Procédures modérées

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une instillation d'élastase dans la trachée par une incision au cou pour provoquer un emphysème, des injections répétées de tamoxifène pouvant causer une péritonite, puis leurs poumons sont prélevés 21 ou 90 jours plus tard. Le porteur affirme qu'aucune méthode sans animal ne permet d'isoler les cellules pulmonaires vieillissantes en cause et justifie ainsi le recours à la souris. Les retombées annoncées pour les patients atteints de BPCO, une éventuelle médecine réparatrice des alvéoles, restent renvoyées au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat étant de caractériser ces cellules.

Objectifs

La Bronchopneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) peut entraîner des complications chez l'homme comme la perte progressive des alvéoles pulmonaires. Dans les poumons des patients atteints par cette maladie, les cellules vieillissantes exprimant le gène p16 sont augmentées et empêchent la réparation des alvéoles. Nos données préliminaires montrent que la délétion de p16 ou l’élimination des cellules vieillissantes corrige les lésions alvéolaires chez la souris. Notre hypothèse est que les cellules vieillissantes bloquent la régénération alvéolaire et expliquent le manque de réparation dans cette maladie. Ainsi, l’objectif du projet est d’étudier le devenir et les propriétés non régénératives des cellules épithéliales vieillissantes dans la perte d'alvéoles liée à la BPCO. La connaissance des propriétés non-régénératives des cellules épithéliales vieillissantes nous permettra de confirmer l’effet délétère de ces cellules sur la réparation des tissus. Si notre hypothèse est validée, nous pourrons ensuite envisager l’utilisation de sénolytiques, molécules permettant d’éliminer les cellules sénescentes, et ainsi restaurer les alvéoles pulmonaires dans l’emphysème pulmonaire chez l’homme. Pour cette étude, nous utiliserons des souris ayant des cellules vieillisantes exprimant le gène p16 fluorescentes, permettant de les isoler et les caractériser au niveau épithélial par différentes analyses.

Bénéfices attendus

Nous anticipons l'identification : i) de(s) mécanisme(s) de l'effet délétère des cellules épithéliales vieillissantes dans la perte alvéolaire, ii) une ou plusieurs sous-populations épithéliales aux capacités régénératives modulées par les cellules p16 vieillissantes. Ces cellules régénératrices seront considérées comme cruciales dans la régénération alvéolaire et leur signature génétique sera analysée. La caractérisation des cellules délétères et des cellules régénératives permettera l'identification de biomarqueurs (caracteristiques biologiques mesurables) d'un processus de régénération réussi ou non. Ce processus serait la dernière étape avant d'envisager le lancement d'un essai clinique pour tester un médicament régénératif identifié avec la plus grande chance de succès. Au total, nous espérons que ces avancées élargiront le champ de la médecine réparatrice aux patients atteints de ces maladies caractérisées jusqu'à présent par une perte terminale et irréversible des alvéoles conduisant à un handicap respiratoire majeur.

Procédures

Instillation intra-trachéale (dans la trachée) sous anesthésie générale, injection intra-péritonéale (dans le péritoine) sur animal vigile et prélevement des poumons sous anesthésie générale, sans réveil.

Impact sur les animaux

Pour activer l'expression de la protéine fluorescente dans notre modèle, il est nécessaire de faire une injection par jour pendant 3 jours de Tamoxifen en injection intra-péritonéale. Cette procédure cause une douleur de courte durée au moment de l'injection. Dans de rare cas, les injections peuvent causer des péritonites chez les animaux. Nous utiliserons sur ces mêmes souris le modèle d’emphysème induit par l’élastase qui consiste en une instillation intratrachéale unique d’élastase. L’élastase est instillée à l’aide d’une aiguille directement dans la trachée. Cela nécessite une petite incision au niveau de l’avant du cou que nous refermons avec du fil de suture. La plaie au site d’injection pourrait s’infecter. Les souris seront mises à mort à 21 et 90 jours après l’instillation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever et étudier leurs poumons.

Remplacement

La variabilité des caractéristiques des patients comme leur âge, leur consommation de tabac, ou encore l’implication d’autres maladies rend plus complexe l’interprétation des résultats en provenance de l’Homme. Le modèle de souris emphysèmateuse ayant des cellules p16Pos fluorescentes permettra d’étudier directement les cellules responsables de la non régénération qui sera uniquement lié à l’emphysème pulmonaire. Les modèles animaux nous permettent de mieux définir les organes et types cellulaires touchés et nous précisent donc les cibles moléculaires intéressantes pour des thérapeutiques éventuelles.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour ce projet est limité à 40, correspondant au minimum pour obtenir des résultats pour une expérience pilote. Pour l’ensemble des manipulations animales un total de 40 souris seront utilisées. Les animaux seront répartis de cette manière : - Caractériser les cellules épithéliales vieillissantes dans les poumons des souris emphysémateuses : 4 souris instillées à l’élastase vs 4 souris instillées au PBS (contrôle) à 21 jours de l’instillation. 4 souris instillées à l’élastase vs 4 souris instillées au PBS (contrôle) à 90 jours de l’instillation. Malgrés le nombre de cellules limités que nous pouvons analyser (limite de cette technique), nous utiliserons 4 souris par condition pour lisser la différence inter-individu. - Tester les propriétés des cellules souches en formant des organoides alvéolaires avec des cellules p16Pos vs p16Neg : 6 souris instillées à l’élastase vs 6 souris instillées au PBS (contrôle) à 21 jours de l’instillation. 6 souris instillées à l’élastase vs 6 souris instillées au PBS (contrôle) à 90 jours de l’instillation. Nous avons besoin d’une quantité suffisante de cellules pour faire au moins 6 puis d’organoïdes (correspondant à 6 souris) par condition pour obtenir un résultat significatif. Le choix du nombre d'animaux pour ce projet a été déterminé par rapport aux précédentes expérimentations effectuées sur des souris utilisées dans le cadre d'un autre projet.

Raffinement

Les animaux seront particulièrement suivis par le personnel qualifié de l'animalerie, avec une attention particulière sur l’aspect des animaux traités. Il y aura un présence quotidienne des zootechniciens et une surveillance accrue de notre part durant les 24h suivant l’instillation d’élastase. Les souris sont hébergées en groupe de 4 par cage. Les souris seront hébergées dans des portoirs ventilés avec un environnement enrichi. Les souris auront à leur disposition de la boisson et de la nourriture, des huttes en carton, des balles de coton, des feuilles de papier pour jouer et des baguettes de bois à ronger. En cas de mal être, les points limites suivants constituront des critères d'arrêt et conduiront à la mises à mort des souris : blessure, infection, masque facial ou signes de douleur.

Choix des espèces

La souris est un animal très utilisé dans la recherche translationnelle et son développement pulmonaire et cérébral est proche de celui de l'homme. Les possibilités d’analyse avec des anticorps sont importantes chez la souris et la mise au point de modèles génétiquement modifiés est bien développée chez la souris. Le modèle d’emphysème induit par l’élastase permet par une unique injection d’obtenir un emphysème important chez la souris. De plus, ce modèle est très utilisé dans la littérature pour étudier l’emphysème plutôt que, par exemple, le modèle d’exposition à la fumée de cigarette qui implique une exposition longue et pénible pour des animaux : 2h par jour pendant 6 mois pour obtenir un emphysème léger. Les animaux seront utilisé à l’âge 2 mois, correspondant à la fin du développement total de l’appareil respiratoire chez la souris.

30 cochons vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une thérapie par ultrasons focalisés sur la valve aortique de 80 à 105 minutes, avec des échographies et des prélèvements de sang, puis est gardé un mois en observation avant d'être tué. Le porteur indique des douleurs possibles liées à l'application de la sonde et à l'émission des ultrasons, en s'appuyant sur des essais déjà menés chez l'humain. Cet amendement, qui ajoute un prélèvement sanguin, sert à tester l'innocuité d'un dispositif traitant le rétrécissement de la valve aortique, les cochons étant tués pour une analyse anatomopathologique.

Objectifs

AMENDEMENT. Notre dispositif est destiné à permettre de traiter de manière non invasive les patients souffrant de rétrécissement aortique calcifié, maladie durant laquelle la valve aortique se rigidifie. Cette pathologie est à l’heure actuelle traitée de manière invasive soit par chirurgie à cœur ouvert soit par cathétérisme afin de remplacer la valve malade. Ces interventions sont lourdes et parfois difficiles voire impossibles à supporter pour des sujets âgés. En focalisant les ultrasons de manière non-invasive sur la valve des patients notre thérapie permettrait de dérigidifier la valve et d’améliorer son fonctionnement sans effets secondaires. De premiers essais cliniques (« First In Human ») de notre prototype d’investigation clinique (Valvosoft®) ont été réalisés en Europe sur 34 patients souffrant de rétrécissement aortique calcifié sévère, inopérables avec les techniques invasives existantes. Les résultats de ces essais sont très encourageants tant du point de vue de l’innocuité de notre thérapie avec aucun évènement indésirable à court et long terme (suivi jusqu’à 24 mois) lié à notre dispositif médical, que des signaux d’efficacité très encourageants. Cependant la performance de la thérapie pourrait encore être améliorée. La durée de la thérapie pour obtenir l’efficacité avait été déterminée in vitro car il n’existe pas de modèle animal du rétrécissement aortique calcifié. Nous avions ensuite vérifié l’innocuité de cette durée sur porcs sains. Notre hypothèse est qu’une durée de thérapie supérieure est nécessaire sur les patients du fait des obstacles aux ultrasons (peau, muscles, côtes, poumons, etc…) qui ne peuvent être reproduits in vitro. Suite aux essais cliniques et à l’analyse des résultats cliniques intermédiaires, nous avons significativement amélioré notre dispositif médical (Valvosoft®) afin d’améliorer sa performance, son innocuité, son usabilité et sa maintenance, en particulier avec un nouveau système d’imagerie, une modification de la forme de l’interface acoustique facilitant la transmission des ultrasons et une nouvelle interface graphique. Nous avons donc trois objectifs : 1) Vérifier l’innocuité de notre thérapie per et post procédure à 30 jours avec le nouveau prototype d’investigation clinique 2) Déterminer si une durée plus longue de 105 minutes de notre thérapie reste sans danger. 3) Vérifier l’usabilité de la version améliorée de notre dispositif.

Bénéfices attendus

L’application de notre thérapie par ultrasons sur des pathologies cardiaques, et sa validation, ouvrirait des nouvelles perspectives pour la prise en charge de ces pathologies chez l’homme (cardiopathie valvulaire) normalement traitées par chirurgie ou cathétérisme. Cela permettrait de proposer à long terme une solution thérapeutique noninvasive et indolore (uniquement par ultrasons), sans chirurgie ni cathétérisme. Cette nouvelle approche si elle s'avère positive transformera la prise en charge des patients avec rétrécissement aortique calcifié.

Procédures

AMENDEMENT. La demande d'amendement de ce projet porte sur l'ajout d'un prélèvement sanguin supplémentaire sur l'animal pendant sa période d'observation entre 12 heures et 24 heures après la fin de notre thérapie par ultrasons. Sous anesthésie générale et analgésie, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : 1) Thérapie non-invasive par ultrasons transthoraciques d’une durée de 80 ou 105 minutes suivant les lots. 2) Echocardiographies de contrôle avant et après thérapie ainsi qu’un mois après thérapie, d’une durée approximative de 15 minutes chacune. 3) Prélèvements sanguins avant et après thérapie ainsi qu’un mois après thérapie, quatre tubes de 5 ml à chaque prélèvement, durée approximative deux minutes à chaque point de contrôle.

Impact sur les animaux

Toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie, garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Sur la base des essais précliniques et cliniques précédents, nous n’anticipons pas de douleurs au réveil ni de perte de poids ou de mobilité. Cependant lors de l’expérimentation des douleurs liées à l’application prolongée de la sonde d’imagerie dans l’espace intercostal sont possibles. Certains patients ont également rapporté une douleur lors de l’émission des ultrasons thérapeutiques qui cesse dès l’arrêt de l’émission.

Devenir

A l’issue de la thérapie, les animaux seront maintenus en vie pour observation et suivi à un mois afin de détecter d’éventuels effets indésirables de notre thérapie. Après le suivi à un mois, les animaux seront mis à mort afin de procéder à une analyse anatomopathologique permettant de détecter d’éventuels effets indésirables de notre thérapie, non détectables par les méthodes non-invasives (échocardiographie) ou minimalement invasives (prélèvements sanguins) mises en œuvre avant la mise à mort.

Remplacement

L’application de notre thérapie in vitro (sur tissus statiques) a déjà été réalisée à de multiples reprises. Nous devons travailler sur le vivant car le mouvement cardiaque et l’obstacle produit par les tissus thoraciques sont les principales difficultés pour l’application de cette technologie, et la réaction des tissus traités sur un mois n’est pas modélisable in silico ou in vitro. De plus, il va être crucial de démontrer l'innocuité (in vivo) de notre thérapie avec la version 2 de notre dispositif chez l’animal à moyen terme pour pouvoir ensuite l’appliquer sur la cardiopathie valvulaire humaine. Enfin, il est important d’évaluer les effets potentiellement indésirables de notre thérapie ce qui n’est possible que in vivo et de vérifier l’activité cardiaque à court et moyen terme (par échocardiographie et biochimie sanguine) avant d’utiliser notre dispositif sur l’homme avec une durée de thérapie plus longue que celle actuellement autorisée. Pour analyser et interpréter notre expérimentation, nous avons deux nécessités : 1) rendre l’expérimentation possible, donc il nous faut un animal d’un poids suffisant, avec une fenêtre de thérapie accessible ; 2) obtenir des résultats extrapolables à l’homme, donc avoir accès à une anatomie comparable aux caractéristiques humaines en effet la profondeur de la valve aortique de porc est de 5 à 10 cm, correspondant à celle de l’homme et c’est un animal qui présente une grille costale comparable à celle de l’homme également. Cela permettra de tester un dispositif identique à celui qui sera utilisé sur les patients. Une des limites actuelles de notre technologie est la taille de notre zone thérapeutique (5 à 10 mm). Travailler sur des animaux plus petits nous exposerait à une difficulté de précision de thérapie et une impossibilité d’extrapoler à l’humain les résultats obtenus.

Réduction

La vérification de l’innocuité de notre thérapie avec notre nouveau prototype d’investigation clinique, sera effectuée dans les mêmes conditions qu’avec la version précédente : 80 minutes de thérapie sur porcs sains, groupe de 15 porcs avec un suivi d'un mois après thérapie par ultrasons. La vérification du deuxième objectif sera réalisée sur 15 porcs exposés à une durée de 105 minutes de thérapie avec un suivi d'un mois après thérapie par ultrasons. Les améliorations d’usabilité de notre dispositif version 2 doivent faire l’objet d’évaluations formatives et sommatives afin de satisfaire les exigences de la Food and Drug Administration (FDA), troisième objectif de cette étude. Dans le cadre des 3R et en particulier de la Réduction, les animaux utilisés pour les deux premiers objectifs permettront de valider et documenter l’usabilité de la nouvelle version de notre dispositif, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Le nombre de 30 animaux en deux groupes de 15 est légitime pour garantir la preuve de concept sur une série (Réduction). Nous nous basons en particulier sur notre étude précédente ayant permis de détecter à l’histologie des effets microscopiques sur la valve de 5 des 16 porcs traités. Travailler sur plus d’animaux n’aurait pas d’intérêt scientifique. Travailler sur moins d’animaux nous exposerait au risque de ne pas aboutir à la preuve de concept, donc de sacrifier inutilement. Une étude statistique sera réalisée avec des tests adaptés afin d’évaluer les effets du traitement sur l'insuffisance aortique et la surface valvulaire pour chaque groupe. De même ces tests seront appliqués pour les évaluations de biochimie sanguine.

Raffinement

Toutes les manipulations chez l’animal seront sous anesthésie générale et analgésie, pour une pénibilité minimale. Sur la base des essais précliniques et cliniques précédents, nous n’anticipons pas de douleurs au réveil ni de perte de poids ou de mobilité. Une fois anesthésiés, les animaux sont intubés et placés sous ventilation contrôlée. Après réveil, les points limites seront basés sur l’examen visuel: état de choc, léthargie, inconscience, immobilité ; émaciation prononcée et atrophie musculaire ; difficultés respiratoires (sifflements, râle, respiration rapide); position anormale (dos voûté, couché sur le côté); et réduction de la mobilité (faiblesse, incoordination, tremblements, paralysie). Si ces signes sont observés, le vétérinaire (qui effectue aussi une visite par semaine) déterminera la procédure à suivre: - soit analgésie dont le traitement sera poursuivi sur une période de 3 à 5 jours -soit euthanasie, sous anesthésie et analgésie. Une alimentation en poudre est administrée afin de faciliter la déglutition suite à l’intubation. Hébergement en cage individuelle, des jeux (boule avec granule, jeux de mordillements) sont fournis.

Choix des espèces

Pour analyser et interpréter notre expérimentation, nous avons deux nécessités : 1) rendre l’expérimentation possible, donc il nous faut un animal d’un poids suffisant, avec une fenêtre de thérapie accessible ; 2) obtenir des résultats extrapolables à l’homme, donc avoir accès à une anatomie comparable aux caractéristiques humaines en effet la profondeur de la valve aortique de porc est de 5 à 10 cm, correspondant à celle de l’homme et c’est un animal qui présente une grille costale comparable à celle de l’homme également. Cela permettra de tester un dispositif identique à celui qui sera utilisé sur les patients. Une des limites actuelles de notre technologie est la taille de notre zone thérapeutique (5 à 10 mm). Travailler sur des animaux plus petits nous exposerait à une difficulté de précision de thérapie et une impossibilité d’extrapoler à l’humain les résultats obtenus. Nous travaillerons sur des cochons jeunes adultes de 14 à 16 semaines d’âge car leur poids compris entre 45-55 kg permettra de tester la faisabilité de notre thérapie ultrasonore sur une anatomie similaire à l’homme.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau de 45 minutes, jusqu'à six passages en chambre de mesure respiratoire et un test de tolérance au glucose de deux heures, avec un régime hypercalorique de huit semaines. Le porteur qualifie l'exposition aux odeurs d'"inoffensive" et affirme que la prise de poids ne cause pas de souffrance. L'étude, menée sur des souris transgéniques, cherche comment les odeurs modulent des neurones du contrôle de la faim, les pistes contre l'obésité restant hypothétiques.

Objectifs

Dans ce projet nous nous intéressons à la régulation de la prise alimentaire. Cette régulation implique notamment un réseau de neurones situé dans le noyau arqué de l’hypothalamus. Les expériences porteront sur 2 populations de neurones ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Il s’agit d’une part, des neurones POMC ayant pour action supposée de limiter la prise alimentaire et d’autre part, des neurones AgRP stimulant la prise alimentaire. De précédentes études réalisées sur des souris ont révélé la capacité de ces neurones à répondre non seulement lorsque le cerveau détecte la présence de nutriments en quantités mais également à des signaux sensoriels issus notamment de la nourriture. Ainsi les neurones POMC et AgRP peuvent être modulés par l’odeur de nourriture avant même qu’un aliment ne soit ingéré. Le présent projet propose de caractériser les mécanismes à l’origine de cette modulation des neurones du noyau arqué par les odeurs de nourriture chez la souris. Différentes odeurs présentes dans des nourritures palatables seront utilisées pour tester leur effet sur la physiologie des neurones POMC et AgRP.

Bénéfices attendus

Les expériences proposées permettront une meilleure compréhension des mécanismes neurobiologiques de la régulation de la prise alimentaire. Dans le contexte de l’augmentation forte du nombre de personnes en surpoids ou obèses dans le monde, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour le contrôle de la prise alimentaire s’appuyant sur l’utilisation d’odeurs modulatrices des circuits neuronaux régulant la prise alimentaire.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une durée d'environ 45 minutes. Toutes les précautions seront prises pour éviter une douleur de l'animal. Ils seront ensuite testés 6 fois maximum en chambre pléthysmographique (animal libre de ses mouvements) pour une durée d'environ 15min par session. Les animaux seront testés pour leur tolérance au glucose (effets métaboliques potentiels des régimes alimentaires administrés) une seule fois à la fin des expérimentations pour une durée de 2h.

Impact sur les animaux

Les odeurs utilisées proviennent d’aliments ou d’arômes alimentaires et seront utilisées à des doses faibles (les doses nécessaires à leur détection par les souris) et sur des durées inférieures à 2h. Cette exposition est donc inoffensive pour les animaux. Le régime hypercalorique entrainera une prise de poids qui sera mesurée une fois par semaine. Durant les 8 semaines d’administration du régime hypercalorique, la prise de poids sera limitée et ne causera pas de souffrance à l’animal. Les perfusions intracardiaques seront réalisées sur animal en cours d’euthanasie à la suite de l’administration d’un antalgique 30min avant.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des expérimentations pour vérifier la bonne implantation des fibres optiques. Si un animal atteint les points limites avant la fin de la procédure, il sera euthanasié.

Remplacement

L’objectif général du projet vise à comprendre les mécanismes à l’origine de la modulation de la prise alimentaire par les odeurs. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude des neurones impliqués dans le contrôle de la prise alimentaire reste donc une nécessité expérimentale pour fairre avancer notre compréhension de ces processus modulateurs. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.

Réduction

Plusieurs éléments permettent de répondre au principe de réduction tout en évitant de compromettre l’obtention de résultats interprétables : i) les tests statistiques envisagés, ii) la variabilité couramment observée permettant d’avoir au maximum n=15, iii) la réalisation de plusieurs tests différents sur le même animal.

Raffinement

En accord avec la structure chargée du bien-être animal au sein du laboratoire, nous avons défini les meilleures conditions d'hébergement possibles ainsi que les points limites précoces. Dans ce projet, nous avons 5 à 10 souris par cage, présence de différents enrichissements (batonnet de bois, dôme en carton et bandelettes de papier pour former un nid), surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Nous appliquons les méthodes recommandées pour l’analgésie, l’anesthésie et l’euthanasie. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience.

Choix des espèces

Le projet proposé porte sur l’étude de populations particulières de neurones hypothalamiques ayant un rôle clé dans le contrôle de la prise alimentaire. Les expérimentations seront réalisées sur des souris transgéniques nous permettant de cibler ces populations neuronales afin d’en comprendre le fonctionnement. La souris est le seul modèle animal permettant les modifications transgéniques nécessaires à la transformation ou à la visualisation de la population neuronale étudiée dans ce projet. D’autre part, la souris est un animal à l’odorat très développé qui utilise les odeurs dans son comportement alimentaire. Enfin, sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues servent les explorations thérapeutiques chez l’humain. Les procédures expérimentales débuteront à l’âge de 5 semaines (mise sous régime modifié). Les mesures neurophysiologiques seront réalisées chez l'adulte au cours de la 13ème semaine de vie.

2 000 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la majorité expédiés vivants vers d'autres laboratoires et les autres tués. Chaque animal subit sous anesthésie une ablation des glandes surrénales de 30 minutes, puis son eau de boisson est remplacée par du sérum physiologique pour compenser la chute de sodium. Le porteur indique une douleur chirurgicale et post-opératoire, une hyponatrémie et une déshydratation. Ce projet prépare à la demande des rongeurs sans glandes surrénales, décrits comme "préparés en vue de leur utilisation", pour d'autres projets de recherche.

Objectifs

Les rongeurs sont les animaux les plus utilisés dans la recherche expérimentale étant un modèle présentant des caractéristiques proches de l'humain et une grande définition et stabilité génétique, ce qui en fait un modèle de choix pour les pathologies humaines. Ils représentent les modèles animaux de choix dans les domaines tels que les maladies cardiovasculaires, neurodégénératives et métaboliques, l'immunologie, l'oncologie, etc. Ce projet a pour but d'avoir des rongeurs préparés en vue de leur utilisation dans leurs études expérimentales. Plusieurs sessions sont réalisées chaque année sur rats et souris (environs 400/an).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la mise au point de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires dans la pathologie humaine qui est ciblée par la/les substance(s) active(s) testée(s). Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Le bénéfice est aussi de ne pas avoir l’influence hormonale (hormones de stress, hormones minéralocorticoides, glucocorticoides et androgènes) intervenant dans la régulation du métabolisme, de la pression artérielle ...

Procédures

Chaque animal subira sous anesthésie, une ablation des glandes surrénales, pour une durée maximale de 30 minutes. Après la chirurgie et durant toute la vie de l'animal, l'eau de boisson sera intégralement remplacée par du liquide physiologique 0.9 % pour compenser l'hyponatrémie.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou les effets indérisables attendus sur les animaux sont la douleur pendant la chirurgie, celle en post-opératoire, également l'hyponatrémie (baisse de sodium dans l'organisme) et la deshydratation.

Devenir

La majorité des animaux seront expédiés dans des laboratoires de recherche, pour une utilisation dans leurs projets de recherche. Les animaux aptes au transport après évaluation clinique seront expédiés, les autres seront mis à mort (pas de possibilité de continuer le projet ou d’être réutilisé).

Remplacement

Pour l’étude d’une pathologie, l’utilisation d’animaux permet de comprendre le fonctionnement d’un organisme. L'utilisation d'animaux est donc rendue nécessaire car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les réactions du corps vivant entier (ensemble complexe). Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. Des méthodes alternatives (ex: in vitro) ne sont pas réalisables, l'objectif du projet étant de fournir des modèles animaux préparés utilisés dans des études expérimentales

Réduction

Nous réalisons ce protocole avec nos partenaires avec qui nous échangeons sur le nombre minimal et suffisant d’animaux utilisés. Aucune approche statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Une surveillance des animaux est faite quotidiennement pour déceler tout signe clinique anormal et atteinte des points limites tout au long du projet. L’observation est basée sur l’utilisation d’une grille d’évaluation spécifique au modèle. Les chirurgies seront réalisées par un personnel formé et expérimenté avec un protocole anesthésique et analgésique adapté et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins adaptés et l'eau de boisson intégralement remplacée par du liquide physiologique 0.9 % pour compenser l'hyponatrémie, afin de permettre une bonne récupération des animaux.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets bénéfiques d'un produit candidat médicament car les rongeurs ont un système nerveux développé et d'autres systèmes métaboliques proches de celui de l'Homme. Leur génétique est parfaitement connue ce qui permet d'avoir des résultats reproductibles permettant d'élaborer des conclusions fiables. Le choix de l'espèce au sein de l'ordre des rongeurs est conditionné par les besoins de nos partenaires suivant les éléments cibles de l'organisme. Le projet commencera avec des animaux à partir de l’âge de 4 semaines (âge minimum). L'âge exact est déterminé par la demande de notre partenaire en fonction de son axe de recherche. Le choix du stade de développement des animaux est donc justifié dans sa demande de projet.

234 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèle de trisomie 21, elles reçoivent des injections dans l'abdomen chaque jour pendant jusqu'à 23 jours, puis passent des tests d'apprentissage et de mémoire. Le porteur indique une douleur accentuée par la répétition des injections et un stress lié à l'isolement et à l'appauvrissement du milieu. L'objectif affiché est de tester trois molécules censées améliorer les performances cognitives, les souris étant tuées pour prélever les cerveaux.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent 3 nouveaux composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer le composé parmi ces 3 candidats (composés 1,2 et 3) qui se révélera le plus efficace en termes de restauration des fonctions intellectuelles. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une amélioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoire, mémoire de travail et mémoire explicite) dans un modèle souris de trisomie 21, qui montre de faibles résultats dans ces 2 tests.

Procédures

Les animaux seront injectés quotidienement par voie intraperitonéale avec des molécules à visée thérapeutique pour une durée maximale de 23 jours. Le temps de l'injection dure 20 secondes maximum.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une aiguille pour l'injection en intraperitoneale. Cette douleur sera accentuée à cause de la repetition des injections, 23 au total, soit 1 par jour. L'isolement des animaux et l'appauvrissement du milieu peut entrainer un stress.

Devenir

Pour la phase 1 (validation de l'activité de la proteine d'intérêt), tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des 12 jours de traitement. Les cerveaux seront prelevés pour réaliser un dosage de l'effet des molécules à visée thérapeuthique. Pour la phase 2 (test d'apprentissage et de mémoire), tous les animaux seront euthanasiés 24 heures après la fin du test permettant d'evaluer les effets des molécules à visée thérapeuthique sur la mémoire et l'apprentissage. Les cerveaux seront prélevés pour des analyses moléculaires.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposé à l’espèce humaine.

Réduction

Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisées à partir de 12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons les 3 composés sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. Une première phase visant a s’assurer de l’effet des inhibiteurs sur l’activité kinase de Dyrk1a sera effectuée. Dans le cas où les molécules testées ne montrent pas l’effet inhibiteur attendu, la phase 2 ne sera pas menée. Pour cette 1ère phase, nous utiliserons 90 souris, réparties en 10 souris sauvages non traitées, 10 souris trisomiques non traitées et 10 souris trisomiques traitées, soit 30 souris x 3 composés évalués, soit 90 souris. Pour cette 1ère phase, notre expérience dans ce domaine nous indique que 10 individus sont suffisant pour obtenir un résultat statistiquement significatif. Pour la 2ème phase de projet, nous allons utiliser un total de 144 souris. L'étude se déroulera en 3 groupes d’expériences (1 groupe par composé) comme détaillée ci-dessous : Pour chacun des différents composés nous aurons besoin de 3 lots d’animaux : - 16 Souris contrôles sauvages non traitées - 16 Souris contrôles trisomiques non traitées - 16 Souris trisomiques traitées, pour 3 molécules différentes. Notre experience dans ce domaine nous montre que 13 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne reponderont pas, c'est pourquoi nous testeront 3 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état. Pour la manipulation des animaux, et afin de limiter le stress, nous utiliserons des tubes de contention, ce qui évite la manipulation par la queue. Les tubes seront laissés dans les cages d'élevage pour palier à l'absence de nid, comme enrichissement du milieu. Les animaux seront elevés en groupe de 2 animaux minimum pour éviter l'isolement, sauf au moment du test du nouvel objet, pour augmenter le niveau d'exploration des souris. Le point d'injection sera alterné droite gauche tous les jours pour limiter la douleur et surveillé quotidiennement. Si des plaies apparaissent au site d'injection, elles seront désinfectées par un antiseptique local + crème cicatrisante (Betadine + Vetramil). Si la plaie devient importante et/ou profonde avec développement d’une infection ou une aggravation à 48h malgré les soins, l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. En outre, le génome de la souris étant manipulable, cela permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du Syndrome de Down. Les souris seront étudiées à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 3 mois, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présents. Dans cette étude, les deux sexes seront utilisés. Nous voulons être sûre que les hormones et donc le sexe n’impactent pas sur l’effet des produits testés.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte dans le fémur des cellules de leucémie humaine, puis des cellules immunitaires et un facteur de croissance par injections répétées, avec des prélèvements de sang et des imageries. Le porteur indique une tumeur dans les os provoquant une douleur modérée, une perte progressive de mobilité et une perte de poids. L'étude, menée sur des souris privées de système immunitaire, cherche comment les cellules "tueuses" du système immunitaire luttent contre la leucémie, les animaux étant tués pour prélever leurs organes.

Objectifs

La leucémie est un cancer du sang. Il a été montré qu’une population particulière de cellules du système immunitaire (système de défense de l’organisme), les cellules tueuses (=cellules Natural Killer) pourraient jouer un rôle important dans la lutte contre le développement des leucémies. L’objectif de notre projet d’utiliser un modèle animal permettant d’identifier les altérations affectant ces cellules tueuses, permettant potentiellement d’identifier de nouvelles voies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Par ce projet, nous espérons élucider les mécanismes par lesquels les cellules Natural Killer (NK) agissent afin d’éliminer les cellules leucémiques. Avec l’amélioration des techniques diagnostiques, et de façon parallèle l’augmentation de l’espérance de vie, le nombre des individus souffrants de leucémies va croître. Comprendre les mécanismes contrôlant la progression du cancer nous permettrait d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de contrôler efficacement le développement du cancer de façon précoce en augmentant l'activité du système immunitaire.

Procédures

Dans le cadre de ce projet, nous mettrons en place un modèle de leucémie chez la souris. A cet effet, nous injecterons des cellules humaines issues de lignées cellulaires leucémiques, par injection dans le fémur de la souris (durée de l’injection de 1 min, sous anesthésie et analgésie). Nous injecterons par la suite des cellules NK humaines (injection dans la veine de la queue, sur souris éveillée; durée de l'injection: 30 secondes), qui possèdent un rôle anti-tumoral et lutterons donc contre le développement de la leucémie. Le maintien de ces cellules chez la souris nécessite des injections sous la peau (sur souris éveillée, durée de l'injection 30 secondes), d’IL15 (facteur de croissance des cellules NK) de façon bi-hebdomadaire (au total 8 injections, sur notre période expérimentale de 4 semaines). Des prélèvements de sang seront réalisés au niveau de la veine de la joue (sur souris éveillée, durée: 15 secondes) afin de suivre la quantité de cellules NK de façon hebdomadaire (soit un total de 4 prélèvements). Le suivi du développement de la tumeur sera effectué une fois par semaine par imagerie (sous anesthésie, d'une courte durée (

Impact sur les animaux

L'injection de cellules leucémiques dans le fémur des souris entrainera le développement d'une tumeur localisée dans les os des souris, pouvant conduire à une douleur modérée associée à une perte progressive de la mobilité et une perte de poids. Les injections par voies sous cutanées, intra péritonéales et intra veineuse peuvent provoquer une douleur modérée chez l’animal en raison de leur répétition (stress liée à la contention quotidienne pendant 5 jours consécutifs).

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées en fin de procédure expérimentale,qui durera au total 4 semaines, pour en prélever les organes à des fins d’analyse scientifique.

Remplacement

L’utilisation du modèle murin dans ce projet est indispensable pour étudier le développement des tumeurs et le rôle des cellules immunitaires, tels qu’ils se déroulent dans un organisme vivant. En effet, cela fait intervenir de nombreuses interactions (cellules/cellules) qui peuvent à ce jour difficilement être reproduites en dehors d’un organisme vivant entier.

Réduction

Nous avons réalisé des analyses statistiques nous permettant de déterminer le nombre d’animaux nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats interprétables scientifiquement. Un suivi longitudinal des différentes cohortes sera réalisé par imagerie, permettant ainsi d’optimiser le nombre d’animaux nécessaire pour chaque expérience.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans un environnement enrichi (présence de tunnel en carton, papier kraft pour faire des nids et buchettes en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être. Ceci sera complété par un suivi clinique hebdomadaire s’appuyant sur une fiche d’évaluation regroupant l’évaluation de différents paramètres (poids, comportement, apparence physique). En fonction du score, différentes actions seront mises en place allant d’une surveillance accrue (bi-quotidienne) à l’ajout de nourriture dans la cage ou à l’euthanasie anticipée de la souris.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l'étude du développement des cellules du sang en raison aux fortes similitudes entre la souris et l’Homme. Nous utiliserons un modèle de souris dépourvu de système immunitaire afin de faciliter la prise de greffe et le développement d’une maladie tumorale, la leucémie aiguë. Ces souris seront adultes, âgées de 8 à 12 semaines de vie au moment du début de nos expériences, car il a été montré la bonne prise de greffe de la leucémie à cet âge. Les animaux des deux sexes seront utilisés pour nos expériences, étant donné l’absence de différence attendue liée au sexe de l’animal sur le maintien et la fonction tueuse des cellules NK.

680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées ou traitées pour supprimer leur système immunitaire, greffées de cellules ou de morceaux de tumeur sur les flancs, avec des prélèvements de sang répétés à la mâchoire. Le porteur indique une baisse de température et un réveil tardif après anesthésie, une douleur possible à l'implantation de la tumeur et des hématomes aux points d'injection. Le projet vise une thérapie ciblant une protéine des liposarcomes, en présentant la souris comme un "organisme entier" impossible à remplacer par la culture cellulaire.

Objectifs

Les liposarcomes sont définis comme étant des tumeurs malignes rares se développant dans les tissus mous et dont les cellules tumorales ressemblent à du gras. Les liposarcomes représentent environ 20% des sarcomes, avec près de cinq milles nouveaux cas par an en France et un pic d’incidence autour de 60 ans. L’évolution des liposarcomes est très rapide et le diagnostic est difficile. Aujourd’hui le seul traitement efficace est la chirurgie. Pour améliorer la prise en charge des patients en offrant une alternative moins lourde que la chirurgie et découvrir de nouveaux traitements, cette étude est nécessaire. Nos objectifs sont de développer une thérapie ciblant une protéine clé de ses tumeurs appelée MDM2 et le métabolisme des acides aminés ainsi que de mieux comprendre le lien entre la tumeur et l’organisme que la tumeur est capable d’influencer pour faciliter sa croissance. L’essence même de la question posée (effet de l'inhibition de la production de serine sur la croissance tumorale des liposarcomes) implique l’utilisation d’un organisme vivant tel que la souris, afin d’illustrer au plus proche de l’homme sa complexité métabolique et immunitaire, sans solutions alternatives satisfaisantes.

Bénéfices attendus

Ce projet, à court terme, permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents des liposarcomes en étudiant plus particulièrement le rôle et la fonction de nos protéines et gènes d’intérêts. L’utilisation de souris non modifiées génétiquement, ainsi que des mâles et des femelles, permettra de modéliser au plus proche de l’humain le métabolisme et les mécanismes mis en place lors d’un cancer. Ces souris seront traitées avec des médicaments permettant la disparition des protéines cibles. Ceci nous permettra de voir si l’élimination de ces protéines induit une diminution de la croissance tumorale et in fine de traiter ces liposarcomes. De plus, les souris prédisposées génétiquement à une inactivation de certains gènes permettront de valider l’impact de l'absence de ces protéines sur la prise et la croissance des liposarcomes. A la fin du projet, l’objectif est d’emmener, vers la clinique, une nouvelle thérapie fasse à la problématique de santé publique qu’est le cancer humain et plus précisément, le liposarcome.

Procédures

Dans un premier temps, les souris seront irradiées au rayon X (1 fois 5min ou 1 fois 5 min et 1 fois 3min) ou traiter avec une drogue (5min 3 fois) afin d’inactiver leur système immunitaire. Lors de cette procédure le personnel qualifié sera emmené à réaliser des greffes de cellules et morceaux de tumeurs sur les flancs des souris (5min par greffe) ainsi que des prélèvements sanguins au niveau de la machoire (150µl chacun et 2min par prélèvement). Une prise de sang 4 jours avant l'irradiation, une 4 jours après puis une fois par semaine jusqu'à la fin de l'expérience. Les prélèvements seront effectués au niveau de la mâchoire par une personne qualifiée.

Impact sur les animaux

L’irradiation des animaux nécessite l’endormissement au préalable des souris avec une injectionde Ketamine-Xylazine ce qui peut entrainer une baisse de température des souris et un réveil tardif. La chirurgie visant à implanter un bout de tumeur dans l'animal peut provoquer une douleur. Lors du traitement des animaux, l’injection dans le bas du ventre à répétition peut entrainer l’apparition d’hématome sous-cutané. Pour ces injections nous privilégierons le côté droit de l’animal mais, sur le long terme cela peut entrainer une gêne/douleur au site de l’injection et un stress modéré pour les animaux. Lors de ces injections, il y aura une contention de l’animal ce qui peut conduire à un stress modéré pour les animaux. L’augmentation de la taille de la tumeur peut entrainer une gêne/ douleur chez l’animal.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en respectant les règles de bien-être animal. Leurs organes seront prélevés afin d’étudier au niveau moléculaire et anatomiques (aspect des tumeurs et organes etc) les effets de nos traitements ou modifications génétiques.

Remplacement

Dans le laboratoire, nous avons déjà réalisé des essais sur cellules et sphéroides (modèles cellulaires 3D) afin de mieux comprendre le lien entre les cellules de liposarcomes et musculaires. Cependant ce système ne permet pas d'appréhender la complexité d'un organisme entier ainsi que la distance réellement présente inter-tissus. De plus, des procédures sur souris ne possédant pas de système immunitaire ont déjà été réalisé afin de montrer l'efficacité des traitements sur les liposarcomes. Mais au vue du lien étroit entre la cytokine impliquée et le système immunitaire, il est important de tester ces traitements dans un contexte où celui-ci est présent. C'est pourquoi il est nécessaire de réaliser ces procédures expérimentales sur animal immunocompétent. Nous avons tous les éléments nécessaires que nous avons pu obtenir sur cellules pour limiter le nombre de groupes expérimentaux et d’animaux et pour aller directement sur la question qui nous intéresse. De plus, notre objectif, in fine, est de prouver l’efficacité d’une telle thérapie et d’amener en clinique cette nouvelle thérapie contre les liposarcomes. Ainsi, l’utilisation d’animaux et notamment de souris est indispensable à la suite de notre projet.

Réduction

Nos résultats expérimentaux effectués sur des cellules et nos précédentes expériences sur souris immunodéprimées nous permettent d’appréhender les résultats attendus et ainsi diminuer les conditions expérimentales. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini en prenant en compte de tests statistiques, sans que cela ne nuise à l’objectif scientifique. C’est sur cette base que nous avons estimé à 680 animaux, le nombre d’animaux nécessaires pour l’ensemble de notre projet.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne et seront pesés deux fois par semaine. De plus, les tumeurs seront mesurées deux fois par semaine afin de ne pas atteindre un volume tumoral trop important (>1000 mm3). Une réduction de 20 % de la masse corporelle sera considérée comme un indicateur de toxicité. Une attention particulière sera portée aux points suivants afin de limiter la souffrance et la détresse : – Une absence d’hydratation ou de prise de nourriture afin d’anticiper une perte de poids excédant 20 % du poids initial – Une gêne dans la locomotion – D’autres signes de douleur tels que l’isolement des autres animaux, les yeux fermés ou creux, le dos voûté – Un saignement ou autre perte de liquide physiologique – Un changement du rythme respiratoire – Tout autre comportement anormal de l’animal tel que la prostration ou la vocalise lors de la préhension De plus, les injections dans le bas du ventre à répétition peuvent entrainer l’apparition d’hématome sous-cutané. Pour ces injections nous privilégierons le côté droit de l’animal mais, sur le long terme cela peut entrainer une gêne/douleur au site de l’injection. En cas d’apparition d’hématome abdominaux elles seront interrompus le temps de sa résorption. Lors de l’endormissement, une crème OCRY-gel sera appliquée au préalable sur leurs yeux afin de prévenir la cécité des animaux. Les souris seront mises sous une lampe chauffante le temps de leur réveil. De plus, de la nourriture et eau en gel sera déposée dans leur cage pour qu’elles puissent se nourrir plus facilement. Lors de la chirurgie, nous appliquerons de la lidocaïne au niveau du site d'incision afin d'insensibiliser cet endroit.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, car elle dispose d’un système génétique, métabolique et immunitaire proche de l’homme. Des modèles génétiquement modifiés permettant l'absence de nos protéines d'intérêts ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. De plus, les souris nous permettent d'étudier le cancer humain par le biais de greffe de tumeur humaine. Ainsi l’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci sur un organisme entier. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes afin de s’affranchir de tous les effets des hormones et de la croissance juvénile sur le métabolisme.

80 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur greffe sous la peau des cellules cancéreuses humaines du pancréas sous anesthésie, puis on les soumet à un champ de pression mécanique une heure par jour, cinq jours par semaine pendant trois semaines. Le porteur indique un stress lié aux anesthésies répétées et une douleur modérée possible due à la croissance des tumeurs. Ce projet teste l'effet d'une pression mécanique sur des tumeurs pancréatiques, les retombées pour les patients étant annoncées à long terme, les souris étant tuées pour prélever les tissus cancéreux.

Objectifs

Le cancer du pancréas représente un problème de santé publique en occupant le deuxième rang des cancers digestifs en France. Ce cancer est très souvent de très mauvais pronostic et est diagnostiqué à un stade avancé avec un nombre de cas en constante augmentation. Il devrait être la deuxième cause de mortalité par cancer en Europe en 2030. Dans le but de développer de nouvelles pistes de traitement des cancers du pancréas de très mauvais pronostic, nous nous proposons d’étudier l’impact d’un champ de pression mécanique sur le développement de ces cancers. En effet, des études antérieures ont montré qu’un champ de pression mécanique inhibait la croissance des cellules cancéreuses pancréatiques en culture. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer les effets anti cancéreux d'une contrainte mécanique sur le développement du cancer du pancréas après greffe de cellules cancéreuses du pancréas humain chez la souris.

Bénéfices attendus

Compte tenu des échecs des différentes thérapies mises en œuvre dans le traitement du cancer du pancréas, nous nous dirigeons vers de nouvelles pistes thérapeutiques des cancers du pancréas. Les avancées au cours de ces dernières années sur les contraintes mécaniques appliquées aux tumeurs nous laissent envisager l’intérêt des champs de pression sur les tumeurs pancréatiques pour en inhiber sa progression. Les retombées attendues de ce projet seront de caractériser une nouvelle thérapie du cancer du pancréas et à plus long terme de soigner ce type de cancer chez l’homme.

Procédures

On réalise deux injections sous la peau de souris femelles adultes (1 injection sur chaque flanc de l'animal), de cellules cancéreuses humaines de pancréas, sous anesthésie. Les cellules vont s’implanter à l’endroit de l’injection et commencer à croître. Cette injection dure moins de 30 secondes. La taille des tumeurs va être suivie. Lorsque les tumeurs auront démarré leur croissance, les souris seront soumises à un champ de pression mécanique sous anesthésie gazeuse à raison de 1 heure, 5 jours par semaine et ce pendant 3 semaines. Les souris vont être suivies tous les jours et les points limites évalués chaque jour de traitement (5 jours par semaine). A l'issu du traitement, les souris vont être suivies et leurs tumeurs mesurées encore 2 semaines, période durant laquelle elles ne subiront pas de traitement. L’ensemble des souris sera alors évalué 3 fois par semaine quant à leur état général, leur poids et la taille des tumeurs, mesurées à l’aide d’un pied à coulisse, au cours du temps.

Impact sur les animaux

1) Un stress physique serait une nuisance induite par les anesthésies répétées et (2) une douleur modérée peut être engendrée par la croissance des tumeurs sous-cutanées. Les animaux ne subissent pas d'autres stress ou douleurs dans ce projet.

Devenir

A l'issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés et les tissus cancéreux seront prélevés pour analyses.

Remplacement

Les connaissances issues de cette étude sur l’animal ne peuvent pas être obtenues actuellement par d’autres méthodes compte tenu de la complexité physiologique de la tumeur comprenant plusieurs types cellulaires impossible à reproduire avec des cellules en culture, nous obligeant de travailler à l'échelle d'un organisme. Des études sur cellules en culture sont, par ailleurs, prévues pour étudier d’autres paramètres qui complèteront ce volet d’expérimentation animale sans pouvoir le remplacer.

Réduction

Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire et suffisant dans chaque sous-groupe pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Chaque souris sera implantée avec des cellules cancéreuses aboutissant au développement d'une tumeur sur chaque flanc, ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre d'animaux qui entre dans l'expérience.

Raffinement

Les méthodes et les mesures choisies visent à diminuer au maximum les contraintes imposées aux animaux. Les animaux seront anesthésiés au moment de la greffe des cellules cancéreuses sous la peau. Au cours de l’expérience, une surveillance visuelle quotidienne et un suivi de l’état général des animaux (3 jours par semaine durant 3 semaines puis 3 fois par semaine durant les 2 semaines d’observation post traitement) seront réalisés. De plus nous avons établi une grille de score qui définit les actions à mettre en œuvre (administration d’analgésie en cas de douleur, euthanasie lorsque un point limite est atteint). Des conditions d’hébergement standard adaptées sont appliquées avec une alimentation standard sans limite de quantité. Enfin, un enrichissement composé de coton et de lanières cartonnées en accordéon sera proposé aux animaux afin qu’ils puissent se confectionner des nids.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser l’espèce souris dans notre projet de recherche car la physiologie du cancer du pancréas induit dans cette espèce animale est proche de celle chez l’Homme. Nous pourrons ainsi répondre aux questions que nous nous posons sur les effets d’un champ de pression mécanique sur le développement de ce type de cancer chez l’Homme. De plus, ce modèle apporte 2 autres avantages : sa taille et sa masse qui limite les quantités de traitement à administrer et le nombre extrêmement grand d'outils biologiques qui permettent la caractérisation des tissus cancéreux chez la souris. Les souris utilisées sont des femelles adultes pour que les animaux restent au même stade de développement tout au long de l’expérience. Nous avons privilégié des femelles pour limiter les conflits entre mâles hébergés dans une même cage.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux interventions chirurgicales au cerveau sous anesthésie, une restriction alimentaire pouvant durer sept jours et des injections cinq jours de suite, avant une tâche de mémoire récompensée par de la nourriture. Le porteur indique que la restriction alimentaire peut être stressante car elle empêche certains comportements naturels, comme cacher de la nourriture. L'objectif est de comprendre le fonctionnement d'une région du cerveau impliquée dans la mémoire, les bénéfices pour les maladies humaines restant renvoyés à d'autres projets de l'équipe.

Objectifs

L’objectif global de notre projet est de contribuer à la compréhension des processus d’encodage et de stockage des mémoires chez les mammifères. Plus spécifiquement, nous souhaitons étudier les mécanismes sous-jacents la formation de la mémoire à long terme dans une zone spécifique du cerveau. Cette zone de cerveau a été impliquée dans plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d’identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions ‘anormales’, telles queles maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives

Bénéfices attendus

La zone de cerveau ciblé par notre étude a été impliquée à plusieurs maladies humaines. Une meilleure compréhension de son fonctionnement en conditions normales est nécessaire afin d'identifier et de comprendre les altérations, qui se manifestent en conditions 'anormales', telles que les maladies touchant le système nerveux central. Les connaissances obtenues grâce à ce travail nous permettront de renseigner d'autres projets en cours dans l'équipe, explorant le rôle de cette région du cerveau dans les altérations pathophysiologiques présentent, par exemple, lors des maladies neuro-développementales ou neuro-dégénératives. La réorganisation structurelle des circuits neuronaux est également un domaine de recherche largement négligé par les études précliniques et notre travail apportera des nouvelles connaissances dans le domaine des mécanismes de plasticité.

Procédures

Les animaux sont nourris avec un régime alimentaire modifié. Ils subissent deux brèves interventions chirurgicales (< 45 min) réalisées sous anesthésie, pour lesquelles ils reçoivent un traitement analgésique et des soins appropriés. Ils sont soumis à une tâche comportementale nécessitant une motivation appétitive pour laquelle ils reçoivent une récompense nutritive. Cette tâche nécessite que la quantité de nourriture disponible soit limitée pendant 7 jours. Ils reçoivent également des injections pendant 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux subissent deux brèves interventions chirurgicales sous anesthésie. Cependant, grâce à l'utilisation appropriée d'analgésiques, d'outils et de matériels stériles, et à une surveillance et des soins post-chirurgicaux adaptés, les conséquences négatives pour les animaux sont minimisées. Une période de rétablissement (4-7 jours) est prévue avant toute autre manipulation. Les animaux sont soumis à une restriction alimentaire. Cela peut être stressant pour les souris car cela ne leur permet pas d'exprimer certains de leurs comportements naturels, comme cacher de la nourriture dans la cage. Pour compenser ce stress, nous manipulons les souris préalablement et nous essayons également de les nourrir à la même heure de la journée afin qu'elles apprennent à associer la présence de l'expérimentateur à l'apport de nourriture. En adaptant le programme d'entraînement, nous maintenons la période de restriction alimentaire aussi courte que possible (maximum 7 jours consécutifs). Le paradigme de la restriction alimentaire nous oblige également à loger les souris individuellement, afin d'éviter la compétition pour la nourriture et l'agression entre congénères. Pour pallier cette contrainte, nous maintenons les souris en hébergement collectif le plus longtemps possible avant cette étape. Nous augmentons la quantité de matériel disponible pour la construction du nid et nous augmentons l'enrichissement en manipulant les souris avant l'expérience. Tout au long des expériences, les souris sont nourries avec un régime spécial (sans effets délétères pour l'animal). Elles reçoivent également des injections intrapéritonéales, qui provoquent un léger inconfort. Pour atténuer les conséquences de cette injection répétée, nous utilisons des aiguilles de très petite taille, ce qui minimise l'inconfort pour l'animal. La solution injectée elle-même n'a aucune conséquence négative pour l'animal. Toutes les manipulations sont effectuées par un expérimentateur formé et compétent ayant plus de 8 ans d'expérience dans la manipulation des animaux.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés et leurs tissus récupérés pour les analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet porte sur l’étude des mécanismes sous-jacents la formation et stockage de la mémoire dans une zone spécifique de cerveau. Pour mener notre étude, nous aurions besoin d’un modèle : i) complexe et intacte, ii) adapté à la réalisation des tests cognitifs, iii) pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique, iv) disposé facilement à la modification de son génome, v) possédant la structure cérébrale ciblée, vi) adapté aux approches expérimentales invasive. Conformément à la Directive Européenne et au principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer des approches alternatives lorsque cela était possible. A notre connaissance, seuls les modèles de mammifères, notamment les souris, répondent à l'ensemble de ces critères. Bien que des tests comportementaux simples soient possibles chez des espèces moins sensibles, ces animaux ne possèdent pas la structure cérébrale ciblée et ne sont donc pas adaptés à l'objectif de notre étude. Les études humaines ne sont pas adaptées à notre question scientifique car des tests invasifs sont nécessaires pour détecter et analyser les neurones associés au stockage de la mémoire et les analyses de connectivité possibles au niveau clinique n'ont pas la résolution nécessaire pour répondre à la question scientifique posée. Les modèles in silico actuellement disponibles ne permettent pas de modéliser le cerveau entier. Pour toutes ces raisons, et malgré notre réflexion, l'utilisation d'animaux est malheureusement nécessaire.

Réduction

Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Nous sommes très attentifs à l’objectif de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés. Pour cette raison nous proposons d'adopter une stratégie expérimentale permettant une analyse précoce de nos données au fur et à mesure (c.à.d. les expériences réalisées au fur et à mesure sur de petits lots de 4-6 animaux). Cela nous permettra de modifier la taille de l'échantillon si nécessaire selon les premiers résultats obtenus. L'utilisation de ces petits groupes permettra également de repérer rapidement les problèmes potentiels de la procédure et de modifier notre approche si nécessaire pour le lot suivant. Approche statistique : selon les caractéristiques de nos données nous appliquons les tests statistiques appropriés à notre question scientifique et à nos données.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant et après chaque manipulation/étape) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Intervention immédiate et appropriée (en cas de besoin) - mesures conservatoires à privilégier. iv) Raffinement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques (pré- et post-op) pour chaque procédure chirurgicale v) Application de soins préventifs après la chirurgie; stratégie de nursing si nécessaire vi) Manipulation quotidienne des animaux avant les sessions comportementales pour réduire le niveau de stress lié à l'interaction avec l'expérimentateur vii) Optimisation de notre tâche comportementale pour minimiser la durée de la restriction alimentaire viii) Entraînement progressif de l'animal (séances d'habituation) intégré à la tâche afin de minimiser le stresse ix) Utilisation d’aiguilles de petite taille pour minimiser l'inconfort associé à l'injection i.p. x) Utilisation, dans la mesure du possible, de méthodes non invasives (par exemple, l'administration dans la nourriture) pour l'administration des médicaments afin d'éviter les contraintes associées aux autres méthodes d'administration. xi) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs proposants les méthodes de raffinement. xii) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus le plus longtemps possible dans des cages collectives.

Choix des espèces

Nous utiliserons la souris car nous voudrions exploiter certains modèles transgéniques impliquant, par exemple, le marquage permanent des cellules activées lors de l’apprentissage, ou l'expression d'une sonde calcique. À ce jour, la souris est la seule espèce mammalienne pour laquelle il est possible, d'une manière routine, de modifier le génome et pour laquelle les modèles créés ont été caracterisés au niveau comportemental et moléculaire. Le choix d'utiliser la souris est également motivé par nos données précédentes et la disponibilité de paradigmes expérimentaux déjà élaborés qui garantissent le succès de notre étude.

1 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une inflammation chronique de l'intestin par injection rétro-orbitale de lymphocytes T sous anesthésie, puis des injections répétées trois fois par semaine pendant huit semaines de composés fournis par des laboratoires clients. Le porteur indique une perte de poids, des selles molles, des diarrhées et des saignements rectaux attendus pendant l'étude, tout en affirmant que les doses testées n'induiront aucun effet indésirable. Ces prestations évaluent des composés contre les maladies inflammatoires de l'intestin, les souris étant tuées le jour de l'analyse de leurs organes.

Objectifs

Les différents laboratoires privés ou publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaître l’impact de leurs composés thérapeutiques sur les maladies inflammatoires de l’intestin (MICI). Les MICI sont des troubles gastro-intestinaux chroniques caractérisés par une inflammation intestinale chronique, des réponses dérégulées contre le microbiote intestinal et un dysfonctionnement de la barrière épithéliale. Les MICI se présentent sous deux formes principales, la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn. L'incidence et la prévalence des MICI sont en constante augmentation dans le monde et ces maladies sont associées à une morbidité marquée et ont un impact majeur sur la qualité de vie et la capacité à travailler. Les traitements conventionnels actuels visent à atténuer l'inflammation. Cependant, environ un tiers des patients ne répond pas au traitement ou devient réfractaire avec le temps. L'objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les maladies chroniques de l’intestin afin de diminuer les échecs thérapeutiques. Pour cela, nous induirons des modèles murins de MICI et nous testerons différents composés thérapeutiques afin d’évaluer leurs effets sur le développement des MICI. A l'issu de l'expérimentation, la composition du système immunitaire sera évaluée et des études histologiques seront menées afin d'évaluer l'efficacité des différents traitements.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer en phase pré-clinique l’efficacité de nouveaux composés thérapeutiques ciblant les maladies inflammatoires de l’intestin, maladies dont actuellement un tiers des patients recevant des traitements anti-inflammatoires ne répond pas ou devient réfractaire avec le temps .

Procédures

La procédure expérimentale repose sur : - une induction de l'inflammation de l'intestin par une unique injection intraveineuse rétro-orbitale (150 μl) de lymphocytes T CD4+ dépourvus d'une sous population régulatrice sous anesthésie générale gazeuse induite à l'isoflurane. Cette procédure dure 3 minutes et 30 secondes, temps comprenant la phase d’endormissement de 3 min à l’isoflurane et 30 secondes pour l’injection rétro-orbitale. - des injections intrapéritonéales (dose-poids de 200μl de mélange/20g de souris) 3 fois par semaine pendant 8 semaines maximum de molécules thérapeutiques afin d'évaluer leur efficacité. La durée de cette procédure est de 1 minute par souris, temps comprenant la pesée, la contention et l’injection des composés ; - des pesées 1/2j afin de suivre le développement de la pathologie pendant 8 semaines maximum. En effet, le poids est un critère d'évaluation clinique de la pathologie. Cette procédure est rapide et dure 20 secondes par souris ; - et un unique prélèvement sanguin de 200μl par voie submandibulaire afin de récolter le sérum le jour de la caractérisation du système immunitaire et des études histologiques. Cette procédure dure 1 minute par souris, temps comprenant la contention et la prise de sang.

Impact sur les animaux

L'induction de l'inflammation de l'intestin par injection intra veineuse de lymphocytes T CD4+ dépourvus d'une sous population régulatrice entrainera une perte de poids et probablement des selles molles, diarrhées et / ou saignements rectaux sur la durée de l'expérimentation (5 à 8 semaines dépendamment de l'induction de la pathologie). Les tests de toxicité des composés thérapeutiques seront effectués en amont par les laboratoires demandeurs. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress (anesthésie, pesées, injections et prise de sang). Chaque gestes techniques sera réalisé par du personnel expérimenté et expert dans ces actes dans le respect du bien-être animal afin de limiter les contraintes subies par l’animal.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort le jour de l’expérience pour le prélèvement d’organes qui seront analysés pour la caractérisation du système immunitaire (immunophénotypage) ou pour l’histologie.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, le modèle testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse. Le modèle murin est donc un modèle de choix pour l'étude du système immunitaire grâce aux connaissances acquises et au nombre d'outils disponibles.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Les modèles de MICI étant hétérogènes, le nombre utilisé pour ces expériences sera de 10 animaux par groupe expérimental, sexes identiques, soit mâles ou femelles dépendamment du partenaire, afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience. Le nombre de groupe sera amené à varier selon les besoins du partenaire, notamment si plusieurs molécules ou doses sont à tester.

Raffinement

Les animaux en expérimentation sont hébergés en zone d’expérimentation EOPS, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu est enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un bâtonnet de papier que les souris pourront grignoter afin de se confectionner un nid. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant le début des injections.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, animal de petite taille et à reproduction rapide et bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Pour ces expériences nous utiliserons des animaux déficients en lymphocytes T « hôtes » adultes de plus de 8 semaines avec un poids supérieur ou au minimum égal à 22g. En effet, les animaux doivent avoir un poids suffisant pour être stable au début du protocole afin de suivre le développement de la pathologie entrainant une perte de poids de 20% dans le groupe contrôle. Les animaux « donneurs » de lymphocytes T CD4+ dépourvus d'une sous population régulatrice seront également utilisés à l’âge adulte car le système immunitaire doit être mature.