Procédures modérées

370 souris porteuses d'une mutation de la sclerose laterale amyotrophique vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. A deux jours de vie, les souriceaux recoivent une injection d'un virus dans le cerveau apres anesthesie sur glace, subissent une echographie sous anesthesie, puis sont tues pour analyse histologique du cerveau. Le porteur indique que les injections entrainent une perte d'animaux, liee a leur jeune age et au rejet par la mere, et affirme que le modele murin reste "indispensable" faute de pouvoir modeliser la distribution d'une therapie genique sans organisme vivant. Les retombees pour les patients sont presentees comme un prerequis a d'eventuels essais chez l'homme.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurologique caractérisée par une mort sélective des motoneurones. Son issue est fatale en quelques années après le diagnostic, par paralysie progressive provoquant une insuffisance respiratoire. L'incidence et la prévalence de la SLA sont dans le monde respectivement de 2 et 8/100 000 personnes et concernent principalement les personnes de plus de 40 ans. La durée de vie après le diagnostic est d'environ 2 ans. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. Certains cas de SLA sont présents au sein d’une même famille, on parle de SLA familiale. Elle est due à des mutations de gènes. L'une d'elle provoque des SLA extrêmement sévères, avec un début des symptômes entre l’adolescence et la quarantaine et une progression très rapide menant au décès en quelques mois suivant le diagnostic. Afin de reproduire cette mutation, un modèle de souris SLA présentant la mutation a été généré. Ces souris développent un phénotype moteur associé à une perte progressive des motoneurones. La thérapie génique est une approche prometteuse, notamment par modification du génome pour corriger cette mutation. Les virus adéno-associés (AAV) en thérapie génique servent de « moyen de transport » pour apporter du matériel génétique dans les cellules cibles. Ils sont souvent utilisés en raison de leur non toxicité et de leur stabilité à long terme dans le cerveau de rongeurs, de primates, mais aussi chez l'homme. Néanmoins, l’injection d’AAV chez des souris de 6 semaines n’a pas permis l’expression du virus chez les souris à l’âge adulte. Une hypothèse serait que l'expression du virus se fasse à un stade trop tard du développement cérébral. L'objectif de ce projet est de réaliser des injections avec des AAV dans un modèle de souris SLA, afin de valider leur effet thérapeutique. Dans un second temps, le comportement moteur des animaux sera analysé afin de valider l'effet de la thérapie génique.

Bénéfices attendus

Cette étude nous apportera une meilleure compréhension de la SLA et des traitements possibles. Le modèle de souris SLA permettra de tester des approches thérapeutiques permettant de reverser les symptômes de ces souris et d’améliorer leur survie. Malgré les efforts déployés pour comprendre la physiopathologie de la SLA et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, il n'existe à ce jour aucun traitement efficace. La prise en charge des patients repose majoritairement sur des traitements améliorant leur qualité de vie et une thérapie pluridisciplinaire prodiguées par des professionnels de santé. La compréhension de la physiopathologie de la maladie est donc indispensable à la conception d’un traitement adapté à chaque forme de SLA. Cette étude chez un modèle de souris SLA est un prérequis pour tester ces traitements chez l’Homme ensuite.

Procédures

Une seule injection sera réalisée en intracérébrale avec un vecteur AAV ou une solution véhicule (NaCl) chez chaque souris à l'âge de deux jours. Les souris seront anesthésiées sur la glace. Le temps total de la procédure est de 10 min : Anesthésie sur glace de la souris : 10 min (cela inclus le temps d'endormissement de l'animal (état d'inconscience) et la préparation à l'injection (désinfection du crâne, prise de coordonnées.) Injection intracérébrale de la souris : 25 sec Une échographie sera réalisée une fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris.

Impact sur les animaux

Une perte du nombre d’animaux est attendue lors des injections, également à cause du jeune âge des animaux et du rejet de la mère après les injections. L'échographie se déroule quant à elle sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin d'effectuer des analyses histologiques.

Remplacement

Les cultures cellulaires ne permettent pas de modéliser l’aspect intégré des pathologies neurologiques. Nous avons donc besoin de recourir à des modèles animaux qui présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l’homme pour réaliser ce projet de recherche. Du fait de la complexité du mécanisme que nous étudions, le modèle animal comme la souris reste indispensable. De plus, on ne sait pas modéliser aujourd’hui la distribution d’un traitement de thérapie génique dans un organisme sans le tester dans un organisme vivant tel que la souris.

Réduction

Les effectifs ont été mis en place suite aux prérequis statistiques et aux résulats de notre étude pilote, permettant tout en réduisant le nombre d'animaux utilisés d'obtenir une réponse statistiquement significative et exploitable, en prenant en compte la variabilité interindividuelle. Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies d’analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de minimum de 18 souris pour le test comportemental est nécessaire. Notre étude pilote nous a montré qu’un taux de 70% de réussite au niveau du site d’injection était obtenu après les injections intracérébrales. Nous avons ainsi défini le nombre d’animaux nécessaires en prenant en compte ces paramètres ainsi que le fait que le génotype sera inconnu au moment de l’injection, les pertes des animaux lors des chirurgies ainsi que le potentiel rejet des mères après les injections. En fonction de la normalité des données (répartition en cloche) les tests statistiques paramétriques ou non paramétriques seront utilisés afin de comparer les différents groupes expérimentaux.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Lors des injections, en cas de signe de souffrance, le personnel qualifié pourra décider de l'arrêt de la chirurgie et de l'euthanasie de l'animal. Lors des chirurgies les mères seront isolées de leur portée. Les souriceaux seront injectés et après le réveil ils seront réintroduits dans leur cage initiale. Ils seront marqués avec leur propre urine afin de masquer toutes odeurs liées à la procédure chirurgicales. Cela évitera un rejet de la mère. Les mères seront réintroduites dans leurs cages une fois la portée injectée et réveillée. Les cages ne seront pas changées lors de la période post-opératoire (48h minimum). Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C). Cette couverture possédant une sonde thermique elle nous permettra de réaliser un retour progressif à 37°de la température corporelle du souriceau. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure. Lors des injections les souris seront anesthésiées sur glace, il s'agit d'une méthode couramment utilisée pour induire une anesthésie chez les rongeurs avant l'âge de 7 jours lors d'interventions chirurgicales. Cette technique a été validée comme sûre et efficace et repose sur le fait que les très jeunes rongeurs sont poïkilothermes (c’est-à-dire régulent leur température avec celle de l'environnement). L'hypothermie profonde fournit à la fois une immobilisation et une analgésie de l'animal.

Choix des espèces

Dans le domaine de recherche sur les maladies neurologiques, la souris est un modèle de choix. Les études réalisées avec ce modèle sont reproductibles et simples d'un point de vue expérimental. Les souris présentent une organisation du système nerveux proche de celle de l'homme. Enfin, nous possédons une grande expertise avec ces modèles et le matériel chirurgical et médical est adapté à ce modèle. Les animaux seront injectés à P2, à un stade précoce du développement cérébral, pour permettre une expression optimale du matériel génétique.

16 macaques a longue queue femelles vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal enchaine IRM, scanner et imagerie TEP sous anesthesie generale, plusieurs seances de neurostimulation par ultrasons en chaise de contention, puis un test de memoire ou l'animal doit choisir entre deux gobelets pour obtenir une friandise, avant d'etre tue par surdosage d'anesthesique pour analyser son cerveau. Le porteur decrit un stress a l'induction de l'anesthesie, des douleurs aux sites d'injection et une gene liee a l'intubation et a la contention. Il affirme que les modeles in silico et in vitro ne reproduisent pas la physiologie cerebrale, juge l'usage du singe "indispensable" en vue d'une transposition a l'homme, et prevoit de reutiliser des femelles deja presentes dans l'etablissement.

Objectifs

Actuellement de nombreux protocoles thérapeutiques visant les troubles neuropsychiatriques (autisme, dépression, …) sont confrontés à l’apparition de pharmacorésistance chez de nombreux patients. Il semble essentiel de trouver des solutions innovantes pour parer à ces complications. Plusieurs techniques de neurostimulations sont proposées: la neurostimulation magnétique transcrânienne, utilisée en clinique, est non-invasive mais a une mauvaise discrimination spatiale, et la stimulation cérébrale profonde qui offre une meilleure résolution spatiale mais nécessite une chirurgie lourde. Nous proposons de pallier ces défauts et de garder ces points forts en utilisant la neurostimulation transcrânienne par ultrasons focalisés. La neurostimulation ultrasonore (US) se fera par application d’une sonde US sur le crâne, permettant la propagation intracrânienne d’ondes US focalisées et la stimulation précise de régions cérébrales. Nos résultats actuels ont montré que la stimulation US induit une activation neuronale, un mécanisme capital dans la thérapeutique des troubles neuropsychiatriques. Cette technique de neurostimulation offrirait une alternative ciblée et non-invasive pour les troubles neuropsychiatriques. Des études exploratoires chez les rongeurs ont démontré la faisabilité de cette technique. Cependant, leurs physiologies (épaisseur du crâne, orientation et forme du cerveau) freinent la transposition en clinique humaine. Des simulations numériques et expérimentales ont montré que les ultrasons pénètrent de façon similaire la boite crânienne chez l'homme et chez le primate. Des manipulations sur des singes cynomolgus sont en cours sans anesthésie pour la neurostimulation. Mais il y a des difficultés lors de la stimulation malgré l'habituation (tête non immobile). Dans la continuité de ce protocole, ce projet a pour but d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation ultrasonore aigüe et chronique sur le primate non humain (PNH) anesthésié. Nous souhaitons tester les effets de la neurostimulation US aigüe (n=8) et la neurostimulation US chronique (n=8). Ce nombre est nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement exploitables. Tous les individus seront euthanasiés à la fin du projet par une méthode réglementaire et les cerveaux seront prélevés pour évaluer l’efficacité et l’innocuité de la neurostimulation US (neuroinflammation, neurotransmission, mort cellulaire, microhémorragies, ...).

Bénéfices attendus

Actuellement, les cas de dépression chez l’homme sont traités à l’aide de divers protocoles thérapeutiques tels que la psychothérapie, les antidépresseurs et autres molécules pharmacologiques. Dans de nombreux cas, les patients développent une pharmacorésistance aux traitements médicamenteux. Cette pharmacorésistance nécessite l’orientation des patients vers d’autres techniques thérapeutiques. Parmi ces techniques, nous pouvons relever la méthode de neurostimulation magnétique transcrânienne ou la stimulation cérébrale profonde (stimulation par implantation d’électrode dans le cerveau) mais la première ne cible pas correctement la zone cérébrale impliquée dans la dépression et la deuxième est trop invasive. Pour pallier ces défauts, nous souhaitons évaluer l’efficacité et l’innocuité d’une nouvelle méthode non invasive et ciblée : la neurostimulation ultrasonore chez le singe. Ce projet permettra ainsi de progresser dans la possibilité de traduire cette technique en clinique humaine. Nous aurons ainsi une avancée supplémentaire pour espérer avoir une alternative non-invasive et résolutive pour le traitement des troubles neuropsychiatriques. La perspective directe de ce projet est une transposition de cette technique pour un essai clinique chez l’Homme.

Procédures

Habituation – renforcement positif : 2 à 5 fois par semaine ; durée : entre 15 minutes et 1 heure par animal ; pendant au moins 1 mois et jusqu’à l’obtention d’une bonne coopération de l’animal vigile. Sont concernés tous les animaux (n=16) IRM cérébrale sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique intramusculaire puis anesthésie gazeuse. Durée d’anesthésie : environ 60min. Scanner CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16), 1 seule fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 10min. Adaptation du dispositif de neurostimulation : Sont concernés tous les animaux (n=16), jusqu’à 10 fois par animal ; injection d’anesthésique et de son antidote (voie intramusculaire), durée d’anesthésie : environ 30min – 1 mois minimum Imagerie TEP-CT sous anesthésie générale: Sont concernés tous les animaux (n=16). Cette imagerie sera réalisée 2 fois sur 8 animaux et 3 fois sur 8 autres animaux; injection d’anesthésique (intramusculaire); injection du produit radioactif (intraveineuse, par cathéter veine saphène ; durée d’anesthésie : environ 1h30 à 2h00. Neurostimulation ultrasonore sous anesthésie générale chimique: Sont concernés tous les animaux (n=16), 8 animaux avec 2 séances de stimulation et 8 animaux avec 10 séances de stimulation; application sur la tête du dispositif de neurostimulation ; injection d’anesthésique et de son antidote ; durée de contention dans une chaise de contention : environ 30min par stimulation. Test de comportement et de mémorisation : Sont concernés uniquement les animaux ayant une neurostimulation US chronique (n=8); pour la mémorisation, l'animal est placé dans un sas et devra choisir entre deux gobelets pour trouver une récompense (friandise). Euthanasie : Sont concernés tous les animaux (n=16), surdosage d’anesthésie.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont les suivants : - Augmentation du stress lors des phases d’induction d’anesthésie (contention dans la cage). - Douleurs/gênes au niveau du site d’injection de l’anesthésie. - Douleurs/gênes oropharyngées liées aux intubations. - Augmentation du stress lors du transport entre les deux sites de manipulation. - Gênes suite à l’installation dans la chaise de contention. - Gênes au niveau du site d’apposition de la sonde ultrasonore. Concernant l’application des ondes ultrasonores lors de la neurostimulation et d’après nos précédentes manipulations sur rongeurs, la neurostimulation ne semble pas avoir d’effet indésirable. Les ondes ultrasonores auront une fréquence au-delà de celle de la gamme audible des primates, il n’y aura donc pas d’effets indésirable escomptés. Ceci a été validé chez les rongeurs dans nos études précédentes et dans la littérature.

Devenir

A l’issu des 2 procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer des analyses histologiques des cerveaux.

Remplacement

Les modèles in silico, in vitro, (cellulaires) et/ou mathématiques ne permettent pas de reproduire la physiologie cérébrale et son environnement (vascularisation, perfusion, débit sanguin, etc…), l’utilisation d’animaux est donc indispensable. De plus, l’objectif final est de transposer cette technique en clinique humaine, en conséquence les études chez l’animal ne peuvent pas être substituées. Des études précédentes ont été menées sur les rongeurs (souris et rats). Les résultats obtenus sont encourageants mais ils ne permettent pas une transposition directe de la neurostimulation en clinique humaine, notamment à cause des différences physio-morphologiques des rongeurs avec l’homme. Pour pallier ces différences, nous proposons d’évaluer notre méthode sur un modèle animal plus proche de l’homme pour la morphologie cérébrale et crânienne, le singe cynomolgus.

Réduction

Les procédures expérimentales ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. La réduction du nombre d’animaux se fera aussi par l’utilisation d’imagerie préclinique. Ainsi l’activité cérébrale d’un animal après neurostimulation sera comparée avec sa propre activité cérébrale avant neurostimulation, chaque animal sera donc son propre contrôle. Ces activités cérébrales seront statistiquement comparées. En considérant une modification de 10% de l’activité cérébrale par rapport à l’activité contrôle, un effectif de 8 animaux par groupe sera utilisé.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en volière disposant de plateformes surélevées avec les congénères et en présence d’objets d’enrichissement. L'alimentation couvrira les besoins journaliers et sera complétée par des friandises. Un programme d'enrichissement sera mis en place (recherche et diversité de l'alimentation, manipulation d'objets, échelle, musique, tv...) ceci donnant un environnement favorable aux procédures expérimentales. Pour limiter le stress, nous recourrons à l’habituation (renforcement positif). Elle sera effectuée par le personnel en charge de l’étude et en collaboration avec le personnel d’animalerie. Les animaux seront habitués à recevoir des récompenses (friandises) après réalisation de tâches simples (ex : toucher un objet) afin d’obtenir la coopération de l’animal et instaurer une relation de confiance. Pour les procédures sous anesthésie, les animaux seront manipulés sur un tapis chauffant et sous monitoring cardio-pulmonaire. Les animaux seront placés sous surveillance à leur réveil. Nous avons défini des points limites permettant d’apprécier la douleur et l’inconfort des animaux. Ces points limites seront des signes observables et évaluables par le personnel de zootechnie. Chaque jour, le personnel de zootechnie veillera à l’apparence des animaux. Les animaux seront pesés à réception puis à chaque manipulation nécessitant une sortie de cage. Des mesures préventives seront prises : médication en concertation avec le vétérinaire référent et/ou apports alimentaires alternatifs, notamment après le retrait des cathéters, l’animal pourra recevoir une injection d'un antidouleur au site de pose du cathéter. Nous aurons recours le plus possible à la réutilisation d’animaux inclus dans d’autres projets sous condition qu’ils n’aient subi aucun dommage cérébral, ni locomoteur.

Choix des espèces

Le choix de cette espèce se justifie par l’analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le singe et l’humain et par sa proximité phylogénétique avec l’espèce humaine. Des macaques femelles pubères seront utilisées pour cette étude. Les pathologies pouvant être soignées par la méthode de neurostimulation ultrasonore sont pour la plupart des pathologies de l’adulte. De ce fait, il s’avère nécessaire de travailler sur des animaux post-pubères. Pour cette étude, des macaques femelles seront utilisées. Actuellement des macaques femelles sont utilisées au sein de l’EU et seront disponibles à la réutilisation. Cela sera en accord avec les principes de réduction et de raffinement édictés par la règle des 3R. De plus, nos équipements d’imagerie actuels ne peuvent pas supporter la forte corpulence de macaques mâles adultes (poids et largeur d’épaule sont souvent trop importants pour le stade de développement souhaité).

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques d'anorexie mentale, elles subissent une chirurgie d'implantation d'une pompe sous la peau, un isolement de dix-neuf jours, des lavages vaginaux quotidiens pour les femelles et deux IRM de deux heures sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyses. Le porteur indique que la chirurgie et les prélèvements peuvent provoquer de la douleur, prise en charge par analgésiques. Il affirme qu'un animal vivant est "nécessaire" pour étudier l'effet du traitement sur le poids et la prise alimentaire, en vue d'un essai clinique chez l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier par IRM l’effet d’un traitement pour la prise en charge de l’anorexie mentale (AM) sur la structure et les fonctions cérébrales chez la souris. L’AM est une maladie complexe et multifactorielle avec une auto-restriction de l’apport alimentaire et entrainant des troubles de la reproduction qui persistent même après rémission. La régulation de la fonction de reproduction repose sur la communication entre certains neurones de notre cerveau : les neurones qui sécrètent l’hormone gonadolibérine (neurones à GnRH), l’hypophyse et les gonades (ovaires et testicules). Toute perturbation des neurones à GnRH entraîne une perturbation importante de cette communication. Des études par imagerie par résonnance magnétique (IRM) ont montré une altération de la structure et du fonctionnement de certaines aires cérébrales dans l’AM. Nous avons développé un modèle de souris chez lequel nous bloquons génétiquement la sécrétion de GnRH de ces neurones. Ces souris mangent beaucoup moins que celles qui ont des neurones à GnRH fonctionnels, mais il en résulte des souris femelles plus grosses que des souris sauvages et des mâles plus maigres et plus petits que des souris contrôles. Ce modèle mime une partie des caractères physiopathologiques de l’AM. L’implantation sous la peau de petites pompes délivrant des taux physiologiques de GnRH de manière physiologique chez ces souris, permet de restaurer une prise alimentaire et un poids normal. Ces données laissent penser que les neurones GnRH pourraient être impliqués dans les maladies nutritionnelles comme l’AM ou l’obésité. Les objectifs de ce projet sont : - de caractériser notre modèle de souris sur le plan cérébral, tant anatomique que fonctionnel en se basant sur ce qui est connu sur le sujet dans l’AM. Cette caractérisation servira de référence pour l‘étude des effets du traitement ; - d’étudier l’impact du traitement à la GnRH sur la structure et le fonctionnement du cerveau afin d’obtenir des arguments solides des effets positifs du traitement sur ces paramètres en vue d’un passage en essai clinique chez l’humain. Dans ce but, nous acquerrons en IRM à haute résolution des images anatomiques et fonctionnelles du cerveau de nos souris modèles avant et après traitement à la GnRH.

Bénéfices attendus

L’AM est une pathologie qui touche essentiellement des populations jeunes et représente la pathologie psychiatrique la plus mortelle. A ce jour, aucun traitement pharmacologique n’existe et le risque de rechute est de 41 %. La re-nutrition et la prise en charge psychologique échouent dans la grande majorité des cas. De plus, la prévalence de cette maladie ne cesse d’augmenter, notamment depuis le début de la crise sanitaire liée à la pandémie de Covid-19. Les professionnels de santé qui prennent en charge cette maladie sont démunis face au taux de rechute et à l’inefficacité à long terme de la renutrition. Les patients de leurs côtés ne disposent pas de prise en charge efficace et durable ce qui conduit au décès de 10% des patients. Une meilleure compréhension de l’effet du traitement au GnRH dans le modèle préclinique devrait permettre, à l’issue du projet, de démarrer un essai clinique de prise en charge chez l’humain. Notre but est de potentialiser l’effet de la prise en charge nutritionnelle et psychiatrique par un traitement mettant l’organisme dans de bonnes conditions métaboliques pour favoriser le retour à un état physiologique. Ce traitement porte un espoir de guérison pour ces patients sans solution thérapeutique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie courte (10-15 minutes) sous anesthésie générale pour implanter la petite pompe sous la peau au niveau de leur dos. Après la chirurgie les animaux seront isolés pendant 19 jours, pour le suivi de la prise alimentaire. Les femelles auront un lavement vaginal d’une durée de moins de 30 secondes par souris et qui seront réalisés tous les matins de la période du traitement soit sur une durée de 19 jours. Pour les mâles, l’indication connue du bon fonctionnement du traitement est le retour d’un taux de présence normale de testostérone dans le sang. Avant et après le traitement, les animaux auront une petite prise de sang pour doser cette hormone dans le sang. Cela représente deux prélèvements d’une durée maximale de 30 secondes par souris. Pour les deux sexes, les souris auront deux sessions d’IRM, l’une avant, et l’autre après le traitement. Le passage en IRM est prévu pour une durée moyenne de deux heures, les souris sont anesthésiées.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire à l’implantation des pompes sous la peau pour délivrer le traitement peut générer de la douleur chez l’animal. Les lavements vaginaux sont non douloureux mais peuvent être inconfortables pour la souris. Ils seront réalisés par une personne formée et habituée à les réaliser. La prise de sang peut générer une douleur ponctuelle au moment de la piqûre. Elle sera réalisée par un expérimentateur formé. Les animaux seront suivis très scrupuleusement pluri-quotidiennement tout au long du protocole afin de repérer tout signe de douleur et d’y pallier par l’administration d’analgésiques dans les plus brefs délais. Enfin les animaux seront placés en hébergement individuel après la chirurgie afin de mesurer leur prise alimentaire.

Devenir

A l’issue des deux IRM toutes les souris du protocole seront euthanasiées afin de procéder aux analyses anatomiques et histologiques des organes après traitement

Remplacement

Nous étudions les effets d’un traitement sur la modulation de la structure et du fonctionnement du cerveau chez d’un modèle préclinique de souris pour un test d’efficacité du traitement juste avant le transfert chez l’humain. Cela nous limite dans la possibilité de remplacer les animaux utilisés par des solutions alternatives qui ne soient pas des animaux vivants. De ce fait, nous avons besoin d’un animal vivant pour étudier l’effet du traitement sur les améliorations des paramètres pertinents comme le poids ou la prise alimentaire, ce que l’on ne pas reproduire autrement. Il faut aussi pouvoir détecter d’éventuels effets néfastes, déterminer les durées idéales du traitement, analyser ses effets positifs et comprendre les mécanismes d’action du traitement pour permettre son utilisation en clinique humaine.

Réduction

Notre recherche vise à explorer des processus physiologiques et physiopathologiques de l’anatomie cérébrale et des fonctions cérébrales en réponse à l’administration du traitement à la GnRH. Nous avons déterminé le nombre maximal d’animaux en fonction des nécessités expérimentales pour réaliser des statistiques significatives. Les analyses des IRM se feront pour chaque souris juste après le passage dans l’imageur sans attendre que toutes les souris aient été examinées. Nous avons choisi une méthode permettant de faire un suivi longitudinal. Ainsi, les mêmes souris sont utilisées pour la première IRM, pour le traitement et pour l’observation des effets du traitement après la seconde IRM. De plus, l’IRM est une méthode qui permet d’étudier de nombreux paramètres sur un même animal : la structure et le fonctionnement du cerveau et tous les paramètres cérébraux qui pourraient être modulés par le traitement. Cela permet de réduire considérablement le nombre d’animaux et le nombre d’expériences à réaliser pour obtenir ces informations si nous n’avions pas recours à l’IRM.

Raffinement

Les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulées par le même chercheur, qui s’en occupera quotidiennement et ne changera pas au cours du protocole. Cela permet aux souris de s’habituer à la présence et à l’odeur de l’expérimentateur et de limiter le stress des animaux lorsqu’ils commenceront le protocole. Les souris devront voyager entre leur animalerie d’élevage et l’animalerie du site où le projet se réalise. Un temps de 15 jours sera laissé pour leur permettre de s’habituer à la nouvelle animalerie et se remettre du stress généré par le transport. Les animaux seront hébergés dans une animalerie agréée conventionnelle, en groupe jusqu’à la chirurgie, puis isolés. Les animaux disposeront de matériel d’enrichissement (papier pour faire un nid, morceau de bois à ronger) et maisonnettes en plastique pour les animaux en groupe. Une fois isolés les animaux n’auront plus de maisonnette à disposition, la pompe en gênant l’accès. Les animaux seront de nouveau manipulés par le chercheur pour se réhabituer à lui dans la nouvelle animalerie. Une première IRM sera réalisée par une personne qualifiée et spécialiste de la pratique de cet examen chez la souris. L’IRM n’est ni invasive, ni douloureuse et se déroulera sous simple anesthésie générale. Les souris subiront ensuite une chirurgie courte pour implanter les pompes sous cutanées permettant de délivrer le traitement. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec application d’un antiseptique sur la plaie pour éviter tout risque d’infection. Par la suite, du paracétamol sera délivré dans l’eau de boisson pour pallier aux douleurs liées à l’acte chirurgical, jusqu’à cicatrisation de la plaie. Les animaux seront suivis tous les jours pour repérer et prendre en charge immédiatement tout signe de douleur. Si des signes de douleurs persistants se manifestent, l’animal sera sorti du protocole. La seconde IRM se pratiquera dans les mêmes conditions que la première. L’euthanasie sera effectuée par un chercheur habitué à réaliser cette intervention et après injection d’un analgésique et sous anesthésie.

Choix des espèces

Le protocole d’étude du traitement de la GnRH a été mis au point chez la souris. Nous utilisons la même espèce pour permettre d’obtenir une répétabilité du protocole dans des conditions identiques. Le traitement est étudié chez un modèle de souris génétiquement modifiée qui permet d’obtenir un phénotype mimant des traits pathologiques de l’anorexie mentale, pathologie pour laquelle nous étudions le traitement. L’utilisation de souris génétiquement modifiées est donc indispensable à l’étude du traitement en phase préclinique. Les animaux utilisés sont de adultes de 4 à 8 mois parce que l’étude des effets de l’hormone GnRH nécessite d’utiliser des animaux adultes. Le vieillissement agit sur la fonction de reproduction et la régulation de la prise alimentaire, c’est pourquoi nous ne dépasserons pas l’âge de 8 mois. Nous avons déjà des données préliminaires chez des animaux dans cette tranche d’âge et la nécessité de pour pouvoir comparer les données impose de respecter cette limite d’âge.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une maladie osseuse pédiatrique, elles subissent des radiographies sous anesthésie à quatre reprises, un isolement de deux heures en cage à urines et des injections de fluorochromes, avant d'être tuées pour prélever leurs os. Le porteur décrit ces actes comme une simple gêne passagère, malgré la gravité modérée déclarée. Il affirme que l'effet de l'inhibition de l'inflammation sur l'os ne peut être caractérisé qu'à l'échelle d'un "organisme entier".

Objectifs

La maladie osseuse pédiatrique rare qui nous intéresse est caractérisée par le remplacement de l’os des mâchoires par un tissu mou fibreux appelé granulome. Cette pathologie se met en place vers 3 à 5 ans et est d’origine génétique. Les lésions caractéristiques de cette maladie sont toujours symétriques et bilatérales et peuvent ne concerner que des zones restreintes de la mandibule ou au contraire toutes les mâchoires jusqu’au plancher de l’orbite. Cette pathologie est caractérisée par une inflammation chronique qui serait responsable de la dégradation de l’os des mâchoires. L’hypothèse que nous avons émise est qu’en inhibant l’inflammation par l’invalidation d’un gène de l’inflammation, le phénotype osseux serait résolu. Ainsi les souris modèles du chérubisme ont aussi été invalidées pour ce gène impliqué dans l’inflammation. Nous allons étudier le phénotype osseux de ces souris à 4, 6, 8 et 10 semaines

Bénéfices attendus

L’impact de l’inhibition de l’inflammasome sur le phénotype osseux (dégradation de l'os des mâchoires) ne peut être caractérisée qu’à l’échelle d’un organisme entier. L’étude de l’effet de l’inhibition de l’inflammasome sur le phénotype osseux pourrait ouvrir des pistes de thérapie pour le chérubisme, une maladie pédiatrique rare et pour le moment ne bénéficiant d’aucun traitement.

Procédures

Le phénotype osseux des souris est exploré par un examen radiographique à 4, 6, 8 et 10 semaines qui nécessite une anesthésie et qui dure 5 minutes, un seul recueil d’urines en cage métabolique (durée maximale 2h) pour l’analyse des marqueurs osseux urinaires, l’injection de 2 fluorochromes pour analyser la formation dynamique de l’os (2 minutes par injection).

Impact sur les animaux

Aucun autre dommage que d’être manipulé pour l’injection (anesthésies et injections de fluorochromes) et isolé pendant 2h maximum n’est envisagé dans le cadre de la caractérisation du phénotype osseux. Les injections, peuvent éventuellement provoquer une gêne très passagère mais qui ne nécessite pas de médication particulière.

Devenir

Les animaux concernés par cette procédure sont mis à mort pour réaliser des prélèvements post-mortem des os et des caecum qui permettront de caractériser le phénotype osseux et l’apparition du granulome du chérubisme.

Remplacement

La mutation d’un gène particulier est responsable du développement du chérubisme. La culture de cellules mutées in vitro a déjà fourni des informations sur les voies de signalisation impliquées dans le développement du chérubisme mais toutes ces études préalables in vitro sont menées sur des cellules de patients. Or, ces derniers ne peuvent être diagnostiqués que quand le granulome est déjà installé. C’est pourquoi une souche murine répondant aux besoins de l’étude a été préalablement généré. L’utilisation de ce modèle nous permettra d’observer les interactions entre l’inflammation et le développement du phénotype osseux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques solides. Leur nombre (48) a été restreint au minimum indispensable pour obtenir des données nécessaires à la caractérisation de l’impact de l’invalidation de l’inflammasome sur le phénotype osseux (dégradation de l’os) du chérubisme. L’analyse préalablement publiée du modèle à 10 semaines permet d’estimer la puissance statistique de nos analyses et l’échantillonnage nécessaire pour caractériser les effets biologiques souhaités.

Raffinement

Les mesures de densité minérale osseuse, seront effectuées tous les 15 jours sous anesthésie avec analgésie. Le temps de radiographie sera d’environ 5 minutes par animal et il sera surveillé jusqu’à son réveil. Le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs assureront une surveillance quotidienne. Nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux aux différents temps de la procédure qui se résument à 6 injections intrapéritonéales (anesthésies et injections de fluorochromes dilués dans du sérum physiologique), 2h maximum d’isolement en cage métabolique. L’assurance d’une anesthésie profonde sera vérifiée par un test de l’abolition du réflexe des extrémités. Cependant, dans l’éventualité d’apparitions de points limites mentionnés plus loin, une surveillance plus fréquente et un apport de nourriture gélifiée seront mis en place. Les animaux seront hébergés sous conditions standards - température 20/24°, cycle jour/nuit 12h/12h, hygrométrie entre 50/55%. Enrichissement : tunnel de carton, nids en papier kraft, maisonnette rouge, bâtons à ronger.

Choix des espèces

Suite aux raisons déjà invoquées dans la section 5.10 / item « remplacement », il a été nécessaire pour mettre en œuvre ce projet de générer un modèle murin répondant aux besoins de notre étude. La densité minérale osseuse des animaux sera évaluée à 4,6, 8 et 10 semaines, dernier temps de l’étude où les animaux seront euthanasiés pour l’analyse plus précise car le phénotype osseux d’ostéolyse est clairement observable.

800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales puis peut être traité par chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie, avec prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie, avant d'être tué pour prélever organes et fluides. Le porteur reconnaît que le développement de la tumeur et des traitements encore mal connus peut provoquer des effets délétères et des douleurs. Il affirme qu'aucune méthode de substitution n'existe pour évaluer une nouvelle molécule contre le cancer du sein, l'animal restant selon lui un "passage obligatoire" avant l'humain.

Objectifs

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles pertinents de cancers du sein.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de démontrer que les traitements testées sont actifs dans un modèle de cancer du sein et aussi d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage chez l'être humain.

Procédures

Les animaux recevront une greffe de cellules tumorales. Dès lors, ils pourront être traité par chirurgie, radiothérapie et/ou traitements chimiothérapeutiques. En cas de prélèvement de sang ceux-ci seront réalisés sous anesthésie et limités à 1 par semaine et à un volume inférieur à 10 %. Un suivi par imagerie pourra être réalisé sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne < 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères. De même, l’utilisation de traitement novateur pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les procédures chirurgicales d'exérèse induiront des douleurs suite à l'incision et à la cicatrisation. Les effets de la radiothérapie.

Devenir

Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués le développement de la tumeur ou encore par le produit / modèle chez les animaux.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur le cancer du sein. De plus, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’une nouvelle thérapeutique. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : classiquement 10 par groupe en fonction de l’effet thérapeutique attendu. L’analyse statistique sera par la comparaison des groupes d'animaux en fonction du traitement réalisé.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi des signes cliniques et la détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • des conditions d'hébergements garantissant la non-contamination des animaux immunodéficients

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilités d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles d'une maladie musculaire génétique, elles reçoivent des injections de molécules thérapeutiques, dont des injections rétro-orbitaires, puis sont soumises chaque mois pendant un an à des tests de locomotion et de force sous anesthésie, avant d'être tuées pour analyser leurs muscles. Le porteur indique n'étudier que les premières étapes des symptômes et tuer les animaux avant la phase terminale de la maladie. Il juge le modèle animal "indispensable" car aucun modèle cellulaire ne reproduit les troubles de la locomotion et de la force.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la correction des altérations locomotrices et de la force musculaire chez des souris modèles d’une maladie humaine musculaire, la dystrophie myotonique, pour laquelle il n’existe pas de traitement. Cette pathologie est due à une anomalie de l’ADN qui entraine un affaiblissement des muscles squelettiques. Ayant précédemment identifié le mécanisme de cette faiblesse musculaire, nous souhaitons désormais développer une approche thérapeutique pour cette maladie. Plus précisément, nous souhaitons injecter en intraveineux différentes molécules thérapeutiques, que nous avons précédemment validées en modèle cellulaire, dans des souris adultes modèle de la dystrophie myotonique, et ceci afin d’étudier la correction du phénotype locomoteur et de la force musculaire de ces animaux. Pour cela nous effectueront une batterie de test non invasif de la locomotion et une mesure de la force musculaire de ces animaux chaque mois sur une période d’environ un an. Nous espérons que cette approche nous permettra d’ouvrir une piste thérapeutique pour cette maladie.

Bénéfices attendus

Nous avons besoin de modèles animaux pour développer une approche thérapeutique pour la dystrophie myotonique, car il n’existe pas de modèle in vitro ou de système cellulaire pour étudier la faiblesse musculaire et les altérations de la locomotion caractéristiques de ces pathologies. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour étudier cette maladie. Enfin, l’analyse de la correction de la faiblesse musculaire dans ce modèle murin a un véritable intérêt pré-clinique pour développer et tester des pistes thérapeutiques pour une maladie humaine musculaire.

Procédures

1 – Les injections en intrapéritonéale, notamment d’agents anesthésiques, requièrent moins d'une minute. 2 – Les injections rétro-orbitaires de virus associés aux adénovirus adénovirales (AAV) ou d’oligonucléotides antisens (ASO), requièrent entre 30 secondes et 1 minute par animal. 3 – L’analyse de la locomotion se fait par une batterie de tests non invasifs réalisés chaque mois et ceci sur une période de 12 mois. Ces tests s’étalent sur une durée de 2 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal. 4 – La mesure de la force musculaire est réalisée en 4 à 8 minutes sous anesthésie gazeuse. Cette mesure est répétée chaque mois (mais en décalage de 15 jours avec les tests locomoteurs) et ceci sur une période de 12 mois.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier une maladie musculaire touchant les adultes, et ceci en utilisant un modèle animal, nous nous attendons donc à l’éventuelle apparition d’altérations locomotrices et de faiblesse musculaire chez ces souris. Toutefois, afin de limiter la douleur induite par les symptômes, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. De plus, les tests locomoteurs que nous utiliserons pour évaluer l’apparition de ces altérations sont classiques, non invasifs et sans douleur. De même, il est à noter que la mesure de la force musculaire se fait sous anesthésie.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs muscles squelettiques pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie musculaire causée par une mutation génétique, la dystrophie myotonique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. De plus, nous avons établi précédemment que le modèle souris est un bon modèle animal d'étude de cette maladie.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents nous ont permis d’établir les doses de molécules thérapeutiques à injecter, les temps d'analyses et que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le facteur de comparaison sera le type de molécule thérapeutique et compte tenu de notre projet d’analyser 7 types et/ou doses de traitements sous deux conditions (contrôle ou pathologique), nous estimons que l’étude de 168 animaux sur 3 à 5 ans est nécessaire.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. De plus, afin de limiter d’éventuelles douleur induite par l’apparition de symptômes locomoteurs, nous n’étudierons que les premières étapes de l’apparition de ces symptômes et les animaux seront euthanasiés avant que la phase terminale de la maladie n’apparaisse. Toutefois, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Enfin, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but de tester des approches thérapeutiques dans un modèle d’une maladie musculaire causée par une mutation génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal pour identifier l’effet de ces traitements à l’échelle de l’organisme entier ; en effet des modèles cellulaires ou un in vitro ne peuvent pas reproduire des troubles de la locomotion ou de la force musculaire et apporter un même niveau d’information. Nous allons étudier des approches thérapeutiques sur le comportement locomoteur et la force musculaire chez des souris adultes, en effet la maladie musculaire que nous étudions touche les adultes, donc des souris sevrée et adultes. Enfin, nous suivrons le comportement locomoteur et la force musculaire de ces animaux sur une période de 12 mois. Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la maladie étudiée.

102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux mâles reçoivent à deux jours de vie une injection de streptozotocine qui détruit une partie de leur pancréas, puis un régime gras et des prélèvements sanguins répétés, avant d'être tués pour prélever le foie, les mères et souriceaux femelles étant également tués. Le porteur teste un composé contre la stéatose hépatique dans un modèle qu'il indique avoir validé "avec le client". Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier l'efficacité réelle d'un composé sur cette maladie.

Objectifs

La stéatose est l’accumulation de graisses à l’intérieur de cellules qui, normalement, n’en contiennent pas ou peu. Le foie, qui comporte très peu de graisses lorsqu’il est sain, peut être le siège de cette concentration. On parle alors de stéatose hépatique. Ainsi, un foie qui contient trop de graisses (triglycérides) est un foie stéatosique. La stéatose hépatique est fréquemment associée à l’obésité mais certains sujets non obèses peuvent présenter cette pathologie. Au début, l’accumulation de triglycérides dans les cellules du foie est responsable d’une stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD - non alcoholic fatty liver disease). Dans cette forme simple, le foie est très riche en graisses et des mesures hygiéno-diététiques permettent la guérison. Le foie retrouve alors son aspect normal. Si la surcharge en triglycérides se poursuit, le foie devient le siège d’une inflammation appelée hépatite. C’est la stéato-hépatite non alcoolique (NASH - Non Alcoolic Steato Hepatitis). L’inflammation ne disparait pas, elle va au contraire s’aggraver avec le temps. Il est possible qu’elle évolue vers la fibrose hépatique. Après plusieurs années, elle peut devenir une cirrhose, avec un risque élevé de cancer hépatique. Malheureusement, il n’existe actuellement aucun traitement médicamenteux approuvé et montrant une efficacité certaine pour la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD - Non Alcoholic Fatty Liver Disease) ou la stéatohépatite non alcoolique (NASH - Non Alcoolic Steato Hepatitis). Le présent projet vise à tester l'efficacité d'un composé en développement visant à traité la stéatose hépatique dans un cadre préclinique. L'objectif est donc d'obtenir une preuve de concept de l'efficacité avant de pousser plus en avant le développement du composé, notamment vers les stades cliniques.

Bénéfices attendus

Si la présente étude permet de mettre en évidence une efficacité des composés en développement sur la stéatose hépatique, ces deniers seront employés ultérieurement dans le cadre d'études cliniques et pourraient, à terme, obtenir une autorisation de mise sur le marché. Ils constitueraient ainsi les tout premiers traitements autorisés pour la prise en charge de la stéatose hépatique.

Procédures

Les souris gestantes seront mise à mort après sevrage des souriceaux. Aucune autre intervention n'est prévue. Les souriceaux recevront une administration de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) à deux jours postnatal (durée de la procédure : 2 minutes envron). Après sevrage, les femelles seront euthanasiées. En effet, il est bien connu que les souris femelles présentent un niveau de résistance élevé au développement de la stéatose comparativement aux souris mâles. Les mâles seront soumis à une alimentation classique (8-10 animaux) ou une alimentation enrichie en graisse (HFD 60% de l'énergie apportée par les lipides; 24-30 animaux) pendant 64 jours (D0-D63). Des prélèvements sanguins seront pratiqués via la veine caudale à D28, D35 et D49 Ces prélèvements ont rapides (durée < 5 minutes). A D63 les mâles seront euthanasiés et un prélèvement sanguin terminal et des prélèvements d'organes seront pratiqués.

Impact sur les animaux

Le modèle employé est un modèle de stéatose hépatique. Le développement de la stéatose est limité dans ce modèle et ne pousse pas jusqu'à la fibrose et aux carcinomes hépatique. Le stade de stéatose (dit "NASH") ne s'accompagne pas d'effet secondaires ni d'effets néfaste. C'est d'ailleurs une des raisons qui expliquent qu'en clinique humaine la stéatose est très mal diagnostiquée avant le stade de développement de cancers du foie. Les administrations de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) et les pélèvements sanguins sont susceptibles d'induire un stress et une légère douleur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure. En effet, l'étude implique des anayses biochimiques et histologiques sur les foies (y compris femelles reproductrices et souriceaux femelles) qui doivent ainsi être collectés à l'issue de la procédure.

Remplacement

L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’efficacité réelle d’un composé sur la stéatose hépatique. Nous avons choisi un modèle utilisant l'espèce souris qui est parfaitement caractérisé dans la littérature scientifique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés.

Raffinement

Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et la stéatose hépatique. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les femelles gestantes seront hébergées individuellement, et ce jusqu'au sevrage des souriceaux. Un enrichissement sera apporté sous forme d'igloo et de matériel de nidification. Après sevrage, les mâles issus des portées seront hébergés en cages collectives (4 souris/cage) et un enrichissement du milieu sera assuré par l'ajout d'igloos et de briquettes de bois spécifiques pour rongeurs. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis, notamment l'emploi d'analgésie pour soulager la douleur le cas échéant.

Choix des espèces

Le modèle de souris C57BL/6 est un des modèles de souris les plus classiquement utilisés et les mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques et de la stéatose hépatique. C'est également ce modèle qui est classiquement utilisé pour l'obtention du modèle STAM. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux mâles seront utilisés entre leur naissance et 12 semaines d'âge. Il est nécessaire de partir de souriceaux puisque le modèle STAM demande une administration de streptozotocine (un agent induisant une destruction partielle du pancréas) deux jours après la naissance. Ce modèle se développe ensuite grâce à la mise sous alimentation enrichie en graisse à partir du sevrage (ici à 4 semaines) et jusqu'à la fin de l'étude.

5 346 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent des injections quotidiennes, des mesures de tension artérielle et une IRM, leurs petits leur étant retirés à trois jours, dans un suivi allant jusqu'à quinze mois après la gestation, avant la mise à mort pour analyses. Le porteur indique que les injections répétées et les mesures de pression peuvent provoquer stress et plaies à la queue, et que des troubles cognitifs peuvent apparaître sur ces temps longs. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre le placenta et le système neurovasculaire, et conclut au recours à l'"organisme entier".

Objectifs

Ce projet porte sur la prééclampsie, la principale pathologie de la grossesse, et plus particulièrement sur l’implication d’une famille de facteurs dénommés les prokinéticines au cours de cette pathologie. Nous nous intéressons également aux conséquences à long terme de cette pathologie qui ont pu être observées en clinique chez les femmes ayant fait une prééclampsie. Au cours de la grossesse normale, les niveaux des prokinéticines circulants augmentent graduellement avec un pic au premier trimestre puis chutent significativement aux deuxième et troisième trimestres. En revanche, chez les patientes prééclamptiques, leurs taux circulants sont significativement plus élevés et le restent au deuxième et au troisième trimestres, associés à de l’hypertension. Ceci est dû à une anomalie au moment de la formation des vaisseaux sanguins du placenta, qui permettent les échanges entre la mère et le fœtus. De ce fait le placenta ne reçoit pas suffisamment de nutriments et d’oxygène et développe un retard de croissance. Chez la mère, le manque d’oxygénation du placenta a diverses conséquences : une hypertension artérielle gravidique, des lésions au niveau des vaisseaux des reins, du foie et du cerveau, ainsi que des troubles de la coagulation sanguine. Le placenta, qui est pour sa part en hypoxie, et va alors se mettre à sécréter et libérer de nombreux facteurs pro-inflammatoires, dont les prokinéticines, dans la circulation sanguine maternelle Il est connu que les femmes ayant fait une prééclampsie sont plus tard, davantage sujettes aux pathologies cardiovasculaires. Récemment, plusieurs études cliniques ont également reporté qu’elles sont aussi susceptibles de développer des troubles de l’attention et de la mémoire, associés à des modifications du tissu cérébral, observées par imagerie médicale, 10 à 20 ans plus tard. L’objectif du projet est donc d'investiguer les mécanismes impliquant les prokinéticines à long terme dans l’apparition des modifications anatomiques cérébrales qui provoqueraient des troubles cognitifs et d’éventuelles pathologies neurodégénératives. Actuellement, ces facteurs sont en cours de certification comme biomarqueurs de la pathologie de la prééclampsie. Donc le but ultime de notre projet est de déterminer s’ils pourraient constituer des cibles thérapeutiques pour traiter la pathologie et ses conséquences à long terme.

Bénéfices attendus

• Les analyses, réalisées précédemment sur des sérums de patientes prééclamptiques, ainsi qu’en provenance d’animaux modèle de la pathologie, suggèrent une implication de la famille des prokinéticines dans le développement de la pathologie grave de la grossesse, qu’est la prééclampsie. • Cette étude in vivo nous permettra de mieux comprendre le rôle des facteurs pro-inflammatoires, que sont les prokinéticines, dans la prééclampsie et sur leurs conséquences à long terme. Enfin ces études nous permettrons de démontrer la valeur thérapeutique des antagonistes des prokinéticines dans le cadre d’un traitement de la pathologie.

Procédures

•les souris gestantes seront traitées par injection (durée : 1 minute), une fois par jour et tous les jours, entre le 7ème et le 17ème jour de la gestation. •Mesure du poids (durée: 5 min) et de la tension artérielle (durée : 20 min) des souris gestantes, tous les 2 jours, pendant 17 jours. • L’IRM des cerveaux sera réalisée 1 fois après la gestation (durée : maximum 2h). •Au moment de l’euthanasie les souris seront analgésiées 30 minutes avant de procéder à l’anesthésie.

Impact sur les animaux

• L’étude implique des injections intrapéritonéales répétées ce qui risquent de provoquer un peu de stress, un léchage de la région d’injection et/ou l’adoption d’une position recourbée suite à l’injection et durant quelques minutes, comme toutes injections chez les souris. •Les souris donnant naissance et allaitant jusqu’au sevrage pourront avoir une perte de poids. •L’enlèvement des souriceaux à J+3 peut représenter un stress pour la mère. •Les mesures de la pression artérielle répétée peuvent provoquer une irritation de la queue avec parfois l’apparition de plaies. •Cette étude porte sur des temps longs (jusqu’à 15 mois après la prééclampsie), des troubles cognitifs, i.e. stéréotypie, pourraient apparaitre.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour effectuer soit des dosages sanguins et tissulaires, soit d’une recherche in situ de marqueurs de l’inflammation et du développement de démence cérébrovasculaire.

Remplacement

•Le projet porte sur l’étude des conséquences cérébrales au cours du vieillissement suite à une pathologie de la grossesse, il nous est donc impossible à ce jour de remplacer par un modèle cellulaire la complexité d’interaction entre organes et cellulaires sur la durée qui existe lors de ce processus in vivo. •Ces mécanismes résultent d’interaction entre le placenta et le système neurovasculaire. A ce jour, il n’existe pas de modèle qui puisse reproduire ce contexte in vitro, sur une seule population cellulaire ou des explants en culture. En effet, l’organisme entier offre la possibilité d’étudier les lésions et les réponses inflammatoires, par dosage des cytokines circulantes, et, in situ, au niveau du site inflammatoire, i.e. : le cerveau dans notre projet. •Ce projet nécessite donc l’approche sur des animaux modèles de la pathologie permettant l’étude des mécanismes physiologiques complexes mis en œuvre.

Réduction

Cette étude se déroule sur une cinétique de 15 mois pour chacun des antagonistes testés, avec 6 points de cinétique. Pour obtenir des résultats statistiquement robustes, chaque groupe de souris comportera 10 souris femelles pour chaque étude. Afin de valoriser totalement les animaux engagés dans cette étude, une étude sera mise en place d’expérimentations in vitro, avec les souriceaux qui vont naitre au cours du projet.

Raffinement

Les animaux femelles sont hébergés en groupe et sans mâles dans un environnement enrichi : tube de cartons, petites maisons en plastique, matériel de nidification, ... L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux hébergés permettent de garantir leur bien-être. L’état de santé des animaux sera surveillé (état général) tout au long de l’expérience et quotidiennement, ce qui nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. •Les modifications de comportement et le degré de mal être des animaux seront surveillés quotidiennement, les points limites seront estimés à l’aide d’une grille d’évaluation du bien-être animal spécifique au projet. Plus l’état de la souris se détériore, plus le score établi dans cette grille augmente. La grille attribue un score suivant l’aspect général, le comportement et la locomotion ainsi que la perte de poids. Des points limites spécifiques à ce projet seront également pris en compte Un arbre décisionnel est mis en place permettant d’intervenir en cas de douleur voir d’euthanasier l’animal, mettant un arrêt à son expérimentation. Dans ce cas les tissus seront prélevés pour être analysés. •Avant les procédures d’IRM et de collecte du sang, les animaux seront analgésiés et anesthésiés.

Choix des espèces

• L’objectif du projet est d’étudier les conséquences de la prééclampsie, c’est à dire de la réaction inflammatoire du placenta au moment de la grossesse, sur le vieillissement du cerveau des années plus tard. Donc le choix de travailler sur un modèle animal est nécessaire pour avoir cette interaction inter-organe et dans le temps. • L’usage de la souris pour ce projet est approprié car comme chez l’humain, la placentation chez la souris est hémochoriale (le sang maternel est au contact direct avec les cellules fœtales placentaires). •Par ailleurs, plusieurs études ont montré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des gènes clés de la placentation chez les deux espèces et que plusieurs facteurs impliqués sont exprimés et régulés de la même façon. •Les travaux de l’équipe, depuis dix ans, ont montré qu’il existe une grande similitude dans l’expression et la régulation des prokinéticines, facteurs inflammatoires étudiés dans ce projet, chez les deux espèces également. •Le projet s’attache à étudier les troubles cognitifs des années après un épisode de prééclampsie, les souris femelles seront étudiées au moment de la prééclampsie (pendant et jusqu’à la fin de la gestation) puis au cours de leur vieillissement, jusqu’à 15 mois post-gestation, ce qui correspond à un âge d’environ 70 ans chez la femme.