Procédures modérées

1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose des implants hormonaux sous anesthésie, on leur injecte des substances dans l'abdomen pendant quinze jours, on incise l'extrémité de leur queue pour cinq mesures de glycémie après six heures de jeûne. Une partie porte un phénotype transgénique dommageable qui réduit ses comportements exploratoires et sociaux et accroît sa sensibilité au stress, l'hébergement individuel et les restrictions alimentaires ajoutant isolement, baisse d'appétit et perte de poids. Le projet annonce des biomarqueurs précoces et des stratégies thérapeutiques contre le déclin cognitif après la ménopause, retombées situées bien au-delà de la première année, quand la mise à mort des 1 536 souris est acquise dès le départ.

Objectifs

Les femmes sont plus touchées que les hommes par certaines maladies du cerveau, comme la maladie d'Alzheimer, notamment après la ménopause. Cette période de la vie s'accompagne de changements importants dans l'organisme : le cerveau, le système de défense de l'organisme et le métabolisme sont tous affectés. La diminution de certaines hormones perturbe le fonctionnement du cerveau et peut, avec le temps, entraîner des dommages neurologiques durables. En parallèle, l'organisme développe un état inflammatoire plus marqué. Cette combinaison, perturbation cérébrale et inflammation, pourrait expliquer en partie pourquoi le risque de développer la maladie d'Alzheimer augmente après la ménopause. Notre projet vise à mieux comprendre ces mécanismes en étudiant comment le système immunitaire se modifie au fil des étapes de la ménopause chez la souris. Nous souhaitons également examiner le lien entre ces modifications et des paramètres tels que le poids et l'alimentation. Enfin, nous cherchons à déterminer si et comment les cellules du système immunitaire jouent un rôle dans le fonctionnement du cerveau durant cette période.

Bénéfices attendus

Identifier les mécanismes clés qui relient ménopause et déclin cognitif. Déterminer le rôle précis des cellules immunitaires dans l’apparition ou l’aggravation des symptômes. Révéler des biomarqueurs précoces, utiles pour le diagnostic ou la prévention, avant l’apparition des pertes de mémoire. Ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, ciblant spécifiquement les processus immunitaires déclenchés par la ménopause. Prévenir la maladie pour éviter de devoir traiter des symptômes cognitifs aggravés. Les premiers résultats de ce projet peuvent être accessibles dès la 1re année de réalisation du projet.

Procédures

Injections abdominales de substances pendant 15 jours (animal vigil). Incisions de la queue pour collecter une goutte de sang et injection pour le test de tolérance au glucose et à l’insuline (animal vigil) : mesurer la glycémie à 0, 15, 30, 60 et 120 minutes après injection (1 intervention d’1 minute par point temporel). Jeûne de 6 h (début tôt le matin pour limiter le stress). Tests comportementaux (animal vigil) : 10 min par session pour étudier les capacités cognitives des souris (1 session par test). La durée réduite de chaque test (inférieure à 1 h), sans manipulation et sans perte de poids attendue. Pose d’implants hormonaux : 5 min d’intervention, 1 fois (animal endormi). Injections cervicales : 30 min d’intervention, 1 fois (animal endormi).

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux induisent un stress léger limité à la durée des tests, inférieure à une heure, sans manipulation invasive ni perte de poids attendue. L’hébergement individuel peut entraîner un stress modéré lié à l’isolement social, pouvant se traduire par une diminution transitoire de l’activité ou de l’appétit. Les interventions chirurgicales nécessaires à la pose d’implants entraînent une douleur post-opératoire transitoire. Une perte de poids peut être observée transitoirement lors des périodes de restriction alimentaire nécessaires à certaines tâches comportementales. L’incision de l’extrémité de la queue pour le prélèvement d’une goutte de sang provoque une douleur légère et de courte durée ainsi qu’une irritation locale transitoire. Le phénotype dommageable du modèle transgénique peut conduire à une réduction des comportements exploratoires et sociaux des souris transgéniques ainsi qu’à une sensibilité accrue au stress. Les injections aabdominales répétées peuvent provoquer un stress léger ainsi qu’une gêne transitoire au moment de la contention et de l’injection. Les injections cervicales nécessitent une anesthésie générale de l'animal (30 minutes d'intervention). Les souris seront donc contrôlées pendant plusieurs jours après la chirurgie .

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure expérimentale. Cette étape est indispensable afin de pouvoir prélever les tissus cérébraux nécessaires aux analyses scientifiques prévues dans ce projet. Ces analyses biologiques ne peuvent pas être réalisées autrement et sont essentielles pour répondre aux objectifs de recherche.

Remplacement

Les liens entre la ménopause, l’immunité, le métabolisme et le fonctionnement du cerveau sont très complexes, car ils impliquent de nombreux organes et systèmes qui interagissent en permanence dans l’organisme. À ce jour, aucune méthode utilisant uniquement des cellules en culture, des organoïdes ou des simulations informatiques ne permet de reproduire l’ensemble de ces interactions dans un organisme vivant. Seules les études réalisées chez l’animal permettent d’observer en même temps l’évolution du comportement, des hormones, du métabolisme, du système immunitaire et du cerveau chez un même individu au cours du temps. Les méthodes alternatives apportent des informations utiles, mais elles ne permettent pas d’évaluer le comportement ni de comprendre les réponses globales de l’organisme nécessaires pour étudier cette période de vulnérabilité liée à la ménopause. Dans l’état actuel des connaissances, l’utilisation de l’animal reste donc nécessaire pour répondre aux objectifs de ce projet.

Réduction

Pour obtenir des souris génétiquement modifiées de manière efficace, nous sélectionnons uniquement celles dont les gènes correspondent à nos besoins. Ensuite, nous comparons les résultats entre différents groupes d’animaux à l’aide de méthodes statistiques adaptées : pour deux groupes, un test simple vérifie s’il y a une différence significative entre eux ; pour plus de deux groupes, une analyse plus poussée est réalisée. Nous avons calculé le nombre idéal de souris par groupe pour obtenir des résultats fiables, en tenant compte de la variabilité naturelle, pour détecter toutes différences entre les groupes. Résultat : il faut environ 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : Période d’habituation avant utilisation en expérimentation d’une semaine minimum. La surveillance des animaux sera renforcée durant les périodes expérimentales et en cas de constat de dégradation du bien-être / souffrance des animaux. L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois l’hébergement des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal. Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée, anatomique, physiologique, comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, il sera mis en place des mesures conservatoires et des critères d’arrêt des souffrances, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier le cerveau et le système nerveux chez les vertébrés. L’organisation de son système nerveux est, à bien des égards, proche de celle de l’être humain, tant sur le plan de la structure que du fonctionnement. Cela permet aux scientifiques de mieux comprendre certains mécanismes cellulaires et comportements, avec des résultats souvent pertinents pour l’humain. Plus largement, les caractéristiques du cerveau de la souris sont similaires à celles des autres mammifères, ce qui rend les connaissances obtenues utiles pour la recherche médicale. Dans ce projet, nous nous intéressons à des cellules du cerveau appelées microglies, qui jouent un rôle important dans la défense immunitaire du système nerveux. Pour les observer, nous utilisons des souris génétiquement modifiées, chez lesquelles ces cellules émettent une lumière visible au microscope. Cela permet de mieux les repérer et d’analyser leur comportement dans le tissu cérébral. Nous étudions également des souris présentant des caractéristiques proches de la maladie d’Alzheimer, afin de mieux comprendre comment le système immunitaire du cerveau évolue dans cette maladie. Les tests biologiques, biochimiques et comportementaux sont effectués sur les souris à partir du moment où elles deviennent adultes sur le plan reproductif et jusqu’au début de l’âge adulte. Cette période correspond à un organisme déjà mature, mais encore peu affecté par le vieillissement. Cela permet d’étudier les effets des manipulations sur un système hormonal fonctionnel, tout en limitant les effets liés à l’âge et en assurant de bonnes conditions de tolérance pour les animaux.

Tuées à l'issue parce qu'aucune, porteuse d'une tumeur mammaire et traitée par chimiothérapie, ne pourra être adoptée ni réutilisée, 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un tatouage à la pince dans les coussinets des phalanges, un rasage du flanc, une greffe de cellules d'un cancer du sein triple négatif, puis des injections de chimiothérapie et d'un donneur de monoxyde d'azote deux fois par semaine pendant quatre semaines. La tumeur gêne la patte arrière et réduit la mobilité, la mesure au pied à coulisse ayant lieu trois fois par semaine. Le sang est prélevé par ponction intracardiaque sous anesthésie, juste avant la mise à mort.

Objectifs

Le traitement du cancer est très difficile. Il faut donc trouver de nouvelles solutions pour améliorer la vie des patients. L’objectif principal de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements utilisés pour un type de cancer du sein. Ce type de cancer du sein, appelé cancer du sein triple négatif CSTN, se développe très vite et est souvent associé à de moins bonnes chances de guérison. Nous proposons de combiner des traitements de chimiothérapies déjà utilisés en médecine avec un autre médicament qui libère une substance appelée « monoxyde d’azote (NO). Des expériences en laboratoire ont montré que cette combinaison pourrait freiner le développement de la maladie. En effet, le NO peut aider à tuer les cellules cancéreuses, surtout quand d’autres substances (appelées cytokines) sont présentes. Ces cytokines sont produites par les cellules cancéreuses et aussi par certaines cellules du corps, comme les cellules du système immunitaire. Certaines chimiothérapies augmentent la quantité de ces cytokines. Dans cas, quand on ajoute un médicament qui libère du NO et qu’il y a beaucoup de cytokines, les cellules cancéreuses se développent moins vite. L’étude sera divisée en 3 parties dont l’objectif sera (1) trouver les bonnes doses de chimiothérapies à utiliser en combinaison ; (2) déterminer à quel moment après le traitement par chimiothérapies les cytokines sont produites ; (3) d’étudier si la combinaison chimiothérapies et du médicament qui libère le NO peut ralentir le développement du cancer, au bon moment où les cytokines sont présentes. Ce projet vise à démontrer que donner un médicament qui libère du NO après les chimiothérapies peut améliorer le traitement de ce type de cancer du sein.

Bénéfices attendus

Le modèle d’étude du CSTN chez la souris que nous proposons d’utiliser dans ce projet permettra d’étudier la croissance tumorale. Grâce à ce modèle murin d’étude in vivo, nous nous attendons à valider l’hypothèse de notre stratégie de traitement qui repose sur l’administration du médicament donneur de NO sur la base d’une augmentation de cytokine faisant suite au traitement par des chimiothérapies dans le CSTN. Nous avons déjà réalisé précédemment une étude similaire dans le cancer colorectal. Ainsi, au travers de ce projet nous nous attendons à démontrer 1) le rôle clé de l’utilisation du médicament donneur de NO en association avec des chimiothérapies et 2) à démontrer que cette stratégie de traitement peut être transposée au CSTN. A long terme ce projet a pour bénéfice d’améliorer l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies standards utilisées chez les patients atteints de CSTN. Ce projet s’inscrit dans le développement d’une nouvelle combinaison de traitement.

Procédures

Anesthésie générale Inhalation d’anesthésiant pendant 5 minutes. Microtatouage Un microtatouage sera réalisé à l’aide d’une pince en 2 secondes au niveau des coussinets de phalanges sous anesthésie générale, une seule fois au début de l’expérience. Rasage Le flanc droit de l’ensemble des souris sera rasé à l’aide d’un rasoir vétérinaire pour injecter les cellules tumorales et mesurer le volume tumoral au cours du temps. L’intervention durera environ 1 minute et sera réalisée une seule fois sur souris vigile au début de l’expérience. Injection des cellules tumorales Les cellules resuspendues dans du sérum physiologique seront injectées sur le flanc droit de l’ensemble des souris sous anesthésie générale. L’injection des souris durera environ 5 secondes et sera réalisée une seule fois au début de l’expérience. Injection des médicaments/sérum physiologique Les injections de chimiothérapies ou sérum physiologique seront injectés individuellement. Les injections seront réalisées sur souris vigile et dureront environ 3 secondes.Le médicament donneur de NO/sérum physiologique seront injectés en sous-cutané au niveau du cou. Une seule injection de 3 secondes sera réalisée deux fois par semaine en vigile pendant environ 4 semaines. Mesure des tumeurs Un suivi de la croissance tumorale sera réalisé 3 fois par semaine pendant 4 semaines environ en vigile à l’aide d’un pied à coulisse. L’intervention durera environ 1 minute par souris. Prélèvement de sang en intra-cardiaque Le sang sera prélevé en intra-cardiaque (sans thoracotomie) après anesthésie générale. Les souris seront maintenues endormies à l’aide d’un masque libérant l’anesthésiant pendant tout le temps du prélèvement. Le prélèvement durera environ 5 minutes par souris. Ce prélèvement sanguin entrainera la mort de l’animal. Mise à mort des souris Les souris seront mises à mort après anesthésie générale. L’intervention durera 3 secondes par souris et sera suivi du prélèvement des tumeurs

Impact sur les animaux

Nuisances dues à l’anesthésie générale pour le microtatouage et l’injection des cellules tumorales : - Stress au moment de l’endormissement dans la boite d’anesthésie - Diminution de la chaleur corporelle Nuisances dues au microtatouage des coussinets des phalanges pour l’identification des animaux : - Stress de la manipulation et de la piqure avec la pince ARAMIS enduite d’encre - Douleur au point piqué Nuisances dues aux injections des chimiothérapies et du médicament donneur de NO : - Stress de la manipulation et de l’injection - Douleur au point d’injection - Effets indésirables dus aux traitements (perte de poids éventuelle) Nuisances dues au suivi de la croissance tumorale : - Stress de la manipulation lors de la mesure du volume tumoral Gêne occasionnée par la tumeur (gêne au niveau de la patte arrière, perte de mobilité)

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésiant pendant 5 minutes puis euthanasiés. En effet, tous les animaux étant porteurs de tumeurs mammaires, aucun ne pourra être réutilisés, replacés ou adoptés. De plus, même en cas de guérison, l’ensemble des souris auront reçu des traitements (chimiothérapies et/ou médicament) ce qui pourrait altérer leur état général en cas d’adoption ou les résultats de nouvelles expériences en cas de réutilisation.

Remplacement

Nous avons préalablement développé des modèles de culture tridimensionnelle (3D) afin de mimer l’architecture tumorale. Néanmoins, ce modèle de culture cellulaire in vitro ne permet pas de reproduire fidèlement la complexité d’un microenvironnement tumoral. Ainsi ce modèle d’étude in vitro ne peut pas se substituer totalement aux expérimentations in vivo étant donné que nous cherchons à étudier l’impact des traitements, d’une part sur le taux de cytokines issues de l’hétérogénéité du microenvironnement tumoral et d’autre part sur la croissance des cellules cancéreuses au sein de leur microenvironnement.

Réduction

Ce projet nécessitera l’utilisation de 320 souris sur une période de 3 ans. La maîtrise du modèle animal chez la souris au laboratoire permet de réduire le nombre d’animaux utilisé au minimum nécessaire pour les expérimentations envisagées afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Des études préliminaires ont été réalisées afin de définir les conditions de traitement et les doses de Nitronal à utiliser. De plus, les expériences seront réalisées sur des groupes de souris randomisés pour limiter au maximum les biais expérimentaux et éviter de recommencer les expériences plus de fois que nécessaire. Par condition de traitement, 10 seront utilisées pour les expériences de croissance tumorale (Procédures n°1 et n°3) et 5 souris pour les expériences de dosage in vitro des cytokines sériques et tumorales au cours du temps (Procédure n°2) afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques de type Two-way ANOVA sur l’ensemble des expériences réalisées.

Raffinement

Pour limiter au maximum les nuisances causées aux animaux et détecter le plus précocement possible toute forme de souffrance ou de mal-être potentiel, les animaux seront observés quotidiennement de façon à vérifier leur bien-être (absence de perte de poids, d’appétit, de déshydratation ou d’immobilité). Les animaux seront toujours hébergés en petits groupes pour limiter l’angoisse/le stress. De plus un enrichissement sera ajouté (matériel de nidification, petit récipient en verre) visant à améliorer la zone de confort tout au long de leur hébergement. Les manipulations (microtatouage, injections des cellules) pouvant générer un inconfort pour l’animal seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille de score regroupant les point limites est décrite ci-dessous de manière à déterminer les actions à mettre en place (surveillance, prise en charge ou mise à mort). Chaque paramètre est évalué séparément selon plusieurs niveaux et reçoit un score en fonction (0 à 4). Le score global est obtenu par addition des scores de tous les paramètres, ce qui permet d’estimer l’état général de l’animal et de définir les actions à mettre en place. Dans tous les cas, un animal sera anesthésié à l’aide de 2.5% d’isoflurane pendant 5 minutes puis mis à mort par dislocation cervicale si 1) le volume tumoral atteint 1500 mm3, 2) s’il présente une baisse de la masse corporelle ≥ 20% de la masse de référence au cours de l’étude (la masse corporelle sera mesurée avant le début de la procédure pour établir une valeur de référence, puis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Une perte de masse corporelle comprise entre 10 et 15% par rapport au poids de référence conduira à une surveillance renforcée, pesée plus fréquente et dépôt de croquettes humidifiées au fond de la cage et/ou de morceaux de pomme) ou des signes (comportementaux/posture) indiquant une souffrance ou une douleur significative qui ne peut pas être supprimée, 3) si l’aspect de la tumeur est nécrosant ou présente une large plaie ouverte. Si la plaie/nécrose de la tumeur est très limitée (< 2 mm), un pansement antimicrobien (pansement en spray cicatrisant à base d’aluminium) sera utilisé pour favoriser la cicatrisation.

Choix des espèces

Les expériences que nous avons préalablement réalisées in vitro ont été menées sur des lignées cellulaires (cancéreuses) de souris. Nous avons utilisé tout particulièrement la lignée 4T1 dérivée de la souris Balb/c. Le modèle de souris Balb/c, syngénique porteur de tumeurs de CSTN est parfaitement maîtrisé au laboratoire et nous permettra d’étudier la combinaison des chimiothérapies avec le Nitronal. Les souris Balb/c seront âgées d’environ 8 semaines de manière à ce qu’elles aient un système immunitaire suffisamment mature pour étudier l’impact de la production de cytokines en réponse au traitement.

Pour tester un gel lubrifiant censé prévenir la transmission sexuelle du VIH, 25 macaques à longue queue femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir jusqu'à huit applications du gel, 25 anesthésies, 25 prélèvements sanguins, trois biopsies de tissus et trois colposcopies vaginales. Seize d'entre elles au maximum sont exposées au virus une fois par semaine pendant huit semaines, avec fièvre, diarrhées persistantes et perte de poids attendues en phase aiguë. Celles du test de tolérance sont réintégrées dans l'étude d'exposition, les animales infectées étant tuées pour mesurer la charge virale dans leurs tissus.

Objectifs

Les infections sexuellement transmissibles (IST) constituent un problème majeur de santé publique, avec plus de 1 million de nouveaux cas recensés chaque jour dans le monde, particulièrement chez les femmes. Malgré les efforts déployés à l’échelle mondiale, le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) reste un pathogène majeur à l’échelle mondiale. Il est donc nécessaire de développer des stratégies permettant de réduire et de prévenir ces infections. Le préservatif reste aujourd’hui le moyen de protection le plus efficace contre ces infections. Toutefois, son usage reste insuffisant dans certaines populations, pour des raisons sociales, culturelles ou liées à l’impossibilité de négociation au sein du couple. Dans plusieurs régions à forte incidence, notamment en Afrique subsaharienne, les jeunes femmes représentent 80 % des nouveaux cas de VIH. Le développement de moyens de protection autonomes, en particulier pour les femmes, ne nécessitant pas de négociation préalable avec le partenaire, représente ainsi un enjeu important de santé publique. Dans ce contexte, le projet vise au développement et à l’évaluation préclinique de gels lubrifiants microbicides pour prévenir de l’infection au VIH, conçus pour reproduire les propriétés protectrices du mucus naturel au niveau des muqueuses génitales. Dans un premier temps, la compatibilité du gel avec les tissus muqueux et les paramètres biologiques généraux de l’organisme au gel seront évalués après administration dans le vagin . Dans un second temps, la protection du gel contre l’infection sera évaluée par l’analyse des paramètres virologiques et immunologiques. Le modèle retenu est le macaque cynomolgus femelle, référence pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH, en raison de la proximité de son système immunitaire avec celui de l’être humain, de la proximité anatomique et physiologique de son appareil reproducteur, de son cycle menstruel et de sa sensibilité à l’infection par un virus simien reproduisant les caractéristiques de l’infection HIV.

Bénéfices attendus

Le projet permettra le développement de nouvelles approches pour la confection de gel lubrifiant microbicide contre les infections sexuellement transmissibles (IST). Tout d’abord contre l’infection VIH chez la femme, et à long terme dans le développement d’un produit à plus large spectre contre les IST pour les femmes et les hommes.

Procédures

Les interventions prévues dans ce projet sont : • Administration du gel lubrifiant candidat ou contrôle (jusqu’à 8 administrations, sur 25 animaux, 1x par semaine, 2min) • Anesthésie des animaux (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 30min) • Prélèvements sanguins (jusqu’à 25x, sur 25 animaux, 5 min) • Biopsie de tissus (maximum 3, sur 25 animaux, 30min). • Suivi de l’environnement vaginal (récolte de fluides vaginaux, jusqu’à 25x, sur 25 animaux 2min) • Infection de 16 animaux maximum, (jusqu’à 8 infections à une fréquence d’une exposition par semaine, 2min) • Colposcopie vaginale, (3x maximum sur 25 animaux, 10min)

Impact sur les animaux

Nuisance liée au traitement Suite au traitement, une réaction locale d’inflammation peut apparaitre : démangeaison, douleur de façon transitoire. Nuisances liées aux prélèvements sanguins et biopsies tissulaires -Une réaction locale après prélèvement sanguin -Une réaction locale, suppuration, démangeaisons/douleur peuvent apparaitre après une biopsie tissulaire de façon transitoire. Nuisance liée à l’anesthésie Les anesthésies répétées peuvent entrainer une baisse de l’alimentation et par conséquent une perte de poids. Nuisance liée à l’infection sexuellement transmissible Les animaux infectés peuvent développer de la fièvre, des diarrhées persistantes, une perte de poids et une baisse du niveau de lymphocytes T de façon transitoire en phase aigüe (durée : quelques semaines). Nuisances liées aux colposcopies La colposcopie n'est pas un examen douloureux mais des crampes peuvent être ressenties après l’examen.

Devenir

Les animaux issus du test de tolérance seront gardés en vie et ils pourront être inclus dans l’ étude de protection afin de réduire le nombre d’animaux utilisés après avis du vétérinaire. Les animaux exposés au virus seront euthanasiés pour l’évaluation de la charge virale tissulaire et des réponses immunitaires dans les tissus.

Remplacement

L es études de tolérance et de l’efficacité d’un produit prophylactique contre des virus aussi critiques que VIH, ne peuvent pas être testées directement chez l’ être humain mais doivent montrer une efficacité dans des conditions proches de ce qui ce qui passe chez l’être humain. L’étude de tolérance et d’efficacité d’un produit au niveau vaginal implique un modèle proche de l’humain au niveau anatomique, du système immunitaire et de sa capacité à être infecté par le VIH. Aucune méthode alternative ne permet actuellement d’évaluer simultanément : • La tolérance locale sur une muqueuse génitale fonctionnelle ; • La protection induite dans un modèle d’exposition répétée au virus reproduisant les conditions de la transmission sexuelle.

Réduction

La taille des groupes a été réduite au minimum nécessaire à une analyse statistique fiable des résultats par des tests adaptés pour pouvoir conclure de la tolérance et de l’efficacité de traitements prophylactiques candidats tout en prenant en compte une certaine variabilité individuelle.

Raffinement

Hébergement Les animaux seront hébergés en groupes avant le début des expérimentations et pendant le test de tolérance. Pendant la phase d’infection, les animaux seront en hébergements individuels proches afin d’éviter la surexposition virale tout en permettant des interactions sociales entre eux. L’enrichissement sera renforcé pour les animaux hébergés individuellement (distribution 2 fois/semaine d’enrichissements destructibles ou de sachet surprise au lieu d’1). En plus, du raffinement (nourriture plus variée, compléments alimentaires) sera mis en place quotidiennement. Anesthésie Les interventions (administrations, prélèvements de tissus, colposcopies) et les prélèvements de fluides seront regroupés autant que possible et réalisés sous anesthésie générale afin d’éviter le stress et d’éventuelles douleurs. Les anesthésies répétées pouvant entrainer une baisse de l’alimentation, une diversification et complémentation de celle-ci pourront être instaurées. Le recours à des techniques d’analgésie et d’antalgie pourra être mis en place lors d’apparitions de signes particuliers. Prélèvements sanguins et tissulaires En cas de signes cliniques liés aux biopsies tissulaires => signalement au vétérinaire, afin de mettre en place un traitement symptomatique en local. Traitement intravaginal Le vétérinaire de l’installation sera alerté en cas d’apparition de signes cliniques (rougeurs, démangeaisons) afin d’adapter le suivi et les soins aux animaux. Infection lors du test d’efficacité Les animaux seront observés quotidiennement. Les expositions virales seront interrompues dès confirmation de l’infection. En cas de modifications majeures des paramètres biologiques après analyses des prélèvement sanguins (, associées à l’apparition de signes cliniques, un avis vétérinaire sera demandé. Examens colposcopiques Des colposcopies permettront de déterminer l’intégrité de la muqueuse vaginale et des signes d’inflammation avant et après traitements. Les colposcopies seront effectuées sous anesthésie pour éviter le stress, aucune douleur n’est attendue lors de cet examen.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus femelle de plus de 3 ans a été choisi en raison de la pertinence scientifique de ce modèle pour l’étude de la transmission muqueuse du VIH retrouvé chez la femme. L’environnement vaginal et le système immunitaire varie au cours de développement et de l’âge de l’animal et ont donc un impact sur la susceptibilité à l’infection virale et sur les effets d’un traitement prophylactique. Ces études seront donc réalisées chez des macaques cynomolgus femelles de plus de 3 ans possédant un système immunitaire « mature ». Le macaque Cynomolgus partage à la fois une grande similarité avec l’être humain au niveau anatomique et morphologique du système reproducteur féminin, mais aussi au niveau de son système hormonal, et de son cycle menstruel. De plus le macaque cynomolgus possède un système et une réponse immunitaire proche de l’ être humain. Ce modèle est susceptible à l’infection par le virus simien, et développe une physiopathologie proche de celle observée chez l’humain atteint du VIH. Aucun autre modèle animal ne permet d’évaluer simultanément la tolérance au niveau de la muqueuse, l’impact hormonal et l’efficacité prophylactique dans un contexte d’exposition virale répétée.

Une neurochirurgie de 90 minutes sous anesthésie générale pour 1 472 souris, dix jours d'hébergement individuel en cage hermétique avec passage à 33 °C puis à 4 °C pendant 24 heures pour 1 312 autres : 2 732 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi jusqu'à quatre immobilisations de cinq minutes en position fœtale dans un tube, des gavages quotidiens, des injections abdominales pendant deux semaines et six mesures de glycémie après sept heures de jeûne. Toutes sont tuées pour prélever cerveau et tissu gras. Le projet porte sur les mécanismes de la reprise de poids après un régime, sans que l'effectif de 2 732 souris soit rapporté à une justification chiffrée.

Objectifs

Le poids de notre corps reste assez stable tout au long de la vie adulte grâce à un mécanisme que l'on appelle le "set-point", qui correspond à un poids de référence que notre organisme cherchera à conserver Ce mécanisme est contrôlé par le cerveau, en particulier par une région appelée l'hypothalamus, qui communique avec les graisses du corps pour gérer l'énergie disponible en modifiant le comportement alimentaire, le stockage et l’utilisation des calories ingérées. Cependant, des facteurs biologiques et environnementaux peuvent modifier le set-point du poids corporel comme c’est le cas dans la maladie de l'obésité. Lorsqu'une personne prend du poids, le corps met en place des mécanismes pour le maintenir, ce qui rend difficile de perdre du poids de manière durable. Cela explique pourquoi 80 % des personnes qui ont suivi un régime ou ont recours à une thérapie de l’obésité reprennent du poids rapidement après l'avoir perdu. De récentes recherches scientifiques suggèrent que les altérations du système nerveux et des cellules du système immunitaire du cerveau, appelées microglie, puissent jouer un rôle dans le set-point du poids. Elles pourraient expliquer pourquoi le corps "se souvient" de l'obésité, ce qui facilite la reprise de poids. Ici nous proposons d’étudier leur rôle dans le maintien et dans la reprise du poids. NOUS ETUDIERONS EGALEMENT COMMENT CETTE “MEMOIRE DE L’OBESITE” PEUT IMPACTER LA MEMOIRE, L’ANXIETE ET L’ETAT EMOTIONNEL, AFIN DE COMPRENDRE LES CONSEQUENCES COGNITIVES ET EMOTIONNELLES DE CES ALTERATIONS CEREBRALES LIEES AU POIDS.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes souffrant d’obésité à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malgré l’existence de thérapies pour la réduction du poids, la plupart des patients reprennent du poids. Cette reprise de poids et l’incapacité de maintenir dans le temps le poids perdu sont de vraies urgences clinques pour la gestion de l’obésité. Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au changement du set-point du poids corporel, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques concernant l’altération du set-point du poids corporel, qui contribue au maintien de l’obésité et des comorbidités associées. À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité

Procédures

1) ANALYSE DE COMPOSITION CORPORELLE (2732 SOURIS) MAINTIEN 5 MINUTES EN POSITION FŒTALE DANS UN TUBE VENTILÉ, SANS ANESTHÉSIE. JUSQU’À 4 ANALYSES PAR ANIMAL. 2) NEUROCHIRURGIE (1472 SOURIS) INJECTION INTRACÉRÉBRALE SOUS ANESTHÉSIE GÉNÉRALE PENDANT ENVIRON 90 MINUTES. UNE INJECTION ANTALGIQUE 30 MINUTES AVANT, PUIS UNE PAR JOUR PENDANT 2 JOURS. PENDANT L’ANESTHÉSIE : DEUX INJECTIONS D’ANESTHÉSIQUES LOCAUX, UNE INJECTION ANTALGIQUE ET DEUX INJECTIONS DE RÉHYDRATATION. UNE SEULE CHIRURGIE PAR SOURIS. 3) INJECTIONS ABDOMINALES (2624 SOURIS) 1152 SOURIS : INJECTIONS ABDOMINALES SANS ANESTHÉSIE PENDANT UN MAXIMUM DE 2 SEMAINES. 2560 SOURIS : EUTHANASIE PAR INJECTION ABDOMINALE SOUS SÉDATION, APRÈS INJECTION SOUS-CUTANÉE D’UN SÉDATIF. 4) GAVAGE ORAL (1472 SOURIS) GAVAGE QUOTIDIEN PENDANT 5 JOURS, SANS ANESTHÉSIE. 5) CAGES MÉTABOLIQUES POUR L’ÉTUDE DE LA DÉPENSE ÉNERGÉTIQUE (1312 SOURIS) HÉBERGEMENT INDIVIDUEL EN CAGES HERMÉTIQUES PENDANT 10 JOURS. TEMPÉRATURE MODIFIÉE À 33 DEGRÉS CELSIUS PENDANT 24 HEURES, PUIS À 4 DEGRÉS CELSIUS PENDANT 24 HEURES, AVEC DEUX JOURS DE RÉCUPÉRATION À 22 DEGRÉS CELSIUS ENTRE LES DEUX. CETTE PROCÉDURE EST RÉALISÉE UNE SEULE FOIS. 6) APRÈS 7 HEURES DE JEÛNE INJECTION ABDOMINALE SUIVIE DE 6 MESURES DE GLYCÉMIE PAR PRÉLÈVEMENT DE SANG À L’EXTRÉMITÉ DE LA QUEUE, SANS ANESTHÉSIE. DURÉE MAXIMALE : 120 MINUTES. RÉALISÉ UNE SEULE FOIS. 7) PRÉLÈVEMENTS SANGUINS EN RÉPONSE AU STRESS (108 SOURIS) PRÉLÈVEMENTS À L’EXTRÉMITÉ DE LA QUEUE, ZONE NON INNERVÉE. MAXIMUM 4 PRÉLÈVEMENTS DE 15 MICROLITRES PAR ANIMAL, SOIT 60 MICROLITRES AU TOTAL, CORRESPONDANT À ENVIRON 4 POUR CENT DU VOLUME SANGUIN. 8) TESTS COMPORTEMENTAUX (108 SOURIS) OBJECTIF : ÉVALUER L’IMPACT DES MANIPULATIONS EXPÉRIMENTALES SUR L’ANXIÉTÉ, LA MÉMOIRE, L’APPRENTISSAGE, LA MOTIVATION ET L’ÉTAT ÉMOTIONNEL. HÉBERGEMENT INDIVIDUEL PENDANT UN MAXIMUM DE 6 SEMAINES DANS DES CAGES TRANSPARENTES, ENRICHIES ET RAPPROCHÉES. TESTS RÉALISÉS : OPEN FIELD (10 MINUTES, UNE FOIS) POUR L’ACTIVITÉ ET L’ANXIÉTÉ ; LIGHT DARK TEST (5 MINUTES, UNE FOIS) ET ELEVATED PLUS MAZE (5 MINUTES, UNE FOIS) POUR L’ANXIÉTÉ ET LA PRISE DE RISQUE ; WATER MAZE (5 MINUTES, 16 RÉPÉTITIONS) POUR LA MÉMOIRE SPATIALE ET L’APPRENTISSAGE ; TAIL SUSPENSION TEST (6 MINUTES, UNE FOIS) POUR LA MOTIVATION ET L’ÉTAT ÉMOTIONNEL. TEST DE PRÉFÉRENCE POUR LE SUCRE : 48 HEURES AVEC DEUX BOUTEILLES D’EAU, PUIS 48 HEURES AVEC EAU ET SOLUTION SUCRÉE À 4 POUR CENT, POUR ÉVALUER L’INTÉRÊT POUR UNE RÉCOMPENSE AGRÉABLE.

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet permettent un hébergement en cage collective tout le long de l’expérience, EXCEPTE POUR LES TESTS DE COMPORTEMENTS OU NOUS DEVONT PLACER LES SOURIS DANS DES CAGES INDIVIDUELLES DEUX SEMAINES AVANT LE DEBUT DES TESTS ET CE JUSQU’A LA FIN DE LA PROCEDURE, POUR UNE DUREE MAXIMALE DE 6 SEMAINES, AFIN DE LIMITER LES BIAIS SOCIAUX. EGALEMENT, pour les tests de dépense énergétique au sein de cages hermétiquement fermées, les souris adultes devront être hébergées de manière individuelle pendant 10 jours maximum, empêchant ainsi les interactions sociales. Au cours de ces 10 jours, la température des cages sera ponctuellement changée à 33°C pendant 24 h, puis à 4°C pendant 24 h, avec deux jours de récupération à 22°C entre ces deux changements. Une légère perte de poids est possible à la suite de ces changements de température.Pour l’ensemble des procédures, les souris subiront un stress d’immobilisation d’une durée de 5 minutes au maximum lors de l’analyse de composition corporelle, qui nécessite l’insertion de la souris dans un tube en plastique afin de pouvoir faire l’analyse, avec des trous pour le passage d’air. Les souris sous régime alimentaire gras vont prendre du poids de manière significative. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. Les souris qui passeront les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent perdre du poids après le jeûne, d’une durée totale de 7 h. La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. LES SOURIS QUI PASSERONT LES TESTS COMPORTEMENTAUX PEUVENT DEVELOPPER UN STRESS PSYCHOLOGIQUE TRANSITOIRE, SE MANIFESTANT PAR DE L’ANXIETE, DES REPONSES DE PEUR OU UNE IMMOBILITE PROLONGEE. CES EFFETS SONT REVERSIBLES ET DE COURTE DUREE, CAR LES TESTS SONT REALISES DE MANIERE LIMITEE ET CONTROLEE, AVEC DES PROCEDURES RAPIDES ET ADAPTEES. DES MESURES SONT PREVUES POUR REDUIRE AU MAXIMUM L’INCONFORT, NOTAMMENT DES MANIPULATIONS DOUCES ET DES PERIODES DE RECUPERATION SUFFISANTES ENTRE LES TESTS. Enfin, des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris ayant une neurochirurgie. Il est possible d’observer une perte de poids/appétit lors de la période post-opératoire. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés et certains de leurs organes seront récupérés (cerveaux, tissu gras, autres) pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle du système nerveux et des cellules immunitaires du cerveau dans la reprise de poids et l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et communique avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu gras…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de ce dialogue entre le cerveau et différents organes. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire, le changement du poids, la dépense énergétique, nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu nos expériences de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximum dont nous estimons avoir besoin durant les 5 ans que durera ce projet. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera (par exemple en regroupant les mâles et les femelles dans nos analyses, si nous constatons que le sexe n’influence pas les résultats de nos tests).

Raffinement

1) LES ANIMAUX ARRIVERONT À 4 SEMAINES ET SERONT HABITUÉS À L’HÉBERGEMENT PENDANT AU MOINS 1 SEMAINE. L’HÉBERGEMENT INDIVIDUEL SERA LIMITÉ AUX TESTS COMPORTEMENTAUX POUR UNE DURÉE MAXIMALE DE 6 SEMAINES, AVEC DES CAGES TRANSPARENTES ET ENRICHIES RAPPROCHÉES POUR LIMITER L’ISOLEMENT.Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages inclut l’utilisation de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons les tunnels pour manipuler les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une neurochirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès le début de l’anesthésie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée d’une solution de réhydratation. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Des points limites précoces et terminaux appropries ont été́ définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie/suture (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire est depuis longtemps étudiée chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à̀ ce type d’études. En effet, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel fait de cette espèce un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de notre étude, la réaction inflammatoire induite par un régime alimentaire riche en graisses est retrouvée à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui rend d’autant plus pertinent l’étude de ce phénomène chez cette espèce. Enfin, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Toutes les souris de cette étude arriveront à 4 semaines d’âge dans notre animalerie. Cet âge a été choisi car il est important que le début du régime riche en graisses commence avant l'âge adulte. En effet, des scientifiques ont montré que les effets de l'obésité sont plus marqués lorsqu'ils sont induits avant l'âge adulte.

Privés de circulation sanguine dans les deux reins pendant 25 à 40 minutes, ou intoxiqués par une molécule toxique pour le rein, 225 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils passent une nuit seuls en cage métabolique sans litière, sur une grille, subissent des recueils d'urine par frottement de la vessie et des anesthésies répétées pour poser puis retirer un capteur de fluorescence fixé sur le dos. Le porteur décrit une prostration, une perte de poids et des œdèmes, et cherche à savoir si l'analyse de l'ADN circulant pourrait remplacer la biopsie rénale chez les patients. Tous sont tués pour prélever reins, cœur, foie et cerveau, le rat ayant été préféré à la souris parce qu'il fournit un volume de plasma et d'urine plus important.

Objectifs

L'insuffisance rénale aiguë (IRA) correspond à un déclin soudain de la fonction rénale, survenant dans 10 pour cent des hospitalisations et chez 50 pour cent des patients en réanimation. Un épisode d'IRA est un facteur de risque pour le développement d'une maladie rénale chronique (MRC), qui représente un fardeau majeur pour les soins de santé. Lors d'une IRA, différentes structures rénales sont agressées. Les symptômes étant similaires, l'identification de la structure lésée sur le seul tableau clinique est impossible. Connaître l'origine de l'IRA est pourtant nécessaire car cela permet d'orienter le traitement. L'identification de la structure agressée repose aujourd'hui sur l'analyse d'une biopsie rénale, réalisée sous anesthésie locale. C'est un acte invasif qui présente certains risques, comme une hémorragie rénale. De plus, cette biopsie ne peut être répétée pendant des jours consécutifs. Mettre au point une méthode diagnostique permettant d'identifier les cellules lésées et de suivre l'évolution de l'IRA représenterait une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Lors d'une IRA, les cellules agressées vont mourir et libérer leur ADN dans la circulation et/ou l'urine. Cependant, d'autres cellules non-rénales (comme les cellules inflammatoires) libèrent de façon normale et constante leur ADN dans la circulation. Il faut donc trouver un moyen d'identifier spécifiquement l'ADN des cellules rénales. Un de ces moyens est la caractérisation de la méthylation, qui correspond à l'addition d'un groupement méthyl sur l'ADN de façon spécifique à chaque type cellulaire. Ainsi, par exemple, l'ADN d’un type de cellules rénales ne sera pas méthylé de la même façon que celui des cellules inflammatoires ou d’autres cellules rénales. Caractériser la méthylation de l'ADN présent dans le sang et/ou l'urine pourrait donc permettre d'identifier le type de cellules agressées lors d'une IRA à partir d'une simple prise de sang ou de collection d'urine. Afin de vérifier cette hypothèse, nous allons étudier trois modèles d'IRA expérimentaux chez le rat qui ciblent des structures rénales différentes. Nous analyserons la méthylation de l'ADN sanguin et urinaire à différents stades de la maladie et comparerons les résultats avec l'analyse classique de biopsie de rein.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet ont un impact à la fois social et médical. Les maladies rénales sont un problème de santé publique. Une personne sur dix est en effet atteinte par une maladie rénale chronique. Une partie importante de ces malades va évoluer vers l'insuffisance rénale terminale, qui est associée à un taux de mortalité élevé. Les seuls traitements de cette insuffisance rénale terminale sont la transplantation et la dialyse, dont le coût est extrêmement élevé (4 milliards par an). Ils représentent le premier budget de la sécurité sociale en France. L'insuffisance rénale aigue est un facteur de risque de maladie rénale chronique. Il est donc absolument essentiel d'améliorer le dépistage et le suivi des patients atteints de cette maladie afin d'optimiser leur prise en charge et réduire le risque d'évolution vers la maladie rénale chronique.

Procédures

(1) Induction des modèles d’insuffisance rénale : Une partie des animaux sera soumise à une procédure chirurgicale qui consiste à priver de la circulation sanguine les deux reins pendant 25 à 40 minutes. Elle s'accompagne d'injections pour l'analgésie et l'anesthésie. Ce protocole a une durée de 40-55 minutes. Une autre cohorte d’animaux sera répartie en deux groupes distincts, chacun recevant, sous anesthésie, l’administration d’une molécule toxique pour les reins. L’induction de ces deux autres modèles ne dure que 5 minutes. (2) Prélèvements : Une partie des animaux sera soumise à un recueil d’urine par miction spontanée puis, si besoin, avec un léger frottement sur la vessie (3-10 minutes). Une autre partie sera placée en cage métabolique une nuit pour recueillir un volume plus important d'urine. Un prélèvement de sang sera réalisé sur tous les animaux, sous anesthésie générale au moment de l’euthanasie, sur un plateau chauffant : durée 5 à 10 minutes. (3) Mesure de la fonction rénale : une partie des animaux sera soumise à la mesure de leur fonction rénale par une technique qui nécessite une anesthésie gazeuse pour injecter le traceur fluorescent et installer sur le dos de l'animal un capteur de fluorescence miniaturisé. Cette partie de la procédure dure cinq minutes. Une deuxième anesthésie est nécessaire deux heures plus tard pour retirer le capteur. Cette partie de la procédure ne dure que deux minutes. La mesure sera répétée plusieurs fois sur chaque souris à des jours différents selon la procédure. (4) Tous les animaux sont euthanasiés par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Les nuisances suivantes peuvent être générées. (1) Stress lié aux manipulations régulières pour les injections et les pesées (stress lors de la contention). (2) Stress lié à passage d’une nuit en cage métabolique : animal en hébergement individuel dans un cage sans litière, sur une grille. (3) Les injections : les douleurs induites sont de courte durée mais les animaux peuvent développer une inflammation locale. (4) Les complications associées aux injections de molécules toxiques pour les reins, soit une prise de poids en raison d’œdèmes, soit une dénutrition. En règle générale, l'induction d'une insuffisance rénale sévère entraine une altération de l'état général, une prostration et une perte de poids. (5) Les complications liées à la chirurgie pouvant provoquer des douleurs malgré une mise en place d’une analgésie péri opératoire (6) Les complications liées à l'anesthésie au moment de la chirurgie, de la mesure de la fonction rénale et l'euthanasie (détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire, stress thermique). Ces nuisances seront réduites au maximum grâce à l'utilisation de mesures de raffinement appropriées. Elles ne peuvent pas être complètement évitées car l'induction d'une insuffisance rénale est absolument indispensable pour le projet. La possibilité d'améliorer le diagnostic et le suivi de l'insuffisance rénale aigue représentera un bénéfice important pour la santé humaine.

Devenir

Tous les animaux (225) seront euthanasiés en fin de chaque procédure, par une méthode réglementaire sous anesthésie générale par une personne expérimentée. Nous devons en effet prélever des organes (rein, cœur, foie, cerveau) pour des analyses. Ce prélèvement sera réalisé après constatation de l’absence de battements cardio-respiratoires.

Remplacement

L'objectif du projet est d'évaluer si l'analyse de la méthylation de l'ADN libre circulant est aussi informative que la biopsie rénale et de déterminer dans quel fluide (urine ou sang) cette analyse doit être effectuée. Il est donc impossible d'effectuer cette étude dans un modèle non animal.

Réduction

Des expériences préliminaires ont permis d’évaluer l’hétérogénéité inter-individuelle du paramètre principal étudié (altération de la fonction rénale) dans nos modèles d'insuffisance rénale. Pour les procédures de mise au point, des lots de 5 groupes sont nécessaires. Pour les procédures dédiées à l'analyse de l'ADN circulant, des lots de 10 animaux de maladie rénale et 5 animaux contrôles sont suffisants pour obtenir la puissance suffisante pour mettre en évidence les différences entre les groupes d’animaux, et s’assurer de la reproductibilité de ces résultats d’une série à l’autre. Les effectifs ont été calculés à partir d’un module statistique de calcul de puissance. Nous utiliserons des tests statistiques appropriés pour l'analyse des résultats. Le nombre total d'animaux est de 225 rats.

Raffinement

(1) Raffinement hébergement et surveillance. Les animaux sont acclimatés dans l'animalerie une à deux semaines avant le début de la procédure. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce concernée excepté pour une courte période d’hébergement individuel en cage métabolique. Le bien-être des animaux est assuré par une surveillance quotidienne de l’aspect et de la motricité ainsi que par une pesée quotidienne pendant toute la durée des protocoles. Le bien-être des animaux est également assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), de morceaux de bois à ronger et d'un dôme refuge en cellulose dans toutes les cages. En dehors d'une courte période d'hébergement individuel limité à deux heures pendant la mesure de la fonction rénale, les rats restent dans leur cage initiale dans les mêmes groupes. (2) Raffinement injections. Les injections sont réalisées par du personnel expérimenté avec des aiguilles adaptées. De plus, certaines injections sont réalisées sous anesthésie générale, sur un plateau thermostaté à 37 degrés. (3) Raffinement Chirurgie. Pour assurer le bien-être des animaux, les actes chirurgicaux s'accompagneront d'une prise en charge péri-opératoire de la douleur et d'une anesthésie appropriée. Les rats seront placés dans une couveuse pour faciliter la phase de réveil dans leurs cages initiales. De la nourriture humidifiée est mise à disposition des animaux dans la cage. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés. (4) Raffinement anesthésie. Pour limiter les complications liées à l’anesthésie les rats sont placées sur un plateau chauffant. (5) Raffinement cage métabolique : le temps passé dans ces cages est réduit au maximum (14 heures environ, en fin de journée). Les animaux ont un accès libre à l'eau et la nourriture. (6) Des points limites associés aux injections, à la chirurgie et aux différents modèles d’insuffisance rénale du projet ont été définis.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles pertinents de maladie rénale. Nous avons choisi d'utiliser le rat plutôt que la souris car un volume important de plasma et d'urine est nécessaire pour obtenir une quantité suffisance d'ADN libre circulant pour l'analyse de la méthylation. Pour toutes les procédures, les rats sont âgés de 9 à 10 semaines car à cet âge, ils ont atteint leur maturité sexuelle, présentent un système rénal mature et ne présentent pas encore de lésions de vieillissement.

2 200 souris vont être utilisées, dont 920 nourries seize semaines au régime gras, 280 isolées 48 heures en cage métabolique et 240 placées à 5 °C pendant six heures ou dix jours, avec mesure de la température rectale. 560 d'entre elles subissent trois tests métaboliques comportant sept piqûres sanguines chacun, 640 une injection quotidienne pendant sept jours, et 1 560 un prélèvement à la veine temporale juste avant leur mise à mort. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes sont tuées pour récupérer organes et sang. L'objectif affiché est d'identifier une enzyme des macrophages comme cible future de médicaments contre l'obésité, perspective renvoyée à d'éventuels développements ultérieurs.

Objectifs

Dans notre organisme, il existe deux grands types de cellules graisseuses, appelées adipocytes. Les adipocytes blancs stockent les graisses issues de notre alimentation, tandis que les adipocytes bruns et beiges les brûlent pour produire de la chaleur. Cette combustion joue un rôle essentiel pour maintenir la température du corps lorsqu’il fait froid, mais aussi pour éliminer l’excès de calories après un repas. Chez les personnes souffrant d’obésité, ces adipocytes « brûleurs de graisse » fonctionnent moins efficacement. Mieux comprendre les mécanismes responsables de cette défaillance pourrait donc ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour restaurer leur activité et favoriser la perte de poids. Des travaux scientifiques ont montré que certaines cellules immunitaires, appelées macrophages, présentes dans les tissus adipeux, participent au bon fonctionnement de ces adipocytes grâce à un dialogue étroit entre cellules. Cependant, en situation d’obésité, ces macrophages changent de comportement et se mettent à produire des substances qui freinent l’activité des adipocytes brûleurs de graisse. L’une de ces substances pourrait être un dérivé lipidique fabriquée par les macrophages grâce à une enzyme spécifique. L’objectif de ce projet est donc de déterminer si et comment, la production de ce dérivé lipidique par cette enzyme des macrophages contribue au dysfonctionnement des adipocytes bruns et beiges.

Bénéfices attendus

L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de ce dérivé lipidique produit par les macrophages dans la dysfonction des adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse et ainsi pourrait permettre de proposer l'enzyme le synthètisant comme une future cible pour des médicaments visant à augmenter la fonction et/ou le nombre de ces adipocytes bruleurs de graisse. Cela permettra de favoriser la dépense énergétique et de réduire la masse grasse et ainsi lutter contre l’obésité et ses complications métaboliques comme le diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Des souris (920) seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines. La masse maigre et la masse grasse sera mesurée sur des souris vigiles (1200) par un appareil à raisonnance magnetique nucléaire (RMN) qui est une procédure non invasive un peu comme un scanner, la mesure dure 2 min/souris. Pour les mesures en cage métabolique, les souris (280) seront en hébergement individuel pendant 48 h. Des souris vigiles (560) recevront seront soumises à 3 tests d’explorations métaboliques nécessitant une injection par test. Pour ces 3 tests, ces souris seront soumises à 7 prélèvements d’une goutte sang d'environ 1µl (soit environ 7µL de sang prélevé par test) pour mesurer la glycémie. Les tests seront espacés de 2 semaines. Un prélevement de sang à la veine temporale sera également réalisé sur certaines souris (1560) avant la mise à mort dans certaines procédures. Des souris vigiles (640) recevront une injection et des souris vigiles (640) recevront une injection par jours pendant 7 jours. Des souris (920) seront hébergées à thermoneutralité (30 °C) pendant 18 semaines maximimum. Pour les expériences d'adaptation au froid par mesure de la température rectale, les souris seront hébérgées à 5°C pendant 6h (120 souris) ou 10 jours (120 souris). 7 mesures espacée d'1h seront faites sur les souris hébérgées à 5°C pendant 6h et 1 mesure par jour sera faite sur les souris hébérgées à 5°C pendant 10 jours. 2 mesures espacées de 10 j seront faites sur des souris hébergées à 21 C °(120 souris).

Impact sur les animaux

Les injections sur animaux vigile entrainent une douleur légère et de courte durée. Le prélevement d'une goutte de sang lors des tests d'exploration métabolique peut engendrer une légère douleur de courte durée. Le prélevement de sang à la veine temporale immédiatement avant la mise à mort entraine une douleur légère et de courte durée. La mesure de la masse grasse/maigre nécessite une contention de l’animal d’environ 2 minutes, pouvant induire un stress modéré et transitoire. La mesure de la dépense energétique en cage métabolique nécessite que les souris soient en hébergement individuel pouvant induire un stress modéré qui sera atténué par une augmentation de l'enrichissement de l'environnement. L'exposition au froid dans les conditions que nous utiliserons induit un stress modéré et une baisse d'environ 2-2.5 °C de la température corporelle mais sans entrainer d'hypothermie sevère car les souris comme tous les animaux à sang chaud (homéothermes) sont capables de mettre en jeux différents processus pour maitenir leur température corporelle interne stable, dans certaines limites, indépendamment de la température extérieure. La mesure de la température rectale s’effectue à l’aide d’une sonde de petit diamètre mais son insertion dans l'anus de la souris vigile peut être inconfortable pour l’animal et donc susceptible de générer un stress supplémentaire en plus de celui lié à la contention.

Devenir

Mise à mort pour récuperer des organes et du sang pour différentes analyses moléculaires

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement nous avons fait des études cellulaires qui ont montré que ce dérivé lipidique inhibe le développement/fonction des adipocytes thermogéniques qui participent au contrôle de la prise de poids et à la thermorégulation. Cependant, les mécanismes du developpement de l’obésité et de ses complications métaboliques ainsi que de la thermorégulation et de la régulation de la dépense energétique sont complexes, faisant intervenir un dialogue entre différentes cellules et organes. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Il nous est donc nécessaire maintenant d’étudier le rôle de la production ce dérivé lipidique par les macrophages sur la fonction des adipocytes bruns et beiges au sein d’un organisme entier car aucune méthode alternative n’existe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des animaux en excès. Les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet . Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Nous avons utilisé un logiciel dédié pour calculer le nombre d'animaux minimum nécessaire permettant d'avoir un effet statistiquement significatif en utilisant des données préliminaires qui permettent de prendre en compte la variabilité de l'effet étudié. Une des procédures est dépendantes du résultat de deux autres et ne sera réalisée uniquement si ces procédures donnent des résultats montrant une différence significative entre les génotypes, afin de réduire le nombre de souris utilisées dans ce projet.

Raffinement

L'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, tige de coton, buchette de bois). Cet environnement a été adapté selon les conditions experimentales pour favoriser le bien-être des souris et des comportements naturels. L'observation quotidienne des animaux permettra d'identifier rapidement des souris souffrantes et de prendre les mesures correctives nécessaires en fonction des points limites définis adaptés à chaque procédure. Une grille d'observation avec conduite à tenir adaptée à chaque procédure a été mise en place afin de prendre les mesures appropriées. Avec le recul que nous avons sur les experiences proposées, nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux pour les différentes procédures mais dans l’éventualité d’apparitions de points limites définis, les mesures retenues seront mises en oeuvre.

Choix des espèces

L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce a un tissu adipeux brun très développé qui contribue à leur dépense énergétique et constitue donc un modèle de choix pour identifier de nouveaux mécanismes régulant la fonction thermogénique de ce tissu et la dépense énergétique. Cette espèce est aussi très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en lipide, elle devient rapidement obèse. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'Homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Les animaux seront étudiés au stade adulte (age 12-23 semaines selon les procédures).

Les doses testées, les voies d'administration et le calendrier suivent les besoins du développement d'un médicament, jusqu'à la prédiction des doses cliniques chez l'être humain. 940 souris vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées directement dans le cerveau au cours d'une chirurgie de 45 minutes, ou par voie intraveineuse et intracardiaque, avant jusqu'à trois séances d'imagerie par semaine pendant huit semaines et des gavages ou injections répétés jusqu'à deux fois par jour. Le porteur reconnaît que les tumeurs cérébrales peuvent provoquer tremblements et convulsions, et prévoit de réutiliser dans un autre projet les 100 souris qui n'auront pas développé la tumeur attendue, les autres étant tuées pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer chez la souris de nouveaux traitements pour les cancers du cerveau et/ou les métastases cérébrales, dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits. Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses du cerveau, soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans le cerveau des souris par injection intracrânienne ou injectées par voie intraveineuse ou intracardiaque pour mimer le processus métastatique (modèle disséminé). En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer des traitements à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur ou de métastases cérébrales, puis à mesurer les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines ou tissulaires du composé d’intérêt et/ou la croissance tumorale. Les mesures de concentrations permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et la pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité préclinique, de toxicologie réglementaire et enfin pour prédire les doses en développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Chaque année, environ 5 900 nouveaux cas de cancer du cerveau sont diagnostiqués en France dont 500 chez les enfants. Il est la première cause de décès par cancer chez les enfants, adolescents et jeunes adultes. Les métastases cérébrales, quant à elles, concernent environ 20% des patients adultes atteints de cancer tout confondu. La prise en charge des cancers du cerveau combine chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie en fonction de son stade de développement, du type de tumeur identifié, de sa localisation et de son agressivité. Lorsque cela est possible, la première phase du traitement d’un cancer du cerveau consiste à utiliser la neurochirurgie pour retirer le maximum de tissu tumoral, sans provoquer de handicap. Il en est de même pour les métastases cérébrales. Contrairement aux tumeurs localisées ailleurs dans l’organisme, le neurochirurgien ne peut se permettre de retirer du tissu sain autour de la tumeur cérébrale pour éviter d’éventuelles récidives, sous peine de séquelles neurologiques graves et irréversibles. En parallèle de la chirurgie, la radiothérapie est un traitement très largement utilisé pour soigner les cancers du cerveau et métastases cérébrales. Elle consiste à délivrer une forte dose de rayons ionisants pour cibler les cellules tumorales tout en limitant les dommages aux tissus sains. Cependant ce type de traitements entraînent des effets secondaires importants et parfois à long-terme. Enfin, la chimiothérapie vise quant à elle à détruire les cellules tumorales avec des médicaments. Elle peut être utilisée seule ou combinée avec la radiothérapie, avant ou après une chirurgie, pour réduire la taille des tumeurs ou éliminer les cellules cancéreuses résiduelles. L’efficacité de ces traitements peut cependant être limitée par plusieurs facteurs, en particulier par la barrière hématoencéphalique qui protège le cerveau en empêchant certains médicaments d’atteindre les tumeurs. Au regard des limitations des traitements actuels pour le cancer du cerveau et des métastases cérébrales, il est primordial de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

1) Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales par voie intracrânienne : chirurgie d’une durée de 45 minutes incluant l’anesthésie jusqu’à la période de réveil, 1 seule fois pendant l’étude. OU • Greffe des cellules tumorales par voie systémique : administration IV ou intracardiaque unique de maximum 5 min sous anesthésie gazeuse, 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs avec l’appareil de bioluminescence : durée 15 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine pendant max 8 semaines. • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence par voie intrapéritonéale : durée 30 secondes sur animaux vigiles (maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée, max 8 semaines). • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max2xjour), intrapéritonéale (max2xjour), sous-cutanée (max2xjour), intramusculaire (max2xjour) ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. OU o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. • Traitement par irradiation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude dans certaines études demandées par le client. 2) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 2xjour) o via la veine faciale : durée 30 secondes (max 2xjour) o via une incision de la veine latérale de la queue (1 seule incision d’environ 2 mm réalisée pour la totalité des prélèvements) durée 1 min (max 10xjour).

Impact sur les animaux

Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux étant opérés du cerveau ou ayant des métastases cérébrales, il est possible que les animaux présentent des signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des convulsions. Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux sont mis en mort en fin de procédure pour prélèvements d’organes/de sang, sauf si les animaux n’ont pas développé les modèles tumoraux escomptés et pourraient être ré-utilisés dans un autre projet dans le cadre de la Réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorale. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Si le modèle le permet, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. L’utilisation de cette technique non-invasive permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme) et de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et de détermination de la taille des groupes expérimentaux. Nous évaluons à 940 le nombre de souris maximal utilisé pour ce projet. Les animaux de la procédure 1 ou 2 pourront parfois basculées en procédure 3 ou 4 ce qui réduira le nombre d’animaux total du projet.

Raffinement

Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés dans des cages de 5 animaux contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. Pour les anesthésies longues (instillation des cellules tumorales ou traitement des animaux) les animaux seront placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température corporelle pour éviter toute hypothermie. A noter qu’afin de protéger la sécheresse oculaire durant la phase d’anesthésie, du gel ophtalmique type Lacryvisc est déposé sur les yeux de l’animal à l’aide d’un coton-tige. Pour éviter l’apparition de potentielle douleur lors de l’instillation des cellules cancéreuses, une injection en sous-cutanée d’analgésique sera réalisée 30 minutes avant l’instillation des cellules. Cette injection sera répétée en cas d’apparition de signe de douleur. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées (voir annexe page 39). En fonction de l’état des animaux la surveillance sera renforcée à 2 fois par jour si besoin. Ainsi, à partir d’un total de 4, les animaux seront observés par un vétérinaire et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limites établi, il sera immédiatement euthanasié. Par ailleurs, les souris immunodéficientes utilisées sont hébergées dans des locaux isolés des souris immunocompétentes avec renforcement des équipements de protection individuelle pour éviter qu’elles soient contaminées par des opportunistes.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles de cancer du cerveau/métastases cérébrales chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1) sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2) la biodisponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes.

Anesthésiées, la peau et les tissus incisés pour dégager la trachée, les souris reçoivent une injection unique d'une molécule qui déclenche une fibrose pulmonaire, puis la plaie est suturée. Deux semaines plus tard, une seconde intubation sous anesthésie leur inocule des particules virales qui déclenchent un cancer du poumon. 640 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des difficultés respiratoires, une posture de repli et une perte de poids possibles. Toutes sont tuées à trois échéances différentes, l'établissement indiquant que leur mise à mort est "nécessaire" au prélèvement des poumons.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique grave, entrainant la mort en 3 à 5 ans. La fibrose est la formation d'une quantité anormalement abondante de tissu cicatriciel. La cause et les mécanismes qui sous-tendent le développement et l’évolution de cette maladie dans le poumon sont inconnus. Elle se manifeste par une perte d’élasticité du tissu de soutien pulmonaire, résultant en une altération des échanges entre les alvéoles contenant l’oxygène et les vaisseaux sanguins. Le poumon devient progressivement trop abimé pour assurer l'oxygénation du sang et le patient développe une insuffisance respiratoire chronique conduisant au décès. Les médicaments disponibles sont uniquement capables d’en ralentir la progression. Ces traitements permettent d'augmenter la survie de ces patients mais on peut craindre l’apparition de cancer du poumon. En effet, les patients atteints de fibrose pulmonaire sont plus susceptibles de développer des cancers du poumon. Avec l'émergence de nouveaux traitements prometteurs contre la fibrose pulmonaire, il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes favorisant la survenue de ces cancers, menaçant potentiellement les patients atteints de fibrose pulmonaire. Les mécanismes conduisant à l'apparition du cancer chez les patients FPI sont encore mal connus. Notre hypothèse est que la fibrose va favoriser la croissance des cancers chez ces patients atteint de fibrose pulmonaire. Nous étudierons des souris génétiquement modifiées pour modéliser le développement du cancer pulmonaire dans le contexte de la fibrose pulmonaire. Ainsi, nous utiliserons des modèles de fibrose pulmonaire établis chez la souris, impliquant une injection au niveau de la trachée sous anesthésie générale de différentes molécules favorisant le développement de la fibrose pulmonaire.

Bénéfices attendus

Les patients atteints de fibrose pulmonaire sont plus enclins à développer des cancers du poumon (une des formes de cancers les plus courantes et mortelles dans le monde). Nos travaux de recherche permettront d’identifier le rôle de la fibrose sur le développement de ces cancers afin 1) d'identifier de nouvelles thérapies potentielles et 2) de permettre une meilleure prise en charge de ces patients fragiles.

Procédures

En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Deux semaines plus tard, les souris recevront une injection unique de particules virales qui activera la formation du cancer du poumon. L’injection se fera via la trachée, après intubation, sous anesthésie générale gazeuse (durée de la procédure: 5 minutes) avec des suites post-opératoires similaires à l’injection du produit fibrosant. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à 3 temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.

Impact sur les animaux

Il faut noter que l'induction de la fibrose pulmonaire et d'éventuelle lésions cancéreuses chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général (posture de repli...) avec perte de poids. Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est également possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des cancers associés à la fibrose pulmonaire.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des modèles alternatifs comme des cultures d'alvéoles pulmonaires reconstituées en laboratoire ou de tranches de poumon. Cependant, ces méthodes alternatives ne permettent pas de modéliser la réponse d’un organe entier vivant dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire et du cancer du poumon.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints. De plus, les prélèvements obtenus grâce à une seule souris permettent de mener de multiples mesures.

Raffinement

1) Surveillance quotidienne: nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. 2) Surveillance clinique en lien avec les procédures: les animaux seront anesthésiés lors des procédures et recevront des antalgiques systématiquement en préopératoire. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur et permettra de détecter une éventuelle souffrance. Selon la grille de surveillance mise en place, la douleur sera prise en charge par l'administration d'antalgiques si nécessaire. La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En post-opératoire, la douleur et la cicatrice seront également suivies de manière rapprochée. En cas de douleur et d'atteinte d'un point limite, les animaux seront euthanasiés (des antalgiques seront administrés avant l’euthanasie).

Choix des espèces

Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés. Des animaux adultes d'au moins 8 semaines seront utilisés car la fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte. Le modèle murin est pertinent du fait de son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme.