des désordres métaboliques pour les souris. - La chirurgie peut être cause de douleur chez l’animal. Le stress thermique induit par l’anesthésie est contrôlé par l’installation des souris sur un tapis chauffant assurant un maintien de la température à 37°C. Le dessèchement oculaire potentiel est prévenu par l’application d’un gel ophtalmique. - Les injections et prises de sang peuvent être cause de douleur pour l’animal. - Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère et un isolement en cage individuelle le temps de la procédure.

Devenir

Les mères, mâles reproducteurs et mâles C57Bl/6 utilisés pour le screening (200 animaux) seront préférentiellement réemployés dans d’autres protocoles. Le reste des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures.

Remplacement

L’objectif du projet est de mieux comprendre chez l'animal les mécanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur induits par un stress précoce ou une exposition chronique à un régime obésogène. L’emploi de modèles animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie par l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.

Réduction

Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié. Le nombre total d’animaux est susceptible d’être revu à la baisse en fonction du succès des reproductions.

Raffinement

- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant certaines expériences, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. - Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille de score. Si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera sacrifié dans les 48h. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permettent un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. De plus, ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. - La procédure de stress précoce sera réalisée sur des femelles lactantes. - Concernant la cohorte impliquant la mise en place d’un phénotype obèse, les souris seront mises sous régime obésogène ou contrôle à partir du sevrage, pour une durée de 15 semaines. Ce choix repose sur les données de la littérature, notamment issues de notre laboratoire, montrant qu’un début d’exposition au régime obésogène au stade de l’adolescence induit des perturbations métaboliques mais aussi de la sphère émotionnelle, majorées, comparativement à une exposition plus tardive (stade adulte). - La suite des expériences (études comportementales, évaluation de la transmission dopaminergique) sera réalisée à l’âge adulte, 15 semaines après le sevrage.

120 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous la peau d'un biomatériau osseux, avant d'être tué pour l'analyse histologique des tissus. Le porteur indique que l'implantation peut provoquer une gêne ou une douleur légère et fixe un seuil d'euthanasie. Il décrit cette étape sur souris comme un préalable à des essais sur os de rat puis chez le "gros animal", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation.

Objectifs

En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Notre projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse, qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matériaux personnalisés qui permettraient d'aboutir à une meilleure réparation osseuse par la stimulation conjointe de la réparation des nerfs, des vaisseaux et des os. Ici, il s’agit de réaliser une première évaluation de nos matériaux en les implantant sous la peau de souris, en préalable à des expérimentations sur site osseux chez le rat. Cette évaluation servira deux objectifs : d’une part, évaluer la biocompatibilité (réaction inflammatoire, réaction à corps étranger, …), et d’autre part évaluer la fonctionnalité (formation osseuse, vascularisation, innervation) des produits, pour définir la ou les formulations les plus appropriées pour l’application chez le rat en modèle de réparation osseuse.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences d’implantation de nos matériaux menées sur modèle souris sont un préalable à la poursuite des travaux sur site osseux chez le rat. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau et/ou l'un des gènes administrés conduiront à l’abandon de l’élément mis en cause. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager dans un premier temps les expérimentations en site osseux chez le rat, et dans un deuxième temps le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée de 5 à 10 minutes)

Impact sur les animaux

L'implantation sous-cutanée peut entraîner une gêne voire une douleur légère. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie selon les standards européens. Au-delà d'un certain seuil, l’animal sera euthanasié sans attendre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de leur temps expérimental pour procéder à une analyse histologique des tissus de la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel régénératif de celui-ci. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Les échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux. La possibilité d'implanter au moins deux matériaux par animal, de réaliser un suivi longitudinal, d'analyser plusieurs paramètres à partir des mêmes prélèvements sur animaux après euthanasie, permet de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés.

Raffinement

L’opération est réalisée sous anesthésie générale. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques sont utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. En cas de lésion sérieuse ne pouvant être traitée par suture et/ou antiseptique, l’animal est euthanasié. La cage reçoit un surcroît d’enrichissements le jour de la chirurgie de manière à distraire l’animal de la gêne liée à la présence du matériau implanté, et ainsi limiter les risques d’arrachement de l’implant, de rupture des points de suture, et d’infection de la plaie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris présentant une immuno-déficience marquée, adaptée à l'implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Les souris seront implantées à l'âge de 7 à 12 semaines. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´implantation sous-cutanée.

90 brebis vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis renvoyées en élevage. Chaque animal subit cinq anesthésies générales de 45 minutes en 48 heures, séquence répétée deux mois plus tard, avec des jeûnes de 29 puis 18 heures, pour suivre par IRM la rétention d'un gel contraceptif destiné aux femmes. Le porteur présente ce gel comme une "alternative révolutionnaire" affichant "100 % d'efficacité in vitro" et justifie la brebis par la proximité de son col utérin avec celui de la femme. Il affirme que le comportement du gel dans le tractus ne peut être appréhendé in vitro et nécessite une validation chez l'animal vivant.

Objectifs

La présente demande s’intègre dans un projet plus vaste visant à développer un gel contraceptif d’origine naturelle (non hormonal) à destination des femmes, comme alternative aux méthodes hormonales existantes. En effet, celles-ci provoquent des effets secondaires et/ou del'inconfort, tels que prise de poids, diminution de la libido, augmentation du risque de maladies cardiovasculaires et de dépression. Malheureusement, les contraceptifs non hormonaux existants sont souvent peu pratiques. Ce projet propose de développer in vitro, puis de tester in vivo chez la brebis, un gel à déposer au niveau du col de l’utérus, qui en interagissant avec le mucus, formerait un bouchon empéchant le passage des spermatozoïdes. L’objectif ici est de mieux comprendre le comportement du gel contraceptif une fois introduit dans le vagin de la brebis. En effet, le comportement du gel dans le tractus reproducteur de l’animal est étroitement lié à son efficacité. Cette expérimentation cherche à répondre à 2 questions : 1- quel est le temps de rétention du gel dans le tractus reproducteur, et en quelles quantités ? 2- quelle est la localisation exacte du gel au cours du temps ? En effet l’hypothèse est que plus le gel est proche du col de l’utérus (voire dans le col), plus il sera efficace. Pour ce faire, la technique d’IRM sera utilisée. En effet, cette méthode non invasive permet de suivre le même animal au cours du temps, et ainsi de réduire la variabilité individuelle. Elle permet aussi de quantifier le gel, et d’avoir accès à l’intégralité du tractus reproducteur de la brebis, avec des images de haute qualité. De plus, la morphologie du col de l’utérus de la brebis ne permet pas d’y insérer des outils d’imagerie tels qu’échographe, fibre optique. La seule contrainte de cette méthode est qu’elle nécessite d’anesthésier les brebis avant de les passer à l’IRM, ce qui implique plusieurs anesthésies dans une même journée si l’on souhaite suivre l’évolution dans le temps du comportement du gel dans le tractus. Le gel contraceptif est constitué du polymère et d'excipients différents. Il existe donc de nombreuses possibilités de formulations différentes. Il s'agit ici de tester des gels avec des propriétés physiques, mécaniques et adhésives variables, et d'identifier la ou les formulations les plus adaptées.

Bénéfices attendus

Le gel contraceptif développé dans ce projet est présenté comme une alternative révolutionnaire aux méthodes actuellement existantes : hormonales (avec tous les effets secondaires connus), non hormonales (qui présentent elles aussi des inconvénients), et les méthodes dites non-techniques (qui ont une efficacité relative). Ce gel est en effet très efficace (100% d’efficacité in vitro annoncée), sans hormones, peu invasif et très pratique d’utilisation. Il représente donc une solution de choix pour les millions de femmes qui ne peuvent et ne veulent pas utiliser d’hormones. La partie développée ici permettra de mieux comprendre la cinétique du gel une fois appliqué dans le tractus, et ainsi de renforcer son efficacité, ainsi que sa sécurité d’utilisation (s’assurer que le gel est bien résorbé ou rejeté au bout d’un certain temps).

Procédures

5 anesthésies générales (d'une durée de 45 minutes) en 2 semaines, dont 4 sur 48 heures, espacées d'au moins 3 heures. Ceci répété une fois, après 2 mois de repos. Deux périodes de mise à jeun de 29 et 18 heures respectivement, répétées à 2 mois d'intervalle.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront 5 anesthésies générales, entrecoupées de réveils, sur une période de 48 heures. Le temps de récupération peut être plus long au fur et à mesure de l’avancement de l’expérimentation. Pour chaque anesthésie les animaux pourront subir un stress lors de la manipulation. Un hématome peut apparaître lors de l’induction de l’anesthésie par voie intraveineuse. Les animaux seront à jeun durant 29 heures pour la première journée de mesures. Du foin leur sera distribué le soir de cette première journée. Puis ils seront de nouveau à jeun pendant 18 heures la deuxième journée.

Devenir

Les animaux retournent à l'élevage à l'issu de l'expérimentation.

Remplacement

L’étude de l’efficacité d’un produit destiné à l’usage chez l’Homme doit d’abord se faire sur animaux, lorsque cela est éthiquement admissible. Dans notre cas, l’efficacité du gel testé a été évaluée in vitro. Elle doit maintenant être confirmée in vivo, avant de pouvoir démarrer une phase d’essai chez la femme. Chaque formulation à tester sera au préalable évaluée in vitro pour la rhéologie, puis ex vivo sur des tractus pour les caractéristiques d'adhésion, et pour finir in vivo en version colorée et visualisation à l'endoscope. La concentration optimale de l’agent de contraste sera déterminée in vitro en amont. Le comportement du gel dans le tractus reproducteur, en tenant compte du mouvement de l’animal, des contractions naturelles du tractus, ne peut être appréhendé in vitro, et nécessite une validation in vivo.vo.

Réduction

L’utilisation de l’imagerie de façon répétée permet de limiter la variabilité individuelle, et donc de limiter le nombre d’animaux nécessaires. Une étude effectuée en 2012 visant à suivre la rétention de crême vaginale dans la brebis par scintigraphie gamma et par IRM chez la femme, a montré qu’un effectif de 6 brebis ou femmes par groupe est suffisant pour mettre en évidence des différences. Les animaux seront leurs propres témoins et suivis durant 4 périodes successives. L’intensité du signal du produit de contraste inclus dans le gel contraceptif sera mesurée par IRM pour ces 4 répétitions par animal. Les données seront analysées par un test non paramétrique. Un logiciel spécialement dédié au calcul d’effectifs pour tests statistiques, en tablant sur une diminution de 25 % du signal entre les périodes d’analyse, un risque alpha de 0.05 et une puissance de 95 %, nous donne le nombre requis d’animaux de 5 par lot. Pour assurer la réussite de l’essai, nous avons choisi la valeur de 6 brebis par lot.

Raffinement

L’IRM est un outil de choix pour investiguer de façon précise et non invasive des questions au niveau de l’organe ou du tractus entier. D’autres techniques ne nécessitant pas d’endormir les animaux ont déjà été testées, tels qu’utilisation d’un gel coloré et observation à l’endoscope, marquage fluorescent du gel et visualisation par endomicroscopie. Cependant, elles ne permettent pas de quantifier précisément le gel, ni de visualiser l’intérieur du col de l’utérus, ou d’avoir une vue d’ensemble du tractus génital. Les animaux seront maintenus en groupe, manipulés dans le calme. La procédure sera réalisée par du personnel expérimenté, ayant une expertise de l'anesthésie chez des modèles ovins. Etant donné la succession des différentes anesthésies sur 48H, les brebis seront maintenues sous O2 à la fin de chaque anesthésie pour améliorer la qualité et la rapidité du réveil. Dès que l’animal présentera les premiers signes de déglutition ou de clignement des paupières, il sera extubé. Pré-examen imagerie/Anesthésie: les animaux arriveront la veille, et seront mis à jeun 16h avant l’intervention, avec abreuvement adlibitum. Induction par voie intraveineuse, puis maintien au masque avec inhalation d’un mélange gazeux d’oxygène et de produit anesthésiant pour obtenir une myorelaxation suffisante avant intubation orotrachéale. Postimagerie – Les animaux sont logés en cases collectives sur paille.

Choix des espèces

La brebis est un bon modèle pour notre étude. En effet, malgré que la morphologie du col de l'utérus de la brebis est plus complexe que celui de la femme, ces 2 espèces ont plusieurs points communs : ce sont toutes les deux des espèces à dépôt de semence au niveau du vagin, la sélection des spermatozoïdes se fait en grande partie par le mucus cervical, la longueur du vagin et le diamètre cervical sont proches. De plus, la brebis a déjà été utilisée à plusieurs reprises comme modèle pour tester des dispositifs contraceptifs; une équipe a montré en 2012 que des données récoltées chez la brebis sont comparables à celles obtenues chez la femme. La vache et la jument ne sont pas des modèles pertinents car ce sont des espèces à dépôt de semence intra-utérine pour les bovins, et les individus sont trop lourds et volumineux pour passer à l'IRM. Brebis adultes multipares pouvant être synchronisées.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras et sucré sur vingt-quatre semaines, elles subissent des tests de tolérance au glucose après jeûne, un test d'endurance sur tapis, des échographies sous anesthésie et l'introduction d'une sonde dans la carotide avant d'être tuées pour analyse des organes. Le porteur affirme que l'obésité et la dysfonction cardiaque n'entraînent pas de surmortalité sur la période. Il indique étudier le mécanisme d'action des gliflozines, un traitement déjà utilisé chez les patients, pour l'optimiser à terme.

Objectifs

Le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Or, le diabète est en pleine expansion dans notre société, ce qui confirme la nécessité de constantes recherches pour mieux cibler les solutions thérapeutiques. Récemment, les gliflozines, i.e. des inhibiteurs des co-transporteurs sodium-glucose (SGLT2), ont démontré un effet bénéfique sur la diminution de la survenue d’évènements cliniques majeurs chez les patients insuffisants cardiaques. Les résultats prometteurs d’un nouveau traitement de l’insuffisance cardiaque par les gliflozines ouvrent une nouvelle voie thérapeutique pour les patients. Néanmoins, pour optimiser les molécules actuelles, nous devons d‘abord identifier leurs mécanismes d’action. En effet, en plus de leur action au niveau des reins, les gliflozines semblent avoir un effet cardiaque direct, notamment sur le métabolisme. Ainsi, notre projet a pour objectif de comprendre comment la gliflozine agit sur la cellule cardiaque, notamment sur la communication du signal calcium entre le réticulum, réservoir de calcium, et la mitochondrie, source d’énergie au sein de la cellule cardiaque dans un modèle chez la souris de cardiomyopathie diabétique. Ces informations permettront de préciser le mécanisme d’action de cette molécule en vue de l’optimiser.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de préciser le mécanisme d’action des gliflozines au niveau cardiaque, mais aussi dans les autres organes, afin d’envisager à terme le développement de nouvelles molécules plus spécifiques et avec une meilleure efficacité pour un plus grand nombre de patients insuffisants cardiaques.

Procédures

Le protocole dure au total 24 semaines. La moitié des souris seront mises sous régime standard pendant 24 semaines et l’autre moitié sera mise sous régime enrichie en lipides et en sucrose. Au bout de 16 semaines, la moitié de chaque groupe aura une supplémentation dans leur nourriture avec la gliflozine, pour mimer le traitement chez les patients. Le développement du diabète chez les souris sera mesuré par un test à 15 et 22 semaines. Pour cela, les souris seront mises à jeun pendant 6 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure. Un test d’endurance sera également effectué à 23 semaines sur tapis de course (durée du test : 20min). Les souris auront été au préalable habituées au tapis de course, 1 fois par jour pendant 3 jours (2mn par session). Une échographie sera effectuée à 16 et 23 semaines sous anesthésie gazeuse (durée anesthésie générale :30min) pour étudier la fonction contractile du cœur. Pour étudier la communication du calcium, la moitié des souris de chaque groupe recevra une injection pour exprimer un senseur du calcium (durée anesthésie générale :11min ; durée injection : 30s). Pour mesurer la pression artérielle, la moitié des souris de chaque groupe seront anesthésiées sous analgésie pour introduire une sonde de mesure dans la carotide (durée anesthésie générale :30min) et seront ensuite mises à mort pour prélèvements des organes à analyser.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons durant ce régime riche en sucre et en gras à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque caractérisé par un cœur plus gros et un remplissage du cœur par le sang diminué, raison de l’étude. Toutefois, l’obésité et la dysfonction cardiaque/métabolique n’entrainent pas de surmortalité, ni d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (24 semaines). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale, ni à l’injection réalisée sous analgésie et anesthésie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes.

Remplacement

Notre projet ayant pour but d’étudier la cardiopathie diabétique impliquant un mauvais fonctionnement contractile du cœur suite à un dérèglement d’origine métabolique et multi-organe, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire. Cependant, l’isolation de cellules contractiles du cœur des souris de cette étude permettra de réaliser de nombreuses analyses en limitant le nombre d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables, soit au maximum 72 animaux sur 2 ans. Par ailleurs, les prélèvements des autres organes en parallèle du cœur ont été mutualisés sur chaque procédure afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis. Les souris sont soumises à une période d’habituation sur le tapis de course. La mise à jeun courte de 6h avant les tests métaboliques est réalisée au matin, ce qui correspond au début de période diurne pour les animaux (c’est à dire à leur période de plus faible activité et en situation post-prandiale).

Choix des espèces

La physiologie de la souris étant « proche » de celle de l’Homme, pour la problématique étudiée ici, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Les animaux C57BL/6-Ola-Hsd auront 5 semaines lors de la mise en place de la diète pour 6 mois, menant à un âge de 29 semaines à l'issue de la procédure. La mise en place de la diète dès cet âge permet le développement d’une cardiopathie diabétique.