Procédures modérées

Renvoyés vers les circuits de commercialisation ou tués par électronarcose dans l'abattoir expérimental de l'établissement, 6 368 poulets de chair vont être exposés à des épisodes de chaleur contrôlés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'élévation de température fait monter leur température corporelle et leur rythme respiratoire, réduit leur activité et freine leur croissance, effets recherchés puisqu'il s'agit de les mesurer. Les manipulations se limitent à des pesées à cinq dates et à des notations de lésions des pattes, sans prélèvement. Le porteur cherche des additifs nutritionnels capables d'atténuer ces effets, et affirme qu'aucune méthode substitutive ne reproduit la thermorégulation des volailles.

Objectifs

L’augmentation des températures environnementales pose des défis majeurs pour la sécurité alimentaire et le bien-être animal. Le stress thermique induit une hausse de l’incidence des maladies chez les animaux d’élevage, notamment en raison d’une augmentation du nombre d’agents pathogènes et/ou d’une altération de la fonction immunitaire de l’animal. Chez les volailles de chair en particulier, le stress thermique constitue l’un des principaux facteurs affectant la santé, la croissance, la consommation alimentaire, la mortalité et le bien-être. Dans ce contexte, l’élévation des températures moyennes et la fréquence accrue des vagues de chaleur rendent indispensable l’étude des réponses animales afin d’adapter les systèmes d’élevage. Ce projet consiste à mesurer l’impact thermique sur les performances de croissance (poids, gain de poids moyen quotidien) et de consommation (consommation d’aliment et d’eau) ainsi que sur des réponses physiologiques (stress oxydatif, température corporelle, etc.). Des mesures comportementales peuvent être aussi analysées dans ce projet afin de caractériser les effets de la chaleur sur le comportement des animaux (activité, prise alimentaire, etc.). De plus, ce projet a pour objectif de tester différents outils pour pallier ce stress thermique. Pour cela, nous étudions de nouveaux programmes alimentaires et/ou de nouveaux aliments. Nous testons ou mettons au point de nouveaux additifs nutritionnels (antioxydants, acides aminés de synthèse, huiles essentielles, probiotiques…) et autres produits d’intérêt nutritionnel ayant pour objectif de réduire les effets néfastes du stress thermique sur les volailles d’élevage.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont multiples. Les mesures réalisées peuvent permettre d’améliorer les connaissances sur l’impact du stress thermique sur les animaux en termes de performances zootechniques, de réponses physiologiques ou de comportements. Ces mesures permettent également d’évaluer l’efficacité de solutions nutritionnelles pour pallier les effets néfastes du stress thermique sur les animaux. Ainsi ces travaux contribueront à renforcer la résilience des systèmes d’élevage face au changement climatique.

Procédures

Aucun prélèvement n’est réalisé sur les animaux. Les manipulations d’animaux sont limitées et non invasives, s’agissant principalement de pesées au cours de l’essai (à J10, J21, J28, J35, J42). Chaque pesée dure entre 1 minute par animal (si pesée individuelle) et 5 minutes maximum (si pesée par petits groupes d’animaux). Dans certains cas, des analyses sur les fèces ou la litière peuvent être réalisées mais cela ne nécessite pas de prélèvement ou d’intervention sur les animaux (récolte des fèces via des plateaux sous les compartiments ou échantillon de litière prélevé dans la case). De même, les mesures de comportements ne nécessitent pas d’interventions sur les animaux puisqu’il s’agit d’observations. Enfin, dans certains essais, des critères de bien-être et/ou physiologiques peuvent être étudiés comme des notations de pododermatite (évaluation des lésions des pattes : rougeurs, irritations, ulcérations) ou des relevés de température corporelle. Cela nécessite une contention de l’animal par l’opérateur, de moins d’une minute par animal.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue dans ce projet est liée à l’exposition des animaux à un stress thermique modéré et contrôlé. Celui-ci se traduit principalement par une augmentation de la température corporelle et du rythme respiratoire, ainsi que par des modifications comportementales (réduction de l’activité, augmentation du temps passé en position de repos). Une dégradation des performances zootechniques (réduction de l’ingéré alimentaire, diminution du gain de poids, altération de l’efficacité alimentaire) est également attendue en lien avec l’élévation de la température ambiante. En conditions extrêmes, un stress thermique prolongé ou trop intense peut entraîner une détérioration de l’état général pouvant aller jusqu’à la mortalité. Cependant, dans le cadre de ce projet, les conditions expérimentales sont définies de manière à induire un stress thermique modéré, sans atteindre ces niveaux critiques. Des mesures de suivi rapproché des animaux ainsi que des seuils d’intervention clairement établis permettent d’adapter immédiatement les conditions (réduction de la température, interruption de l’exposition) afin de prévenir toute atteinte sévère au bien-être. De ce fait, aucune mortalité liée à cette procédure n’est attendue.

Devenir

À l’issue de chaque essai, les animaux sont soit orientés vers les circuits conventionnels de commercialisation des volailles de chair, soit mis à mort par électronarcose à des fins scientifiques dans notre abattoir expérimental par du personnel formé et conformément aux méthodes de mises à mort règlementaires. Cette seconde option permet la réalisation d’analyses complémentaires de qualité de la viande par exemple.

Remplacement

Aucune méthode substitutive ne permet actuellement de reproduire la complexité de la thermorégulation chez les volailles, en intégrant les interactions comportementales et métaboliques intervenant dans ce processus.

Réduction

Pour chaque essai, nous adaptons le nombre d’animaux en fonction des objectifs et du nombre de solutions testées. L’idée est d’avoir suffisamment d’animaux pour que les résultats soient fiables, sans en utiliser plus que nécessaire. Pour cela, nous utilisons des méthodes statistiques qui permettent de déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires pour détecter une différence réelle entre les groupes si elle existe. Nous nous appuyons aussi sur notre expérience et sur les résultats d’autres études scientifiques pour ajuster ce nombre. Cette approche permet d’obtenir des résultats solides tout en limitant le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, certains essais sont réalisés en collaboration avec plusieurs entreprises, ce qui permet de partager les résultats et d’éviter de répéter des expérimentations similaires.

Raffinement

Le bien-être des animaux repose sur une surveillance quotidienne assurée par un personnel qualifié et spécialement formé à l’élevage et à la manipulation des volailles. Les animaux sont élevés en case collective (entre 12 et 40 animaux). La période de démarrage entre 0 et 10 jours d’âge ne sera pas concernée par l’augmentation des températures et hygrométries, afin de permettre aux jeunes volailles de s’adapter à leur environnement et car elles sont particulièrement sensibles sur cette phase (plus de risque d’altération de leur bien-être). La durée et les périodes d’augmentations de la température seront adaptées à la thématique d’essai et réduites au maximum. Les manipulations sont réduites, peu invasives et courtes dans le temps. Elles se limitent principalement à des pesées (J10, J21, J28, J35, J42). L’eau et les aliments sont distribués à volonté. L’air est ventilé, les conditions d’ambiance (température et hygrométrie) sont contrôlées via un boitier de commande. Dans les dispositifs au sol, les animaux sont logés sur de la litière (copeaux ou paille). Dans les autres dispositifs avec des compartiments, un sur-grillage plastique est placé au sol des modules afin d’améliorer le confort pour les pattes des volailles. Un papier de démarrage (papier absorbant) est placé au sol les premiers jours après l’arrivée des poussins. Il permet de déposer un peu d’aliment directement à leur portée et d’améliorer le démarrage alimentaire, tout en limitant le contact avec le sol grillagé. Il est retiré après quelques jours.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible. Les poussins sont reçus, âgés d’un jour, comme dans les conditions d’élevage habituelles. Ils sont élevés jusqu’à 35 ou 42 jours d’âge (en fonction des dispositifs, des thématiques ou des génétiques étudiées). Lors de la phase de démarrage (jusqu’à 10 jours d’âge), les volailles seront élevées avec des conditions d’ambiances (température et hygrométrie) conformes au cahier des charges standard leur assurant un bien-être optimal. Cela permet une meilleure adaptation des animaux à leur environnement, et de limiter les potentielles nuisances sur les animaux en n’impactant pas cette phase plus critique de développement des animaux. C’est sur les phases de croissance et/ou de finition (après 10 jours d’âge et jusqu’à 42 jours d’âge maximum) qu’une modification des consignes de conditions d’ambiances pourra intervenir afin d’évaluer l’impact de celles-ci ainsi que des solutions nutritionnelles sur les animaux.

Le poids des souris est maintenu à 85 % de leur poids de départ par le contrôle de la nourriture, un point limite étant fixé à 20 % de perte, seuil auquel la ration est augmentée. 240 souris, adultes de trois à six mois ou âgées de dix-sept à vingt mois, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant cinq à six semaines, chacune est pesée deux fois par jour et cherche des récompenses alimentaires dans des labyrinthes, une à quatre fois par jour, avant d'être tuée sous anesthésie pour prélever son cerveau. Le porteur affirme que le modèle murin offre des avantages "uniques et irremplaçables" pour ces évaluations comportementales, qui exigent selon lui les interactions d'un "organisme entier".

Objectifs

La mémoire de travail est un système cognitif essentiel au comportement dirigé vers un but : elle permet le maintien temporaire et la manipulation d'informations pertinentes en vue de la réalisation d'actions motivées . Dans ce cadre, elle joue un double rôle — planification et exécution — en assurant la coordination optimale des actions nécessaires à l'atteinte d'un objectif. Bien qu'il soit largement admis que le vieillissement physiologique altère la mémoire de travail chez l'humain comme chez le rongeur, il demeure incertain que ses différents sous-processus — maintien, mise à jour et manipulation de l'information — soient également vulnérables au vieillissement normal, en particulier dans le modèle murin. L’objectif de ce projet est de déterminer l’effet du vieillissement sain sur ces différents sous-processus de la mémoire de travail dans le modèle murin de vieillissement, en testant des souris dans différents dispositifs expérimentaux ciblant spécifiquement chacun de ces sous-processus, suivi par des études. Cette recherche pourrait contribuer à mieux comprendre les mécanismes du déclin cognitif, identifier des cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques et améliorer la qualité de vie des personnes âgées.

Bénéfices attendus

Au cours des deux dernières décennies, l’espérance de vie a augmenté de plus de six ans, principalement en raison d’une diminution des taux de mortalité plutôt que d’une augmentation des années vécues sans incapacité. Par conséquent, l’amélioration de la qualité de vie des personnes âgées est devenue un enjeu majeur de santé publique, nécessitant une compréhension approfondie de la biologie du vieillissement. Par ailleurs, la trajectoire du vieillissement cognitif en bonne santé varie considérablement d’un individu à l’autre, soulevant la question suivante : pourquoi certaines personnes présentent-elles des signes de déclin cognitif plus précocement que d’autres ? Cette variabilité constitue un axe central des recherches actuelles et forme le fondement du présent projet. Ce projet vise à caractériser les différentes composantes de la mémoire de travail. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra d’expliquer pourquoi certains individus conservent une flexibilité cognitive préservée, tandis que d’autres connaissent un déclin plus marqué.

Procédures

Le contrôle de la prise alimentaire vise à encourager les souris à apprendre et à réaliser les exercices de mémoire, leur consommation de nourriture étant régulée afin de maintenir un état de faim modérée tout en assurant leur bonne santé grâce à un suivi quotidien. Cette phase dure environ 5 à 6 semaines. Pendant cette période, les souris participent quotidiennement à des exercices dans des labyrinthes, au cours desquels elles doivent retrouver des récompenses alimentaires en mobilisant leur mémoire. Ces sessions durent quelques minutes et sont réalisées une à quatre fois par jour sur une durée totale de cinq à six semaines. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire réalisée sous anesthésie et analgésie afin de permettre la réalisation des prélèvements nécessaires à l’analyse des cellules cérébrales au microscope. Cette chirurgie terminale sous anesthésie profonde durera environ 20 à 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus au cours de cette procédure sont d’impact léger à modéré et suivent le parcours chronologique de l'animal. En amont des tests, la mise en place du contrôle alimentaire peut générer une sensation de faim légère, susceptible d'induire un stress ou une agitation transitoire. Lors des sessions épreuves, la confrontation à la nouveauté de la tâche comportementale et le processus d'apprentissage peuvent également devenir sources de fatigue, de frustration (notamment lors des erreurs) ou de stress, se manifestant par une possible agitation. À cela s'ajoute un stress léger lié aux manipulations régulières et aux déplacements des animaux vers les dispositifs expérimentaux. Enfin, lors de l’euthanasie des animaux effectuée sous anesthésie générale et analgésie, il existe un risque lié à l’utilisation des anesthésiques (stress thermique, risque d’arrêt cardio-respiratoire, etc.).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de l'expérience car les tissus cérébraux doivent être préservés pour une analyse histologique ultérieure.

Remplacement

Le modèle murin est essentiel pour notre projet en raison de ses avantages uniques et irremplaçables. Les évaluations comportementales nécessitent des interactions complexes de l'organisme entier qui ne peuvent être reproduites par des méthodes in vitro ou ex vivo. Ainsi, l’utilisation du modèle murin est cruciale pour étudier de manière exhaustive les processus neurologiques et comportementaux.

Réduction

Nous avons déjà réalisé une étude comportementale pilote préalable au cours de laquelle nous avons vérifié que les dispositifs fonctionnent et que les souris sont capables d'apprendre. De plus, des tests statistiques rigoureux sont employés afin de garantir la fiabilité et la validité des données, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux nécessaires tout en maintenant la rigueur scientifique. Ces analyses permettent d’obtenir des résultats fiables avec un effectif réduit. En tenant compte de l’expérience antérieure du laboratoire et des paramètres de puissance statistique, le nombre total d’animaux requis est estimé à 240. Le nombre d’animaux par groupe est le minimum requis pour obtenir des résultats interprétables et atteindre l’objectif scientifique défini dans ce projet.

Raffinement

À l’animalerie, les souris sont hébergées en groupe et ont accès à la nourriture et à l’eau ad libitum pendant 5 jours. Après, il y a une phase d’habituation à l’expérimentateur. Le début de l’expérience correspond à la mise en place du contrôle alimentaire ; à partir de ce moment, les animaux restent hébergés en groupe de 2-3 souris par cage, où leur consommation alimentaire est surveillée au niveau de la cage, tandis que leur poids est suivi individuellement. On prendra soin de distribuer la nourriture à chaque animal dans la cage pour éviter que les animaux ne se disputent la nourriture. Un suivi rigoureux est mis en place pour détecter d'éventuels symptômes de dominance ou d'anhédonie ; en cas de comportement dominant avéré, l'animal concerné sera isolé, et si des signes d'anhédonie apparaissent, la souris sera isolée et bénéficiera d'un retour à une alimentation normale. Tout au long de ce processus, la Structures chargées du Bien-être Animal (SBEA) sera systématiquement sollicitée et assurera un suivi quotidien des animaux pour valider le maintien de leur bien-être. Chaque animal sera pesé 2 fois par jour. Le poids cible pour les procédures expérimentales est fixe à 85 pour cent par rapport au poids de référence initial. Le point limite est fixé à une perte de poids de 20 pour cent par rapport au poids de référence. Si le poids d’un animal descend en dessous de ce seuil, sa ration alimentaire sera immédiatement augmentée afin de stabiliser son poids autour de la valeur cible de 85 pour cent du poids initial. En complément du suivi pondéral, l’état de santé général sera évalué quotidiennement au moyen d’une fiche de suivi comprenant : 1) General: observation de la posture, de l’état du pelage, des yeux 2) Le comportement : détection de signes de fatigue importante, d’apathie ou d’agitation excessive 3) L’échelle de grimace : utilisation de cet outil pour détecter d’éventuels signes de douleur ou d’inconfort significatif. En cas de fatigue marquée ou de score de détresse modéré, l'animal sera retiré de la session de test, placé sous surveillance rapprochée et bénéficera d'un retour à une alimentation ad libitum si son état ne s'améliore pas dans les 24 heures. En cas de dépassement des points limites éthiques sans possibilité de récuperation, l'euthanasie sera pratiquée. L'abre décisionnel avec les point limites en en annexe.

Choix des espèces

La souris est un modèle robuste et bien validé pour l'étude de l’effet de l’âge sur des comportements cognitifs, notamment la mémoire spatiale et les apprentissages dépendants de la motivation et de la récompense. Les circuits cérébraux responsables de ces processus sont hautement conservés entre la souris et l'homme, ce qui confère à ce modèle une forte pertinence translationnelle pour répondre à notre question scientifique. Comme nous cherchons à comparer les performances des souris adultes et âgées des deux sexes dans une tâche de flexibilité cognitive, les animaux sélectionnés pour cette étude représenteront deux stades de développement distincts : 1) des souris adultes (3 à 6 mois) et 2) des souris âgées (17 à 20 mois).

Une injection unique de monocrotaline installe en trois à quatre semaines une hypertension pulmonaire qui épaissit le ventricule droit et peut évoluer vers une insuffisance cardiaque. 132 rats, mâles et âgés de quatre semaines à l'injection, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gavés pendant 28 jours avec du carvacrol, un composé de l'origan et du thym. Chacun passe ensuite sous anesthésie générale un électrocardiogramme, une IRM d'une heure et demie, une échographie et une mesure de la pression pulmonaire, avant d'être tué pour prélever les tissus. Le porteur décrit chez ces rats un "léger essoufflement" et une gêne qu'il qualifie de modérée au motif que les animaux ne sont pas soumis à l'effort.

Objectifs

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une affection cardiovasculaire sévère caractérisée par une élévation anormale de la pression dans les artères pulmonaires, entraînant une surcharge de travail inadéquate du cœur droit. Cette surcharge de pression provoque progressivement un épaississement de la paroi du ventricule droit, pouvant dans les cas les plus extrêmes conduire à une insuffisance cardiaque. Malgré des avancées thérapeutiques, l’HTAP évolue rapidement et demeure difficile à détecter à un stade précoce, compromettant ainsi le pronostic vital. De nombreuses études ont montré que l’HTAP est associée à un remodelage des vaisseaux pulmonaires, à des altérations de l’activité électrique cardiaque et à un remodelage de la structure du cœur. Parmi les composés bioactifs issus de sources naturelles, le Carvacrol (CAR) présent dans l’origan, le cresson poivré et le thym suscite un intérêt croissant pour ses propriétés antioxydantes, anesthésique, analgésique, anti-inflammatoires et cardioprotectrices. Des études récentes indiquent que le CAR pourrait moduler l’activité électrique cardiaque en agissant et il aurait la capacité de protéger le cœur des effets de l’infarctus. Dans ce contexte et malgré l’utilisation répandue du CAR dans les médicaments, les compléments alimentaires et les aliments, les données relatives à ses mécanismes d’action, en particulier concernant la fonction cardiaque dans un contexte HTAP, demeurent encore insuffisantes.. Dans ce contexte, nous chercherons à déterminer si le CAR peut contribuer à limiter le remodelage cardiaque et les altérations de l’activité électrique dans un modèle HTAP induite chez le rat.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra à court terme de mieux comprendre les mécanismes associés à la pathologie de l’HTAP. Elle permettra également de mettre en évidence l’effet thérapeutique de substances pharmacologiques sur ces divers mécanismes mis en jeu. L’efficacité de traitements préventifs et curatifs seront mis en évidence ainsi que d’éventuels effets secondaires. Si les études sont positives, des études cliniques pourront être envisagées à plus long terme sur les substances bénéfiques identifiées de façon à mettre en place un traitement plus efficace avec un rapport bénéfice-risque minimum pour les patients.

Procédures

Ce projet vise à mieux comprendre et traiter l’hypertension artérielle pulmonaire, une maladie grave qui touche les vaisseaux sanguins des poumons et fatigue fortement le cœur. Pour cela, un modèle de cette maladie sera reproduit chez le rat grâce à une injection unique d'une molécule pour déclencher la maladie. La maladie apparaît généralement après 3 à 4 semaines. L’augmentation de la pression dans les artères pulmonaires oblige alors la partie droite du cœur à travailler davantage. Avec le temps, cela provoque un épaississement du muscle cardiaque (hypertrophie) qui peut évoluer vers une insuffisance cardiaque droite. Le projet permettra d’évaluer les effets protecteurs de la molécule, ce traitement sera administré par gavage (par voie orale) pendant 28 jours après l’apparition de la maladie. Son efficacité sera étudiée à partir d’analyses du sang et des tissus. Lorsque la maladie sera installée, plusieurs examens seront réalisés sur chaque animal sous anesthésie générale afin de limiter la douleur et le stress : un électrocardiogramme (ECG) pour étudier l’activité électrique du cœur (une seule fois, environ 10 minutes) ; une IRM avec injection d’un produit de contraste pour observer le cœur et les vaisseaux (une seule fois, environ 1h30) ; une échographie cardiaque (une seule fois, environ 30 minutes) ; une mesure de la pression dans les artères pulmonaires et du débit cardiaque (une seule fois, environ 30 minutes) - un prélèvement sanguin (une seule fois, quelques minutes). L’ensemble de ces examens permet de suivre l’évolution de la maladie et d’évaluer si le traitement testé peut protéger les poumons et le cœur.

Impact sur les animaux

Chez le rat, la pathologie peut se manifester par un léger essoufflement et une diminution de l’activité. Comme les animaux ne sont pas soumis à l’effort, la gêne attendue est considérée comme modérée. Une prise de poids plus faible peut également être observée. Les anesthésies nécessaires aux examens peuvent entraîner une hypothermie,. L’injection du produit induisant l’HTAP peut provoquer une légère irritation locale. Enfin, le CAR, composé naturel présent notamment dans le thym et l’origan, est généralement bien toléré et ne présente pas d’effets indésirables significatifs aux doses utilisées.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les tissus d'intérêt pour des analyses.

Remplacement

Il est indispensable de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et moléculaires mis en jeu dans cette pathologie afin de pouvoir élaborer une prise en charge plus ciblée. Seules des expérimentations sur modèle animal entier pourront permettre d’atteindre ce but. Par ailleurs, il est très difficile d’obtenir des échantillons de patients souffrant d’hypertension pulmonaire, ce qui limite considérablement l’étude directe des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’HTAP et renforce donc indirectement la nécessité de modèles expérimentaux fiables pour tester en routine des médicaments à fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux, les animaux sont répartis dans différents groupes expérimentaux et seront mutualisés pour permettre l’obtention de données scientifiques robustes. Les échantillons prélevés serviront pour des analyses histologiques, biochimiques et fonctionnelles. L’estimation du nombre d’animaux repose sur notre expertise préalable, en cohérence avec les données issues de la littérature, et tient compte également des besoins requis pour une analyse statistique adéquate réalisée préalablement.

Raffinement

Une attention permanente sera portée au bien-être des animaux tout au long du protocole, Lors des examens, les animaux seront sous anesthésie générale avec un protocole antidouleur approprié ainsi qu’une surveillance accrue (électrocardiogramme, capteur de pression…). Si l’état de l’animal le nécessite, les responsables du projet et/ou les vétérinaires pourront intervenir pour adapter le protocole antidouleur ou interrompre la procédure. Afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de l’expérimentation, des outils structurés tels que l’arbre décisionnel et les critères d’arrêt des souffrances sont mis en place pour guider la prise de décision et intervenir rapidement en cas de détresse. Des points limites ont été définis afin de prévenir toute souffrance excessive des animaux inclus dans l’étude. Ces critères reposent sur l’identification de signes cliniques et comportementaux traduisant une altération significative du bien-être de l’animal, le suivi est réalisé par le personnel formé et attentif aux conditions des animaux.

Choix des espèces

Le rat est utilisé car les rongeurs sont des espèces couramment employées pour développer des modèles expérimentaux d’HTAP. En effet, les rongeurs permettent de reproduire de manière fiable les altérations vasculaires et hémodynamiques observées dans cette pathologie ce qui permet d’évaluer efficacement les traitements expérimentaux. L’injection de la molécule induisant la pathologie sera effectuée chez les rats mâles juvéniles âgés de 4 semaines et l’évaluation de l’effet de la molécule thérapeutique sera donc réalisée chez des rats de 8 semaines.

Une partie des souris de ce projet n'a aucune défense contre les infections, si bien qu'une infection peut les faire maigrir brutalement et les tuer. 612 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une molécule censée éliminer les cellules responsables de la pemphigoïde bulleuse, une maladie de la peau. Chaque animal reçoit cinq injections abdominales hebdomadaires, une injection dans la veine de la queue, jusqu'à neuf injections de traitement en trois semaines et des prises de sang répétées à la joue sur animal vigile, jusqu'à sept en quatorze jours, gestes qui peuvent ulcérer le point d'injection et provoquer des hémorragies locales. Toutes seront tuées, à la fin des procédures ou dès l'atteinte d'un point limite, pour prélever la peau et les organes du système immunitaire.

Objectifs

La pemphigoïde bulleuse est une maladie de la peau qui se caractérise par la production anormale d'anticorps ciblant une molécule présente dans les différentes couches de la peau et entrainant son décollement et la formation de bulles et plaies douloureuses. A l’heure actuelle, les patients sont traités avec des médicaments anti-inflammatoires puissants (corticoïdes) ou des traitements affectant le système immunitaire (système de défense contre les infections) du patient. De plus, la plupart des patients rechutent à l’arrêt du traitement. Il est donc indispensable de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques plus sûres et durables pour ces patients. Ce projet vise à étudier l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique ciblée qui vise à éliminer spécifiquement les cellules qui sont responsables de l’apparition des symptômes de la pemphigoïde bulleuse sans affecter les autres cellules du système immunitaire qui ne sont pas impliquées dans la maladie. Notre stratégie repose sur la capacité de nos nouvelles molécules à reconnaitre spécifiquement les cellules impliquées dans la maladie et à activer le système immunitaire afin de les éliminer spécifiquement. L’efficacité de cette stratégie a été validée dans le contexte d’autres maladies auto-immunes, comme la polyarthrite rhumatoïde (maladie inflammatoire touchant les articulations) et le pemphigus vulgaris (autre maladie auto-immune de la peau) et nous souhaitons tester son efficacité dans la pemphigoïde bulleuse, afin d’apporter la preuve de concept in vivo de l’efficacité de notre stratégie thérapeutique ciblée.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle stratégie thérapeutique permettant l’élimination ciblée des cellules impliquées dans la maladie, sans affecter les autres cellules saines non impliquées, ce qui pourrait permettre d’ouvrir de nouvelles pistes pour mieux traiter les patients souffrant de pemphigoïde bulleuse.

Procédures

Les animaux inclus dans ce projet seront soumis à : - des injections dans l'abdomen d'animaux non anesthésiés afin soit d'induire chez ces souris la génération de cellules productrices d'anticorps particuliers (5 injections, 1 fois par semaine), soit de les traiter avec les molécules thérapeutiques (1 injection unique ou 3 injections par semaine, tous les 2 jours, pendant 3 semaines). Chaque injection nécessite la contention rapide des souris et la totalité du geste (contention + injection) dure 1 à 2 minutes maximum. - une injection unique dans la veine de la queue sur animaux non anesthésiés pour la mise en place du modèle d'étude (durée: 2 min). - des prises de sang au niveau de la veine de la joue sur animaux non anesthésiés pour suivre l’apparition des cellules productrices d'anticorps (6 prélèvements sur 33 jours) ou leur diminution post traitement (3 prélèvements, 1 par semaine) ou d’évaluer la présence du traitement dans le sang des souris (7 prélèvements sur 14 jours). Chaque prise de sang nécessite la contention rapide des souris et la totalité du geste (contention + ponction) dure moins de 3 minutes.

Impact sur les animaux

Les injections dans l'abdomen ou dans la veine de la queue ainsi que les prises de sang nécessitent la contention des souris, source de stress. Les injections dans l'abdomen répétées peuvent entrainer une inflammation locale et une ulcération au point d’injection, voire l'apparition d'un gonflement lié à la présence de liquide dans le ventre de la souris, même si cela est extrêmement rare. Les prises de sang répétées peuvent entrainer une inflammation locale et un risque d’hémorragie. Une partie des souris utilisées dans ce projet ne possède pas de système de défense contre les infections. En cas d'infection, la maladie peut évoluer rapidement vers une dégradation brutale de l’état général (amaigrissement) pouvant aller jusqu’à la mort de l’animal. Le traitement par lui-même peut également entrainer un effet léger et transitoire sur le bien-être de l'animal.

Devenir

L'ensemble des souris de ce projet sera euthanasié à la fin des procédures expérimentales ou lorsqu'elles présenteront des signes de souffrance (atteinte d’un point limite). Nous réaliserons des analyses sur les prélèvements obtenus en post-mortem (peau, organes du système immunitaire).

Remplacement

L’étude à l’échelle de l’organisme est indispensable pour tester l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant spécifiquement des sous-populations de cellules, tout en prenant en compte la complexité des interactions cellules-cellules et des nombreuses populations de cellules immunitaires existantes. Cette approche globale nécessite l’utilisation de modèles animaux qui ne peuvent être totalement remplacés par des approches en dehors de l’organisme, sur des cellules cultivées en laboratoire par exemple. Cependant, dans les études que nous menons, des techniques alternatives ne nécessitant pas l’utilisation d’animaux, telles que des co-cultures cellulaires et approches sur organes reconstruits ont été utilisées dans la mesure du possible en amont pour caractériser l'activité des peptibodies avant le passage au modèle animal.

Réduction

Le nombre de souris par lot expérimental a été déterminé en fonction de la littérature afin de réduire au maximum l’utilisation de souris tout en préservant l’interprétation et la significativité des résultats. Nous adapterons le nombre de souris utilisées en fonction des résultats des premières expériences afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes pour respecter leur comportement naturel dans un environnement propre et contrôlé limitant les risques d’infection. Les injections et prélèvements sanguins seront systématiquement alternés entre coté droite et côté gauche de l’animal afin de limiter au maximum les risques d’inflammation et d’infection liés aux injections et prélèvements répétés. Les souris seront surveillées immédiatement après les injections ou les prélèvements de sang. Les souris seront ensuite surveillées quotidiennement afin de détecter des signes de souffrance liés aux procédures effectuées en tenant compte de leur apparence et de leur comportement. Une surveillance bihebdomadaire des souris à l'aide d'une grille de score clinique et d'aide à la décision sera réalisée. En cas de suspicion de dégradation de l’état de la souris, une stimulation de la souris sera faite afin de vérifier sa mobilité, et d’identifier des réactions de défense/agressivité, signes de douleur). En cas de dégradation de l’état général de la souris, ou si un/ou des signes cliniques sont atteints (au-delà duquel l’animal pourrait souffrir), les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le modèle souris a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet, modèle largement décrit dans la littérature pour des approches similaires et la recherche en immunologie. De plus, la bonne connaissance des modèles murins, notamment d’un point de vue génétique et immunologique, permet une bonne interprétabilité des résultats obtenus. Enfin, les indicateurs d'altération du bien-être chez la souris sont bien connus, permettant ainsi une prise en charge appropriée. Nous utiliserons des souris de 6 à 8 semaines ce qui correspond à des souris jeunes adultes, âge décrit dans la littérature pour les expériences que nous devons mener.

Toutes les souris de ce projet subissent une chirurgie du crâne de vingt à trente-cinq minutes sous anesthésie générale, avec injection dans la zone de l'horloge interne. 600 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour vérifier après coup où l'injection a atteint le cerveau. Selon les lots, elles vivent trois semaines seules en cage avec une roue d'activité, passent 48 heures isolées en imagerie cérébrale, ou enchaînent quatre tests comportementaux en quatre jours. Le porteur indique que les procédures reproduisent une perturbation du cycle repos-activité pouvant conduire à un état assimilé à l'anxiété, sans nommer aucun des quatre tests.

Objectifs

L'hypothyroïdie concerne près de 10% de la population. Cette maladie induit notamment des troubles de l'humeur tels qu'irritabilité, anxiété ou dépression, qui restent mal compris. Ces troubles pourraient être liés à la perturbation de notre horloge interne qui régule le cycle veille-sommeil. Nos résultats obtenus chez des souris hypothyroïdiennes soutiennent cette hypothèse. Notre objectif est maintenant de comprendre plus précisément comment les hormones thyroïdiennes, dont le taux sanguin est diminué pendant la maladie, interfèrent avec le fonctionnement de l'horloge, située dans une zone précise du cerveau. Pour répondre à cette question, nous utiliserons 2 lignées de souris génétiquement modifiées permettant de modifier l'action de ces hormones spécifiquement au site de l'horloge. Des tests comportementaux et une imagerie cérébrale permettront d'évaluer l'état d'anxiété et la physiologie de l'horloge interne de ces souris.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la régulation de l'horloge circadienne par les hormones thyroïdiennes. Cette compréhension pourrait ouvrir sur de nouvelles approches des troubles psychiques associés à l'hypothyroïdie, en tenant compte des rythmes circadiens des patients. Plus généralement, les mécanismes identifiés constitueront de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prise en charge des maladies mentales liées aux troubles circadiens dans une société moderne active 24 heures sur 24.

Procédures

Toutes les souris subiront une chirurgie crâniale sous anesthésie générale de 20 à 35 minutes. Un lot sera hébergé en cages individuelles enrichies d'une roue d'activité pendant 3 semaines, un autre lot subira une série de 4 tests comportementaux sur 4 jours consécutifs, et un autre lot suivra une session d'imagerie cérébrale en cage individuelle pendant 48h.

Impact sur les animaux

Les procédures devraient reproduire certains effets de l'hypothyroïdie liés à l'horloge circadienne, notamment une perturbation du cycle repos-activité, ce qui peut conduire à un état assimilé à l'anxiété. Dans de rares cas, l'approche chirurgicale du cerveau pourrait induire inflammation, infection ou inconfort. Les périodes en hébergement individuel sont source de stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour vérification des sites d'injection dans le cerveau

Remplacement

La réponse comportementale à une perturbation cérébrale telle que réalisée ici ne peut pas être étudiée par des méthodes alternatives. Toutefois, ce projet s'inscrit dans un cadre plus large visant à établir sur le long terme un modèle théorique du fonctionnement de l'horloge circadienne. Nous espérons aboutir à un modèle suffisamment riche et prédictif pour anticiper par le calcul sur ordinateur les réponses de l'horloge dans différentes situations physiopathologiques en complément/remplacement des modèles animaux.

Réduction

Sur la base de notre connaissance des tests comportementaux envisagés, nous avons utilisé un programme de calcul de puissance statistique. L'imagerie cérébrale permet de réduire le nombre d'animaux nécessaires car chaque animal est son propre contrôle au cours du temps, et plusieurs cellules sont enregistrées dans un même champ.

Raffinement

Pour toutes les souris subissant une intervention chirurgicale, la douleur sera prise en charge avant, pendant et après la chirurgie. Les points limites définis permettent une prise en charge suffisamment précoce des animaux pour limiter les nuisances subies à un niveau modéré. Toutes les souris seront habituées progressivement à l'environnement expérimental et aux personnels en charge de l'application des procédures.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère de choix dont l'horloge interne et la physiologie thyroïdienne reposent sur les mêmes principes que l'espèce humaine. Cette espèce donne un accès unique à un large éventail d'outils génétiques, notamment les 2 lignées uniques utilisées dans ce projet. Les animaux seront utilisés à un stade de jeunes adultes, à partir de 6 semaines, lorsque la croissance du crâne est terminée.

Le crâne du lapin adulte est assez large pour y creuser deux défauts osseux, ce qui fait servir chaque animal de témoin à lui-même. 6 lapins vont être utilisés à ce titre, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à l'issue pour analyser les tissus autour de l'implant. L'unique intervention, une chirurgie de la boîte crânienne d'environ 45 minutes sous anesthésie générale, laisse une douleur locale pendant trois à cinq jours et un biomatériau candidat au remplacement de la dure-mère. Le porteur présente ce doublement des sites opératoires comme une mesure de réduction et annonce qu'aucun test statistique ne sera réalisé sur ces six animaux.

Objectifs

La dure-mère est la membrane la plus externe qui entoure le cerveau. Lorsqu’elle est abîmée, il peut être nécessaire de la remplacer par un substitut artificiel. Les produits actuellement disponibles peuvent encore provoquer des complications, comme des fuites de liquide cérébrospinal, des infections ou des douleurs. L’objectif de ce projet est d’évaluer un nouveau biomatériau conçu pour reproduire au plus près l’organisation naturelle de la dure-mère, à la fois par sa structure en couches et par son réseau de fibres. Cette étude pilote doit permettre de vérifier, dans un site d’implantation crânien pertinent, si ce matériau est bien toléré et s’il interagit favorablement avec les tissus voisins, en particulier la dure-mère et l’os.

Bénéfices attendus

À court terme, cette étude permettra de confirmer si le biomatériau candidat présente une bonne biocompatibilité et un comportement satisfaisant dans un site anatomique proche de son usage futur. Elle permettra aussi d’identifier d’éventuels effets indésirables avant d’envisager des études plus avancées. À plus long terme, ce projet pourrait contribuer au développement de substituts de dure-mère plus sûrs et plus efficaces, avec pour objectif de diminuer les complications postopératoires chez les patients et d’améliorer leur prise en charge.

Procédures

Unique intervention chirurgicale sur la boite crânienne sous anesthésie générale (durée : environ 45 min)

Impact sur les animaux

En plus d'un stress léger à modéré lié à la contention, la manipulation et l'induction de l'anesthésie, les principales nuisances attendues sont celles liées à la chirurgie : douleur locale légère à modérée pendant 3 à 5 jours au niveau des sites opératoires, ainsi qu’un faible risque d’infection. Le biomatériau implanté pourrait induire une réaction inflammatoire locale, à l'origine de signes neurologiques d'intensité variable, mais ce risque est considéré comme limité au vu des résultats préliminaires obtenus.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour permettre l’analyse post-mortem des tissus au niveau des sites d’implantation et du site contrôle. Cette étape est indispensable pour évaluer précisément la tolérance du biomatériau, les interactions avec la dure-mère et l’os, ainsi que la réponse tissulaire locale.

Remplacement

Une importante phase d’évaluation in vitro, associée à une étude préliminaire, a été menée en amont afin de sélectionner le biomatériau le plus prometteur, d’anticiper d’éventuelles complications et de limiter les groupes d’étude à un seul candidat implanté. Néanmoins, malgré l’intérêt de cette étape de présélection, ses limites résident dans l’impossibilité de reproduire l’ensemble des interactions biologiques, mécaniques et tissulaires observées in vivo, justifiant ainsi le recours à l’expérimentation animale. Le biomatériau développé est à visée d’implantation à long terme chez l’humain (substitut de dure-mère), des étapes pré-cliniques chez l’animal ne peuvent pas être totalement remplacées dans la perspective translationnelle pour répondre à la question scientifique que constitue l’évaluation précise du devenir après implantation et de la réaction immunitaire locale et systémique.

Réduction

Le projet a été conçu pour limiter le nombre d’animaux utilisés. Un seul biomatériau candidat est testé. De plus, chaque lapin sert de contrôle pour lui-même grâce à un site témoin sans implantation, ce qui réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Le projet est présenté comme une étude pilote sur 6 animaux. Aucun test statistique ne sera réalisé dans cette étude pilote.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation, d’un environnement enrichi, d’une chirurgie réalisée sous anesthésie générale et locale, d’une prise en charge antalgique et d’un suivi clinique renforcé. Leur état sera surveillé très étroitement, notamment pendant la première semaine postopératoire, avec une grille de score et des points limites permettant une prise en charge rapide ou, si nécessaire, une mise à mort anticipée pour éviter toute souffrance prolongée.

Choix des espèces

Le lapin a été choisi en raison de la pertinence de ce modèle pour les études sur la boîte crânienne en ingénierie tissulaire osseuse et pour l’évaluation préclinique de biomatériaux. Ce modèle est largement décrit dans la littérature, ce qui facilite la comparaison des résultats et le lapin a été choisi car son crâne est de taille suffisante pour permettre la réalisation de deux défauts standardisés chez un même individu, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires. Ce modèle est bien décrit dans la littérature pour l’étude des biomatériaux dans la boîte crânienne et permet d’étudier les interactions entre l’os, le périoste et la dure-mère. Les animaux utilisés seront des lapins adultes, car le projet ne porte pas sur le développement et parce que la taille de l’animal adulte est nécessaire à la réalisation du modèle chirurgical. Les deux sexes seront inclus dans cette étude pilote. Les animaux seront adultes (5 mois et pesant environ 4kg) : les éléments évalués au cours de l’étude n’impliquent aucune notion de développement qui amènerait à utiliser des lapins immatures ou âgés, le substitut développé est à visée d’utilisation chez l’humain adulte, et la taille des lapins adultes permettra la création de deux défauts sur le même individu.

240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever le foie, les muscles ou le pancréas. Elles subissent une à quatre prises de sang sur animal vigile, jusqu'à huit injections, pour certaines une chirurgie de moins de trente minutes, et une privation de nourriture ou d'eau de douze à quarante-huit heures. Le projet vise à valider chez la souris un biomarqueur sanguin déjà observé chez des patients atteints de lésions aiguës du foie, du muscle ou du pancréas. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ou in silico ne reproduit ces interactions dans un "organisme entier" et conclut que l'expérimentation animale reste "indispensable".

Objectifs

Certaines lésions aiguës affectant des organes vitaux tels que le foie, les muscles ou le pancréas peuvent déclencher des réponses inflammatoires et métaboliques systémiques sévères. Ces atteintes sont observées dans différents contextes pathologiques humains, notamment lors d’intoxications aiguës, de sepsis ou de maladies auto-immunes et peuvent évoluer vers une défaillance multiviscérale. Ces processus sont fréquemment associés à l’activation de mécanismes de mort cellulaire régulée, tels que l’apoptose, la nécroptose et la ferroptose, qui, lorsqu’ils sont activés de manière excessive ou non contrôlée, peuvent contribuer à l’aggravation des lésions tissulaires. L’objectif général du projet est d’identifier et de caractériser un mécanisme commun de signalisation systémique des lésions tissulaires aiguës reposant sur la libération, dans la circulation sanguine, d’un biomarqueur intracellulaire lors de la mort cellulaire. Le projet vise à valider et à approfondir des observations réalisées chez l’homme, notamment dans des cohortes de patients présentant des pathologies inflammatoires aiguës ou métaboliques, afin d’évaluer la valeur prédictive de ce biomarqueur vis-à-vis de la morbidité et de la mortalité, en complément des marqueurs actuellement utilisés.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif d’améliorer la compréhension des mécanismes biologiques impliqués lors de lésions aiguës touchant des organes vitaux. En s’appuyant sur plusieurs modèles expérimentaux complémentaires, il permet d’analyser comment des dommages cellulaires sévères peuvent être associés à la libération de signaux circulants reflétant l’intensité des atteintes tissulaires et la réponse globale de l’organisme. Les résultats attendus contribueront à mieux comprendre les liens entre les lésions locales d’un organe, les réponses systémiques observées dans l’organisme et l’évolution vers des formes graves de la maladie. Cette approche intégrée, combinant des observations issues de différents niveaux d’analyse, vise à identifier des indicateurs biologiques globaux permettant de mieux apprécier la sévérité des atteintes et leur évolution dans le temps. À plus long terme, ces travaux pourront apporter des connaissances utiles pour la recherche biomédicale, en particulier pour l’étude de pathologies inflammatoires aiguës ou chroniques pouvant conduire à une altération de plusieurs organes. Les bénéfices attendus concernent principalement l’amélioration des connaissances fondamentales sur les mécanismes en jeu, susceptibles de contribuer indirectement au développement de stratégies de prise en charge ou de prévention de ces pathologies chez l’homme ou l’animal.

Procédures

Toutes les souris feront l'objet de manipulations de routine nécessitant d'être brièvement maintenues. Afin de clarifier le parcours des animaux, les interventions se répartissent ainsi, selon les groupes étudiés : Prélèvements sanguins : chaque animal subira entre 1 et 4 prises de sang, réalisées sur animal vigile. Chaque geste dure quelques secondes. Injections : certains animaux recevront entre 1 et 8 injections, réalisées sur animal vigile ou sous anesthésie selon la nature de l’intervention. Chaque injection dure quelques secondes. Lorsque l’intervention est susceptible d’induire une douleur, un traitement analgésique préventif est administré en amont. Ces traitements analgésiques sont intégrés au nombre total d’injections prévues. Injection sous anesthésie générale : pour un groupe spécifique, une injection nécessaire à l’induction du modèle expérimental sera réalisée sous anesthésie générale de très courte durée. Le geste dure quelques minutes. Un traitement analgésique sera ensuite maintenu pendant la phase d’observation. Chirurgie : certaines souris subiront une unique intervention chirurgicale de moins de 30 minutes. Cet acte sera réalisé sous anesthésie générale profonde, associée à des traitements analgésiques préventifs locaux et généraux. Les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l’hypothermie liée à l’anesthésie. Contrôle de l’alimentation ou de l’accès à l’eau : avant le début de certaines expériences, certains animaux vigiles seront soumis à une période unique et temporaire de retrait de la nourriture ou de l’eau, d’une durée comprise entre 12 et 48 heures selon la procédure concernée. Cette étape est nécessaire pour standardiser leur état métabolique ou reproduire les conditions physiopathologiques du modèle.

Impact sur les animaux

Des périodes de contrôle alimentaire sont prévues et peuvent induire une sensation de faim, une baisse transitoire d’activité et une gêne liée au jeûne. Un contrôle alimentaire plus prolongé peut majorer la sensation de faim, entraîner une perte de poids transitoire et une altération temporaire de l’état général. Un contrôle hydrique est également prévu et peut induire une sensation de soif et une gêne transitoire. La contention, les manipulations répétées, les administrations et les prélèvements réalisés sur animaux vigiles peuvent induire un stress aigu transitoire, une réaction d’évitement et une détresse ponctuelle. Le placement en dispositif de contention pour certaines administrations, ainsi que la répétition de gestes techniques au cours de certaines procédures, peuvent majorer ce stress transitoire. Certaines étapes impliquent une anesthésie et une intervention chirurgicale, susceptibles d’induire un stress physiologique, une baisse transitoire de la thermorégulation et, plus rarement, une détresse cardio-respiratoire pendant l’anesthésie ou au réveil. Certaines administrations nécessitent un réchauffement transitoire, pouvant constituer un stress thermique. Les prélèvements sanguins peuvent induire une douleur légère et transitoire, ainsi qu’un risque d’hématome ou de saignement local. Les administrations par injection peuvent induire une douleur brève au point d’injection et une irritation locale ; lorsqu’elles sont répétées, elles peuvent augmenter le risque de réaction inflammatoire locale et de complication interne. Les administrations intramusculaires peuvent induire une douleur locale et une gêne locomotrice transitoire. L’intervention chirurgicale peut induire une douleur post-opératoire, un risque d’inflammation locale, un risque d’infection et une altération transitoire de la mobilité. L’induction expérimentale de lésions aiguës peut entraîner une maladie avec inconfort, douleur modérée, baisse d’activité, troubles transitoires de l’alimentation et de l’hydratation.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Notre laboratoire met en œuvre, en amont des expérimentations animales, des approches de remplacement visant à limiter le recours aux animaux lorsque cela sera possible. Les phases exploratoires et de mise au point reposent notamment sur des modèles in vitro (essais sur des cultures de cellules) et sur des approches in silico, utilisés pour tester des hypothèses, optimiser des conditions expérimentales et sélectionner les paramètres à mesurer. Toutefois, les objectifs de ce projet nécessitent des investigations in vivo. Les modèles retenus reposent sur l’induction de lésions d’organes ainsi que sur l’évaluation de leurs conséquences métaboliques. Ces phénomènes impliquent des interactions intégrées entre plusieurs organes et systèmes (notamment immunitaire, métabolique et nerveux). À ce jour, aucun modèle in vitro ou in silico ne permet de reproduire de façon suffisamment fidèle l’ensemble de ces interactions et leur dynamique dans un organisme entier, ni d’évaluer de manière intégrée les effets des procédures sur l’état général, la réponse inflammatoire et les paramètres biologiques mesurés aux temps précoces définis. En conséquence, l’expérimentation animale reste indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un nombre total maximal de 240 souris. La stratégie de réduction repose sur l’optimisation du plan expérimental afin de limiter le nombre d’animaux utilisés tout en maintenant la validité scientifique des résultats. Afin de réduire le recours à des animaux témoins distincts, chaque animal sera utilisé, lorsque le protocole le permet, comme son propre contrôle, grâce à la réalisation de prélèvements ou de mesures avant et après l’administration expérimentale. Cette approche permet des comparaisons pour un même individu et contribue à limiter le nombre total de souris nécessaires au projet. Par ailleurs, les expérimentations seront regroupées et planifiées de manière à mutualiser les lots lorsque cela est possible. Plusieurs tissus seront prélevés chez un même animal et utilisés pour différentes analyses afin de maximiser les informations obtenues. De plus, les échantillons seront partagés avec des collaborateurs dans un cadre défini afin d’éviter la réalisation d'expériences redondantes et de limiter la production de nouveaux lots d’animaux. La taille des effectifs a été établie de manière stricte grâce à un calcul de puissance : cette méthode permet de déterminer l’effectif minimal nécessaire pour observer un effet. En conséquence, chaque groupe expérimental comprendra 15 souris, ce qui permet de prendre en compte la variabilité naturelle entre les individus tout en limitant le nombre d’animaux. Enfin, sur ces effectifs réduits, il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques rigoureux pour garantir une interprétation fiable et solide des résultats.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et de prise en charge des animaux respecteront strictement la réglementation en vigueur ainsi que les pratiques validées au sein de l’établissement utilisateur. Les animaux seront hébergés en cages collectives, avec un accès permanent à une alimentation standard et à l’eau ad libitum, sauf lorsque des périodes de privation ou de restriction seront explicitement prévues par certaines procédures expérimentales. L’environnement sera enrichi par la mise à disposition de matériaux de nidification et d’abris, afin de favoriser l’expression de comportements naturels et de limiter le stress. Une surveillance clinique régulière, adaptée à chaque procédure, sera assurée tout au long du projet. Elle permettra l’identification précoce de tout signe de mal-être ou d’altération de l’état général, tels qu’une diminution de l’activité, une posture anormale, une piloérection ou des modifications du comportement. Des points limites spécifiques à chaque modèle expérimental sont définis afin de limiter la douleur, la souffrance ou la détresse des animaux. L’apparition d’une altération marquée de l’état général ou de signes cliniques sévères conduira à une évaluation immédiate et, le cas échéant, à l’arrêt anticipé de la procédure pour l’animal concerné. Les sites d’injection et, lorsque cela est applicable, les zones chirurgicales feront l’objet d’une observation régulière afin de détecter précocement toute réaction locale ou complication. Un suivi attentif sera également assuré après les administrations ou les interventions chirurgicales, en particulier durant les phases critiques définies pour chaque procédure. Des mesures adaptées de prise en charge seront mises en œuvre afin de limiter l’inconfort lié aux actes expérimentaux, incluant le recours à des protocoles d’anesthésie et d’analgésie appropriés ainsi que des mesures de maintien de la température corporelle lorsque cela est nécessaire. En cas de diminution de la prise alimentaire, un apport nutritionnel complémentaire sous forme de gel alimentaire pourra être mis à disposition afin de garantir un apport énergétique suffisant. L’ensemble des actes expérimentaux sera réalisé par du personnel formé et habilité à l’expérimentation animale, conformément aux exigences réglementaires, afin d’assurer des manipulations maîtrisées, reproductibles et respectueuses du bien-être animal.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet seront des souris, incluant des souris commerciales non transgéniques et des souris génétiquement modifiées pour cibler des gènes spécifiques liés aux maladies étudiées. Ces souris sont fertiles, possèdent un système immunitaire normal et ne présentent aucun problème de santé lié à leur génétique dans des conditions d’élevage classiques. Le choix de la souris se justifie par la pertinence de cette espèce pour étudier les inflammations aiguës, les lésions des organes et les mécanismes de mort des cellules. La souris permet d’explorer globalement les interactions entre les systèmes immunitaire, métabolique et sanguin, qui sont au cœur de ce projet. Ces réactions complexes à l'échelle de l'organisme entier ne peuvent pas être reproduites de façon adéquate par des méthodes alternatives (comme des cultures de cellules). De plus, la souris constitue un modèle de référence pour lequel il existe une grande expertise en élevage, en soins vétérinaires, et de nombreux outils d’analyse fiables. La disponibilité de souris génétiquement modifiées et la grande similitude des mécanismes biologiques étudiés avec ceux observés chez l’humain rendent cette espèce particulièrement adaptée à nos objectifs. Les animaux seront utilisés à partir de l'âge de 8 semaines. À ce stade, les souris ont terminé leur développement et présentent un système immunitaire et un métabolisme adultes, ce qui est indispensable pour garantir la fiabilité scientifique des résultats de cette étude.

Jusqu'à trente gavages et cinq privations d'eau de quinze heures trente en cinq jours : 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. S'y ajoutent une prise de sang et jusqu'à trois injections sur animal vigile, un isolement quotidien d'environ une heure pour mesurer la prise de boisson, et deux passages en pot de plastique jusqu'à ce que l'animal défèque. Le projet cherche à savoir si les souris qui absorbent mal le fructose en boivent moins par aversion, et si leur microbiote en est la cause. Toutes seront tuées pour prélever le cæcum et son contenu.

Objectifs

Le fructose est un sucre très présent dans notre alimentation et mal absorbé lorsqu’il est consommé en excès, on parle de malabsorption du fructose. Cette malabsorption, très fréquente chez les enfants et les jeunes adultes, cause des symptômes gastrointestinaux (production excessive de gaz, diarrhées, douleurs abdominales) et peut induire une sensation de satiété. Nous étudions ce phénomène à l’aide de modèles de souris qui présentent les mêmes difficultés d’absorption du fructose que les humains. Nous avons constaté que le fructose, consommé lors d’un repas ou sur le long terme : augmente une hormone digestive pouvant jouer un rôle dans les douleurs intestinales et la prise alimentaire, modifie la composition du microbiote intestinal, et change le comportement alimentaire des animaux : ils mangent moins pendant les deux premiers jours d’exposition au fructose, puis reviennent à la normale à partir du sixième jour. Nous voulons comprendre si dans ce contexte de mauvaise absorption du fructose, ces changements de comportement alimentaire traduisent un phénomène d’aversion (réaction négative ou ressentiment fort qui pousse à éviter ou à rejeter quelque chose) puis d’habituation suite à la consommation ponctuelle ou répétée à ce sucre et identifier les médiateurs biologiques impliqués. Nous souhaitons savoir si ces modifications de la prise alimentaire sont liés aux changements du microbiote et si ce dernier en est la cause directe. Pour cela, nous comparerons des souris normales à des souris qui absorbent mal le fructose, traitées ou non par des antibiotiques déplétant le microbiote. Elles recevront un régime sans fructose, puis seront soumises à un test visant à évaluer leur préférence ou leur refus de la solution de fructose par rapport à une solution neutre telle que l’eau, un test d’aversion lors d’une exposition ponctuelle, dite « aigüe » (5 min) ou répétée, dite « chronique » (10 jours) à ce sucre. Ce test a pour but de comparer le volume de fructose ingéré sous forme liquide dans la boisson à celui de l’eau afin d’évaluer la préférence de boisson des animaux et ainsi leur potentiel refus (aversion), vis-à-vis de ce sucre. Nous analyserons aussi le microbiote et marqueurs biologiques potentiellement liés à ces modifications du comportement alimentaire. L’objectif est de mieux caractériser la malabsorption du fructose et les mécanismes associés en clarifiant le lien entre le fructose, le microbiote, la douleur viscérale et la prise alimentaire.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est d’identifier les mécanismes impliqués dans les changements de comportement alimentaire observés chez les souris qui n’absorbent pas bien le fructose, suite à une exposition répétée ou ponctuelle à ce sucre. En effet, cela permettra de mieux comprendre la mise en place de ce phénomène et de déterminer s’il existe un lien entre ces changements de comportements alimentaires, la douleur intestinale, et les changements du microbiote. En effet, l’identification des médiateurs biologiques impliqués dans l’établissement de ces symptômes de malabsorption du fructose, pourraient permettre de développer à terme, de meilleures stratégies alimentaires ou thérapeutiques et ainsi améliorer la qualité de vie des personnes atteintes. De plus, on retrouve des symptômes similaires dans le syndrome de l’intestin irritable (SII), qui est le désordre intestinal le plus fréquent, avec 14,4 à 22 % des patients atteints qui n’absorbent pas bien le fructose. Ainsi, compte tenu de la forte prévalence du SII dans le monde, et d’un pourcentage non négligeable de malabsorption du fructose parmi les patients atteints de SII, il semble crucial d’en décrypter les mécanismes sous-jacents.

Procédures

Les animaux seront soumis à un et/ou deux tests comportementaux ayant pour objectif d’évaluer leur réaction (refus ou préférence) vis-à-vis du fructose via la mesure de sa consommation dans la boisson. Au cours de ce protocole qui durera au total 5 jours, les souris seront soumises à 5 périodes de restriction d’eau de 15h30, à un hébergement individuel (de courte durée (1h05/jour) nécessaire pour mesurer la prise hydrique, à un prélèvement sanguin (moins de 20 secondes) à l’état vigile, à maximum 3 injections (moins de 20 secondes/ injection) à l’état vigile, à maximum 30 gavages (moins de 20 secondes / gavage) à l’état vigile ainsi qu’à de la contention (quelques secondes) à l’état vigile. Les animaux seront soumis à deux prélèvements de fèces au total, au cours desquels les animaux seront placés dans un pot transparent, le temps (maximum 10 minutes) qu’ils évacuent deux fèces.

Impact sur les animaux

Les animaux seront susceptibles d’être seront susceptibles d’être soumis : A un stress et une potentielle déshydratation, lors des périodes de test de préférences et de mesure de la prise hydrique, nécessitant une période de restriction d’accès à l’eau. • A un stress lors de l’hébergement individuel de courte durée, nécessaire pour mesurer la prise hydrique au cours des tests d’aversion, lors de la récolte de fèces impliquant le placement de la souris dans un pot en plastique afin qu’elle émette des selles et lors du prélèvement de sang, nécessitant une contention de moins de 20 secondes. Au cours de ce prélèvement et des injections prévues, les animaux ressentiront une légère douleur due à la piqûre, de l’ordre de quelques secondes.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié afin de prélever certains tissus (caecum et contenu de caecum).

Remplacement

À ce jour, aucun modèle ou technique in vitro ou ex vivo ne permet de reproduire les interactions complexes entre le fructose, le microbiote et l’axe intestin-cerveau. Le recours à des animaux est donc indispensable pour intégrer et analyser de manière globale les données génétiques, physiologiques, du microbiote et de l’alimentation ainsi que les informations biologiques obtenues à partir des dosages hormonaux dans le sang et des analyses des tissus intestinaux et cérébraux.

Réduction

Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental et par génotype afin d’obtenir des résultats fiables et significatifs. Ce nombre a été déterminé en prenant en compte la variabilité des mesures de prise hydrique et des dosages ainsi que la variabilité connue des réponses du microbiote et de son adaptation au fructose. Pour analyser les résultats, nous utiliserons des méthodes statistiques adaptées, en fonction du type de données recueillies, pour garantir des conclusions solides et précises. Dans cette perspective de réduction, nous prévoyons de n’inclure qu’un seul groupe contrôle, valable pour l’ensemble des groupes tests.

Raffinement

Pour assurer le bien-être des animaux, plusieurs mesures seront mises en place : • Un enrichissement du milieu de vie : Les souris disposeront de papier sopalin pour construire leur nid, d’un bâton à ronger, d’un abri en propylène rouge, ainsi que de deux hamacs pour réduire les risques de bagarres. • Les animaux seront en groupe ; • Une habituation à la contention : Les animaux seront habitués à la contention et à l’expérimentateur afin de minimiser leur stress pendant les manipulations expérimentales ; • Cages des souris placées côtes à côtes sur le même portoir dans des cages transparentes lors de l’hébergement individuel nécessaire au test de préférence et de mesure de la prise hydrique d’aversion ; • Une surveillance et une pesée seront réalisées quotidiennement pendant la période du test d’aversion, pour contrôler l’état des animaux et s’assurer de leur bien-être tout au long du test et pouvoir intervenir ; • Des points limites seront définis et appliqués.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé dans les recherches sur les maladies gastro-intestinales, en raison de sa pertinence scientifique. Nous disposons de données préliminaires sur ces modèles génétiques originaux, qui sont disponibles uniquement chez la souris et indispensables pour notre étude. De plus, la souris possède les mêmes transporteurs et enzymes impliqués dans le métabolisme du fructose que l’humain ce qui renforce sa pertinence pour cette étude. Enfin, la malabsorption du fructose observée chez l’homme l’est également chez la souris et fait intervenir chez l’un comme chez l’autre, une altération dans la voie du métabolisme du fructose. Les groupes de souris seront testées pour l’aversion au fructose à 7 semaines d’âge, ce qui correspond chez l’humain à environ la tranche d’âge « 18-25 ans », groupe démographique étant le plus grand consommateur de fructose dans la population humaine.