Procédures modérées

390 lapins et poules vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections destinées à leur faire produire des anticorps, puis des prélèvements sanguins répétés, avant d'être mis à mort pour récupérer la quasi-totalité de leur sang. Le porteur décrit des réactions locales possibles, gonflement ou abcès, et générales, fièvre, perte de poids, baisse d'activité. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est assez efficace, écartant la production d'anticorps par criblage de phages jugée "décevante" malgré son existence depuis 1990.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de produire des anticorps polyclonaux suite à des immunisations de poules et lapins. Ces anticorps seront notamment utilisés pour la recherche (immunologie, oncologie, immunohistochimie, biomédicale…), en médecine, pour la réalisation de test de diagnostic… Ce projet respecte la réglementation relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques en vigueur.

Bénéfices attendus

1) Obtenir des quantités suffisantes d'anticorps polyclonaux pour pouvoir travailler dessus. 2) Approfondir les connaissances nécessaires pour l'avancement de la recherche dans les domaines suivants : immunologie, oncologie, immunohistochimie, recherche biomédicale, médecine... 3) Faire évoluer les tests de diagnostic. 4) Trouver de nouvelles pistes d'applications thérapeutiques.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux types d'interventions : des injections et des prélèvements sanguins. Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements, possibilité d'observation chez les animaux de réactions locales (gonflement, abcès...) et/ou générales (augmentation température, perte de poids, diminution de l'activité...) après les administrations.

Devenir

Les animaux inclus dans ces études seront mis à mort afin de récupérer la quasi-totalité du volume sanguin circulant selon les besoins et surtout de respecter le principe de précaution.

Remplacement

La production d'anticorps (AC) polyclonaux nécessite 1 immunisation de l'animal dans le cadre de ce projet. Il n'existe actuellement aucune méthode substitutive assez efficace pour répondre aux objectifs du projet. Une nouvelle approche a été publiée en 1990 pour le développement d'AC par un système de criblage de collection de phage qui ne nécessite pas l'immunisation d'animaux, mais les résultats restent très décevants. En effet, depuis 1990, aucun anticorps n'est utilisé en thérapie ou en diagnostic clinique malgré un certain nombre de publications scientifiques utilisant cette technologie. Seuls 1 AC anti-TNFα et plus récemment des AC neutralisants du SARS-Cov-2 ont été développés à partir de collection de donneurs humains dont les derniers sont des donneurs ayant été en contact avec le virus, donc immunisés. A ce jour, l'alternative aux immunisations animales consiste à développer des AC synthétiques à partir de banques ou "Library" synthétique pour le criblage d'un nombre important de fragments de molécules ("binders"), ayant une bonne interaction avec l'antigène. Ces fragments sont plus petits que les AC et peuvent réagir avec une certaine affinité avec l'antigène mais aussi tout autre antigène ayant une structure proche de celle recherchée. Ces réactions croisées sont, parmi d’autres inconvénients, souvent rencontrées par cette approche synthétique. Un autre inconvénient majeur, est que le fragment ne reconnait qu’1 seul épitope (partie d'une molécule capable de stimuler la production d'un anticorps), alors qu’un sérum polyclonal est multi-épitope, ce qui permet d’augmenter la sensibilité de la détection et aussi faciliter son développement dans le temps. Tous les AC synthétiques développés et publiés à ce jour sont dirigés contre des protéines recombinantes qui ont été utilisées pendant les étapes de criblage. Leur utilisation est très limitée et ne dépasse pas l’étape de résultats préliminaires, puisqu’ils ne reconnaissent pas les protéines endogènes (élaborées par l'organisme) qui ont des structures natives et conformationelles. Les AC synthétiques ne reconnaissent pas certaines modifications des protéines qui leur donnent telle ou telle fonction biologique. C'est pourquoi la majorité de ces anticorps n'est pas utilisée par la communauté scientifique qui continue de travailler et publier avec les anticorps conventionnels. L'approche de criblage par phage est testée en parallèle pour comparer les performances et valider ou non cette alternative.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum. Entre 2 et 6 animaux (poule ou lapin) seront inclus par étude. Le nombre sera choisi en fonction des volumes de sang que l'on peut prélever afin d'obtenir une quantité suffisante d'anticorps. Pour les poules, un nombre de 8 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 240 poules sur 5 ans (calcul à partir de 6 poules par étude). Pour les lapins, un nombre de 5 études environ par an a été estimé, d'où l'utilisation potentielle de 150 lapins sur 5 ans (calcul à partir de 6 lapins par étude). La réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sera respectée.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi (exemples : lapins = bois à ronger, foin/paille, de quoi grimper et se cacher... ; poule = perchoir, bloc à picorer ou type coquilles d'huîtres...). Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et un enrichissement compensatoire. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

Le lapin est une espèce particulièrement immunoréactive, permettant ainsi d’obtenir un sérum disposant d’une concentration importante en anticorps, avec des anticorps de forte affinité. En plus de leur immunoréactivité importante, les poules disposent d’anticorps spécifiques, les immunoglobulines Y, notamment extraits à partir du jaune d’oeuf. Ainsi, l’immunisation de poules permet de contrôler facilement le taux d’anticorps en limitant la contrainte imposée aux animaux. De plus, il existe des différences de séquences entre la partie constante des immunoglobulines Y et des immunoglobulines G. L’utilisation d’immunoglobulines Y permet ainsi de réduire le bruit de fond, les réactions croisées et les signaux aspécifiques. Les anticorps de poules sont également une alternative aux anticorps de lapin pour les expériences nécessitant des anticorps provenant de plusieurs hôtes différents. Le choix de l’espèce se fera donc en fonction de l’utilisation prévue des anticorps. Les lapins seront âgés de 6 semaines à 2 ans environ et les poules d'1 jour à 2 ans environ, car c’est à ces stades qu’ils sont entièrement immunocompétents.

3 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier par IRMf le codage des transformations somatomotrices. Chaque animal est habitué sur plusieurs mois à la sortie de cage et aux tâches, subit une chirurgie possible sous anesthésie et des injections d'un agent de contraste à base d'oxyde de fer, avec restriction hydrique et contention. Le porteur reconnaît un stress lié à l'immobilité et au bruit de la machine, et un risque de troubles hépatiques dû au fer. Il présente le primate non-humain comme "essentiel", modèle le plus proche de l'humain, et prévoit de réutiliser ces animaux plutôt que de les tuer.

Objectifs

Au quotidien, nous intégrons plusieurs modalités sensorielles afin d’interagir de façon flexible avec l’environnement. Par exemple, la coordination des informations visuelles, proprioceptives et tactiles nous permet d’attraper précisément une tasse sur une table. La transformation de l’information visuelle en mouvement de la main a été largement étudiée en laissant de côté le rôle de l’information tactile dans la planification de l’action, de ce fait nos connaissances sur cet aspect sont restreintes. Pour frapper, de nuit, un moustique posé sur notre main avec notre autre main, notre cerveau a besoin de guider le mouvement de notre main non pas quelque part à l’extérieur du corps, mais quelque part sur le corps. Cette transformation est complexe car notre corps peut prendre de multiples configurations : debout, assis, bras croisés etc. Le traitement tactile-moteur prend très probablement place dans le cortex postérieur pariétal (CPP). Cependant, les régions cérébrales précises ainsi que les mécanismes responsables demeurent méconnus. Notre projet a pour objectif d’identifier, par imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), les régions cérébrales impliquées dans l’organisation de mouvements vers le corps et d’élucider les mécanismes cérébraux sous-jacents. Pour ce faire, des macaques exécuterons des mouvements oculaires vers un endroit sur les mains défini soit par des cibles visuelles placées près des mains, soit par des cibles tactiles sur les mains. Les mains seront tantôt croisées tantôt décroisées passivement grâce à un moteur tactile. La comparaison des activations cérébrales lorsque les mouvements des yeux sont dirigés vers une information visuelle ou vers une information tactile, placées sur des mains croisées ou non croisées, nous permettra de répondre aux questions suivantes : Comment est-ce que la planification des mouvements de yeux change en fonction de la position de la main par rapport au corps ? Comment est-ce que la planification du mouvement des yeux change en fonction de la nature de l’information qui guide ce mouvement, visuelle ou tactile ? Cette étude s’inscrit dans une perspective comparative, puisque les mêmes expérimentations sont réalisées chez l’humain, dans l’objectif de comparer les fonctions du cortex pariétal humain et du primate non-humain, dans le contexte de la préparation de mouvements vers le corps.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral du processus de transformations somato-motrices. Grâce à ce projet, nous serons en mesure de décrire plus précisément les aires cérébrales impliquées ainsi que leur dynamique de fonctionnement. Ce projet permettra également une comparaison entre l’humain et le macaque et ainsi d’expliquer des différences évolutives entre ces deux espèces proches. Cette comparaison est rendue possible grâce à l’utilisation de l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle chez des sujets éveillés chez ces espèces, permettant ainsi la comparaison directe entre les activations cérébrales obtenues. Ces questions relèvent clairement du domaine des neurosciences fondamentales, et notre principale ambition est de mieux comprendre comment le cerveau met en œuvre ces fonctions cognitives chez l'homme et les primates non humains. Cependant, nous pensons que les réponses que nous apporterons pourront alimenter de nombreux domaines des sciences appliquées, des neurosciences cliniques, des sciences vétérinaires à l'intelligence artificielle.

Procédures

Habituation à la sortie de cage (3 mois) ; 1 Chirurgie potentielle sur un animal maximum, sous anesthésie générale (3h) ; Habituation aux tâche comportementales (6 mois); Habituation à l’injection d’agent de contraste (2 mois) comprenant 1 injection vigile (injections: 5s à 10s); Campagnes d’acquisitions IRMf vigile comprenant (3 semaines, 1 session par jour, maximum de 3 campagnes d’acquisition par an): 1 injection pour chaque session (injections: 5s à 10s), 3 prélèvements sanguins pour chaque campagne d’acquisitions IRM pour contrôler les niveaux de fer circulants (prélèvement: 10s à 15s). La procédure dans son ensemble est considérée comme modérée.

Impact sur les animaux

L’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) ne constitue pas une source potentielle de nuisances importantes. Les animaux peuvent toutefois subir un stress de par l’immobilité imposée ainsi que de par le bruit important généré par la machine. La restriction hydrique peut s’avérer stressante. La tâche implique le déplacement passif des bras dans un système de contention. Des injections de produit de contraste seront effectuées en vigile. Ce produit de contraste est un oxyde de fer supra-magnétique, qui peut induire des élévations du taux de fer sanguin et potentiellement des troubles hépatiques.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives. Les animaux ayant un plot implanté seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant des approches IRMf. De ce fait, nous ne prévoyons pas de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques. Si la décision est prise d’une sortie de protocole, le plot de tête sera désimplanté. A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes pourront être réutilisés pour une autre étude, ou un replacement dans un sanctuaire sera envisagé. En dernier recours, si aucune solution alternative n’est possible, les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale et comparative, utilisant des approches d’imagerie IRMf. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables (approche évolutive) transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Enfin, le projet scientifique porte spécifiquement sur la comparaison des fonctions cognitives chez l’homme et le macaque. A terme, cela permettra donc de préciser les circonstances expérimentales et cliniques dans lesquelles le macaque peut être utilisé comme un modèle de la cognition humaine, et les conditions où il ne le peut pas.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 3 animaux dans le protocole (2 en réutilisation et un en nouvelle inclusion). Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=2) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques comportementales avec des méthodes d’imagerie chez le primate non-humain, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=1). Tous les protocoles seront lancés sur les mêmes animaux ce qui nous permettra de comparer différentes acquisitions sur les mêmes sujets et ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les animaux en réutilisation, pour cette étude, suite à des recherches peu invasives, sont déjà entrainés à l’IRM et hébergé dans le laboratoire. Cette réutilisation est d’autant plus importante que ces animaux doivent être entraînés sur une longue durée de temps, avec renforcement positif, pour arriver à un comportement stable, avant de pouvoir passer à la phase de collecte de données. Nous prévoyons de lancer 9 campagnes d’acquisitions par animal (15 sessions par animal, chaque session incluant de 2 à 15 scans en fonction de la motivation des animaux).

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. Par exemple, l’imagerie constitue une approche non-invasive qui va nous permettre d’étudier l’activité cérébrale dans le cerveau entier des animaux sans engendrer d’effets délétères. L’implantation du plot, réalisée chirurgicalement sera réalisée avec les meilleures techniques d’asepsie possible, par un neurochirurgien, afin de réduire le risque d’infection ou de désimplantation. En dehors des sessions d’imagerie qui seront réduites le plus possible sans compromettre les résultats scientifiques, les animaux seront hébergés dans un environnement social, incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement (selon un protocole défini en SBEA et implémenté par les chercheurs et les techniciens animaliers). Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. Une sortie de cage vers la chaise sans canne est également à l’étude dans notre structure. De plus, la mise en place de points limites précoces nous permettra un suivi régulier du stress des animaux.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Cette étude s’intéresse à des mécanismes neurobiologiques chez le macaque pour des raisons de connaissance fondamentale. - Phylogénétiquement, ce modèle animal est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle la rendant notamment plus « facilement » comparable pour des études évolutives - Cette étude s’inscrit explicitement dans une perspective comparative entre espèces, la comparaison homme macaque étant un point clé de cette étude. En plus des connaissances fondamentales générées cela va permettre de préciser l’opportunité d’utiliser le macaque comme un modèle de la cognitive humaine et de ses dysfonctions. -Des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes du point de vue des neurosciences fondamentales. -Toutes informations physiologiques ou physiopathologiques obtenues chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. « Les deux animaux réutilisés sont des animaux matures. Les animaux reçus de nos fournisseurs sont de jeunes adultes (3.5-4 ans). Ils arrivent généralement déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. L’étude portant sur des sujets adultes, les variations de maturation ou de vieillissement au sein de cette tranche d’âge restes minimes et ne devrait pas engendrer de variations significatives des réponses neuronales dans les taches étudiées. A terme, des analyses portant sur un possible effet âge sur les traitements cognitifs qui nous intéressent pourront être entreprises à plus large échelle.

405 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection induisant un cancer mammaire, jusqu'à trois examens d'imagerie sous anesthésie, une injection de sonde et un prélèvement de sang terminal avant la mise à mort. Le porteur indique n'avoir observé aucun effet indésirable notable au cours de deux années d'études antérieures et suit les tumeurs au pied à coulisse. Il présente la validation in vivo de ces agents de contraste comme "primordiale" et "indispensable", aucun modèle in vitro ne reproduisant selon lui la dissémination métastatique.

Objectifs

Depuis 2 ans, les études de notre client, menées dans le projet autorisé sur la « validation in vivo de nouveaux agents de contraste spécifiques pour la netrin-1, potentiel biomarqueur du cancer mammaire métastatique », ont démontré des résultats prometteurs in vitro e in vivo. La suite des études a permis la conception d’autres agents de contraste pour le même biomarqueur (nétrine-1), ainsi que l’identification d’autres biomarqueurs pour lesquels notre client a cependant conçu des sondes d’imagerie, qui ont été synthétisées et testés in vitro. Notre client souhaiterait pouvoir les étudier in vivo, sur des souris témoin ainsi que des souris porteuses de tumeur mammaire. Pour cette nouvelle demande, il s’agit de pouvoir effectuer le même type de procédures autorisés que dans le projet précédent, mais, cette fois, concerne l’étude de plusieurs biomarqueurs, en utilisant des sondes d’imagerie de petite taille, à administrer par voie intraveineuse.

Bénéfices attendus

L’imagerie moléculaire, notamment le ciblage de biomarqueurs spécifiques, représente une alternative de choix pour une détection précoce de cancer étant donné que les changements physiologiques apparaissent bien avant les changements morphologiques que ces biomarqueurs engendrent et doit permettre un diagnostic précoce. Les études in vitro réalisées au préalable démontrent une affinité ou une réponse au biomarqueur de choix pour certaines des sondes développées par notre client et leur validation in vivo sur des modèles de cancer est primordiale.

Procédures

Induction de cancer mammaire : 1 injection par animal 5 minutes maximum sous anesthésie générale gazeuse. Suivi par imagerie : au maximum 3 examens non invasifs sur 24h avec 1 délai d'1h minimum entre 2 examens sous anesthésie générale. Administration de la sonde 1 seule injection par voie intraveineuse sur souris vigile. Prélèvement de sang sur animal anesthésié volume de 400μL puis mise à mort. Mesure de la tumeur au pied à coulisse: sur animal vigile, 2 minutes, 1 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Concernant la mise en place du modèle de cancer mammaire, les dommages attendus sont liés au développement d’une tumeur et nous mettrons en place un suivi ainsi que des points limites pertinents permettant d’anticiper toute douleur ou stress qui pourrait être provoqué chez l’animal. La douleur infligée par l’injection des cellules et réactifs pour l'imagerie, elle, correspond à celle d’une piqûre d’aiguille. Après ces 2 ans d’études, nous n’avons pas remarqué d’effets indésirables ou nuisances dues au développement tumoral ni à l’administration des sondes. La cinétique par imagerie scintigraphique 3D ainsi que la biodistribution ex vivo ont été réalisées 10 jours post induction. A ce stade, les tumeurs sont

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de chaque procédure car elles ne peuvent pas être réutilisées pour la procédure suivante ou une autre étude.

Remplacement

Le cancer et la formation des métastases sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes, tissus et types cellulaires, conduisant en particulier à l’échappement des cellules cancéreuses de la tumeur primaire et leur survie et dissémination dans l’organisme. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro, le recours aux animaux est indispensable. Par ailleurs, ce projet vise à vérifier le ciblage spécifique d’un agent de contraste vers la tumeur ; et de comprendre la biodistribution de ces agents de contraste parmi les différents organes, ce qui n’est possible qu’en utilisant un animal vivant. Pour ces raisons l’utilisation du modèle animal souris est fondamental, puisque l’étude préclinique en particulier ne peut se faire que sur un organisme vivant entier.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles. Pour chacune des sondes, pour chaque procédure et à chacun des 6 souris sont induites avec des cellules 4T1 en intramamaire. Nous en sélectionnons 3 sur les 6 de taille de tumeur identique pour effectuer les examens. L’analyse statistique sera effectuée avec le logiciel GraphPad PRISM V7 pour comparer les lots expérimentaux. Etant donné le nombre réduit de souris par lot, des tests Mann-Whitney non paramétriques avec correction de Welch seront utilisés pour déterminer les différences entre chaque lot change selon la distribution des échantillons, et le test de Kruskal-Wallis non paramétrique suivi par un post-test de Dunns ou Tukeys de comparaison de groupes multiples.

Raffinement

Les animaux seront observés scrupuleusement et des points limites prédictifs nous permettront de prendre les mesures nécessaires afin d’éviter toute souffrance au cours de l’expérimentation. Les études réalisées depuis 2 ans ont montré très peu de souffrance des animaux. Les points limites n’ont jamais été atteints (pas de perte de poids observée, pas de tumeur >200mm3, pas de nécrose sévère des tumeurs mammaires. De plus, durant les examens d'imagerie et l'induction du modèle tumoral, les souris seront anesthésiées. Enfin, les souris seront hébergées dans des cages en portoir ventilé enrichies avec du celluron. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation.

Choix des espèces

La souris est une espèce animale classiquement utilisée pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d’utiliser des techniques d’imageries in vivo. C’est ainsi le modèle animal de choix afin de réaliser des expérimentations permettant d’étudier la croissance de tumeurs primaires et de métastases issues de cellules cancéreuses. La lignée de cellules 4T1 est une lignée d'origine murine. Elle est classiquement administrée au laboratoire sur la lignée de souris BALB/c By. Le fournisseur de la lignée cellulaire (ATCC) indique qu'elle provient de souris BALB/c By (Aslakson CJ, Miller FR. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52: 1399-1405, 1992). Un lot de souris BALB/c By témoin sera aussi étudié. 5 - 6 semaines, stade où les bourgeons mammaires ne sont pas complètement développés et où les conditions hormonales de la souris sont adéquates pour la croissance tumorale.

4 000 souris, rats et hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit sous anesthésie une chirurgie de pose de cathéter vasculaire ou non vasculaire, jusqu'à 45 minutes, suivie d'un hébergement individuel de deux à six jours. Le porteur reconnaît une douleur pendant et après la chirurgie et un inconfort lié à l'isolement. Il présente cette prestation comme préparant des rongeurs cathétérisés expédiés vers d'autres laboratoires, et décrit l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'homme.

Objectifs

Les rongeurs sont les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux dans les domaines tels que l'oncologie, les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, etc. Ce projet a pour but d’avoir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans des études expérimentales. Plusieurs prestations sont réalisées chaque année sur rats, souris et hamsters concernant l'implantation de cathéters (vasculaire : 400/an et non vasculaire : 400/an).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, le projet diminue le stress car il évite les appareils de contention, allège et diminue la contention manuelle. Il empèche également la douleur provoquée par des injections ou des prélèvements, unique ou répétés.

Procédures

Chaque animal subira sous anesthésie, une chirurgie de pose de cathtéter(s) vasculaire ou/et non vasculaire, pour une durée maximum de 45 minutes. Suite à la chirurgie, l'animal sera hébergé individuellement, pour une durée comprise entre 2 et 6 jours.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie, celle en post-opératoire, et également l'hébergement en individuel, pouvant générer inconfort et stress.

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales.

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adapté afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres système métabolique proche de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connu ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins suivant les éléments cibles de l'organisme. Les animaux commenceront le projet à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimun) et devront peser au moins 100 g (pour les rats), 20 g (pour les souris) et 60 g pour les hamsters. L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet.

20 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent sur deux jours une chirurgie du dos induisant une plaie cutanée chronique avec arrêt de l'irrigation sanguine, puis des traitements par plasma froid trois fois par semaine et un maintien en cage individuelle. Le porteur indique que l'induction de la plaie peut causer une souffrance limitée dans le temps et qu'un excès d'espèces réactives pourrait provoquer une nécrose des tissus, constituant un point limite. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne permet de suivre la cicatrisation sur plusieurs semaines et conclut que le recours au rat est nécessaire.

Objectifs

Les plaies cutanées chroniques représentent un problème de santé publique important avec en France près de 50 000 patients atteints d’ulcère de jambe, 40 000 diabétiques avec une plaie du pied et 350 000 escarres. Leur prise en charge induit des coûts importants de par la chronicité de ces plaies. Les soins sont prolongés, le matériel est parfois coûteux, le temps infirmier nécessaire est important, les arrêts de travail et les hospitalisations sont longues. De plus, ces plaies chroniques ont toujours un retentissement majeur sur la qualité de vie du patient. Les plasmas froids produisent des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote qui ont une capacité pro-cicatrisante et antibactérienne. L'utilisation des plasmas froids se différencie par le fait qu’elle est non invasive, c’est-à-dire sans contact, et sans douleur. Les objectifs de cette première étude menée dans le cadre d’un nouveau projet sont d’évaluer les effets de plasmas froids générés par une nouvelle technologie sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques induites chez le rat. Les effets seront comparés à ceux observés sur des plaies cutanées chroniques non traitées. Les traitements par plasmas froids seront effectués sous anesthésie 3 fois par semaine jusqu’à cicatrisation complète. A l’issue de l’étude, des dosages seront effectués sur un prélèvement de sang après placement des animaux sous anesthésie générale, suivi après leur euthanasie du prélèvement d’organes pour la réalisation d’analyses.

Bénéfices attendus

La réalisation de cette première étude dans le cadre d'un projet global va permettre d’évaluer les effets de traitements par plasmas froids de "nouvelle génération" sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat, et de comparer ces effets avec des plaies cutanées chroniques non traitées. Les données des analyses effectuées sur les prélèvements de sang, de peau de la région cicatrisée et des organes prélevés en fin d’expérimentation, permettront d’appréhender les effets des traitements effectués sur la cicatrisation de plaies cutanées chroniques chez le rat. Cela permettra de poursuivre les études sur l’animal dans le cadre de ce projet, et notamment d’étudier les effets d’une combinaison traitements par plasmas froids et pansement actif, et d’envisager leur utilisation future chez l’Homme. Cela permettra à terme de proposer une nouvelle thérapie innovante pour le traitement de plaies cutanées chroniques chez le sujet sain ou diabétique.

Procédures

Les rats seront soumis à une procédure chirurgicale pour l’induction d’une plaie cutanée chronique avec arrêt de l’irrigation sanguine sur une région du dos, procédure effectuée sous anesthésie générale sur 2 jours consécutifs. Un traitement analgésique sera administré chaque jour avant la chirurgie et 6 heures après la fin de celle-ci le 2ème jour. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ le 1er jour et en 10 minutes environ le 2ème jour. Les plaies cutanées seront traitées 3 fois par semaine et seront protégées par un morceau de gaze stérile et 2 bandes de sparadrap pour le maintien de celle-ci. Un suivi quotidien des rats sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Un maintien des rats en cage individuelle est nécessaire pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps, et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée chronique réalisée sur 2 jours successifs peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. Les traitements et les changes de gaze et de sparadraps, effectués également sous anesthésie générale de courte durée, environ 5 à 10 minutes, n’engendreront quant à eux aucune douleur. Une toxicité éventuelle des traitements par plasmas froids pourrait se traduire par exemple par une nécrose avancée des tissus traités en raison d'un excès d'espéces réactives de l'oxygène, pouvant alors constituer un point limite. L’hébergement en cage individuelle des rats est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’ils ne s’arrachent entre eux les points de suture, la gaze et les sparadraps au cours de la période de traitement. Cela permet également d’éviter toute interférence avec le processus de cicatrisation qui est un processus long passant par différentes phases successives. Cet hébergement en cage individuelle des rats peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque rat de voir au moins un de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social. Un prélèvement de sang de 3 ml environ sera réalisé sur les 20 rats lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, effectué en moins d’une minute avant leur euthanasie, pour réaliser des analyses sanguines.

Devenir

A l’issue de l’unique procédure expérimentale, les 20 rats seront euthanasiés lorsque leur plaie cutanée sera totalement cicatrisée, après réalisation d’un prélèvement de sang pour la réalisation d’analyses sanguines. Les rats seront euthanasiés afin de permettre le prélèvement de la peau au niveau de la région ou la plaie cutanée a été induite, ainsi que des organes pour la réalisation d’un ensemble d’analyses.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de réaliser des traitements et un suivi sur une durée prolongée, plusieurs semaines, du processus cicatriciel dépendant de mécanismes complexes successifs. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats d’études menées sur un autre modèle expérimental chez le rat, et d’un calcul de puissance statistique. Sur la base de ce calcul il est nécessaire d’utiliser au moins 9,5 rats par groupe de traitement pour les 2 groupes de traitement envisagés. Nous utiliserons donc 2 groupes expérimentaux de 10 rats.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction des plaies cutanées (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré trois fois par semaine lors de chaque traitement et/ou change de gaze et de sparadrap et observation des plaies cutanées. Si une perte de poids importante est observée, ou si des signes d’infection de la plaie cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les rats seront placés en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique et respecter également la période de réalisation des traitements appliqués pour être dans des conditions similaires à celles qui seront utilisées chez l’Homme. Des briques d’Aspen seront placées dans chaque cage de rats comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacées lors de chaque change de litière. L’utilisation de cages transparentes permettra de maintenir un contact social visuel entre les rats d’un même portoir.

Choix des espèces

Le Rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet car il présente une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme, avec une durée de cicatrisation suffisamment longue. Les animaux seront de jeunes rats âgées de 8 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 9 semaines pour la réalisation des expérimentations. Les rats auront ainsi une taille permettant l’induction de plaies cutanées chroniques de dimensions suffisantes pour mimer les plaies cutanées chroniques chez l’Homme.

83 200 souris et rats vont être utilisés, la plupart tués, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles subissent une chirurgie de transfert d'embryons d'environ quinze minutes sous anesthésie générale, pour servir de mères porteuses. Le porteur indique que ces femelles réimplantées sont tuées au sevrage des petits, sauf quelques-unes gardées comme sentinelles sanitaires, et que 156 rates sont réutilisées. Il justifie la voie chirurgicale par un taux de naissance 2,5 fois supérieur à la méthode non invasive, qu'il juge sans réelle "valeur ajoutée éthique".

Objectifs

Ces transferts d’embryons ont pour but de mettre à disposition de la communauté scientifique des animaux sains. En effet, la présence de contaminants dans les colonies de rongeurs de laboratoire peut introduire un biais dans les résultats obtenus et leur analyse, ainsi qu'avoir des conséquences néfastes sur le bien être de ces animaux. La cryoconservation et le transfert d’embryons permettent de réduire considérablement les populations de rongeurs de laboratoire, en ciblant la naissance d'une majorité d'animaux d'intérêt scientifique. En effet, à partir d’embryons décongelés, de sperme suivi d’une fécondation IN VITRO ou encore de collecte d’embryons post accouplements naturels, les embryons collectés et lavés en milieux stériles appropriés sont réimplantés dans des femelles pseudogestantes qui vont en assurer le développement IN UTERO et leur élevage jusqu’au sevrage. Enfin, au-delà des 2 arguments cités ci-dessus, le transfert d’embryons permet également d’autres améliorations telles que le retour à un microbiote caractérisable, améliorer les conditions d’élevage, sécuriser sanitairement les échanges lors de collaboration,… Ce projet est donc un élément de base dans la gestion et l'élevage des colonies de rongeurs de laboratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont d'obtenir rapidement des rongeurs d'intérêt scientifique et de haute qualité sanitaire issus de femelles réimplantées ayant la capacité de donner les meilleurs taux de naissances possibles post transfert embryonnaire par voie chirurgicales.

Procédures

Les animaux subissent une procédure chirurgicale unique d'une durée moyenne de 15 minutes après anesthésie générale

Impact sur les animaux

La chirurgie de transfert d'embryon est composée d’un protocole chirurgicale unique et analgésique maitrisé ainsi que d’un suivi post-opératoire adapté. L’impact négatif pour l’animal est réduit au maximum.

Devenir

Les femelles réimplantées seront mises à morts au sevrage des petits sauf quelques-unes qui seront utilisées en tant que sentinelles pour le contrôle du statut sanitaire des portées. Les animaux sevrés seront envoyés au donneur d’ordre pour des fins scientifiques.

Remplacement

Des solutions commerciales de kits de transfert d'embryons par voie naturelle sont proposées par différentes compagnies. Les méthodes dites "non invasives" (par voies naturelles) offrent des taux de naissance de l'ordre de 2.5 fois moins comparativement à la méthode chirurgicale. Cela nécessite donc l'utilisation d'un plus grand nombre de donneuses d'embryons et de mères porteuses pour obtenir un même résultat. Les taux de naissances obtenus et les spécificités techniques associées à leur utilisation ne permettent donc pas encore une réelle valeur ajoutée éthique pour les transferts d'embryons par des quantités réduites d'animaux au strict minium pour atteindre les objectifs scientifiques souhaités. Les transferts d'embryons dans des femelles pseudgestantes B6CBA/F1 permettent également la réalisation de shéma d'accouplement (IN VIVO ou IN VITRO) avec des taux d'animaux d'intérêts supérieurs à ceux issus d'accouplements naturels. Ces transferts évitent ainsi de nombreux accouplements naturels pour une cible finale en terme de nombre d'animaux d'intérêt identique dont les femelles du modèle ne pourraient pas: ovuler, assurer une gestation ou encore allaiter correctement.

Réduction

L'aspect réduction du nombre d'animaux est traité via une politique de réduction au strict minimum nécessaire de femelles réimplantées pour atteindre des objectifs fixés par les utilisateurs finaux. Les revitalisations de modèles maintenus au format congelé lorsqu'ils ne sont pas en études actives, les décontaminations par transfert embryonnaires, les expansions rapide de colonies par fécondation IN VITRO,... sont toutes des solutions qui répondent complètement aux 3R et à l'objectif de réduction d'animaux en élevage. La production d’animaux expérimentaux par des méthodes alternatives, intégrant des transfert d’embryons, permet de rationaliser les besoins des chercheurs : - en évitant les élevages permanents desquels une infime partie des animaux produits est utilisée. - en offrant une homogénéité des lots, une qualité génétique et sanitaire supérieure, et un microbiote standardisé. - en permettant de réduire la quantité d’animaux produite aux uniques besoins. Un élevage moyen d’un modèle produit environ 500 animaux par an, ce qui arriverait à une quantité de 2 500 000 animaux nés sur 5 ans pour 1000 modèles. Pour le même nombre de modèle, le transfert embryonnaire pour produire les lots d’animaux expérimentaux sur 83 700 mères porteuses permet une réduction minimale de 10 fois la quantité d’animaux produite en élevage continue. Cette méthode répond efficacement aux attentes d’une démarche 3R.

Raffinement

Le raffinement sera obtenu par l'application d'une surveillance quotidienne de l'état de santé des animaux avec une grille d’évaluation adaptée pour déceler tout signe clinique et atteinte des points limites, par un hébergement avec enrichissement adapté à l'espèce et à son état physiologique et par un protocole analgésique maitrisé lors de la chirurgie. D'après notre historique, les taux de gestations et taux de naissance sont similaires à ceux d'accouplements naturels et nous avons une absence de mortalité post chirurgie. Ces éléments témoignent d'une procédure maitrisée.

Choix des espèces

L’espèce choisie doit être identique à celle du modèle scientifique et pour lesquel le recours à cette technique est nécessaire. Parmi les rongeurs, les espèces les plus utilisées par la communauté scientifique sont les souris et les rats. Pour les souris, nous avons choisi l’hybride B6CBA/F1 qui est la plus reconnue scientifiquement pour ses qualités reproductrices pour assurer une gestation et un sevrage d'un plus grand nombre de petits avec un gabarit homogène et donc une standardisation optimale du process. Pour les rats, la souche Sprague Dawley est reconnue comme étant la plus appropriée pour cette même technique et pour ses qualités reproductrices. L’âge est déterminé par l'âge de maturité des fonds génétiques et la faculté des animaux utilisés à mener à bien la production d’une portée jusqu’à son sevrage : -Rats: Sprague Dawley de 10 à 12 semaines -Souris: B6CBA/F1 de 10 à 15 semaines

1 560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une incision de la peau et du muscle de la patte arrière sous anesthésie pour induire une allodynie, puis reçoit des candidats médicaments par diverses voies avec parfois des prélèvements de sang répétés. Le porteur indique que le modèle repose sur la douleur provoquée par l'incision plantaire et signale des risques de non-réveil ou de mauvaise cicatrisation. Il présente ces deux modèles comme intégrés à "l'offre de service" de l'entreprise, destinée à des clients développant des analgésiques.

Objectifs

Dans le cadre de son travail, le laboratoire teste des candidats médicaments. Le but de ce projet est de tester des molécules dans un modèle de douleur post-opératoire chez la souris. Les douleurs post-opératoires sont des douleurs survenant à la suite d’une intervention chirurgicale. Les patients atteints de ces douleurs présentent des symptômes caractéristiques tels qu’une hyperalgésie (sensation douloureuse ressentie comme encore plus douloureuse) et une allodynie (sensation non-douloureuse ressentie comme douloureuse). Ce type de douleur est encore principalement traité par des opiacées, mais aussi des antiépileptiques ou anti-inflammatoires. Le traitement ne peut donc pas rester perdurer sur du long terme sans entrainer dépendance, accoutumance ou de lourds effets secondaires. Aux vues du nombre d’opération réalisées chaque jour, il est important de trouver des molécules fiables et efficaces pour traiter les douleurs post-opératoires. Deux modèles précliniques de douleur ont donc été mis au point pour étudier les nouveaux traitements contre ces douleurs post-opératoires. Un de ces deux modèles consiste à inciser seulement la peau plantaire, alors que l’autre consiste à inciser en plus les tissus profonds. L’incision de la peau et des tissus profonds induit une douleur plus importante que l’incision de la peau seule. L'incision de la peau et des muscles imite mieux la chirurgie invasive (une douleur aiguë intense) et conduit à une douleur chronique (entre 4 et 5jours). Ce modèle de douleur post-opératoire peut être associé avec des tests d’allodynie mécanique : von Frey électronique ou monofilament de von Frey. Ces tests sont couramment décrits dans la littérature. Le test de monofilament de von Frey est utilisée avec la méthode dit “up-and-down” et va permettre de déterminer le seuil 50% de retrait de la patte en gramme. Le von Frey électronique va, lui, permettre de donner une valeur en gramme du seuil de retrait de la patte.

Bénéfices attendus

Ces deux modèles seront intégrés dans l’offre de service de l’entreprise qui pourra ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés avec un modèle proche de la clinique, qui permet de proposer de tester ces candidats médicaments sur l’allodynie mécanique chez la souris.

Procédures

Les animaux sont soumis à une incision de la peau et une incision du muscle de la patte arrière droite, cela dure environ 4-5min par animal. Ils sont soumis à l’administration de composés à potentiel anti-douleur par voie p.o., ip., sc., i.v. ou i.m. Les souris peuvent recevoir une injection ou deux si le client demande une co-admnistration. Le geste de l'admnistration dure 1minute environ. Les souris peuvent aussi être soumises à des prélèvements de sang afin de surveiller la pharmacocinétique d’un composé. Cela peut être des prélèvements uniques ou répétés en fonction de la demande client.

Impact sur les animaux

La nuisance principale est liée au modèle lui-même qui consiste en l’induction d’une allodynie par incision de la voute plantaire des animaux. Pour limiter la douleur lors de l’induction du modèle, l’incision est réalisée sous anesthésie gazeuse. De plus, les effets indésirables peuvent être un non-réveil suite à l’anesthésie sous isoflurane ou une mauvaise cicatrisation de la plaie. Des nuisances associées à la pharmacologie peuvent également apparaitre (tremblement, sédation, déshydratation). Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, rétro-orbital). Les administrations et prélèvements peuvent donc présenter des nuisances pour les souris.

Devenir

Le modèle de douleur post-opératoire chez la souris entraine une activation des processus inflammatoires. Les processus inflammatoires sont mobilisés dans de nombreux modèles de douloureux même chronique comme les neuropathies. Il est donc difficile d’évaluer l’impact que pourrait avoir cette chirurgie sur un autre modèle de douleur. De plus, les administrations de candidat médicaments peuvent aussi créer des interactions ou des modifications biologiques difficiles à évaluer dans le cadre de ce travail. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société.

Remplacement

L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=10 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées par la société. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV.

Raffinement

Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Le test avec les monofilaments de von Frey comporte une valeur de cut-off à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance. Pour limiter le stress les animaux sont habitués au dispositif de tests aussi. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation et 24h aux salles de tests). De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, papier kraft et briquettes en bois à ronger). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude ou à défaut par un autre technicien du laboratoire (formé à l’expérimentation animale niveau I ou II). Concernant l'anesthésie, les animaux pour la chirurgie POP sont sous isoflurane durant maximum 5minutes, un système de chauffage et d'aspiration sont intégrés à la table d'anesthésie gazeuse afin de garantir un réveil plus confortable pour les animaux.

Choix des espèces

La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein d’ANS Biotech. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature. 1560 souris seront utilisées pour ce projet. Le découpage de ce nombre par procédure se présente ainsi : - 780 souris subiront la procédure n°1 - 780 souris subiront la procédure n°2 Soit un total de 1560 souris Lots 10 animaux/groupes x 5 groupes + 2 animaux x 3 études/an x 5ans = 780souris par procédure

5 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les bases neurales de l'attention. Chaque animal reçoit un plot de tête et une chambre d'enregistrement fixés par des vis, avec une craniotomie de 18 mm donnant accès au cerveau pour y descendre des électrodes lors des sessions. Le porteur reconnaît un risque d'infection et de lésions cérébrales à mesure que les enregistrements se répètent. Il conclut que le primate non-humain est "essentiel" comme modèle le plus proche de l'humain, et prévoit de réutiliser ces animaux devenus d'une "grande valeur scientifique" plutôt que de les tuer.

Objectifs

La fonction attentionnelle est une fonction cognitive essentielle à l’implémentation de la plupart des autres fonctions cognitive. Elle améliore ainsi les fonctions d’apprentissage, de mémorisation, de planification, de raisonnement etc. Lorsqu’elle fait défaut, suite à un accident cérébral, une maladie neurodégénérative ou encore des troubles neurodéveloppementaux, les personnes se retrouvent en difficultés cognitives dans leur vie quotidienne et leurs apprentissages. Notre objectif est d’identifier les processus neuronaux et métaboliques qui sous-tendent cette fonction à la fois localement (c’est-à-dire comprendre comment chaque neurone et les neurones d’une même région cérébrale fonctionnent ensemble lorsqu’on utilise notre attention), et dans le réseau cérébral attentionnel (c’est-à-dire entre les différentes aires cérébrales qui sont activées lorsqu’on utilise notre attention). Nous analyserons ces réponses neuronales locales et distantes pendant l’exécution de tâches comportementales impliquant l’attention, en situation normale, ou lors de l’utilisation de molécules stimulant le système noradrénergique et ainsi l’attention, ou encore, en utilisant des approches visant à modifier l’activité corticale par le sujet lui-même et lui permettant d’apprendre à optimiser le fonctionnement de ces régions cérébrales. Le projet combine analyse du comportement, et injections pharmacologiques systémiques et intracérébrales, enregistrements électrophysiologiques, et enregistrements métaboliques. Nous ciblerons spécifiquement le cortex pariétal et le cortex préfrontal, deux régions impliquées dans la fonction attentionnelle. Il sera réalisé chez le primate non humain, le seul modèle animal doté d’un système visuel et attentionnel comparable à celui de l’Homme et capable d’effectuer des tâches aussi complexes que celles réalisées par l’Homme. Ce projet nous permettra d’atteindre une meilleure compréhension de la façon dont le cerveau met en œuvre la fonction attentionnelle, et de proposer des pistes thérapeutiques pharmacologiques ou interventionnelles (invasives ou non-invasive) pour sa réparation ou son amélioration.

Bénéfices attendus

Ce projet est conçu pour enrichir nos connaissances fondamentales concernant le fonctionnement cérébral et la fonction attentionnelle du primate non-humain, et de l’homme par extension. Grâce à ce projet, nous pourrons comprendre comment l’activité neuronale et métabolique du cortex pariétal et du cortex préfrontal organise la fonction attentionnelle et quel rôle la neuromodulation noradrénergique joue dans ce contexte. Nous serons également en mesure de caractériser les bénéfices des approches visant à modifier l’activité corticale par le sujet lui-même (neurofeedback) sur la dynamique cérébrale ainsi que sur la performance comportementale. Ces questions relèvent clairement du domaine des neurosciences fondamentales, et notre principale ambition est de mieux comprendre comment le cerveau met en œuvre la fonction attentionnelle chez l'homme et les primates non humains. Cependant, nous pensons que les réponses que nous apporterons pourront alimenter les neurosciences cliniques.

Procédures

Habituation à la sortie de cage (3 mois) ; 2 Chirurgie sous anesthésie générale (3h/ Chirurgie); Habituation aux tâche comportementales (6 mois); Enregistrements électrophysiologiques et métaboliques (3 mois); 2 Anesthésies générales pour examens d’imagerie anatomique (3h/ examen). La procédure dans son ensemble est considérée comme modérée.

Impact sur les animaux

La partie électrophysiologique du projet implique l’implantation d’un plot de tête et d’une chambre d’enregistrement par l’intermédiaire de vis en céramique et en titane chirurgicalement implantées sur la tête de l’animal. Les chambres d’enregistrement pariétale et préfrontales donneront sur une craniotomie (circulaire 18mm de diamètre) permettant l’accès à la dure-mère et au cerveau pour pouvoir y positionner une électrode (d’enregistrement neuronal ou métabolique) au moment des sessions d’expérimentation. La présence de ces chambres d’enregistrement constitue une source potentielle d’infection requérant une attention particulière, avec des soins fréquents adaptés. De potentiels lésions cérébrales engendrées lors de la pénétration de l’électrode dans le cerveau sont à prévoir avec la répétition des sessions d’enregistrement. Le suivi comportemental quotidien des animaux nous informera sur la présence ou non d’une lésion débilitante. Cette possibilité demeure toutefois extrêmement rare. Il n’est pas démontré que l’effet cumulatif entre les différentes phases du projet soit délétère pour la santé de l’animal. Toutes les étapes du projet étant classées en procédure légère, à l’exception des interventions chirurgicales classées en modérée, nous estimons que la sévérité totale du projet demeure modérée pour les animaux.

Devenir

A la fin du protocole, en concertation avec le vétérinaire réfèrent et dépendamment du degré réel de sévérité de la procédure pour chaque animal, les singes seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude. Ces animaux auront acquis une grande valeur scientifique, du fait de leur entrainement à réaliser des taches cognitives. Les animaux ayant un plot implanté seront préférentiellement réutilisés pour une autre étude nécessitant les mêmes approches expérimentales. De ce fait, nous ne prévoyons de désimplantation chirurgicale à la fin de notre protocole que sur les animaux pour lesquels une sortie de protocole sera décidée. Également, notre protocole ne nécessite pas l'euthanasie de ces animaux pour des fins scientifiques. Les animaux sortis de protocole seront candidats à un replacement dans un sanctuaire. En dernier recours, si aucune solution alternative n’est possible, les animaux seront sacrifiés.

Remplacement

L’utilisation du modèle primate non-humain apparait essentiel pour la réalisation de cette étude de recherche fondamentale, utilisant des approches d’électrophysiologie et de pharmacologie. Phylogénétiquement, ce modèle d’étude pré-clinique est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle. Ainsi, les informations obtenues seront plus facilement comparables transposables et identifiables à une application chez l’humain. De plus, des taches comportementales variées peuvent être réalisées par ces animaux permettant ainsi l’étude d’un large spectre de comportements complexes. Aucun autre modèle animal ne présente ces caractéristiques. Par ailleurs, cette approche d’électrophysiologie telle que décrite dans le projet ne peut être à ce jour réalisée chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit à la valeur minimale permettant d’atteindre une significativité et reproductibilité des observations. Au total, nous prévoyons la possibilité d’inclure 5 animaux dans le protocole (4 en réutilisation et 1 en nouvelle inclusion). Ce nombre a été choisi sur la base du nombre minimum standard d’animaux (n=4) défini par la communauté scientifique abordant des problématiques comportementales avec des méthodes d’électrophysiologie chez le primate non-humain, étant données les conditions expérimentales envisagées, et sur la possibilité d’avoir à remplacer des animaux en cours de protocole (n=1). Tous les protocoles seront lancés sur les mêmes animaux ce qui nous permettra de comparer différentes acquisitions sur les mêmes sujets et ainsi optimiser la puissance statistique de notre étude. Les animaux en réutilisation, pour cette étude, sont déjà entrainés aux tâches comportementales et hébergé dans le laboratoire. Deux sont déjà implantés des chambres d’enregistrements. Cette réutilisation est d’autant plus importante que ces animaux doivent être entraînés sur une longue durée de temps, avec renforcement positif, pour arriver à un comportement stable, avant de pouvoir passer à la phase de collecte de données.

Raffinement

Notre méthodologie expérimentale a été planifiée afin de minimiser l’impact de notre étude sur la santé et le bienêtre des animaux. L’expérimentation implique l’utilisation simultanées de plusieurs types d’enregistrements (neuronaux, métaboliques) avec ou sans manipulation pharamacologique, permettant ainsi de maximiser la qualité et la diversité des données recueillis permettant ainsi le recueil de données de haute valeur scientifique, habituellement recueillis dans le cadre de plusieurs protocoles indépendants. L’implantation du plot, réalisée chirurgicalement sera réalisée avec les meilleures techniques d’asepsie possible, par un neurochirurgien, afin de réduire le risque d’infection ou de désimplantation. Les animaux ne seront implantés avec les chambres d’enregistrement qu’au moment d’initier la phase d’électrophysiologie de l’étude. La craniotomie réalisée chirurgicalement sera la plus petite possible à l’intérieur de la chambre d’enregistrement, minimisant ainsi le possible risque d’infection. Les enregistrements seront effectués avec des microélectrodes/sondes fuselées à faible diamètre (150microm) pour ne pas créer de lésion significative au niveau de la structure cérébrale d’intérêt. Les imageries réalisées au préalable nous permettront de cibler avec précision les régions cérébrales à enregistrer et nous indiquerons comment positionner l’électrode pour être le plus efficace possible dans la collection de données électrophysiologiques et métaboliques. En dehors des sessions comportementales qui seront réduites le plus possible, les animaux seront hébergés dans un environnement social avec accès à de grandes volières incluant du matériel de fourrage et de multiples formes d’enrichissement. Pour favoriser des interactions sans stress excessif entre l’animal et l’expérimentateur, les animaux seront entrainés à la technique d’association positive entre un son (clicker), une action, et une récompense alimentaire. De plus, la mise en place de points limites précoces nous permettra un suivi régulier du stress des animaux.

Choix des espèces

Pour cette étude, le modèle primate non-humain (macaque) apparait essentiel pour plusieurs raisons : - Cette étude s’intéresse à des mécanismes neurobiologiques chez le macaque pour des raisons de connaissance fondamentale. - Phylogénétiquement, ce modèle animal est le plus proche de l’humain dans l’expression de ses comportements et dans son organisation anatomo-fonctionnelle la rendant notamment plus « facilement » comparable pour des études cognitives -Toutes informations physiologiques ou physiopathologiques obtenues chez le primate non-humain est plus facilement transposable à une application chez l’humain. Les quatre animaux réutilisés sont des animaux matures. Les animaux reçus de nos fournisseurs sont de jeunes adultes (3.5-4 ans). Ils arrivent généralement déjà en groupe et sont socialement compatibles permettant de les pairer pour leur hébergement. L’étude portant sur des sujets adultes, les variations de maturation ou de vieillissement au sein de cette tranche d’âge restes minimes et ne devrait pas engendrer de variations significatives des réponses neuronales dans les taches étudiées