Procédures modérées

2850 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Une partie developpe un lupus induit par une application sur l'oreille, l'autre porte une mutation qui declenche spontanement la maladie, avec selon le porteur rash, aphtes, arthrite, nephrite, anemie et atteintes cardiovasculaires, avant que toutes recoivent des composes par gavage puis soient tuees pour analyse des tissus. Le porteur affirme que le recours aux modeles animaux est "indispensable" et s'appuie sur des modeles utilises en routine depuis cinq ans dans l'etablissement. Les benefices avances, de nouvelles therapies pour les patients, restent renvoyes au long terme.

Objectifs

Le lupus érythémateux systémique est une maladie hétérogène, d'origine auto-immune, caractérisée par la présence d'auto-anticorps anti-nucléaires. La prévalence est estimée à environ 1 pour 1000 (variation en fonction des ethnies, rapport femmes/hommes de 10:1). Le lupus peut atteindre tous les organes et se répercute sur la qualité de la vie. Il se manifeste par les symptômes suivants : rash sur la face, aphtes, photosensibilité, arthrite, néphrite, troubles neurologiques, anémie, thrombocytopénie, atteintes cardiovasculaires, pulmonaires, digestives. Les objectifs du traitement sont de traiter les épisodes aigus qui peuvent compromettre le pronostic vital et minimiser les risques de poussées pendant les périodes de relative stabilité. De nombreux patients ne répondent pas aux traitements actuels qui reposent sur l'hydroxy-chloroquine, les antiinflammatoires non-stéroïdiens, les corticoïdes et les immunosuppresseurs, l'anticorps monoclonal anti-CD20. Des traitements plus performants sont nécessaires. Galapagos a mis au point plusieurs tests in vitro permettant d’induire différentes voies de signalisation impliquées dans l'inflammation dans des cellules humaines ou murines. Grâce à la miniaturisation, nous avons pu mener plusieurs campagnes de criblage à haut débit qui ont permis d’identifier des molécules chimiques ou des cibles biologiques capables de bloquer ces voies de signalisation in vitro. Ces molécules vont être optimisées dans le but d’en faire des médicaments. Dans le cadre de ce projet, les candidats-médicaments qui auront montré un potentiel significatif d’inhibition des voies de signalisation ciblées dans les différentes pathologies seront retenus pour être évalués in vivo sur des modèles animaux du Lupus. Ce programme de découverte de médicaments sera mené avec plusieurs séries chimiques agissant via des modes d’action moléculaires différents, mais tous pertinents dans l’objectif de diminuer les symptômes des différentes pathologies d’intérêt. Des combinaisons entre ces modes d’actions seront envisagées au cours de ce programme et testées sur les modèles animaux. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients Lupus.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles du Lupus chez la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Le poremier modèle sera induit par un agent en application topique sur l'oreille et le second modèle sera des souris génétiquement altérées à phénotype dommageable qui developpent spontanément la maladie. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques du lupus érythémateux systémique qui se carractérisent par un rash sur la face, des aphtes, de la photosensibilité, de l'arthrite, une néphrite, desn troubles neurologiques, une anémie, une thrombocytopénie ainsi qu'atteintes cardiovasculaires, pulmonaires et digestives.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce et les tissus seront collectées pour une étude de la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. Les paramètres mesurés seront gardés ou exclus selon qu'ils suivent une distribution normale et présentent une variabilité acceptable.L'analyse statistique concerne des séries indépendantes, supérieures à 2 groupes. L'analyse de variance (ANOVA) sera suivie d'un test paramétrique ou non paramétrique en fonction de la configuration de l'étude, permettant des comparaisons multiples (e.g. Dunnett). Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé par inhalation d’isoflurane (induction 4%, maintien 2%). De la buprénorphine à 0,01-0,2 mg/kg/8h en sous cutanée sera utilisée en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal.

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature

1848 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de tumeur sous la peau puis des traitements, avant d'etre tue pour des prelevements, le resume restant tres bref sur le deroule des procedures. Le porteur prevoit une mise a mort par dislocation des qu'un point limite est atteint et administre le butyrate dans l'eau de boisson pour limiter les manipulations. Il qualifie le recours a l'animal d'"incontournable", jugeant impossible de reproduire le systeme immunitaire et ses interactions hors d'un organisme vivant.

Objectifs

Les acides gras sont naturellement présents dans la circulation sanguine et sont utilisés comme source d’énergie par le corps humain. Lorsque ces acides gras possèdent 6 atomes de carbones ou moins, ils sont qualifiés d’acides gras à chaines courtes (AGCC). Lors d’une précédente étude, nous avons démontré que des souris recevant une boisson enrichie en butyrate (AGCC possédant 4 atomes de carbones) et traitées avec un anticorps monoclonal (médicament fabriqué en laboratoire qui est capable de se fixer spécifiquement sur une cible désignée) présentaient une réponse anti-tumorale significativement réduite par rapport aux souris également traitées mais buvant de l’eau normale. Une observation similaire a été faite dans une étude clinique chez l’homme : des concentrations plus élevées en AGCC (butyrate ou propionate, respectivement 4 et 3 carbones) ont été mises en évidence dans le sang des patients n’ayant pas répondu à un traitement par anticorps monoclonal. Ce projet a pour but de déterminer si l’efficacité d’un traitement par un type d’anticorps monoclonal (anticorps actuellement le plus fréquemment utilisée chez l’homme pour combattre le cancer) pouvait également être altérée par le butyrate. Si c’est le cas, le butyrate pourrait alors devenir une molécule prédictive de la réponse au traitement anti-cancéreux. Evaluer les effets des acides gras à chaine courte (AGCC) sur la réponse anti-tumorale et mettre en évidence les mécanismes immunosuppresseurs induits par les AGCC (butyrate et propionate) induisant une résistance aux médicaments ciblant et bloquant les checkpoints immunitaires.

Bénéfices attendus

Le butyrate (et dans une moindre mesure le propionate) sont décrits comme pouvant réduire l’activité du système immunitaire : en grandes quantités, ils vont faire pencher la balance immunitaire en faveur d’une tolérance (pouvant expliquer la tolérance vis-à-vis de la tumeur). La compréhension des mécanismes d’actions permettrait de proposer des molécules bloquant l’action des AGCC qui pourraient, à terme, être utilisées chez l’homme en combinaison des traitements actuels pour augmenter les chances de réponses.

Procédures

Greffes de tumeurs par voie sous-cutanée.

Impact sur les animaux

Nuisances dues à la présence de tumeurs greffées en sous-cutané, et d'administrations de médicaments.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvements post-mortem et analyses.

Remplacement

Ce projet nécessite de travailler sur des souris vivantes car il est actuellement impossible de reproduire les mécanismes du système immunitaires ex-vivo du fait de sa complexité . Les modèles in-silico et in-vitro sont importants et permettent de tester les hypothèses développées dans une certaine mesure. Cependant ces modèles présentent rapidement leurs limites : ce projet s’intéresse à la modulation du système immunitaire en fonction de la concentration en AGCC. Les expérimentations font donc appel aux interactions s’établissant entre plusieurs systèmes complexes (système digestif, système immunitaire …) qui ne peuvent être reproduit in-vitro. Le caractère incontournable du recours à l’animal est de nous permettre d’étudier, dans sa globalité, la modulation du système immunitaire (et ses interactions avec les autres systèmes complexes). Pour l’heure, il reste impossible de reproduire le système immunitaire et ses interactions avec les autres systèmes ex-vivo.

Réduction

Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre de souris nécessaire grâce au logiciel G*Power et d’après le critère le plus pertinent : le volume tumoral. Le nombre d’animaux a été calculé à l’aide d’un test Wilcoxon-Mann-Whitney et d’après les moyennes et les écarts types obtenus après 23 jours de croissance tumorale (plus grande différence de surface entre les groupes de souris). Les variables obtenues et utilisées dans le calcul sont les suivantes : « effect size d » = 0.954, α=0.05 et « Power » =0.85.

Raffinement

Les injections seront faites sous anesthésie locale (lidocaïne) ou générale (isoflurane). Les prélèvements de sang se feront au niveau la veine submandibulaire pour réduire la douleur au long terme induite par ce genre de procédure. De plus, au moment du prélèvement, les souris seront maintenues sous anesthésie par isoflurane (1 à 1.5L/min d’air à une concentration de 1.5 à 2% d’isoflurane) et nous vérifierons que les souris sont bien endormies avant de procéder à la piqûre. Les souris seront également surveillées jusqu’à leur réveil pour contrôler le bon rétablissement après anesthésie. Les cages seront enrichies avec du sizzle nest et des tubes en carton permettant de réduire le stress induit à chaque fois qu’elles seront manipulées. De plus lors de leur arrivée dans l’animalerie, les souris seront placées en quarantaine pendant 1 semaine pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement. Les acides gras administrés aux souris seront directement présents dans l’eau de boisson. Cela réduit fortement l’angoisse et la douleur engendrées chez les souris car cela évite des administrations de produit quotidiennement par gavage ou par injection intrapéritonéale. Enfin les souris ayant reçues des cellules tumorales seront surveillées quotidiennement et la détection de points limites entrainera un sacrifice par dislocation.

Choix des espèces

Le butyrate a montré qu’il était capable d’inhiber de la réponse anti-tumorale aux immunothérapies chez la souris. Il est donc cohérent de poursuivre la caractérisation des mécanismes d’actions dans ce modèle animal. Les anticorps bloquant les checkpoints immunologiques CTLA-4 et PD-1 que nous souhaitons étudier ont été développés et optimisés chez la souris et ont fait leurs preuves. Nous utiliserons deux modèles syngéniques : BALB/c et C57Bl/6. Ces modèles sont capables de porter des tumeurs décrites comme sensibles aux immunothérapies (CT26 et MC38 et B16K1). Les souris BALB/c et C57Bl/6 possédant des fonds génétiques différents, les mécanismes impliqués dans la réponse anti-tumorale varient également. Un parallèle peut être fait avec l’homme dont la diversité génétique explique les variabilités de réponse face aux traitements. Nous intéresserons également à un modèle tumorale capable de faire de la dissémination métastatique (4T1) qui ne peut être greffé que sur le modèle BALB/c. Les souris qui seront utilisées auront au minimum 8 semaines. Elles auront d’une part atteint la maturité sexuelle et d’autres part, elles auront fini de développer leur système immunitaire. Travailler sur le système immunitaire mature des souris permettra, en partie, de faire le parallèle avec celui de l’homme.

96 souris glaneuses vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Les jeunes sont separes de leur mere aux jours 9 et 12 pour enregistrer leurs cris de separation, puis testes en champ ouvert et face a un objet nouveau aux jours 35 et 50, avant d'etre tues au jour 55 pour peser leurs organes, dont les glandes surrenales comme marqueur de stress. Le porteur reconnait que la separation maternelle peut, dans de rares cas, conduire la mere a un infanticide et que les tests repetes imposent un stress. Il affirme qu'une etude du comportement individuel ne peut se passer d'animaux, l'objectif etant de mesurer l'effet de l'age de la mere sur la personnalite de la descendance.

Objectifs

Les effets de l'âge maternel sur le développement de la personnalité de la progéniture ont rarement été étudiés dans des modèles animaux. Dans notre étude, nous visons à examiner les différences potentielles de différences individuelles cohérentes dans le comportement (c'est-à-dire les différences de « personnalité ») entre la progéniture née de mères jeunes et âgées. Ceci sera fait par le phénotypage comportemental des jeunes. Tout d'abord, pendant la période de nidification, cela se fait par des tests répétés de vocalisation de séparation, libérant généralement des fréquences variables de cris de séparation ultrasoniques chez les petits. Plus tard, après le sevrage, nous effectuons deux tests combinés, qui sont également répétés, les tests en champ libre et directement après, un nouvel objet est introduit dans l'arèneet l'exploration de l'objet par l'animal est quantifiée. Ainsi, ces deux tests servent à quantifier des différences individuelles cohérentes (différences de personnalité) dans la tendance à l'exploration. Le premier type de test a été fréquemment utilisé pour phénotyper les différences individuelles chez les jeunes mammifères, y compris chez les souris. En outre, la tendance à l'exploration, quantifiée par des tests de champs libre et des tests du nouvel objet, est un trait de personnalité clé chez de nombreuses espèces de petits mammifères.

Bénéfices attendus

Nous pourrons mettre en évidence la contribution de l'âge de la mère dans la personnalité de la progéniture, ce qui est un aspect jusqu'à présent peu exploré des caractéristiques maternelles dans ce contexte. Deuxièmement, en associant les vocalisations ultrasoniques des petits en réponse à la séparation à leur tendance à l'exploration lors des tests effectués après le sevrage, nous serons en mesure de conclure dans quelle mesure les vocalisations au cours de la vie précoce sont prédictives des différences de personnalité au cours des étapes ultérieures de la vie.

Procédures

Seules des mesures comportementales seront effectuées. Les tests suivants sont effectués sur des animaux vigiles : (1) Une séparation maternelle est effectuée les jours postnatals 9 et 12 (5 minutes chacun), c'est-à-dire pendant la période de nidification. Au cours de ce test, on quantifie la fréquence des vocalisations non ultrasoniques des animaux lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs (appel de séparation). (2) Les jours postnatals 35 et 50 (5 minutes chacun), les animaux sont introduits dans une nouvelle arène et leur exploration et leur activité locomotrice sont quantifiées. Directement après ces 5 minutes de test, un nouvel objet (une boîte métallique, par exemple) est introduit dans l'arène et les réponses de l'animal (pendant les 5 minutes suivantes) à ce nouveau stimulus sont quantifiées.--- Au total, chaque individu sera soumis à 6 tests comportementaux entre les jours postnatals 9 et 50, chaque test ayant une durée de 5 minutes. -- Une fois l'expérimentation terminée, les animaux sont euthanasiés au jour postnatal 55 et seront disséqués par la suite.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux que nous utilisons peuvent être considérés comme peu ou modérément invasifs. De brèves séparations des petits de leur mère, comme cela a été fait lors du test de vocalisation de séparation aux jours 9 et 12, peuvent, dans de rares cas, conduire à un infanticide par la mère. En outre, les tests répétés aux jours 35 et 50 peuvent imposer un certain stress aux jeunes. Cependant, nous considérons que les effets négatifs d'un tel stress plutôt léger ou modéré n'affecteront pas notablement le bien-être.

Devenir

A la fin de la procédure, au jour postnatal 55, les 96 animaux expérimentaux seront euthanasiés. Ensuite, les animaux seront disséqués et nous allons mesurer et peser leurs organes. Sur la base de ces données, nous comparerons, par exemple, le poids des glandes surrénales (en tant que marqueur du stress chronique) entre les petits issus de mères âgées et de mères jeunes.

Remplacement

Les conséquences de l'âge maternel sur l'émergence de différences individuelles constantes de comportement ("différences de personnalité") ne peuvent être évaluées par d’autres moyens que ceux où l’utilisation d’animaux est requise. S’agissant d’une étude sur le comportement des individus il n’est pas possible de se passer des animaux.

Réduction

Selon notre hypothèse, la cause sous-jacente des différences potentielles de personnalité entre les descendants de mères jeunes et de mères âgées sont les effets de l'âge des mères, qui trouvent donc leur origine au niveau maternel. Ainsi, il est nécessaire de tester un nombre suffisamment élevé de mères, c'est-à-dire 12 portées de mères jeunes et 12 portées de mères âgées. Cependant, il est également nécessaire de tester plusieurs jeunes par portée afin de démêler les effets de facteurs tels que le sexe et la masse corporelle des jeunes, qui peuvent également influencer l'émergence de différences de personnalité. Ainsi, nous avons décidé de tester 4 jeunes par portée, de préférence 2 mâles et 2 femelles. Cette stratégie nous permettra également de garder les 4 frères et sœurs ensemble dans un groupe après le sevrage, ce qui est favorable du point de vue du bien-être animal. La taille d'échantillon (au total: N = 96 animaux expérimentaux) nécessaire pour obtenir des résultats fiables a été calculée par un test de puissance.

Raffinement

Des enrichissements environnementaux (matériaux de nidification, rondins à ronger) seront fournis aux animaux à tout moment, aux couples reproducteurs ainsi qu'aux jeunes après le sevrage. Après le sevrage, les animaux expérimentaux (N = 96) sont toujours gardés en groupe avec leurs frères et sœurs de la même portée, ce qui leur procure un environnement social stable. En outre, la présence de frères et sœurs apporte généralement un soutien social et contribueront ainsi à amortir les conséquences négatives du stress. Tous les transferts d'animaux d'une cage à une autre ou à un dispositif de test se feront sans manipulation directe mais par l'utilisation d'une petite boîte dans laquelle l'animal sera encouragé à entrer. Les différents tests auxquels les animaux sont soumis sont brefs (5 minutes chacun) et peu invasifs. Lorsque les jeunes sont séparés de leur mère lors des tests effectués pendant les jours postnatals 9 et 12, nous empêchons le refroidissement des jeunes par un sol chauffé à 30°C dans le cadre du test. En outre, pour éviter efficacement un éventuel infanticide de la mère lors du retour au nid, nous avons pris diverses mesures, par exemple : utilisation de gants portant uniquement l'odeur de la portée particulière, séparation courte seulement, la mère n'entendra pas les cris de séparation des petits pendant la procédure. Un point limite majeur de cette expérimentation est d'éviter l'utilisation de petits pour le test de vocalisation de séparation dont la température corporelle s'est déjà refroidie trop bas avant l'expérience. Il s'agit d'un processus réversible, qui peut se produire car certains petits, au cours de leur dynamique naturelle dans le nid, perdent parfois temporairement le contact avec leurs frères et sœurs de portée avant d'être récupérés au nid par la mère. Par conséquent, lorsque nous sortons les petits pour l'expérimentation, nous mesurons leur température de surface corporelle à l'aide d'un thermomètre infrarouge sans contact. Seuls les petits dont la température de surface corporelle est supérieure à 34°C sont utilisés. Si la température de surface corporelle du petit choisi est trop basse, il est ramené au nid et peut être testé après 1-2 heure, lorsqu'il s'est remis de son épisode de basse température. Les tests comportementaux aux jours postnataux 35 et 50 donnent généralement aux animaux la possibilité d'adopter une solution comportementale qui leur convient.

Choix des espèces

La souris glaneuse a, dans des conditions naturelles, une durée de vie très courte. Seuls les juvéniles nés pendant les mois d'été survivent à l'hiver. Pour cette raison, le schéma suivant se dessine : (1) Au printemps, toutes les femelles qui se reproduisent sont primipares mais sont les vieilles femelles (environ 7-8 mois) nées au cours de l'année précédente. (2) Plus tard au cours de la saison de reproduction, les mères sont principalement nées au cours de la même année (=des mères plus jeunes). Il existe des différences distinctes dans l'âge maternel au printemps et en été chez cette espèce. Notre projet utilise ce phénomène intéressant de l'histoire de vie de cette espèce, et explorera dans une étude en laboratoire si les différences d'âge maternel conduisent à des différences de personnalité chez la progéniture. Nous quantifierons la vocalisation des jeunes pendant la période de pré-sevrage, vers les jours 9 et 12. À cet âge, les petits émettent des cris de séparation ultrasoniques lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs. Plus tard, à l'âge de 35 et 50 jours (stade juvénile, avant la maturité), nous testerons la tendance à l'exploration des animaux dans une arène ouverte et lorsqu'ils sont confrontés à un nouvel objet. Des études précédentes ont montré que tester les animaux à ces jours est approprié, car ils sont généralement très motivés pour explorer l'arène de test.

80 souris modeles de la trisomie 21 vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal est gave quotidiennement pendant dix-sept jours avec une molecule a visee therapeutique ou sa forme inactive, subit un poincon d'oreille pour le genotypage, passe des tests de memoire spatiale et de reconnaissance d'objets, puis est tue pour doser l'effet du compose dans le cerveau. Le porteur indique que les gavages repetes peuvent devenir douloureux et espere une amelioration des performances cognitives du modele. Il affirme que l'etude de ces deficiences intellectuelles d'origine genetique passe par un organisme vivant proche de l'homme, sans autre methode possible.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observées dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent de tester 1 nouveau composé (et 1 composé non fonctionnel, utilisé comme contrôle négatif) pour leur propriété à améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer si ce composé sera efficace en terme de restauration des fonctions intellectuelles. En parallèle, le composé non fonctionnel devrait avoir aucun effet. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME (Administration, Distribution, Métabolisation et Excrétion) pharmacologique, par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une amélioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoires : mémoire de reconnaissance spatiale et mémoire explicite de reconnaissance d'objets) dans un modèle murin de trisomie 21, qui montre de faibles performances dans ces 2 tests. Cette amélioration sera caractérisée également par un dosage de l'activité de phosphorilation de Dyrk1a, activité qui devrait être diminuée par l'effet du composé testé. Les animaux traités avec la forme non active du composé devraient présenter les mêmes déficits que les individus contrôles sauvages non traités.

Procédures

Les animaux seront gavés quotidiennement avec des molécules à visée thérapeutique pour une durée maximale de 17 jours. Le temps du gavage est de 20 à 30 secondes maximum. Pour le genotypage des animaux, un poinçon d’oreille sera effectué, conjointement à la pose d'une bague d'identification . Ce geste est rapide et ne prend que quelques secondes

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages, au maximum 17 jours au total, soit 1 par jour. Stress léger et rapide dû à la pose de bague et prélèvement d'une biopsie d'oreille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des 17 jours de traitement. Les cerveaux seront prélevés pour réaliser un dosage de l'effet des molécules à visée thérapeutique.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposé.

Réduction

Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisés à partir de 3 mois, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons le composé sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. L'étude nécessitera 5 groupes de 16 animaux (8 femelles et 8 mâles), soit 80 souris au total. 13 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testerons 3 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état. Pour la manipulation des animaux, et afin de limiter le stress, nous utiliserons des tubes de manipulation, ce qui évite de les prendre par la queue. Les tubes seront laissés dans les cages d'élevage comme enrichissement du milieu. Les animaux seront élevés par groupe de 2 animaux minimum pour éviter l'isolement.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. En outre, le génome de la souris étant manipulable, il permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du syndrome de Down. Les souris seront étudiées à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 3 mois, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présents.

578 souris immunodeprimees vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une greffe de cellules de glioblastome humain dans le cerveau par ouverture du crane, puis des seances hebdomadaires d'imagerie sous anesthesie et des instillations nasales de candidats-medicaments, une moitie etant en plus irradiee, avant d'etre tuee pour analyser la progression tumorale. Le porteur decrit surtout le stress lie aux anesthesies repetees et prevoit une mise a mort des qu'un point limite de degradation est atteint. Il affirme qu'aucune alternative n'existe, les organoides cerebraux ne reproduisant pas selon lui la complexite du microenvironnement tumoral.

Objectifs

Avec plus de 3000 nouveaux cas par an en France, les récidives de gliomes de bas grade ainsi que les glioblastomes sont des tumeurs cérébrales avec un mauvais pronostic et pour lesquelles les traitements sont lourds mais peu efficaces. Néanmoins, la chirurgie en association à la radiothérapie et la chimiothérapie permet de prolonger de quelques mois la survie. En effet, la survie des patients après diagnostic n’excède pas 2 ans y compris après un traitement. Dans des études in vitro, nous avons sélectionné de nouvelles molécules qui en association avec la radiothérapie réduisent la croissance des cellules tumorales. Nous proposons de tester ces nouvelles molécules dans un modèle préclinique. La transplantation intracérébrale de cellules issues de gliomes humains chez des souris est le modèle de choix pour tester l’efficacité d’approches pharmacologiques en combinaison avec la radiothérapie.

Bénéfices attendus

Cette étude préclinique permettra d’évaluer l’efficacité in vivo de molécules pour réduire la croissance de cellules de gliomes. Ce travail pourra servir de référence pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques du cancer du cerveau le plus fréquent chez l’Humain adulte.

Procédures

L’opération de xénogreffe comporte 4 étapes : injection d’un antalgique, une anesthésie, ouverture minime de la boîte crânienne et injection de cellules issues de gliomes humains dans le cerveau de l’animal, pour une durée totale de l’opération de moins de 20 min par souris. L’imagerie par bioluminescence sera réalisée de façon hebdomadaire durant 5-9 semaines. Cette mesure nécessite une anesthésie gazeuse de l’animal pour 15-20 min et l’administration intrapéritonéale d’un composé. Deux mois après la greffe, les candidats-médicaments seront administrés par instillation nasale sous anesthésie légère à raison de 5 fois par semaine et pour 1 ou 3 semaines selon la procédure. L’administration est réalisée sous anesthésie gazeuse et dure moins de 5 min. Les jours de mesure de bioluminescence, l’administration sera réalisée au cours de la même anesthésie. La moitié des animaux sera exposée à une radiothérapie sous anesthésie gazeuse pour une durée de 20-30 min.

Impact sur les animaux

La nuisance majeure attendue de cette expérimentation concerne le stress provoqué par les anesthésies gazeuses répétées (opération de transplantation, instillations nasales). L’opération de transplantation est un acte chirurgical qui représente des effets indésirables mais celui-ci est bien maîtrisé et les animaux se rétablissent rapidement après l’opération. L’instillation nasale d’un petit volume d’une solution saline est une méthode non-invasive permettant l’administration de petites molécules qui vont diffuser dans le cerveau. Le stress lié à cette approche réside dans les anesthésies répétées, la contention et l’obstruction momentanée d’une narine. La radiothérapie requiert une anesthésie générale afin d’immobiliser l’animal mais l’exposition à l’irradiation ne génère pas de souffrance et la dose utilisée n’engendre pas d’effets néfastes.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélever le cerveau afin de réaliser des analyses histologiques et d’évaluer l’effets des composés pharmacologiques sur la progression tumorale.

Remplacement

Il n’existe actuellement aucune alternative à l’utilisation d’animaux pour l’étude du glioblastome, particulièrement en raison du microenvironnement tumoral qui joue un rôle défavorable et ne peut être reproduit dans un système in vitro. Des cultures d’organoïdes cérébraux sont en cours de développement mais ce modèle expérimental, dépourvu de certains types cellulaires impliqués dans la croissance tumorale, ne représente pas à ce jour toute la complexité du modèle in vivo.

Réduction

Dans ce projet, deux candidats-médicament seront évalués dont l’un d’entre eux est connu pour ne pas présenter d’effet indésirable in vivo. Des essais de non-toxicité pour la deuxième molécule seront réalisés au préalable et en cas d’effets cliniques néfastes, son utilisation sera interrompue ; l’étude sera limitée à la première molécule. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été défini en fonction de la littérature et notre expérience sur la variabilité des expériences de transplantation. Plusieurs types de cellules de glioblastomes représentant différentes caractéristiques des glioblastomes sont inclues dans cette étude. Les expérimentations seront réalisées indépendamment pour chacun des types de cellules de glioblastome et de façon séquentielle si bien qu’en cas d’évolution tumorale défavorable le protocole pourra être interrompu plus précocement et éviter l’utilisation de tous les groupes d’animaux.

Raffinement

Afin de protéger d’une éventuelle contamination par l’environnement, ces animaux immuno-déficients seront hébergés dans des conditions sanitaires strictes dans des cages avec un système de ventilation contrôlée. Mise en place d’un protocole d’anesthésie/analgésie. Mise en place d’un suivi clinique régulier avec l’aide d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés, d’un arbre décisionnel et de critères d’arrêt de souffrance. Des critères de point limite ont été établis et leur expression justifiera l’interruption de l’expérience et la mise à mort de l’animal pour lui éviter toute souffrance.

Choix des espèces

La greffe de cellules humaines sera réalisée sur des animaux immunodéprimés pour éviter tout rejet. Dans ce projet, nous utiliserons un modèle de souris présentant un thymus rudimentaire, connu pour supporter la transplantation et la croissance de cellules de gliomes humains dans leur cerveau. Par ailleurs, ce modèle de souris présente une faible radiosensibilité et permet l’étude de la radiothérapie contrairement à d’autres modèles de souris immunodéficientes. Le gliome est une tumeur cérébrale fréquente chez l’adulte qui affecte sans distinction les mâles et les femelles. Nous utiliserons donc des animaux adultes mâles et femelles.

36 souris vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal recoit une puce sous-cutanee sous anesthesie, passe des tests comportementaux (Live Mouse Tracker en arene, apprentissage sur ecran tactile) puis une injection d'un produit convulsivant qui provoque des myoclonies et quelques crises, avant d'etre tue par perfusion intracardiaque de fixateur pour prelever le cerveau. Le porteur fait l'hypothese d'alterations moderees du comportement, proches des troubles autistiques, et affirme qu'etudier le developpement du cerveau impose un "organisme entier". Les benefices avances relevent de la comprehension de maladies neurologiques dont l'autisme.

Objectifs

L’hormone thyroïdienne est essentielle pour le bon développement du cerveau chez les mammifères. Un défaut de celle-ci au cours du développement du cerveau induit des troubles neurologiques tels que retards mentaux, défauts de concentration, épilepsie, défauts de contrôle du mouvement. Les mécanismes par lesquels l’hormone thyroïdienne agit sur le cerveau sont mal compris. Il a été montré récemment qu'un récepteur de l’hormone thyroïdienne joue un rôle majeur, notamment dans les neurones dits inhibiteurs. Parmi ces neurones inhibiteurs, une sous-population particulièrement sensible a été identifiée : des neurones qui expriment une protéine appelée parvalbumine. Chez l’homme, des pathologies telles que l’autisme, l’épilepsie et la schizophrénie sont associés à un déficit de neurones à parvalbumine. De plus, chez la souris, l’invalidation du gène de la parvalbumine induit des altérations du comportement qui évoquent les troubles du spectre autistique. L’objectif de ce projet est d’évaluer si le blocage de l'hormone thyroïdienne uniquement dans les neurones à parvalbumine induit des modifications de comportement chez la souris. Nous faisons l’hypothèse que ces souris pourraient présenter des altérations modérées de leur comportement, potentiellement en lien avec les troubles autistiques.

Bénéfices attendus

L'étude du rôle de l’hormone thyroïdienne dans les neurones à parvalbumine permettra de mieux comprendre le développement du cerveau chez les mammifères. Plus précisément, les résultats de ce travail contribueront à mieux comprendre ce qui se passe chez les patients atteints de pathologies affectant cette hormone thyroïdienne. Plus largement, comme les neurones à parvalbumine jouent un rôle majeur de coordination de l’activité dans le cerveau, les résultats de cette étude devraient améliorer notre connaissance de l’origine de plusieurs maladies neurologiques, dont l’autisme.

Procédures

Une implantation sous-cutanée d'une puce constituera la seule intervention que subiront les animaux. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique durant une durée de 30 minutes maximum. Les animaux consommeront de l'eau acidifiée pendant le test Touch Screen (21 jours). Une injection d'un produit pro-convulsivant: durée moins d'une minute. Une injection de produits anesthésiques: durée moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux subiront une implantation d'une puce, permettant l'identification par radiofréquence, en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Lors des périodes d'analyse du test Live Mouse Tracker, ils seront simplement transférés dans une arène de 50 cm de côté qui disposera de sciure, boisson et aliment qu'ils pourront explorer. Pour le test du Touchscreen, l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test (21 jours). Suite à l’injection d'un agent pro-convulsivant par voie intrapéritonéale, les animaux présenteront des myoclonies (contractions rapides et brutales des muscles) et peu de crises cloniques (spasmes rythmés) et toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur). Enfin, les animaux seront anesthésiés avec un mélange d'anesthésiques avant d’être perfusés par voie intracardiaque avec une solution tampon et un fixateur de tissus afin de préléver leurs cerveaux pour réaliser des analyses histologiques.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant d'étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans le dévelopement du cerveau, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier, car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le développement du cerveau. A cet égard la souris est un modèle pertinent, car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme. Des études in vitro sont réalisées en parallèle, notamment pour aborder les aspects moléculaires de l'hormone thyroïdienne.

Réduction

D’après notre expérience, les paramètres comportementaux présentent en général une grande variabilité interindividuelle, il est nécessaire de prévoir 12 souris par groupe pour pouvoir conclure statistiquement. En fonction de la répartition des données nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (mutants vs contrôles). A l’issue de l’étude comportementale, nous avons prévu de prélever les cerveaux de 6 souris de chaque groupe, de façon à disposer de matériel biologique qui permettra de prolonger l’étude par une exploration histologique, si les tests comportementaux révèlent des différences entre souris exprimant la mutation et souris témoins. Cela évitera de générer une nouvelle cohorte de souris pour l’histologie, le cas échéant. Le nombre de 6 par groupe est suffisant pour conclure statistiquement sur les paramètres histologiques.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans l'organisme car elle joue un rôle similaire chez la souris et chez l'homme. De plus, c'est actuellement la seule espèce chez laquelle existent différentes lignées premettant de bloquer cette hormone dans un type cellulaire choisi. Cette étude comportementale sera réalisée sur des souris adultes, âgées de 16 à 20 semaines au début des tests, de façon à ce que le développement du cerveau soit terminé au début de l’étude.