Procédures modérées

Des injections provoquent une colite aiguë ou chronique chez 1 200 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec douleurs abdominales, perte de poids et changements de comportement. Une nouvelle molécule anti-inflammatoire leur est ensuite administrée, seule ou combinée à d'autres, l'étude durant d'une à quatre semaines selon le protocole. Toutes sont tuées pour analyser la réponse de leur système immunitaire, ce que la rubrique consacrée au devenir ramène à "certains animaux" mis à mort "de manière réglementaire". Le RNT ne nomme ni le produit qui déclenche la colite, ni les tests de suivi, ni les seuils des scores cliniques annoncés, et indique que l'anesthésie ne sera utilisée "que si la situation l'exige".

Objectifs

Certaines cellules du système immunitaire jouent un rôle clé dans l’inflammation, qu’elle soit aiguë ou chronique. Lors de maladies inflammatoires, un déséquilibre entre différents types de cellules immunitaires contribue à entretenir et aggraver l’inflammation. Nous cherchons donc à tester de nouvelles molécules capables d’agir spécifiquement sur ces cellules afin de rétablir l’équilibre. En laboratoire, ces molécules ont déjà montré qu’elles réduisent les substances responsables de l’inflammation et augmentent celles qui la freinent. L’objectif est maintenant d’évaluer leur efficacité dans différents modèles de maladies inflammatoires et d’estimer leur potentiel comme futurs traitements

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester une nouvelle molécule qui agit sur un mécanisme précis du système immunitaire afin de réduire l’inflammation. Son efficacité sera comparée à celle des traitements déjà existants pour vérifier son intérêt. L’étude permettra aussi de mieux comprendre comment cette molécule agit sur le fonctionnement des cellules immunitaires. Enfin, nous évaluerons des traitements combinant plusieurs cibles du système immunitaire. Ces approches pourraient être plus efficaces que les traitements actuels ou que l’utilisation d’une seule molécule.

Procédures

Les animaux recevront des injections pour provoquer la maladie étudiée et pour administrer les traitements. Des prises de sang pourront également être réalisées si nécessaire, sous anesthésie afin de limiter tout inconfort. Chaque intervention sera courte et l’ensemble de l’étude se déroulera sur une période allant d’une à quatre semaines, selon le protocole prévu.

Impact sur les animaux

La colite, qu’elle soit aiguë ou chronique, peut provoquer des douleurs abdominales, une perte de poids et des changements de comportement chez les animaux. Afin de suivre leur état de santé et de limiter ces effets, des évaluations régulières basées sur des scores cliniques et pathologiques seront mises en place. Ces outils permettront de surveiller au mieux l’évolution de la maladie et le bien‑être des animaux.

Devenir

Après les injections, les animaux seront replacés dans leur cage. À la fin de certaines étapes de l’étude, certains animaux seront mis à mort de manière réglementaire afin d’analyser la réponse du système immunitaire et mieux comprendre les effets des traitements.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode capable de reproduire entièrement le fonctionnement du système immunitaire en dehors d’un organisme vivant. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire pour cette étude. Des essais réalisés auparavant en laboratoire sur des cellules ont montré que la molécule testée avait un effet biologique. Ces résultats ont permis de mieux préparer l’étude chez l’animal et de choisir les éléments à observer pour évaluer son efficacité.

Réduction

Tous les animaux prévus ne seront pas forcément utilisés. Des études supplémentaires ne seront réalisées que si un effet du traitement est observé. Dans ce cas, des analyses seront menées pour mieux comprendre comment le traitement agit, en examinant certains animaux à différents moments de l’évolution de la maladie, avant l’apparition de signes sévères. Afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant l’utilisation d’animaux, le nombre a été fixé à 10 animaux par groupe, ce qui permet une analyse statistique pertinente avec un nombre réduit d’animaux.

Raffinement

L’objectif principal est de comparer le niveau d’inflammation observé entre différents groupes de souris afin d’identifier des effets clairs et fiables des traitements testés. Une attention particulière sera portée au bien‑être des animaux : leur état de santé sera surveillé régulièrement et des mesures seront prises pour limiter autant que possible la douleur et la souffrance. Si l’état d’un animal se dégrade au‑delà d’un certain seuil, il sera retiré de l’étude et pris en charge de manière appropriée. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, un rythme jour/nuit équilibré et un environnement enrichi pour réduire le stress. Le nombre d’animaux par cage sera limité afin d’éviter la surpopulation, et des ajustements seront faits en cas de comportements agressifs. Les procédures ont été conçues pour minimiser le stress et la douleur tout en permettant une évaluation scientifique fiable. Des traitements contre la douleur seront administrés lorsque nécessaire, et l’anesthésie ne sera utilisée que si la situation l’exige.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en recherche, notamment pour les études fondamentales et précliniques, car elle est bien connue et dispose de nombreux outils permettant d’analyser le fonctionnement du système immunitaire. Les modèles d’inflammation développés chez la souris reproduisent de manière satisfaisante ce qui est observé chez l’être humain. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines. À cet âge, les réponses inflammatoires sont plus homogènes et reproductibles que chez des animaux plus jeunes ou plus âgés, dont le système immunitaire fonctionne différemment. Cela permet d’obtenir des résultats plus fiables et comparables entre les groupes étudiés.

80 souris issues du croisement de deux modèles de maladies neuromusculaires vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À 8 ou 9 semaines, chacune passe 22 heures seule en cage d'actimétrie, court sur un tapis roulant et reste suspendue à une grille retournée pendant une minute au maximum, un effort que le porteur reconnaît susceptible de surcharger des muscles déjà myopathiques. La série se termine par une mesure de force sur le muscle tibial antérieur, jusqu'à une heure, sous anesthésie profonde et sans réveil. Le RNT justifie ce sort en notant que les prélèvements ont lieu après la mise à mort, "ce qui évite toute douleur supplémentaire".

Objectifs

La myopathie centronucléaire (Myopathie Centro Nucléaire) BIN1-CNM est une maladie héréditaire du muscle squelettique, caractérisée par une faiblesse musculaire progressive et un handicap moteur. Les mutations perturbent l'organisation membranaire et le couplage excitation-contraction, entraînant des noyaux centraux dans les fibres musculaires. Aucune thérapie curative n'existe à ce jour. Des études récentes montrent qu'une surexpression d'une protéine associée aggrave plusieurs formes de CNM. Notre équipe a démontré qu'une réduction fonctionnelle de cette protéine corrige partiellement les phénotypes d'un modèle murin MTM1-CNM. Nous testons donc si sa diminution atténue les altérations du modèle BIN1-CNM (Myopathie Centro Nucléaire) par croisement avec un modèle CMT (Charcot Marie Tooth) à perte partielle de fonction. Ce projet évalue le potentiel thérapeutique de cette modulation pour corriger les anomalies musculaires et élucide les mécanismes communs aux CNM.

Bénéfices attendus

Ce projet explore les mécanismes physiopathologiques communs aux myopathies centronucléaires (Myopathie Centro Nucléaire) et aux neuropathies périphériques, notamment la maladie de Charcot-Marie-Tooth (Charcot Marie Tooth). En combinant un modèle murin de myopathie centronucléaire avec un modèle de perte partielle de fonction protéique, il vise à identifier des cibles moléculaires modulant la gravité de la maladie. Les bénéfices attendus consistent à déterminer si une réduction de cette protéine prévient ou atténue les manifestations de la myopathie centronucléaire, tout en éclairant les mécanismes communs entre myopathie centronucléaire et Charcot-Marie-Tooth, ouvrant des perspectives thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions, à 8-9 semaines d’âge, avec une durée globale limitée et des procédures répétées uniquement lorsque cela est scientifiquement justifié. Phénotypage comportemental et locomoteur non invasif : tests d’activité locomotrice spontanée (actimétrie), de locomotion fine (tapis roulant) de force musculaire (grille retournée), réalisés chez l’animal vigile, sans anesthésie. L’activité locomotrice spontanée de l’animal sera acquise pendant 22 h au maximum, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement, sans toutefois subir un isolement sensoriel (pas d’isolement olfactif ni auditif). Le test de locomotion fine (tapis roulant) et de grille retournée ont chacun une durée maximale de 1 minute avec un maximum 1 test par jour pour limiter le stress. Mesures de force musculaire in situ : intervention chirurgicale mineure sous anesthésie générale profonde et anti douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes. Chaque séance dure maximum une heure et est réalisée une seule fois par animal, sans réveil, en fin de procédure (8 semaines). Ces interventions sont conçues pour être aussi brèves et peu répétées que possible, tout en permettant la collecte des données nécessaires à la caractérisation complète du phénotype musculaire et à l’analyse moléculaire et histologique.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux dans ce projet découlent des manipulations expérimentales (génétique, tests comportementaux, chirurgie, anesthésie, euthanasie) : 1. Tests fonctionnels et comportementaux: Test de la grille retournée (hanging test): Stress aigu dû à la sensation de chute imminente et à la contrainte physique (maintien en suspension). Risque minime de chute sur une surface constitué de 5 cm de litière, pouvant une anxiété transitoire. Effort musculaire intense mais bref (≤ 60 s), sans lésion musculaire attendue chez des animaux sains, mais surcharge possible chez les souris déjà myopathiques. Analyse de la démarche (tapis roulant/Digigait): Stress léger à modéré lié à la nouveauté de l’environnement et à la contrainte de marche forcée. Fatigue musculaire transitoire sans lésion durable attendue. Actimétrie (cages avec capteurs): Stress modéré lié au changement de cage, à l’isolement partiel et à l’enregistrement prolongé (22 h), mais sans manipulation directe. Perturbation possible des rythmes circadiens ou du comportement d’exploration en raison de l’environnement artificiel. 2. Mesure de force musculaire in situ sur le tibial antérieur: Les souris peuvent présenter, de manière transitoire, une gêne ou une douleur légère à modérée liée aux procédures chirurgicales, mais cette douleur est prévenue et traitée par une anesthésie générale et une analgésie adaptée. Les injections intrapéritonéales nécessaires à l’induction de l’anesthésie générale peuvent provoquer un stress et une gêne transitoires (manipulation, douleur ponctuelle à l’injection). La contention de l’animal pour l’injection est brève, d’une durée maximale de 15 secondes, réalisée par du personnel formé, avec une prise en charge rapide par l’anesthésie, ce qui limite la durée de ces effets.

Devenir

Le sort prévu pour tous les animaux, consiste en leur mise à mort pour la collecte de tissus. La collecte terminale de muscles et d’organes est nécessaire pour corréler phénotype fonctionnel et analyses moléculaires/histologiques/ ultrastructurales. Les prélèvements sont réalisés après la mise à mort, ce qui évite toute douleur supplémentaire.

Remplacement

Dans ce projet, le Remplacement n’est pas possible car l’objectif est d’évaluer l’effet d’une réduction fonctionnelle protéique sur les phénotypes musculaires dans un modèle de myopathie centronucléaire, ce qui nécessite de reproduire la pathologie musculaire in vivo, avec toute sa complexité tissulaire, mécanique et systémique. Les modèles cellulaires (myotubes, lignées musculaires) ou organoides ne permettent pas de recréer la fonction intégrée du muscle squelettique, ni les interactions nerf-muscle, ni les réponses comportementales et locomotrices mesurées ici. De même, les approches in silico ou in vitro ne suffisent pas à tester les paramètres fonctionnels tels que les tests comportementaux, la force musculaire in situ ou les analyses histologiques et ultrastructurales, qui exigent un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé de manière à respecter le principe de Réduction tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques. Pour chaque groupe expérimental, un effectif de 10 animaux par sexe (soit 20 souris/groupe) a été retenu après calcul de puissance préalable, basé sur les données de variabilité observées dans les modèles murins de myopathies et de neuropathies, afin d’éviter tout suréchantillonnage. Ce nombre repose également sur notre expertise préalable dans la caractérisation de modèles murins de myopathies et de tests de force musculaire. La distribution des données sera évaluée (Shapiro–Wilk ou Kolmogorov–Smirnov), puis des analyses adaptées appliquées : ANOVA (ou Kruskal–Wallis si non normale), tests post hoc (Tukey/Dunn), et t/Mann–Whitney pour comparaisons ponctuelles. Le plan maximise l’information par animal (phénotypage fonctionnel complet, analyses histologiques/moléculaires), limitant le total à 80 animaux. Les procédures sans réveil et la standardisation rigoureuse réduisent les répétitions expérimentales. La cohérence des groupes (contrôle, mutation protéique, modèle pathologique, modèle combiné avec une amélioration du phénotype attendue) optimise les conclusions sans multiplier les conditions.

Raffinement

Les moyens de raffinement mis en œuvre dans ce projet visent à minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des souris tout au long de l’expérimentation. Les animaux sont logés en groupe, dans des conditions de température, d’hygrométrie et d’éclairage contrôlées, avec litière et abris adaptés, et bénéficient d’un enrichissement environnemental (tunnels et matériel de nidification) pour favoriser le bien être et limiter les comportements stéréotypés. Une manipulation douce et progressive, ainsi qu’une phase d’habituation aux dispositifs de tests (grille retournée, tapis roulant, cage d’actimétrie), sont mises en place pour réduire l’anxiété liée aux manipulations et à la nouveauté. Les protocoles comportementaux sont courts et espacés, avec des temps de repos suffisants, afin d’éviter la fatigue et la surcharge musculaire. Pour la chirurgie in situ (mesure de force musculaire), des anesthésiques et analgésiques adaptés sont utilisés, et l’intervention est conduite sous anesthésie profonde dans le cadre d’une procédure sans réveil, ce qui évite toute douleur post opératoire. Une surveillance clinique régulière (poids, état général, locomotion, alimentation, hydratation) est assurée, avec des critères de mise à mort précoce clairement définis pour interrompre l’expérimentation en cas de souffrance manifeste. Les critères de points limites de Morton & Griffiths sont appliqués systématiquement, avec une mise à mort immédiate en cas de perte de poids >15% sur une semaine, de prostration prolongée ou de paralysie sévère, et en cas de mortalité postnatale importante. Enfin, les protocoles sont standardisés (heure de test, conditions environnementales, manipulateurs formés) et les méthodes non ou moins invasives (tests comportementaux, actimétrie) sont privilégiées, ce qui réduit la variabilité et limite le besoin de répéter les expériences sur de nouveaux animaux, tout en préservant la qualité scientifique des données.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris) est retenue comme modèle de référence pour l’étude des myopathies et neuropathies périphériques, grâce à sa physiologie musculaire et neuromusculaire hautement conservée avec l’humain. Elle permet de reproduire fidèlement les phénotypes fonctionnels (faiblesse progressive, altérations locomotrices, atrophie), absents chez les invertébrés ou poissons zèbres. Les animaux sont utilisés du stade juvénile (8-9 semaines) à adulte jeune, correspondant à l’installation complète du phénotype pathologique sans progression excessive. À 8 semaines (équivalent ~20 ans humain), la faiblesse musculaire est pleinement exprimée, idéale pour les tests comportementaux (grille retournée, tapis roulant, actimétrie) et la force in situ sur tibial antérieur. Ce stade évite les biais néonataux (variabilité élevée) ou âgés (comorbidités), maximisant la pertinence scientifique et le respect des 3R.

Faute de modèle animal existant pour une complication cutanée tardive de la maladie de Lyme, ce projet en construit un avec 105 souris sans poils, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélever leurs organes. Le geste infligé tient en une seule injection de Borrelia afzelii sous la peau, de quelques secondes, sur animal éveillé. La souffrance attendue vient donc de l'infection elle-même, réaction inflammatoire locale puis arthrite possible, et non de l'acte. Le porteur écrit que l'absence de douleur au point d'injection dispense d'analgésie, sans indiquer combien de temps les souris seront gardées infectées, alors que la lésion visée survient chez l'humain des années après la piqûre de tique.

Objectifs

L'Acrodermatite Chronique Atrophiante (ACA) est une manifestation cutanée tardive de la borréliose de Lyme européenne due quasi-exclusivement à l’espèce Borrelia afzelii. Elle représente 3 à 5% des cas de borréliose de Lyme et survient des années voire parfois des décennies après un érythème migrant (EM) non traité, souvent au même site anatomique, ce qui suggère que cette bactérie a à la fois une capacité notable à persister pendant une longue durée dans la peau humaine sans être détectée et le potentiel d'induire une inflammation destructrice chronique tout en résistant à l'éradication par le système immunitaire. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle animal d’ACA qui pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Les souris utilisées comme modèle d’étude sont des souris sans poil non consanguines utilisées en cancérologie et dermatologie car les lésions cutanées sont plus facilement observables. Aucune étude des conséquences cutanées d’une infection de ces souris par des souches de Borrelia afzelii provenant de patient ayant présenté une ACA n’a été réalisée à ce jour. L’objectif principal de ce projet de recherche est de mettre au point un modèle d’infection cutanée de souris sans poil par des souches pathogènes de Borrelia afzelii afin de permettre l’étude des mécanismes impliqués dans l’ACA. L’objectif secondaire de ce projet est de caractériser l’infection chez cette souris : dissémination, séroconversion (apparition d’anticorps anti Borrelia).

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre au point un modèle murin d’acrodermatite chronique atrophiante afin de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie, encore très peu connue, notamment dû à l’absence de modèle existant. La mise en place d’un modèle murin d’ACA pourrait dans un second temps permettre de décrire les facteurs d’hôte (par exemple système immunitaire) et bactériens expliquant la persistance de Borrelia afzelii dans la peau et l’inflammation tardive de ce tissu.

Procédures

Injection, 1 seule fois par souris, sur souris vigile, quelques secondes

Impact sur les animaux

Dans les suites de l’injection intradermique de Borrelia une faible réaction locale inflammatoire peut apparaitre. Dans un second temps, une arthrite peut potentiellement se manifester. Un léger stress peut être ressenti par la souris lors des manipulations

Devenir

Les souris ne peuvent être réutilisées, puisque le prélèvement de leurs organes est nécessaire à l’expérimentation. Elles seront donc mises à mort.

Remplacement

Les explants de peau ou les organoïdes ne sont pas utilisables pour répondre à la question scientifique pour 2 principales raisons : -Ils ne permettent pas d’observer des lésions cutanées tardives (maintien en culture de l’explant a une durée limitée de 10-15 jours) -Ils ne permettent pas d’étudier la dissémination de la bactérie (autres zones cutanées, autres organes) et les effecteurs du système immunitaires recrutés à partir du sang dans le tissu cutané.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour ce protocole a été calculé au minimum des exigences de publications internationales. Cependant, dans un but de réduction, le nombre de contrôle a été réduit à son maximum.

Raffinement

Concernant le bien être général des souris, elles disposeront d'un tunnel, d'un barreau à ronger, de coton et du carton ciselé pour réaliser un nid et seront regroupées en groupes sociaux. Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce selon, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Concernant : - L’inoculation intradermique : l'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques, même si un inconfort lié à l’inflammation de la piqûre peut être observé à la suite de celle-ci. En cas de réaction inflammatoire qui serait trop importante un médicament anti-inflammatoire sera administré et un avis vétérinaire sera pris si l’évolution est défavorable. - L’apparition d’une d’arthrite. Si une gêne douloureuse de la souris est observée, un suivi sera réalisé et un médicament anti-inflammatoire sera administré et un avis vétérinaire sera pris si l’évolution est défavorable. - Les souris sans poil étudiées possèdent des vibrisses, mais les cils sont soit extrêmement rudimentaires, soit totalement absents. Une attention particulière sera portée sur l’observation des yeux et l’apparition d’une éventuelle conjonctivite. De plus, l’enrichissement utilisé ne produit pas particulièrement de poussière. Les souris sont mises à mort à 1 mois, 6 mois ou à 1 an selon leur groupe ou si elles présentent des lésions évocatrices d’une ACA. Pendant toute la durée expérimentale, l’état des souris est évalué quotidiennement, des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance inutile.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et des nymphes de tiques. Les souris « contrôle » sont sensibles à l’infection par Borrelia sl et sont classiquement utilisées en recherche scientifique sur ce sujet. Les souris étudiées dans notre protocole sont sensibles à l’infection par Borrelia afzelii, et constituent le meilleur modèle d’observation d’une éventuelle pathologie cutanée en raison de leur absence de poil. Des animaux sevrés à partir de 3 à 4 semaines seront utilisés. Pour le bon développement des souris, il est important qu’elles soient sevrées avant d’être séparée de leur mère. Il semble dans la littérature que l’inoculation des souris jeunes par Borrelia permet des manifestations cliniques plus marquée par rapport à une inoculation à 12 semaines.

Porteuses de mutations qui leur font développer un syndrome de Sjögren, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent du clopidogrel ou des anticorps qui détruisent leurs plaquettes, par gavage et par injection intraveineuse, avec des prises de sang pratiquées sur animaux éveillés. Les contraintes subies sont "faibles" et les traitements plaquettaires "ne relatent pas de mal-être animal", affirme le porteur, dont l'étude repose sur le vieillissement d'animaux construits pour tomber malades. Il conclut qu'aucune méthode alternative n'existe, la cytométrie en flux exigeant selon lui un grand nombre de cellules prélevées dans les organes immunitaires.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle des plaquettes dans la syndrome du Sjögren (SjS). Le syndrome de SjS est une maladie rare, touchant entre 0,01% et 0,3% de la population adulte (selon les critères historique « AECG » de 2002), mais reste la maladie auto-immune systémique la plus fréquente après la polyarthrite rhumatoïde (PR). Cette pathologie inflammatoire systémique affecte majoritairement les glandes salivaires, lacrymales et les muqueuses, lié à une infiltration des glandes correspondantes par des cellules immunitaires, essentiellement des lymphocytes T et B. L’activation lymphocytaire B est un élément central de la maladie, comme en atteste la production de nombreux auto-anticorps (en particulier les anti-Ro60/TROVE2/SSA, anti-Ro52/TRIM21/SSA et anti-La/SSB, présents chez 2/3 des malades et associés à des formes plus sévères. Cependant, ex vivo, après analyse d’une cohorte de plus de 100 patients, ils s’avèrent que d’autres cellules seraient activées pendant la maladie et notamment les plaquettes. Or les plaquettes sont aussi des cellules immunitaires en plus d’être des cellules hémostatiques. Il est donc important d’évaluer leur impact et de choisir le bon modèle murin. Il existe plusieurs modèles murins mimant le SjD, les souris TgIL14 (mime la physiopathologie du SjD, modèle cellules T dependant) et les souris MRL/lpr (présence d'autoanticorps du SJD, modèle cellule B dépendant) Axe 1. Evaluation de l’implication des plaquettes dans le modèle TgIL14 Axe 2. Evaluation de l’implication des plaquettes dans le modèle MRL/lpr

Bénéfices attendus

Le choix d’utiliser le modèle de Sjogren TgIL14 et le modèle MRL/lpr a été basé sur la littérature, la présence d’autoanticorps (modèle MRL/lpr), la physiologie de la pathologie (TgIL14). Par ailleurs, le modèle MRL/lpr est « T-dépendant » alors que le modèle « IL14 » est « B-dépendant » ce qui permet de récapituler les principaux éléments de la physiopathologie du syndrome de Sjögren. Afin d’étudier le rôle des plaquettes dans la physiologie du syndrome de Sjogren, nous avons décider d’inhiber les fonctions plaquettaires en utilisant le clopidogrel mais aussi de depleter le système des plaquettes avec un anticorps deplétant. Une étude a été réalisée in vitro avec le clopidogrel et donne de bon résultat, mais n’intègre pas la diversité des cellules d’un organisme. Par ailleurs, il est complexe de modéliser les interactions de toutes les cellules circulantes en enlevant les plaquettes, dans des essaies in vitro. C’est pourquoi l’axe 1 et 2 de cette demande éthique permettra d’évaluer dans un modèle murin, l’implication des plaquettes dans le syndrome de Sjogren.

Procédures

prélèvèments sur animaux vigiles, injections intraveineuse, gavage tous les animaux de l'étude

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des gavages et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent. Cependant, les modèles utilisant le clopidogrel ou les anticorps depletant ne relatent pas de mal-être animal, dans des souris de type wild type. Une attention particulière et un monitoring sera effectué sur les souris TgIL14 et MRL/lpr qui subiront l’un ou l’autre des traitements plaquettaires.

Devenir

tous les animaux de la procédure 1 et 2 seront mis a mort

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’implication des plaquettes dans une pathologie nécessite l’évaluation sur un modèle vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons au préalable évaluer in vitro le statut d’activation des plaquettes chez l’homme (cohorte de patient atteint de Sjogren et de donneur sain). Afin de réduire le protocole, une étude pilote commune à l'axe 1 et 2, dont les résultats seront utilisés. Cette étude pilote utilisera 40 souris afin d’optimiser d’évaluer le traitement clopidogrel et d’anticorps depletant dans l’animalerie. Dans l’étude principalede l’axe 1 et 2, un groupe contrôle ainsi que 3 groupes de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail, le détail des groupes est abordé. Considérant une variance hypothétique maximale de 16%, le nombre minimal d’animaux nécessaire a l’observation d’une difference significative pour une mesure unique, si elle existe, est de 6 par groupe experimentale . Un test statistique approprié sera appliqué en fonction des comparaisons effectuées entre les différentes mesures/groupes. Ainsi, lorsque la condition de normalité de la distribution de valeurs est remplie, un test T de student sera appliqué entre les moyennes. Lors d’analyse longitudinale, les corrections pour mesures apportées ou des tests tolérants à la non independance des données seront appliquées de façon appropriée. La bonne approche statistique permettra de réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Raffinement

Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerions à ce que l’hébergement des animaux leur permettent d’avoir un enrichissement (avec paille, bois, coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Il s’agit d’une étude de vieillissement avec une manipulation réduite des animaux (prise de sang en veine saphène ou caudale et/ ou injection de médiateurs lipidiques en intrapéritonéale). Les souris seront observées quotidiennement et lorsqu’une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Dans notre étude nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique puisque nous étudions les médiateurs lipidiques dont l’expression est modulée par ces produits.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique de pathologie inflammatoire comme le syndrome de Sjögren. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 6 mois. Elles ont toutes un stade de développement complet.

Importée des États-Unis puis élevée sur place pour réduire les coûts d'achat, la lignée MMTV-PyMT fournit les 2 040 souris de ce projet, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit à 21 jours l'amputation d'un millimètre de queue sous anesthésie, pour le génotypage. Les femelles porteuses du transgène développent des tumeurs mammaires à croissance rapide, avec métastases pulmonaires chez 80 à 90 % d'entre elles, ulcération possible de la tumeur, gêne mécanique et détresse respiratoire, avant d'être tuées pour prélever tumeurs et métastases. Les mâles sans transgène sont tués faute d'usage, les mâles porteurs et les femelles sans transgène restant en vie pour la reproduction.

Objectifs

Maintien de lignées génétiquement altérées pour développer des tumeurs mammaires spontanées pour l’étude de la formation des métastases des cancers du sein luminaux et caractérisation génétique de ces dernières par une méthode invasive. La biopsie sera utilisée afin d’extraire l’ADN de la souris et de réaliser un génotypage nous informant de l’altération génétique ou non des souris.

Bénéfices attendus

La lignée MMTV-PyMT est disponible commercialement mais l’obtention des animaux est couteuse car elle nécessite une importation des États-Unis. L’élevage permet donc de réduire les coûts et d’avoir des animaux vivants disponibles pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des métastases des cancers du sein luminaux. Le génotypage permet la caractérisation génétique de ces lignées pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour le prélèvement de tumeurs.

Procédures

Prélèvement de la queue (1mm) pour biopsie 1 fois sous anesthésie générale à l’isoflurane, durée inférieure à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. Le modèle MMTV-PyMT est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide et souvent métastatique (80 à 90% des animaux développent des métastases pulmonaires spontanées). La croissance de la ou des tumeurs primaires peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose (mort cellulaire) et être associée à la formation d’ulcère entraînant une douleur pour l’animal. Les métastases pulmonaires peuvent entraîner de la dyspnée, de la polypnée, une respiration abdominale marquée et de la détresse respiratoire. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les deux à trois jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés tous les jours afin de leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.

Devenir

Les animaux de sexe masculin n'exprimant pas le transgène seront euthanasiés. Les mâles exprimant le transgène et les femelles sauvages seront gardés en vie pour le maintien des lignées (reproduction). Les femelles exprimant le transgène seront mise à mort pour prélever le tissus tumoral et métastatique.

Remplacement

Génotypage : pas de remplacement possible sur le projet de prélèvement de tissu. Les souris générées dans ce projet permettront l’étude des mécanismes de la colonisation métastatique des cancers du sein luminaux. Il est très compliqué de mimer in vitro la formation de métastases. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau de l’organe métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité des cellules cancéreuses observée in vivo. L’élevage des lignées MMTV-PyMT permet de générer des tumeurs de cancer du sein luminal en conservant l’hétérogénéité des cellules cancéreuses et du stroma. Les cellules cancéreuses seront isolées et étudiées ex vivo avec des essais se rapprochant le plus des conditions in vivo comme la culture en 3 dimensions de tumoroïdes. Notamment, afin d’étudier le rôle de gènes d’intérêt, l’effet de l’amplification ou la délétion de ces gènes sera évalué ex vivo afin d’éliminer les gènes n’ayant pas d’effet sur les cellules cancéreuses. Les poumons prélevés serviront à étudier les métastases pulmonaires afin d’étudier l’environnement immunitaire mais également la présence de protéines d’intérêt impliquées dans la formation de celles-ci par immunofluorescence.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, un nombre minimum de deux cages de reproduction seront utilisés pour le maintien des lignées murines. Comme le croisement des souris MMTV-PyMT se fait avec un male hémizygote pour le transgène et une femelle sans transgène, seule la moitié des souris issue du croisement exprimeront le transgène. Parmi ces souris, seule la moitié sera de sexe féminin et développera une tumeur mammaire utilisée pour notre étude. D’après notre expérience, ces souris génèrent 8 souriceaux toutes les 3-4 semaines ce qui correspond à 2 souris avec le bon phénotype (femelle MMTV-PyMT). Avec deux cages, on estime obtenir 4 souris toutes les 3 semaines. Ces souris sont utilisées au laboratoire pour toutes nos expériences ex vivo. Ce nombre de cages nous permettra de réaliser 3 à 4 expériences par mois. Le nombre de cage sera réduit si nos besoins diminuent.

Raffinement

Génotypage : La biopsie de queue des animaux est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale à l’isoflurane (induction 5%, 1.5L d’air) en fonction de l’aisance du personnel. Cette méthode est approuvée, précise, rapide et standardisée, ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal. Le prélèvement est ensuite stocké au congélateur jusqu’à utilisation pour le génotypage. Lignée à phénotype dommageable : les souris femelles développent des tumeurs mammaires à partir de 53 jours. Le suivi tumoral se fera 2 fois par semaines avec un pied à coulisse puis quotidiennement lorsque les tumeurs atteignent environ 10 mm de diamètre. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront surveillés tous les jours afin de procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Le modèle MMTV-PyMT de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie et concorde avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein luminal (S. Attalla et al. 2020). - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine Les animaux seront génotypé à 21 jours. Les souris MMTV-PyMT développent des tumeurs spontanées à partir de 53 jours avec des tumeurs d’environ 17 mm de diamètre (1500 mm3, point limite) aux alentours de 10-12 semaines. Afin de récupérer un maximum de tissu cancéreux, les souris seront utilisées lorsqu’elles présenteront une tumeur de 17 mm de diamètre (environ 1500 mm3), sauf si un point limite est atteint avant.

Quarante heures en cage individuelle sans enrichissement, répétées trois fois, et jusqu'à 52 semaines de régime hypercalorique : 1 400 souris et 1 500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin. Les souris femelles reçoivent chaque jour un dérivé de la testostérone qui supprime leur cycle, les hamsters femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, et l'ensemble subit frottis vaginaux quotidiens pendant quatorze jours, prises de sang après jeûne, tests de tolérance au glucose, épilation sous anesthésie et échocardiographie. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est attendu de ces mesures. L'objectif est de construire des modèles de syndrome des ovaires polykystiques associé à l'obésité pour y tester des composés, aucun modèle in vitro ou ex vivo de présélection n'existant selon lui.

Objectifs

Le syndrome d’ovaires polykystiques (SOPK) touche 6 à 13% des femmes en âge de procréer. Elle se traduit par un désordre hormonal menant à l’anovulation et à l’infertilité. Outre le fait que le syndrome impacte la vie sexuelle des femmes atteintes, il peut induire un désordre métabolique et un risque cardiovasculaire important : ces femmes sont plus susceptibles de développer un surpoids/une obésité, de l’hypertension artérielle, de l’hyperlipidémie, un diabète de type 2. Aujourd’hui les traitements anti-obésité et anti-diabète ne sont pas compatibles avec le souhait de procréation et d’enfanter et il est donc nécessaire de trouver une stratégie thérapeutique efficace pour traiter les atteintes métaboliques de ses femmes sans pour autant les empêcher de procréer. Pour ce faire, il faut donc développer des modèles précliniques atteints de syndrome d’ovaires polykystiques et d’obésité permettant de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées à cette population de patientes.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles SOPK associé à l’obésité mimant ce qui est observé chez les femmes atteintes. Ils permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques associée à la SOPK et ainsi de tester et valider de nouvelles thérapies.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en sucre seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 52 semaines pour les hamsters). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeûn 6h maximum avant le prélèvement. Des frottis vaginaux seront réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (quotidiennement pendant 14 jours et jusqu’à 4 fois durant le projet, sur animal vigile, quelques secondes). Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à un taux normal de sucre dans le sang. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille (2 minutes en fin de période de traitement). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes.

Impact sur les animaux

-Le traitement quotidien avec un dérivé de la testostérone induit l’absence de cycle menstruel chez la souris femelle. -L’ovariectomie (retrait des ovaires) induit l’absence de cycle œstral chez le hamster femelle. -Obésité induite par l’ingestion d’un régime gras : Le maintien de l’animal sous régime gras favorise sa prise de poids et limite ses capacités de mouvements. -Les mesures réalisées et les traitements : aucun effet douloureux n’est attendu après ces mesures cependant, il peut arriver qu’un animal supporte mal l’anesthésie ou soit stressé par certains gestes techniques. -Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.

Devenir

Nous devons collecter les organes cibles (foie, système génital, tissus adipeux, muscles, cœur, tibia a minima) donc tous les animaux seront mis à mort en fin de projet.

Remplacement

Le dérèglement associé à la SOPK et l’obésité est un dérèglement multi organique, qui se passe de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo de préscreening. La SOPK est une maladie combinant dérégulation du cycle hormonal et dérégulation métabolique. Ces dérégulations ciblent de multiples organes de l’appareil reproducteur et du système métaboliques (foie, tissu adipeux, muscle, pancréas, …). Aujourd’hui il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo mimant l’ensemble de ces dérégulations.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses comorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.

Raffinement

Lors de la mise sous régime et lors du traitement pharmacologique, l’état physique des animaux est monitoré et scoré 1 fois par jour tous les jours de l’étude. Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage, entraineront un examen clinique poussé par la structure du bien-être animal (SBEA). Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier serait mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être sera placé en armoire chauffante. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage individuelle (dépense énergétique) se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les animaux peuvent voir leur congénère à proximité. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés par la SBEA avec du cicalfate crème et du cicalfate lotion 2/jour jusqu'à l'apparition des croutes. L'utilisation des antibiotiques type acide fusidique sera validé avec le vétérinaire désigné.

Choix des espèces

La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète car suffisamment caractérisé et publié. Le hamster est un modèle bien connu pour avoir un métabolisme des lipides (cholestérol et triglycérides) et des lipoprotéines, comparable à l’homme. En outre, nous avons caractérisé et publié plusieurs modèles nutritionnels de hamster, y compris celui utilisé dans le présent projet, en utilisant des mâles. En conséquence la connaissance acquise sur ces espèces permet de limiter le nombre d'animaux utilisé. Les souris sont utilisées à partir de 4 semaines d’âge et les hamsters sont utilisés à partir de 13 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine où la SOPK se met en place au moment de la puberté.

Une injection dans le vitré, deux minutes par œil, abîme volontairement le nerf optique de 266 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus. Elles sont ensuite anesthésiées dix minutes pour mesurer l'activité de leur rétine, et testées éveillées cinq minutes devant des stimuli visuels contrastés. Le RNT qualifie ces tests d'indolores et couramment pratiqués en ophtalmologie humaine, tout en énumérant comme effets attendus une démarche instable, des tremblements, une incapacité à grimper, une désorientation et un comportement anxieux. L'équipe affirme que ce modèle constitue le seul moyen d'explorer la maladie et de tester des traitements sur la rétine, alors qu'elle écarte ses propres souris génétiquement modifiées au motif que leur neuropathie apparaît trop tard.

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’identifier des traitements capables de protéger le nerf optique dans les neuropathies optiques. Le projet porte sur les neuropathies optiques, une maladie qui entraine une perte de la vision progressive due à une perte de la fonction du nerf optique qui permet de relier l’œil au cerveau. Il n’existe actuellement pas de traitement pour traiter cette maladie. Nous proposons de générer un modèle animal pour reproduire la maladie et tester des traitements. Ce modèle animal reproduira fidèlement les symptômes retrouvés chez les patients. Il est important de noter que ce modèle représentera le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie. Ce modèle est également le seul modèle qui puisse être utilisé pour tester des traitements sur la rétine. Nous développerons un axe de recherche sur les animaux vivants, auxquels nous injecterons une protéine ayant une fonction de protection de la rétine. Nous mesurerons le bénéfice de cette thérapie sur la fonction visuelle des animaux au cours du temps.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence si notre traitement est capable de protéger la vision des animaux. A long terme, ce projet permettra de proposer un traitement chez les patients atteints de perte de vision.

Procédures

266 animaux seront anesthésiés pendant 10 minutes pour mesurer l’activité de la rétine. Ces animaux auront reçu dans leur vitré soit le composé induisant une atteinte de la vision, soit une solution contrôle. L’injection dure 2 minutes par œil. L’acuité visuelle sera mesurée sur ces animaux éveillés soumis à des stimuli visuels de différents contrastes. La mesure de l’acuité visuelle dure 5 minutes par souris.

Impact sur les animaux

Les tests pour mesurer la vision sont indolores et pratiqués couramment en ophtalmologie humaine. L’injection dans le vitré peut induire une courte douleur (moins de 2 min). Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. Les effets indésirables liés aux tests peuvent provoquer à court terme, une démarche instable, des tremblements, une incapacité à grimper, une désorientation, un comportement anxieux.

Devenir

Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvement de tissus post-mortem.

Remplacement

Nous réalisons déjà des expériences en laboratoire sur des cellules (issues de patients ou de modèles animaux), ce qui permet de répondre à certaines questions sans utiliser d’animaux. Cependant, ces approches ne permettent pas d’étudier entièrement les maladies du nerf optique, car celles-ci impliquent le fonctionnement global de l’organisme, notamment les interactions entre l’œil et le cerveau. Par ailleurs, avant de pouvoir tester une nouvelle thérapie chez l’être humain, la réglementation impose de démontrer son efficacité et sa sécurité dans un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle de souris reproduisant les caractéristiques de la maladie observée chez les patients constitue aujourd’hui l’approche la plus adaptée. Elle permet d’évaluer de manière fiable les effets d’une thérapie, tout en tenant compte des contraintes scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Notre projet étudie toutes les souris qu’elles soient mâles ou femelles, car la maladie touche les 2 sexes. Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant d’avoir un effet statistique significatif.

Raffinement

Toutes les mesures biologiques pour étudier la vision sont effectuées sur l’animal éveillé ou sous anesthésie. Les animaux sont placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu'au réveil. Après toutes analyses, les souris seront observées quotidiennement. Si des animaux montrent des signes de douleurs ou de souffrances, nous évaluerons cette souffrance et nous prendrons les décisions nécessaires afin de réduire la durée et l’intensité de la souffrance pour y mettre fin.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris adulte, car c’est le modèle mammifère de référence pour étudier l’impact d’une maladie sur l’organisme. Le stade adulte est utilisé pour s’assurer que la rétine est mature. Nous utilisons ce modèle car la neuropathie optique apparait rapidement permettant de tester plus efficacement des approches thérapeutiques alors que les modèles génétiquement modifiés que nous avons, développent une neuropathie optique légère ou très tardives. La souris est donc un très bon modèle animal pour tester des traitements.

Opérés sous anesthésie générale pendant environ trente minutes pour recevoir un assemblage de quatre biomatériaux, 25 des 34 rats sont ensuite irradiés trois fois par semaine pendant quatre semaines, puis tous sont tués trois mois après la dernière intervention pour explanter le dispositif. Ces procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et exposent les rats à des douleurs postopératoires, des difficultés à s'alimenter, une infection du site opératoire, une dermatite radio-induite et des troubles du comportement décrits comme anxiété, dépression ou agressivité. Le porteur revendique une démarche One Health, aucun modèle in vitro ne permettant selon lui d'évaluer la biocompatibilité de l'assemblage après irradiation. La réduction du nombre de rats est justifiée par la suite du programme, un essai clinique vétérinaire sur des chats et des chiens atteints de cancers de la bouche.

Objectifs

La présente demande couvre une sous partie du projet de recherche hospitalo-universitaire (RHU) , qui vise à développer une solution innovante pour résoudre un problème clinique pour lequel les solutions actuelles ne sont pas optimales : la reconstruction osseuse immédiate et personnalisée pour les cancers de la tête et du cou, tout en limitant la morbidité. Nous souhaitons modifier le procédé chirurgical standard de reconstruction des os du visage - qui consiste actuellement à utiliser un lambeau osseux libre du patient - en proposant un dispositif médical (DM) idéal, combinaison de 4 biomatériaux. Le projet repose sur un consortium de 7 partenaires experts dans le domaine de la recherche clinique humaine et vétérinaire, du DM, et de la caractérisation des biomatériaux. Le DM final sera constitué par 4 DM distincts qui seront associés le jour de l’intervention: 1- Implant en céramique: substitut osseux. 2- Implant à base de Titane : Système de fixation utilisé en combinaison avec le substitut osseux . 3- Membrane d’albumine (Alb) : revêtement cicatrisant et biocompatible, avec des propriétés anti-inflammatoires. 4- Spray antimicrobien.. Plus particulièrement la partie du projet qui fait l’objet de cette présente demande d’autorisation a pour but d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. L’objectif primaire est d'évaluer l’efficacité du DM en termes de biocompatibilité et néovascularisation après irradiation versus sans irradiation. La tenue d’un tel dispositif post-irradiation reste un challenge, compte tenu de l’impact de la radiothérapie sur les tissus environnant. L'objectif secondaire vise à évaluer l'effet de l'albumine avec ou sans spray antibactérien sur la biocompatibilité du DM et sa capacité de néovascularisation comparée à celui du DM HA-Ti seul chez le rat irradié ou non irradié. La biocompatibilité du DM sera évaluée par analyse histopathologique dans les différentes conditions. Cet essai est nécessaire avant l’essai clinique de reconstruction osseuse faciale par la procédure sur des animaux de compagnie souffrant de cancers de la cavité orale dans le cadre d’une médecine « One Health ». Le projet est réalisé dans 2 Etablissements Utilisateur (EU1 et EU2)

Bénéfices attendus

A moyen terme, le projet permettra d'éviter le risque de séquelles esthétiques et morbides sévères aux patients atteints d’un cancer de la tête et du cou et aux animaux de compagnie ayant besoin d’une reconstruction osseuse, et ainsi d’améliorer leur qualité de vie et réduire le fardeau économique pour la collectivité. Le DM mis au point dans le cadre du projet pourra également bénéficier aux animaux de compagnie, pour lesquels il n’existe actuellement pas de solution de reconstruction des os de la face. Plus particulièrement, cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation chez le rat irradié est cruciale puisqu’elle permettra de donner les premières preuves de faisabilité d’utilisation du DM suite à une radiothérapie avant de passer à des essais cliniques sur des animaux de compagnie souffrant de cancer de la tête et du cou.

Procédures

Les 34 rats vont subir 1 chirurgie d’implantation du dispositif sous anesthésie générale d’environ 30 minutes réalisés dans l'EU 2/2. Les 2/3 des animaux (25 rats) seront ensuite irradiés 3 fois par semaine pendant 4 semaines (soit 12 séances d’une durée d'une minute maximum par animal à chaque fois), 4 semaines après l’implantation , cette étape est réalisée dans l'EU 1/2. 3 mois après la chirurgie (groupe contrôle),ou 3 mois après la dernière séance d’irradiation (groupe expérimental) seront mis à mort et explantés pour analyse, étape réalise dans l'EU 2/2

Impact sur les animaux

1. Douleurs post-opératoires dans les jours suivant l'implantation 2. Difficultés à l'alimentation dans les jours suivant l'implantation / les séances d'irradiation 3. Infection du site opératoire dans les jours suivant l'implantation 4. Mauvaise cicatrisation dans les jours suivant l'implantation 5. Dermatite radio induite dans les jours suivant les séances d'irradiation 6. Effets secondaires systémiques : tels que des effets sur le poids corporel, le métabolisme, ou d'autres paramètres physiologiques. 7. Problèmes de comportement tels que l'anxiété, la dépression ou l'agressivité.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés trois mois après la dernière intervention (implantation ou radiothérapie, selon le groupe). Les analyses qui seront faites pour vérifier l’intégration des DMs ne permettent pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Cette étude de biocompatibilité et de néovascularisation vise à évaluer la faisabilité d’implantation d’un nouveau DM dans un contexte de tissu irrad L’utilisation des implants à base d’Hydroxyapatite et à base de Titane est déjà autorisée en reconstruction osseuse et a été largement documentée. Les deux autres éléments qui composeront le DM final, le spray antibactérien et la membrane d’albumine, ont déjà fait d’étude in vitro et in vivo mais dans le cadre de tests séparés. Cette étude sera la première à tester la biocompatibilité et la néovascularisation suite à l’implantation de l’assemblage des 4 DMs. Il n’existe à ce jour et à notre connaissance aucun modèle in vitro permettant une telle évaluation.

Réduction

Le projet s’inscrit dans la démarche One Health. En effet, il est prévu que le DM mis au point soit aussi testé chez des chats et chiens atteints de cancers oraux dans le cadre d’une étude clinique vétérinaire. Les données générées lors de cette étude permettront de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire tout en offrant une solution de reconstruction pour les animaux participants à cette étude clinique. Le nombre d'animaux nécessaire a été réduit par une analyse statistique optimale établie en fonction des résultats attendus (avec un biostatisticien), ainsi que le choix de modèles animaux et de protocoles déjà validés dans la littérature. Le taux de succès sera estimé dans chaque groupe avec un intervalle de confiance de 95% . L’effet de l’irradiation sera évalué par un test statistique non paramétrique . Le protocole d’irradiation a été défini avec une spécialiste de radio-oncologie vétérinaire

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux. Les animaux ne seront jamais seuls en cage (sauf si un isolement est nécessaire, notamment en post-opératoire). Les animaux seront surveillés avec attention chaque jour (comportement, cicatrice) et seront pesés de manière hebdomadaire durant toute l'expérience. La douleur sera prise en charge dès que nécessaire. La taille des DM a été adaptée à la morphologie des animaux. Dans les jours suivants la chirurgie et les séances d’irradiation, une surveillance renforcée des animaux sera mise en place (Un enrichissement environnemental dans les compartiments sera réalisé avec mise en place de cachettes, de papier, coton pour réaliser des nids. Des points limites seront respectés pour éviter toute souffrance excessive. L'ensemble du personnel est qualifié et compétent en matière d'expérimentation animale, et l'animalerie possède l'agrément et le plateau technique nécessaires. A noter que les animaux ne pourront pas être réutilisés car l’évaluation de la régénération tissulaire nécessitera une autopsie.

Choix des espèces

Le rat est un modèle établi pour les tests de biocompatibilité..De plus, comme nous cherchons à reproduire le protocole de soins, et en particulier la radiothérapie subit par les patients et les animaux de compagnie atteints de cancer de la tête et du cou. Le projet visant la mise au point d’un DM permettant la reconstruction faciale chez l’adulte, les procédures ne concerneront que des rats adultes

3 320 souris vont être utilisées dans ce projet sur le glioblastome, chacune pouvant passer par une chirurgie intracérébrale de 30 à 40 minutes, cinq injections quotidiennes consécutives, jusqu'à cinq cycles de traitement renouvelés toutes les deux semaines, deux séances d'imagerie par bioluminescence par semaine et quatre prélèvements sanguins, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La tumeur cérébrale provoque perte de masse musculaire, prostration, déshydratation et lésions cutanées, et les souris immunodéprimées utilisées courent un risque accru d'infection. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau, la voûte crânienne et les ganglions lymphatiques. Le porteur travaille en parallèle sur des organoïdes de glioblastome intégrant microglie et monocytes, et conditionne le remplacement d'une partie des expériences in vivo aux résultats de ce projet collaboratif.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’étudier les modifications du microenvironnement tumoral après l’administration de traitements diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules (type de traitement appelé sénothérapie) dans trois modèles murins de glioblastome (GBM). Ces modèles complémentaires récapitulent les altérations moléculaires identifiées dans un sous-type de GBM de patients dit mésenchymateux. Ce projet comprend trois volets : (1) Évaluation de l’effet de nouvelles drogues ciblant les cellules sénescentes ou leur activité sur la survie des souris après avoir vérifier que ces molécules sont perméables à la barrière hémato-encéphalique ; (2) Analyse en 3D des réseaux vasculaires sanguin et lymphatique méningé au niveau du cerveau entier et de la voûte crânienne, après marquage des protéines des vaisseaux par des anticorps fluorescents ; (3) Analyse du compartiment immunitaire de la tumeur en utilisant 4 approches : (i) analyse de l'expression des protéines et des ARN messagers (intermédiaires en le gène et la protéine) sur coupes de tissus ; (ii) analyse de l'expression des ARN messagers de cellules dissociées de la tumeur ; (iii) trie de cellules dissociées après marquages fluorescents spécifiques de type cellulaires, de la tumeur, des ganglions lymphatiques cervicaux et des méninges ; (iv) étude de l’action combinée de sénothérapie et d’immunothérapie (thérapie stimulant le système immunitaire).

Bénéfices attendus

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale adulte primitive la plus fréquente et agressive avec une médiane de survie des patients inférieure à 15 mois après diagnostique. Les résultats issus de ce projet permettront de comprendre les mécanismes sous-jacents de l’action bénéfique d’une sénothérapie en étudiant les compartiments immunitaire et vasculaire, au sein de la tumeur et en périphérie. Selon nos résultats, notre projet pourrait proposer une nouvelle approche thérapeutique en combinant une sénothérapie (traitement diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules) et une immunothérapie (traitement stimulant le système immunitaire). Cette dernière de donnant pas à ce jour, de résultats positifs dans la vaste majorité des GBM.

Procédures

La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 7 actes techniques incluant une injection pré-opératoire, une injection au niveau du cerveau de virus ou de cellules tumorales nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. L'ensemble de ces 7 actes techniques ne sera pas effectué sur la totalité des animaux du projet. L'injection unique pré-opératoire sera d'une durée de 10-20 secondes. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié (anesthésie générale et locale) et analgésié en pré et post-opératoire. Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil. La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min. Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement. L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile. Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal).

Impact sur les animaux

Ce projet comporte deux étapes majeures où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale consiste en une injection de virus ou de cellules tumorales dans des zones précises du cerveau. Ces injections sont effectuées sous anesthésie/analgésie qui peut entraîner des nuisances, par exemple des risques anesthésiques, des douleurs post-opératoires ou des risques infectieux. De plus, lors de cette étape comme lors de l'imagerie par bioluminescence des risques d'hypothermie et de détresse cardiorespiratoire sont possibles. Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration, déshydratation, lésions cutanées). En outre, les traitements par injections peuvent engendrer une douleur de courte durée, un risque d'irritation du tube digestif et un risque d’inflammation du péritoine. De même, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique pourrait être observée. Par ailleurs, nous utiliserons des souris immunodéprimées qui présentent un risque acru d'infections

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris contenant une tumeur, la voute crânienne et les ganglions lymphatiques afin de les analyser au niveau moléculaire, histologique et cellulaire.

Remplacement

En parallèle de ce projet in vivo, nous caractérisons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patients collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare et est obtenu grâce à la collaboration avec des neurochirurgiens et des neuropathologistes. Cette étude fondamentale demeure néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans des modèles animaux précliniques. Dans un souci de remplacement et réduction, nous avons initié la génération des tumoroides (ou explants de tissus en suspension) à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire et le réseau vasculaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle de tumoroides conservant de façon fidèle la présence et l’activité du microenvironnement. Un projet collaboratif vise à générer des organoides de glioblastome incluant de la microglie et des monocytes infiltrants. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.

Réduction

Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, nous utiliserons dans ce projet 3320 souris. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 10-18 animaux par groupe. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Pour cette raison, nous visons à obtenir des résultats robustes en utilisant plusieurs modèles murins de glioblastome complémentaires. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, voute crânienne, ganglions lymphatiques, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescente localisée dans le cerveau sera disséquée à la loupe binoculaire. Nous réaliserons plusieurs types d'analyses sur chaque tumeur. Dans certains cas, immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour réduire le stress post-opératoire, les animaux seront logés par groupes pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris femelle est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous regrouperons cet animal avec un animal de compagnie. Pour les mâles isolées (modèle 3), nous rajouterons un enrichissement (maison en carton) et nous notifierons sur la cage ‘animal isolé’. Lors des prélèvements sanguins, si le saignement ne stoppe pas rapidement, une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposée à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus de quelques minutes, l'animal sera euthanasié. Pour les souris immunodéprimées la litière et les aliments seront irradiés, les enrichissements seront autoclavés, et ils boiront de l'eau osmosée afin de réduire les risques d'infections qui sont élevés dans ces modèles.

Choix des espèces

Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Aussi, de nombreuses données de multiomics réalisées à partir de modèles murins de glioblastome sont disponibles et nous aideront à comprendre et analyser nos propres résultats. Les lignées de souris génétiquement modifiées utilisées pour ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour générer des glioblastomes car cette tumeur se développe chez l’adulte à partir de 30 ans. Ce projet qui vise à évaluer les modifications du microenvironnement tumoral (système immunitaire et architecture des vaisseaux sanguins et lymphatiques) après l’administration de traitements diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules (type de traitement appelé sénothérapie) dans des modèles murins de glioblastome utilisera des souris mâles et femelles. En effet, de nombreuses études ont montré que l’activité du système immunitaire varie selon le sexe.