Procédures modérées

15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La peau de leur dos est incisée à trois endroits sur 4 cm en une seule chirurgie sous anesthésie, puis ils sont mis à mort à J21 pour prélever la ligne de suture et évaluer la cicatrisation. Le porteur compare des colles de suture développées par son laboratoire à des techniques courantes, dans une étude pilote de trois réplicas par formule. Il indique que le lapin est choisi parce qu'il tolère un gilet de protection là où les rongeurs arrachent la suture, et qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les forces mécaniques d'une plaie.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de déterminer l’efficacité de différentes formules de suture nouvelle génération développées par notre laboratoire (comparativement à des techniques utilisées couramment) pour la suture d’incision chirurgicale. 1 – évaluer la qualité de la cicatrisation en fin du processus cicatriciel : un prélèvement histologique sera réalisé à J21 à la fin de la phase de ré-épithélialistaion de la plaie. 2 – évaluer la durée de cicatrisation : un contrôle visuel 2 fois par semaine permettra d’évaluer le stade de cicatristaion de la plaie.

Bénéfices attendus

La suture de plaie traumatique ou d’incisions chirurgicales est réalisée soit par colles chirurgicales, soit par un fil de suture, soit une agrafe. La suture par fil/agrafe créé des lésions du derme et implique la présence d’un corps étranger dans la suture, engendrant un risque d’apparition d’une infection cutanée post-opératoire. Ils ont également comme inconvénient de ne pas stabiliser parfaitement la plaie lorsque des tensions sont exercées dessus. Le bord à bord des berges cutanées est maintenu uniquement au niveau du point de suture ; ceci a pour conséquence de rouvrir la plaie, gênant la cicatrisation et laissant une cicatrice fibreuse voire des cicatrices hypertrophiques ou chéloïde. Des rapports montrent que l’incidence de la formation d’une cicatrice hypertrophique après une chirurgie se trouve entre 33% et 91%. D’après l’enquête nationale de prévalence des infections nosocomiales en France, la prévalence des patients infectés était de 4,97% en 2006 (au niveau du site opératoire dans 14% des cas). Ainsi, l’utilisation d’une colle chirurgicale ayant une force d’adhésion équivalente à une suture permettrait de résoudre les limites détaillées cidessus (bord à bord parfait, pas de corps étranger, pas de lésion, une parfaite stabilisation des berges de la plaie…). Les seuls produits actuellement utilisées pour cette application sont les colles de cyanoacrylate (Leukosan). Elles ont pour avantage d’avoir un temps de prise rapide et une haute résistance au déchirement. Cependant leurs faibles propriétés adhésives à la peau font qu’elles ne sont indiquées que pour les sutures de petites plaies avec un taux de déhiscence de 20%. Elles ne peuvent ainsi pas être utilisées en alternative d’une suture par fil ou agrafe. L’étude des propriétés adhésives des colles chirurgicales actuellement commercialisées montre que la faible adhérence de ces colles est due au fait qu’elles se fixent sur la surface desquamante des tissus biologiques. Or, il s’avère que l’adhésion à un tissu biologique repose sur un ancrage à son extrême surface. Les produits testés dans cette étude reposent sur ce principe. Cet ancrage à la superficie du tissu permet d’atteindre des performances techniques inégalées (équivalente à une suture par fil et dix fois supérieures aux colles chirurgicales)

Procédures

Procédure chirurgicale d’incision et suture cutanée sous anesthésie générale. L’anesthésie durera 30-45 min.

Impact sur les animaux

La peau du dos de l’animal va être incisée à 3 endroits en une chirurgie. Chaque incision mesurera 4 cm de long. L’animal sera endormi généralement au cours de la chirurgie. Pour limiter la douleur ressentie, l’animal recevra un traitement antiinflammatoire en pré chirurgie puis toutes les 24h jusqu’à ce que l’animal ne présente plus de signes cliniques d’inconfort. Au cours de l’anesthésie, l’animal pourrait se refroidir. Pour pallier cet inconfort qui pourrait engendrer une mauvaise récupération des suites de l’anesthésie, l’animal sera placé sur un tapis chauffant tout le long de la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort. A 21 jours, à la fin de la phase de ré-épithélialisation de la plaie, les animaux seront mis à mort et des prélèvements seront réalisés le long de la ligne de suture pour évaluer la qualité de la cicatrisation.

Remplacement

Les plaies traumatiques et les incisions chirurgicales sont des plaies complexes qui touchent les différentes structures de la peau (allant de l’hypoderme à l’épiderme) et qui subissent des forces mécaniques qui peuvent être importantes en fonction de la localisation de la plaie. Il n’existe donc pas de modèles in vitro permettant de prendre en compte tous ces paramètres. Par ailleurs dans le développement d’un nouveau dispositif médical, il est nécessaire de tester les formulations sélectionnées sur des modèles animaux afin d’appréhender la biocompatibilité des matériaux avant le passage chez l’Homme.

Réduction

Cette étude est une étude pilote qui nous permet principalement de faire de l’imagerie pour observer les différences sur le processus cicatriciel en fonction de la solution de suture utilisée. Pour chaque formule trois réplicas seront réalisés afin de pouvoir observer et comparer la cicatrisation sur 3 individus (lapins). Ces 3 réplicas nous permettrons également de comparer la différence de temps de cicatrisation entre différentes solutions de suture.

Raffinement

Les animaux bénéficient de plateforme dans leurs cages, de jouets et de morceaux bois à ronger dans leur environnement de vie. Les animaux recevront un traitement anti-inflammatoire et antalgique les 3 premiers jours post opératoire qui permettra de réduire la douleur ressentie. Le traitement pourra se poursuivre en fonction des signes cliniques observés quotidiennement les jours suivants. Les animaux seront suivis environ 21j le temps de la cicatrisation puis seront mis à mort.

Choix des espèces

Les modèles animaux préférentiellement utilisés dans la littérature dans ce type d’expérimentation sont les rongeurs, le lapin ou encore le porc. Les rongeurs ont tendance à retirer/arracher tout corps étranger présent sur leur peau, ce qui empêche toute chance de conclusion sur l’efficacité d’un système de suture de plaie. Chez le lapin, il est possible de protéger la zone lésée grâce à un gilet de protection conçu sur mesure. Ce gilet permet à la plaie de cicatriser sans que l’animal ne sollicite sa suture. Ces gilets de protection sont conçu pour des animaux mature d’un poids d’environ 2.5kg. Par ailleurs, chez un lapin adulte de 2.5kg, la surface (cm²) du dos adaptée à la réalisation des incisions prévues dans cette étude. Enfin, un animal mature dispose de structures anatomiques cutanée et système immunitaire adaptés aux besoins de l’étude.

78 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des composants de bioprothèse cardiaque sont implantés sous la peau de leur dos sous anesthésie, suivis de deux séances d'imagerie TEP avec injection d'un traceur, avant euthanasie à J29 pour prélever le sang et les tissus. Le porteur teste un traitement de surface censé réduire l'inflammation, un bénéfice pour les patients humains qu'il renvoie au conditionnel et à un transfert futur. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de moyens alternatifs et que la réaction aux biomatériaux chez la souris reproduit celle de l'homme.

Objectifs

Les valves cardiaques artificielles sont utilisées pour remplacer des valves malades chez l'Homme. Certaines valves dites biologiques sont composées de tissus biologiques d’origine animale (porc ou bovin). Elles présentent de nombreux avantages par rapport à des prothèses complétement synthétiques (valves dites mécaniques), notamment en termes de fonction et risque de formation de caillots (thrombose). En revanche, la composition des valves biologiques reste « étrangère » au système immunitaire du receveur les rendent susceptibles d’être rejetées par le tissu receveur. En effet, malgré toutes les mesures mises en place pour rendre le tissu biologiquement inactif, les cellules qui assurent la défense de notre organisme reconnaissent inéluctablement la différence d’origine du tissu implanté et déclenchent une réaction inflammatoire qui réduit sensiblement la durée de vie des bioprothèses par rapports aux solutions mécaniques. Ainsi, bien que plus performantes, les bioprothèses sont rarement implantées chez les sujets jeunes en raison de ce risque de vieillissement prématuré. L’objectif de cette étude est de tester le potentiel d'un traitement de surface sur les valves biologiques capable de diminuer cette réaction inflammatoire.

Bénéfices attendus

Les effets attendus sont une diminution de l'inflammation des tissus environnants lorsque les bioprothèses sont recouvertes avec le traitement de surface à l'étude avant implantation par rapport aux bioprothèses standard non traitées. L'évaluation pré-clinique du bénéfice apporté par le revetement proposé peut considérablèment accélérer le transfert de l'innovation chez l'homme (application aux bioprothèses cardiovasculaires qui sont utilisées en pratique clinique).

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure d'implantation des composants des bioprothèses (traitées avec le traitement de surface ou non) sous la peau du dos sous anesthésie générale et à deux séances d'imagerie dans les suites (TEPscanner, 7 jours et 28 jours après implantation, toujours sous anesthésie générale) pour visualiser et mesurer la réaction inflammatoire au niveau de la zone d'implantation. Ces procédures d'imagerie comportent une injection d'un traceur par voie intraveineuse. Les procédures de chirurgie dureront 20 minutes et les séances d'imagerie 40 minutes.

Impact sur les animaux

Concernant l'intervention chirurgicale, les effets indésirables potentiels après l'intervention comportent des douleurs au site d'implantation sur la peau du haut du dos, des démangeaisons et des troubles de la cicatrisation. Concernant les scanners, ces examens sont peu invasifs et ne comportent pas d'effets indésirables attendus.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés le lendemain de la dernière imagerie (soit J29) afin de prélever du sang et d'étudier les biomarqueurs de l'inflammation. Les composants des bioprothèses implantés 29 jours plus tot seront également prélevés pour etre analysés en microscopie.

Remplacement

Dans ce projet, il n'existe pas de moyens alternatifs à l'expérimentation animale. En effet, à ce jour il n'existe pas de méthode fiable permettant d'estimer de facon fiable l'efficacité du traitement de surface à l'étude. Toutefois, des manipulations préliminaires sur des cellules endothéliales aortiques humaines (expériences "in vitro") ont permis d'affiner le protocole du traitement de surface et d'utiliser le nombre minimal d'animaux.

Réduction

Afin de diminuer au maximum le nombre d'animaux, un calcul statistique a été réalisé en amont. De la meme facon, une mutualisation des résultats expérimentaux au sein de l’unité de recherche pourrait permettre l'exploitation des résultats par d'autres chercheurs et de limiter l'utilisation ultérieure d'animaux.

Raffinement

Le confort, la douleur et le stress des animaux seront scrupuleusement recherchés à l'aide de grille de surveillance journalière. Un recours à l’anesthésie générale sera systématique pour toutes les procédures et des soins spécifiques pourront etre conduits en fonction de l'examen (désinfectant, anti-douleurs). L'administration d'anti-douleurs sera réalisée en cas d'inconfort ou de douleurs et une euthanasie sera pratiquée dans les plus brefs délais en cas de non-amélioration. La surveillance de points limites (devant faire stopper l'expérimentation) sera systématique et faite quotidiennement. Les conditions d’hébergement seront également optimisées au maximum avec respect du rythme veille/sommeil. Afin de minimiser le stress post-chirurgie, des éléments d’enrichissement des cages comme des bâtons à ronger et du coton, ainsi que de la nourriture en gélée, seront placés. Enfin, nous priviliégerons des procédures d’imagerie non invasive (TEPscanner) pour visualiser l'inflammation des tissus.

Choix des espèces

Le modèle animal (souris) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet. Des souris adultes C57Bl6/J de 6 à 9 semaines d'âge seront utilisées. Bien qu'il n'existe pas d'impact de genre attendu, des sujets femelles seront utilisés pour une meilleure cohabitation. La reaction aux biomatériaux chez cette espèce reproduit de façon très fidèle les réponses observées chez l'homme (mammifère). Les tests précliniques sont communemment effectués dans cette espèce et sont abondamment documentés dans la littérature scientifique.

2 100 souris et 2 100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est implantée dans leur cerveau, un geste que le porteur décrit comme sévèrement douloureux, avec irradiation, traitements répétés et exsanguination terminale. L'établissement réalise une douzaine d'études par an selon les commandes de clients. Il affirme que les méthodes alternatives ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo, les retombées cliniques étant renvoyées aux essais ultérieurs.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de tumeur intracrâniennes (tumeur implantée dans le cerveau des animaux, = tumeur stéréotaxique), déjà mis en place dans nos laboratoires ou bien d’en développer de nouveaux (dans nos laboratoires) chez les rongeurs (rats ou souris) afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. L’évaluation des traitements potentiels chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de la pathologie humaine et d’arriver, avant les essais cliniques, à réaliser une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles précliniques de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques ou diagnostiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, représentant un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent la première évaluation de l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés. Au cours des expériences, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur ou mimer l’apparition de sites métastatiques dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance/échappement après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme des moyens de défense.

Procédures

- Identification des animaux (implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage), sous anesthésie - Transport vers le site ou est réalisé l’irradiation (durée totale moins de 30 minutes, les animaux restant dans leur cage de stabulation). - Irradiation - Greffe des cellules tumorale dans le cerveau, sous anesthésie et antalgie. - Traitements par voies intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée sous anesthésie, mais pouvant être réalisés sur animaux vigiles - Traitements par voies intradermique ou intramusculaire, sous anesthésie et analgésie - Traitements par voie orale, sur animaux vigiles sous contention. - Suivi des animaux (poids) - Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie) - Prélèvements de sang, sur animaux anesthésiés, par ponction dans : la veine jugulaire. - Prélèvements de sang, sur animaux vigiles sous contention, par piqure dans la veine saphène (possibilité de déposer de la poudre hémostatique pour limiter le saignement s’il se produit après le prélèvement). - Prélèvements de sang, sur animaux vigiles sous contention, par piqure dans la veine caudale (animal placé dans 1 boite thermorégulée à +37°C). - Prélèvement d’un grand volume de sang lors de l’euthanasie (« exsanguination terminale ») par ponction intracardiaque ou via l’aorte abdominale, sous anesthésie profonde, suivi d’une confirmation de la mort par une deuxième méthode physique - Mise à mort en fin de procédure (overdose d’anesthésique confirmée par une deuxième méthode physique, CO2 suivi d’une deuxième méthode physique - Prélèvements de tissus après euthanasie (post-mortem)

Impact sur les animaux

Une douleur sévère sera induite par la procédure de greffe, l’analgésie mise en place permettra de l’atténuer très significativement. Un stress sera ressenti par les animaux, pendant 1 ou 2 jours, lors de la randomisation et/ou le début des traitements. De même un stress léger sera ressenti lors de la réalisation des gestes techniques pour identification des animaux (tatouage par exemple), lors d’un transport de courte durée, ainsi que pour les traitements (par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale) et le suivi des animaux (mesures des poids et par imagerie). Une douleur légère sera également ressentie lors de la piqure pour traitement par voies intraveineuse et intrapéritonéale. Un stress et une douleur légère liée à la piqure seront ressentis par les animaux lors des prélèvements de sang (en cours d’étude). Une douleur forte sera ressentie dans le cas d’injections intramusculaires et intradermiques, celle-ci sera fortement atténuée par une analgésie adaptée. Les animaux pourront perdre du poids à la suite des traitements avec de nouveaux composés. Une douleur forte sera ressentie par l’animal lors de prélèvements de sang à l’euthanasie par ponction intracardiaque, elle sera fortement réduite par une analgésie adaptée.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux étant porteur de tumeur dans le cerveau et ayant fait l’objets de gestes techniques, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments En effet, les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D peuvent être utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la survie des animaux entre les différents groupes de l’étude seront comparées pour évaluer l’efficacité des composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 12 études seront réalisées chaque année, mais le nombre pourra varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 3 à 10 groupes [un groupe contrôle (= véhicule), un groupe recevant un médicament de référence, 1 à 8 groupes recevant des nouvelles molécules]. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 7 et 20. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser, si possible, des biomarqueurs (cytokine plasmatique par exemple) et des techniques faiblement invasives d’imagerie (IRM par exemple) chez le petit animal. Ces techniques permettent de suivre les biomarqueurs sur le même animal tout au long de l’étude, ceci réduisant la taille de la cohorte nécessaire pour la réalisation de l’expérience. Ces techniques peuvent également constituer un moyen d’atteindre les objectifs de l’étude avant l’apparition des signes cliniques, et donc limiter la souffrance des animaux.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées par des techniciens formés et qualifiés, selon des modes opératoires validés. La greffe des tumeurs sera réalisée sous anesthésie et analgésie pour atténuer fortement la douleur que ce geste technique engendre. Les animaux bénéficieront également de soins adaptés après la greffe. Les animaux ressentiront un stress léger lorsque ceux-ci seront attribués aux groupes de traitement, stress toutefois limité par l’enrichissement de leur environnement. Un stress léger sera également perçu lors des manipulations pour suivre le poids des animaux ou bien lors des séances d’imagerie (pour suivi de l’évolution de la tumeur). La fréquence des mesures de poids sera adaptée, elle pourra être quotidienne et ce afin de prodiguer des soins adaptés aux animaux dès que nécessaire et éviter toute souffrance. Les traitements avec des nouveaux produits à tester induiront un stress léger. C’est pourquoi, la plupart seront réalisés sous anesthésie. Si jamais des traitements engendre une douleur quelconque, les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée pour la supprimer. Des prélèvements de sang pourront être réalisés. Ils induiront un stress léger de l’animal. C’est pourquoi, ils seront réalisés sous anesthésie. Une douleur légère liée à la piqure sera également ressentie. La perte de poids des animaux sera suivie. Un animal montrant une perte de poids égale ou supérieure à 15% de son poids initial sera euthanasié. Toute intervention sur un animal qui pourrait engendrer une douleur sera réalisée avec une analgésie adaptée afin de l’atténuer fortement.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Enfin, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvements et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines minimum à la date d’induction tumorale). L’utilisation d’animaux adultes garantit la reproductibilité l’injection des cellules tumorales, c’est-à-dire que cette injection est toujours réalisée au niveau des coordonnées souhaités. Cela garantit également que la vitesse de croissance des tumeurs sera similaire d’une expérience à l’autre. L’utilisation d’animaux plus jeunes ne permet pas de garantir que l’injection des cellules est réalisée au niveau des coordonnées souhaitées (une injection au niveau de coordonnées non connues peut induire des effets neurologiques néfastes).

5 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur humaine leur est greffé pour développer des modèles dits PDX, avec traitements et prélèvements sanguins, y compris par ponction intracardiaque terminale. L'établissement, prestataire, développe ces modèles pour des partenaires afin de cribler des molécules. Le porteur affirme que les PDX sont les seuls à reconstituer la complexité des tumeurs humaines, une perte de poids déclenchant supplémentation ou arrêt du traitement.

Objectifs

En Europe, les cancers pédiatriques sont la 1ère cause de mortalité infantile non accidentelle. 20% des enfants et adolescents diagnostiqués meurent chaque année et bien que 80% survivent, les 2/3 d’entre eux souffrent au long terme d’effets secondaires associés à un traitement souvent inadapté. Le développement de thérapies efficaces en oncologie pédiatrique est aujourd'hui devenu un enjeu majeur. Ces dernières années, grâce à l’avancée des thérapies ciblées, une augmentation très importante de nouvelles molécules approuvées pour le traitement des cancers chez l’adulte a été enregistrée. Or, il existe encore peu d’options thérapeutiques accessibles aux enfants et adolescents atteints de cancers. Pour pallier à ce retard, ce projet a été mis en place pour permettre le développement de systèmes de criblages performants dans le but de tester de nouvelles molécules développées chez l'enfant et des molécules développées ou en cours de développement chez l'adulte qui pourraient aussi être efficaces chez l'enfant. Dans le cadre de ce projet, notre société est chargée de finaliser le développement de modèles de tumeurs humaines xénogreffées sur souris ou Patient Derived Xenografts (PDX) représentants au mieux l'hétérogénéité et la variété des cancers pédiatriques solides. Ces modèles seront utilisés pour réaliser des études précliniques avec un nombre d'animaux réduit afin d'identifier les meilleures thérapies potentielles dont pourraient bénéficier les enfants et les adolescents malades. Le développement de modèles PDX est indispensable car ces modèles sont les seuls permettant de reconstituer la complexité des tumeurs humaines et bien que l'environnement cellulaire qui entoure les greffons est constitué de tissus de souris, ce sont sans doute les modèles qui s'approchent le plus de la maladie humaine. Ces PDX sont donc, à l'heure actuelle, les outils les plus performants pour mimer les réponses observées chez les patients en clinique et établir une liste des meilleurs traitements potentiels pour lutter contre les cancers pédiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de développer les modèles nécessaires pour déterminer l’efficacité de nouvelles molécules développées chez l'enfant ou de molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte afin d’améliorer et d'identifer des thérapies efficaces pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Parmi un très grand nombre de molécules à tester, incluant de nouvelles molécules ou des molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte, et dont l’efficacité doit être démontrée chez l’enfant, les études précliniques avec un nombre d'animaux réduit sont une première étape vers l’identification des traitements les plus efficaces pour l’ensemble des cancers pédiatriques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une greffe correspondant à l'implantation d'un fragment de tissus tumoral. Avant la greffe, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale). La peau est incisée au niveau du dos de l'animal après désinfection préalable. La greffe est réalisée par l'implantation d'un fragment tumoral. Afin d'identifier avec précision le modèle implanté, les souris seront marquées au niveau des oreilles ou avec une puce insérée en sous cutané. L'incision est alors refermée par 2-3 agrafes préalablement aseptisées. La procédure a une durée globale de 30 minutes maximum par souris. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être et de leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. Selon les molécules, l’administration sera réalisée par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutané en fonction du schéma de traitement associé. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles des prélèvements de sangs pourront être effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale, dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques pourront être pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Certains modèles de PDX sont susceptibles d’induire une perte de poids chez la souris. L'administration de molécules est susceptible d’induire une perte de poids chez la souris. En cas d'une perte de poids supérieure à 15% du poids en début d'expérimentation pour les souris porteuses de modèles en développement ou une perte de poids supérieure à 10% pour les souris porteuses de modèles en traitement, une supplémentation sous forme de gel sera ajoutée dans la cage. Dans ce cas, la mesure du poids corporel est effectuée tous les jours jusqu'au retour à une perte de poids

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. La réutilisation ne peut pas être possible car les effets des procédures précédentes que les animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, traitement par des molécules) pourraient introduire une variabilité indésirable dans les résultats de toute étude ultérieure.

Remplacement

Ce projet a pour objectif de développer les modèles nécessaires pour déterminer l’efficacité de nouvelles molécules développées chez l'enfant ou de molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte afin d’améliorer et d’identifier des thérapies efficaces pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il n'existe pas de méthode alternative autre qu’in vivo dans le modèle murin permettant de valider les résultats avant un transfert chez l'homme.

Réduction

Le développement de PDX est standardisé et la parfaite connaissance de ce type de modèles permet de mettre en place une stratégie expérimentale n’utilisant que le nombre strictement nécessaire d’animaux. Nous estimons développer 100% des modèles transférés par les partenaires du projet. L'approche sélectionnée pour la réalisation d'études précliniques permet d'évaluer, sur un nombre réduit de souris, l'efficacité et la toxicité de molécules sur une large cohorte de modèles. Ce format d'étude permet de réduire le champ d’investigation en diminuant le nombre important de molécules à tester dans des études précliniques plus approfondies et donc de réduire le nombre global d'animaux utilisés. La taille des groupes des études précliniques sur un nombre d'animaux réduit se base également sur la valeur classiquement utilisée du taux d'inhibition présentant un intérêt qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tous en garantissant la puissance de l'expérimentation. A partir de nos données, nous avons pu déterminer les variables liées à la croissance tumorale de ce type de modèles et définir le nombre d’animaux minimum et nécessaire à l’observation significative d’un effet >58%.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour monitorer leur bien-être général et leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Pour chaque animal, tout signe clinique observé susceptible de causer une douleur, une souffrance ou une angoisse, sera immédiatement enregistré. En cas d’apparition de signes cliniques importants, l’observation pourra être portée à 4 fois par jour au lieu d'une. Lors de l’acte chirurgical, la greffe se fera sous anesthésie générale par une injection par voie intrapéritonéale. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage et/ou les traitements seront arrêtés jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. En cas de diarrhée causant une perte de poids, les dispositions associées à la perte de poids seront prises. L'ensemble de ces mesures permet d'anticiper et de réduire une éventuelle souffrance de l'animal.

Choix des espèces

L'objectif du projet est le développement de modèles nécessaires pour la détermination de l’efficacité de nouvelles thérapies pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il n'existe pas de méthode alternative autre qu’in vivo permettant de valider les résultats avant un transfert chez l'homme. Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques et qui ont été utilisées lors du pré-développement des modèles par les partenaire du projet. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, de plus de 18g, âgés entre 6 et 10 semaines pour augmenter nos chances de succès.

60 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des porcelets subissent une chirurgie de cerclage de l'artère pulmonaire pour créer une insuffisance cardiaque droite, avec IRM et prises de sang, puis une sternotomie terminale sans réveil. Le porteur indique des effets possibles comme hémorragie, troubles du rythme et troubles respiratoires. Il affirme que la culture cellulaire ne peut se substituer à l'animal, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au terme du projet.

Objectifs

L’hypertension pulmonaire, qu’elle soit idiopathique ou associée à des pathologies respiratoires, est caractérisée par une élévation de la pression artérielle pulmonaire au repos. Au niveau cardiaque, le ventricule droit (VD) tolère mal la surcharge de pression imposée par ces pathologies ce qui conduit rapidement à une détérioration de sa fonction contractile (insuffisance cardiaque droite) qui s’accompagne d’un risque accru d’arythmies. L’insuffisance cardiaque droite demeure la première cause de mortalité chez ces patients mais aucun traitement ciblant le VD malade n’est actuellement disponible. Malgré une forte progression de la prévalence de l’insuffisance cardiaque droite ces dernières années, les mécanismes à l’origine de la dysfonction de ce ventricule demeurent assez mal compris. Ce projet a pour objectif d’identifier les mécanismes impliqués dans la dysfonction électrique et contractile du VD en surcharge de pression chez le porc mâle afin d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Il n’existe aucun traitement curatif pour l’hypertension pulmonaire et la mortalité chez ces patients provient essentiellement d’une insuffisance cardiaque droite et d’arythmies. Le projet a pour objectif d’identifier des cibles moléculaires impliquées dans la dysfonction électrique et contractile du VD dans ce contexte. A terme, ce projet permettra la mise en place de traitement et une meilleure prise en charge des patients atteints d’hypertension pulmonaire.

Procédures

Les animaux subiront une opération chirurgicale permettant de mettre en place le modèle pathologique de la maladie cardiaque, cette opération est réalisée sur animal anesthésié, la durée de l'intervention sour anesthésie est de maximum 2 heures. L'animal est ensuite réveillé et des tests sont réalisés quelques semaines après afin de répondre à l'objectif du projet. Ces tests consistent en la réalisation d'une IRM cardiaque (examen d'imagerie non-invasif) et d'une prise de sang, ceci est réalisé sous anesthésie générale, durée inférieur à 3 heures. Toujours sous anesthésie générale ; sternotomie médiane, ouverture du péricarde, examen électrophysiologique épicardique : durée anesthésie

Impact sur les animaux

L’opération des animaux induira les effets indésirables identiques à une opération réalisée chez l’Homme, au niveau de l’anesthésie générale, celle-ci peut induire au réveil : hypothermie nausée, tremblements, apathie temporaire. Lors de l’opération (mini-thoracotomie latérale gauche pour tous les animaux et cerclage de l’artère pulmonaire uniquement pour les animaux CAP) les effets indésirables suivants : hémorragie, trouble du rythme cardiaque, hypothermie peuvent être constatés. Les nuisances induites au-delà de la période péri-opératoire peuvent être : une infection de la zone opératoire, et pour les animaux CAP, les effets indésirables liés à la pathologie peuvent être : troubles respiratoires, augmentation du rythme cardiaque, fatigue.

Devenir

La première étape du projet consiste à créer le modèle pathologique de dysfonction ventriculaire droite ainsi que les animaux contrôles appropriés. Leur devenir est de permettre l’étude du remodelage électrique et mécanique du ventricule droit dans ce contexte. Il est donc nécessaire pour cela que l’ensemble des animaux soient gardés en vie et soient soumis à la deuxième étape qui a pour objectif de réaliser des examens de suivi des animaux à différents temps. La deuxième étape, vise à caractériser l’état pathologique des animaux cerclés par rapport aux contrôles, mais également à permettre à posteriori de corréler les modifications hémodynamiques, contractiles, et structurelles aux modifications électrophysiologiques relevées in vivo puis ex vivo. Il est donc nécessaire d’euthanasier les animaux à la fin du projet pour permettre des expérimentations ex vivo/in vitro plus approfondies.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est la seule façon de répondre aux objectifs du projet car elle permet de reproduire de façon fiable la situation pathologique humaine dans sa globalité. La culture cellulaire ne peut se substituer à l’utilisation d’animaux dans le cadre de notre projet car les cardiomyocytes adultes se dédifférencient rapidement en culture entrainant une modification de leurs propriétés électrophysiologiques. D’autre part, les études menées in vivo et ex vivo permettent d’obtenir des informations spatiotemporelles liées à la structure 3D du myocarde pouvant influencer l’électrophysiologie et non accessibles sur des cultures cellulaires.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu (N=60 sur 3 ans) a été déterminé par calcul statistique afin d’évaluer le nombre minimal d’animaux nécessaire à la mise en évidence des effets de la pathologie de façon robuste. Pour répondre également à la réduction du nombre d’animaux, les expérimentations in vivo seront réalisées sur les mêmes animaux que ceux prévus pour les expérimentations ex vivo/in vitro. D’autre part, les expérimentations in vitro seront réalisées par plusieurs chercheurs à partir des mêmes cœurs pour limiter l’utilisation des animaux.

Raffinement

Les mesures de raffinement sont mises en place tout au long du projet. Dès leur prise en charge au laboratoire. Des observations biquotidiennes seront réalisées en post-opératoire pendant 4 à 10 jours. Ensuite, un suivi quotidien sera réalisé par des personnes formées, compétentes et soucieuses du bien-être animal, basées notamment sur l’apparence physique externe, le comportement (sociabilité, appétit) et les réponses comportementales aux stimuli externes (peu enclin aux manipulations, tentative de fuite). Ces contrôles permettent de repérer tout animal en souffrance, d’en avertir le responsable du projet et de prendre les mesures appropriées. Les animaux sont hébergés dans un environnement adapté pour réduire l’angoisse des animaux, dans des locaux adaptés, en groupes sociaux avec un enrichissement adapté à l’espèce : jouets (ballons, chaînes,…) changés régulièrement. La procédure expérimentale est réalisée par du personnel qualifié et expérimenté permettant un temps interventionnel réduit au maximum sous anesthésie générale avec une prise en charge adaptée de la douleur (analgésie). Tout constat d’un mal-être est remonté au responsable du projet et au vétérinaire délégué pour des examens approfondis et traitements adaptés. Si la douleur, la souffrance et l’angoisse ne pouvaient être réduites à leur minimum), une décision d’interruption d’expérimentation sera prise.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales, le Porc a des paramètres physiologiques cardiaques comparables à ceux de l’Homme. De plus, la fonction cardiaque de l’Homme et du porc sont très proches sur le plan hémodynamique et électrophysiologique (contrairement aux rongeurs). Enfin, la croissance rapide du porc permet la mise en place progressive de la surcharge de pression dans notre modèle, représentant un modèle de la pathologie humaine plus réaliste. En début de la procédure expérimentale, des porcelets de moins de un mois, de 10 kg en moyenne, seront inclus. La croissance rapide des cochons (poids attendu à 4 mois post-chirurgie de 65-85 kg) va permettre la mise en place progressive de la pathologie d’intérêt. Ces paramètres correspondent à ce qui se passe chez l'Homme, et donc cela permet de répondre à l'objectif du projet.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est inoculée, avec des injections de traitement deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut nécroser ou s'ulcérer, l'animal étant tué si elle dépasse 2 000 mm³. Il affirme que la validation de ces anticorps ne peut s'effectuer que chez l'animal vivant, l'entrée en essai clinique restant une perspective.

Objectifs

L’immunothérapie constitue un véritable espoir dans le traitement de nombreux cancers, notamment dans ceux sans prise en charge efficace actuellement. Ce traitement consiste principalement en l’administration d’anticorps monoclonaux dirigés contre les cellules tumorales ou leur microenvironnement afin de limiter la croissance tumorale. Plusieurs types d’anticorps monoclonaux peuvent être utilisés dans ce but, sous réserve que le patient présente bien la protéine ciblée au sein de sa tumeur. D’autres anticorps monoclonaux ont une action immunomodulatrice en levant le mécanisme d’inhibition du système immunitaire induit par la tumeur. Ces mécanismes sont communs à plusieurs cancers et ces traitements récents ont des indications dans déjà sept types de cancers : poumon, rein, vessie, tête et cou, mélanome , maladie de Hodgkin et maladie de Merkel et sont actuellement évalués dans de nombreux autres cancers. Bien que des réponses remarquables et prolongées aient pu être observées chez des patients atteints de cancers avancés métastatiques, un nombre important de patients (80 à 60% selon les cancers) restent réfractaires au traitement.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet permettra de compléter la caractérisation de notre produit par confirmation des marqueurs tumoraux identifiés et permettra de de débuter un essai clinique chez l’homme , dans des cancers ou le besoin médical est très important. Dans le cadre du lymphome cette étude permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de notre candidat médicament et ainsi d’offrir une vrai alternative thérapeutique aux patients atteints de lymphomes T périphériques et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie ou via injection en intra-péritonéale sur animal vigile. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal pour les traitements (2 fois par semaine pendant 4 semaines) sur animaux vigiles. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :< à 5 min par souris. Pour les injections en intrapéritonéale la manipulation des souris n'excédera pas 1 min.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 2000mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Les modèles de lymphomes T périphériques peuvent induire une splénomegalie, mais aucune autre altération majeure n’est attendue. L’état clinique et le poids des souris seront suivies 3 fois par semaine. Ces modèles sont également considérés comme des procédures modérées.Une contention légère sera fait sur les souris pour l'administration intrapéritonéale par du personnel qualifié afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Cette manipulation ainsi que la piqure ne durera que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères. La manipulation des souris pour mesurer la masse tumorale n’excédera pas 1 min. elle se fera 3 fois par semaine dont 2 fois en même temps que l’injection des traitements afin d’éviter les manipulations intempestives.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Du fait du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire, la validation d’un traitement par anticorps polyclonaux ne peut s’effectuer que dans un modèle in vivo. Il est nécessaire d’utiliser des animaux pour atteindre les objectifs du projet car cette étude a pour objet l'évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un ou plusieurs traitements en préclinique. Les animaux sont indispensables à cette étape d’évaluation thérapeutique du traitement car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité du (des) traitement(s), de caractériser le fonctionnement du (des) traitement(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est efficace.

Réduction

Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 -15 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Les tests statistiques utilisés reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ces tests nous permettent d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance tels que les animaux ayant un score clinique > à 7 sur deux jours consécutifs, l’animal se verra administrer en sous-cutané une injection de buprénorphine à 0.1mg/kg deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie de la tétracaïne.

Choix des espèces

La souris NMRI nude est très largement utilisée pour la mise en place de modèle xénogreffe. De plus elle présente une activité résiduelle du complément murin, ce qui la rend pertinente pour l’évaluer l’activité biologique de nos traitements à base de d’anticorps polyclonaux. Tous les modèles xénogreffe décrit dans ce projet ont été validé et caractérisé dans des publications. Adulte-8-10 semaines, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.

1 200 souris et 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée, avec jusqu'à deux chirurgies, radiothérapie, imagerie et prélèvements sanguins, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité, se nécroser ou métastaser jusqu'aux poumons. Il affirme que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain, les bénéfices étant renvoyés au long terme.

Objectifs

Les cancers du sein sont les cancers les plus fréquents chez la femme. Ils représentent une pathologie très hétérogène. Ainsi, deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des réponses aux traitements conventionnels très différentes. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet vise à évaluer les propriétés anti-tumorales de différentes approches thérapeutiques incluant notamment des candidats médicaments, la radiothérapie ou encore l'utilisation de dispositifs médicaux dans des modèles de tumeurs mammaires obtenues par greffe de cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du sein. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé ou le dispositif médical testé est actif dans un modèle expérimental de tumeurs mammaires ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

En fonction de l'étude, les animaux pourront subir au maximum 2 chirurgies de 5 à 15 min chacune, sous anesthésie générale, pour l'implantation d'un dispositif médical et l'exérèse chirurgicale de la tumeur mammaire. Ils seront également anesthésiés au moins une fois, généralement par anesthésie gazeuse, pour l'implantation des cellules tumorales. Ils pourront également être anesthésiés plusieurs autres fois au cours de l'étude pendant quelques minutes, généralement par anesthésie gazeuse, afin de procéder à des traitements comme la radiothérapie et/ou à des suivis par imagerie. Dans le cas de radiothérapie, les animaux seront traités généralement pendant 5 jours consécutifs. Les suivis par imagerie se feront eux généralement 1 fois tous les 7 à 15 jours pendant environ 2 mois. Les animaux pourront également subir plusieurs prélèvements de sang dans le respect des recommandations éthiques (volumes prélevés, fréquences et temps de récupération).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur mammaire peut entrainer un inconfort voire une réduction de la mobilité des animaux. Les tumeurs peuvent également développer une nécrose. Des métastases, en particulier au niveau des poumons, peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Par ailleurs, les effets potentiellement indésirables du/des produits testé(s) font l’objet d’échange avec nos promoteurs et les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort de l'ensemble des animaux à la fin de l'étude pour réaliser des prélèvements d'organes et/ou des observations macroscopiques.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les tumeurs mammaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6-10 animaux/groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • le suivi d’éventuel signes cliniques, • la détermination des points limites, • le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. • un protocole analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire ainsi qu'un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs mammaires obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale. Les animaux utilisés sont des animaux adultes âgés de 6 à 10 semaines au moment de l’implantation des cellules tumorales. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.

260 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections intramusculaires répétées de deux candidats myorelaxants, avec prélèvements sanguins, puis sont tués pour analyse du muscle. Le porteur n'attend aucun signe clinique et situe les nuisances dans le stress de contention et la douleur des injections. Il affirme que les modèles cellulaires sont débattus et ne reproduisent pas le système immunitaire, l'étude vérifiant l'absence de réaction immunitaire à ces molécules d'un développeur privé.

Objectifs

Après avoir démontré le bénéfice d’efficacité des produits (FTP-501 et FTP-101) face aux produits de référence utilisés en clinique lors de projets précédents, ce projet expérimental s’intéresse au potentiel immunogène de ces candidats. Cette étude a pour objectif de confirmer la non-présence d’Anticorps Anti-Drug (ADA) suite aux injections des différents composés. Ces molécules pourraient a priori provoquer une réaction immunitaire suite aux injections, diminuant ainsi l’efficacité du traitement et sa tolérance. Il est donc important de vérifier qu’une telle réaction est limitée ou inexistante.

Bénéfices attendus

Les troubles du mouvement sont des maladies neuromusculaires, qui handicapent durablement les patients et ont un impact sociétal important. La dystonie est un trouble qui se caractérise par des contractions musculaires involontaires, pouvant entrainer des mouvements répétitifs ou des postures figées. La spasticité musculaire, quant à elle, est considérée comme une sur-contraction inhabituelle et involontaire du ou des muscles. Ce trouble du système nerveux central résulte en une crispation et une rigidité accrue du muscle touché. Le traitement de ces maladies implique généralement la prescription de traitements administrés oralement : le baclofène, les benzodiazépines, le dantrolène… Ces traitements systémiques comportent tous des effets secondaires conséquents. Alternativement, l’injection intramusculaire de certains produits directement dans le muscle affecté peut soulager ces malades : le phénol ou la toxine botulique. Cette approche présente des avantages devant celles présentées précédemment, notamment concernant les effets secondaires. Cette approche doit encore être optimisée : les patients et soignants attendent des myorelaxants offrant encore moins d’effets secondaires, capables d’être efficaces rapidement après l’injection, et dont les effets seraient durables. L’objectif de notre projet est de mettre en évidence les effets bénéfiques de l’utilisation locale de différents produits myorelaxants novateurs à effet rapide et durable, sur la contraction musculaire pour les patients souffrant de troubles du mouvement comme la dystonie et la spasticité. Au cours d’une étude princeps, nous avons pu identifier au moins 5 produits présentant une activité myorelaxante d’intérêt ; ensuite, grâce aux différents projets déposés, nous avons avancé nos 2 premiers Lead (FTP-501 et FTP-101) quasiment au terme de leur développement préclinique. Chacun des produits identifiés au cours de l’étude princeps semble avoir des caractéristiques pharmacologiques différentes : certains induisent une myorelaxation très rapide (FTP-101), et d’autres offrent un effet durable par exemple (FTP-501). Or, selon la maladie neuromusculaire, le besoin clinique est différent, et donc chaque caractéristique est plus ou moins critique. Ce projet permettra de vérifier qu’aucune réaction immunitaire ne se manifeste suite aux injections et que les produits sont bien tolérés quelle que soit la dose injectée, et bien tolérés après des injections répétées.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - Injection intramusculaire = 3 injections, durée 30 secondes/injection/animal = 1 min 30 sec - Pesée des animaux = 7 pesées / animal => 30 secondes / pesée = 3 minutes 30 sec / animal - Prélèvements de sang = 7 maximum par animal, durée 2 minutes = 14 minutes / animal.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, aucun signe clinique ni effets secondaires n’est attendu ici suite à l’injection des composés, d’après nos résultats obtenus dans nos études précédentes et la littérature. En effet lors de nos précédents projets, aucun signe clinique de type infection ou inflammation suite à une seule injection n’a été observé. Nous n’attendons pas ici de réactions suite aux multiples injections. Dans le cadre de nos procédures, les nuisances attendus sont : le stress des animaux dû à la contention pour l’injection, une douleur liée aux injections i.m. et les multiples prélèvements de sang (6 maximum).

Devenir

Tous les animaux des différentes procédures seront euthanasiés. Un prélèvement pour analyse histologique du muscle injecté sera réalisé.

Remplacement

Le remplacement ne peut pas être assuré dans cette étape du programme de travail, car la pertinence des modèles cellulaires de coculture est aujourd’hui encore débattue, et de tels modèles ne prennent de toute façon pas en compte le paramètre de diffusion (qui est essentiel lorsqu’on s’intéresse au profil pharmacodynamique des composés). De plus, nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe (impossible à reproduire dans sa globalité in vitro) et nécessite des expérimentations in vivo.

Réduction

Pour la réduction, la taille des groupes nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement significatifs a été déterminé avec le logiciel G-Power. Nous utiliserons donc le nombre minimal d’animaux par groupe permettant d’arriver à une conclusion. Soit 10 animaux par groupe (5 mâles et 5 femelles). Cependant, si les résultats sont dépendants du sexe, les groupes d’analyse seront de 5 animaux. Cette taille de groupe nous permet néanmoins d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des cages en plastique transparent de 1800cm2 au sol et comportant une plateforme. Les cages seront ventilées individuellement, placés dans une pièce sous air conditionné, avec un cycle jour/nuit de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité. Ils seront maintenus en groupe de 2 ou 3 rats par cage. Ils disposeront de matériel de nidification (litière en chips de cellulose) puis d’enrichissement : les rats ont un tunnel rouge ainsi qu’un bâton de bois à ronger. Les animaux seont surveillés quotidiennement permettant un suivi clinique de chaque animal. Ainsi, des points limites sont mis en place durant tout ce projet permettant de définir des critères d’arrêt si nécessaire. Les prélèvements sanguins seront réalisés par un expérimentateur entraîné, et via une approche limitant le stress et la douleur, tout en ne dépassant pas les limites de volume prélevables chez un rat.

Choix des espèces

La comparaison de la rapidité d’action entre notre molécule et les traitements sur le marché ne pourra se faire que sur un modèle : i) exprimant les cibles moléculaires d’intérêt à la jonction neuromusculaire, et ii) dans lequel il existe une limite de diffusion dans les tissus. En effet, la cinétique des molécules après injection intra-musculaire est fortement dépendante de la capacité à diffuser dans le muscle, un tissu très compartimenté comportant plusieurs membranes interne. Nous recherchons ici des réactions immunitaires suite aux injections de nos composés. Le système immunitaire d’un hôte est extrêmement complexe et nécessite des expérimentations in vivo. De plus, nous avons choisi le rat d’une part, par continuité avec nos études précédentes et notre expérience sur ce modèle et d’autre part, car il s’agit d’un modèle de choix pour des études de toxicité de composé. Nous utiliserons des rats Sprague Dawley âgées de 6 semaines en début d’expérimentation (200g) et 18 semaines maximum en fin d’expérimentation (600g pour les mâles). Des jeunes adultes sont choisis ici pour le bon fonctionnement de leur système immunitaire.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On provoque une inflammation chez des femelles gestantes porteuses d'une mutation, pour observer les effets sur le développement nerveux des embryons, avec suivi par échographie. Le porteur indique que l'injection peut induire un développement anormal in utero et une mise bas prématurée. Il affirme qu'il est impossible de remplacer ce modèle muté, les retombées cliniques étant renvoyées à une meilleure compréhension des pathologies.

Objectifs

Lorsque des infections sont contractées durant la grossesse, il en résulte l’apparition de davantage de pathologies du neuro-développement (PND), autisme, paralysie cérébrale, schizophrénie etc. Ces pathologies sont dues en particulier à un développement anormal du système nerveux. De plus, les naissances prématurées qui peuvent s’y ajouter sont un facteur également aggravant. Il a récemment été montré que des anomalies de motricité apparaissent précocement, avant que les anomalies cognitives ne puissent être diagnostiquées. Des travaux récents ont mis en évidence des mutations dans certains gènes, qui jouent un rôle crucial dans le développement du système nerveux central, et qui sont impliqués dans de telles pathologies neuro-développementales. L’existence simultanée d’une inflammation placentaire accentuerait les conséquences de ces modifications génétiques. Lors d’infections au cours de la grossesse, une inflammation du placenta peut être décelée et impacter le développement des embryons. En cas de fragilités génétiques dues à des mutations chez certains embryons, le développement normal du système nerveux est perturbé, ce qui peut conduire à différentes pathologies neurodéveloppementales. Nous provoquerons une situation d’inflammation chez la souris gestante, et nous analyserons l’effet de mutations dans les embryons sur : (i) des marqueurs inflammatoires présents dans les fluides amniotiques des portées, (ii) le développement neuro-anatomique du système nerveux, (iii) de l’appareil neuro-moteur dont les masses musculaires, ainsi que (iv) le développement du placenta.

Bénéfices attendus

Le gène étudié permet la transmission de signaux de l’environnement en permettant notamment le développement embryonnaire du cerveau. Son étude dans des modèles de souris nous permettra d'obtenir une meilleure compréhension des signaux moléculaires et cellulaires et des facteurs multiples conduisant aux pathologies neuro- développementales dans le contexte inflammatoire de la grossesse. Elle devrait également conduire à une amelioration du pronostic des troubles précoces du développement neuro-moteur.

Procédures

Les souris seront accouplées pour déclencher une gestation. Les accouplements seront réalisés jusqu’à l’obtention de 6 souris gestantes par groupe. Les souris suivies subiront 4 examens d'imagerie non invasive pour le suivi des gestations sous anesthésie générale ne dépassant pas 20 minutes. Au cours de cette gestation, une réponse inflammatoire suite à une seule injection (durée maximale : 30 sec) sous-cutanée d’une molecule déclanchant l’inflammation sera générée pouvant entraîner des défauts de développement in utero.

Impact sur les animaux

Impact de l’agent inflammatoire sur l’état général des souris : une vigilance sera portée sur l’inflammation provoquée, même si des conséquences telles que l’hypothermie sont peu probables aux doses faibles utilisées ici (jusqu’à 40 fois moins que les doses rapportées). Il est attendu que les injections d’un composant bactérien, qui provoque de l’inflammation, induisent un développement anormal des embryons in utero et une possible mise bas prématurée.

Devenir

Mort pour utilisation des tissus : analyses anatomiques et dosages immunologiques.

Remplacement

Il est impossible de remplacer ce modèle murin porteur d’une mutation constitutionnelle pour le gène d’intérêt, mais des études en culture ont permis de montrer son rôle sur le développement de certaines structures du système nerveux. Par ailleurs, nous avons déjà identifié des toxines utilisables en culture cellulaire pour renforcer certains des résultats que nous aurons obtenus dans les souris.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe sera de 6 pour atteindre une robustesse statistique. L'échographie non invasive permettra de déterminer in utero l'apparition d'une létalité dans les portées et de préciser à quel stade elle apparaît, évitant une mise à mort séquentielle des femelles gestantes au cours de la gestation, comme cela est habituellement le cas pour les études de mortalité in utero. Ce suivi nous permettra également d’éviter d’engager une inflammation dans des femelles n’ayant pas ou trop peu de petits.

Raffinement

L'échographie non invasive permettra de caractériser in utero plusieurs paramètres fonctionnels (fréquence cardiaque, flux sanguin et résistance hémodynamique) en plus des informations anatomiques (rapport périmètre cranial / périmètre abdominal). A partir des expériences préliminaires, nous établirons rapidement le timing auquel l’injection sera réalisée (précoce ou tardive) pour n’effectuer dans un premier temps l’étude que sur le stade d’injection qui donne les résultats les plus évidents. Les échographies seront faites sous anesthesie, et nous avons établi une grille qui nous permet d’évaluer l’éventuelle détresse et souffrance des animaux et de les supprimer ou soulager et ainsi d’améliorer leur bien-être. Les conditions d’hébergement seront optimisées en évitant l’isolement des animaux et leur maintien en groups sociaux dans des cages enrichies de cylindres en carton.

Choix des espèces

Choix du modèle murin : le modèle de souris a été choisi car il permet d’étudier les conséquences durant le développement embryonnaire de l’absence d’expression d’une protéine. Modèle mammifère, adapté pour les études à visée clinique : études sur la reproduction/gestation, rôle du placenta. Reproduction rapide, fond génétique homogène, nombre important d’animaux dans une même portée, avec des génotypes différents, permettant une comparaison interne fiable. Nombre de publications ont récemment rapporté que les mutations murines introduites miment la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à pour les études anatomiques du système nerveux, la mise en place des motoneurones qui a lieu précocement et le développement des masses musculaires.

36 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie générale, on leur injecte des nanocapsules dans les disques intervertébraux, avec suivi par IRM pendant six mois, puis mise à mort pour analyse des disques. Le porteur indique une douleur modérée transitoire après l'injection et précise recourir à des animaux réformés destinés à l'abattoir. L'objectif est d'évaluer un traitement des lombalgies avant d'éventuelles études chez l'humain.

Objectifs

Les douleurs lombaires chroniques fréquemment rencontrées chez l’Homme concernent des sujets de tous âges. Le coût de leur prise en charge représente 240 milliards d’euros par an pour la totalité de l’UE. Toutefois, le tribu payé par l’individu malade reste le plus important : les lombalgies sont une cause majeure d’incapacité et de morbidité dans le monde. Le contributeur majeur de ces douleurs lombaires est la dégénérescence des disques intervertébraux (40%), appelée lombalgie discogénique. Le disque intervertébral (DIV) joue un rôle essentiel d’amortisseur dans la biomécanique de la colonne vertébrale. Il subit un processus dégénératif progressif inévitable au cours du temps (vieillissement), qui, lors de dégénérescence discale, est accéléré. Les DIV concernés sont alors plus rapidement altérés, avec pour conséquence une modification de la biomécanique vertébrale et une lombalgie discogénique. Aujourd’hui, aucune option thérapeutique disponible ne permet de ralentir l’évolution de cette maladie. Les traitement préconisés sont symptomatiques : physiothérapie, médicaments antidouleurs ou même chirurgie pour les patients les plus atteints. Les traitements chirurgicaux reposent sur l’exérèse totale du DIV incriminé : les procédures restent très invasives et s’accompagnent le plus souvent d’une convalescence longue et de risques de complications. A plus long terme, une instabilité vertébrale et une aggravation de l’atteinte des DIV adjacents sont souvent observées, aboutissant à des rechutes. L’amélioration des connaissances autour de la physiopathologie discale à l’origine des douleurs lombaires offre aujourd’hui de nouvelles opportunités de traitement. Il s’agit en particulier des approches de médecine régénératrice qui ont pour objectif de restaurer le tissu discal en modifiant la machinerie cellulaire à l’aide de miARN (petites molécules d’acide ribonucléique). C’est dans ce contexte que ce projet a pour objectif de démontrer l’innocuité et l’efficacité d’une injection intradiscale de nanocapsules lipidiques (LNC) renfermant des miARN chez des individus ovins (modèle animal spontané de dégénérescence discale), avant de pouvoir envisager des études cliniques chez l’Homme. L’efficacité thérapeutique sera évaluée contre placebo pour trois concentrations croissantes de miARN, pour un volume d’injection et une concentration en LNC constants : 36 animaux seront répartis en 4 groupes de 9 individus.

Bénéfices attendus

La dégénérescence discale (vieillissement prématuré des disques intervertébraux jouant le rôle d’amortisseurs entre les vertèbres) est responsable de 40% des lombalgies. Actuellement, il n’existe pas de solution thérapeutique permettant de stopper l’évolution de cette maladie ni de restaurer un disque intervertébral (DIV) fonctionnel. Les patients les plus atteints, pour lesquels la physiothérapie et l’administration d’antalgiques ne sont pas suffisantes, peuvent bénéficier d’une intervention chirurgicale au cours de laquelle le DIV incriminé est retiré. Les conséquences d’une telle chirurgie sur la biomécanique de la colonne vertébrale ne sont pas négligeables et les DIV adjacents sont alors d’autant plus sollicités, avec une aggravation de leur atteinte. Le projet que nous menons aspire à développer une nouvelle alternative thérapeutique qui pourrait être proposée aux patients atteints de lombalgie discogénique à des stades précoces, afin de restaurer un fonctionnement cellulaire permettant la synthèse de fibres de collagène et le maintien de l’hydratation du DIV, paramètres indispensables pour qu’il joue son rôle biomécanique. Il ne s’agirait plus de traiter les dégâts causés par la maladie (douleurs, hernie discale) mais de stopper son évolution voire de restaurer un DIV complètement fonctionnel. A court terme, cette expérimentation doit permettre d’évaluer l’innocuité de la procédure mini-invasive décrite (injection intradiscale sous contrôle radioscopique de nanocapsules lipidiques renfermant des molécules de miARN). A moyen terme, elle doit permettre d’évaluer l’efficacité d’une telle injection dans des DIV atteints de dégénérescence discale, et de choisir la dose de miRNA optimale véhiculée par les nanocapsules lipidiques. Et enfin, à long terme, elle doit permettre d’envisager plus rapidement la mise en place d’études cliniques chez l’Homme, l’obtention de résultats encourageants chez un modèle animal spontané représentant un tremplin non négligeable.

Procédures

Chacune des 36 brebis sera manipulée 4 fois pour des soins réalisés systématiquement sous anesthésie générale ou des examens/prélèvements post-mortem : - le premier jour (durée de l’anesthésie = 2h) : radiographies et IRM du rachis lombaire, injection intradiscale des nanocapsules lipidiques dans 3 disques intervertébraux (DIV) lombaires sélectionnés par randomisation. Les animaux sont répartis en 4 groupes de 9 animaux : un groupe placebo (nanocapsules lipidiques vides) et 3 groupes avec des nanocapsules lipidiques renfermant des miARN à trois concentrations différentes. - M1 et M3 (durée de l’anesthésie = 1h) : radiographies et IRM du rachis lombaire - M6 : euthanasie des animaux, radiographies et IRM du rachis lombaire (les DIV étant des tissus non vascularisés, leur aspect à l’IRM reste inchangé pendant plusieurs heures après la survenue de la mort), prélèvement de la totalité des DIV du rachis lombaire (nombre variant entre 6 et 7 selon les brebis) Par ailleurs, les animaux seront soumis à un examen clinique quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation, sur leur site d’hébergement (pas de déplacement prévu pour les animaux). L’examen clinique se fait dans un premier temps à distance (temps mis à profit pour que les animaux s’habituent à la présence humaine) puis de manière rapprochée et individuelle (quelques minutes par animal, sans douleur).

Impact sur les animaux

La procédure décrite ici ne fait appel à aucun geste particulièrement douloureux. L’injection intradiscale par voie transannulaire (injection au sein du noyau pulpeux, élément central du DIV, à travers l’anneau fibreux, élément périphérique du DIV) se fait de manière percutanée (procédure mini-invasive correspondant à un geste de radiologie interventionnelle) et sous anesthésie générale. Une douleur modérée transitoire peut être ressentie par les animaux dans les jours qui suivent l’injection. Le risque infectieux lié à l’injection intradiscale est très faible.

Devenir

L’euthanasie des brebis aura lieu au 6ème mois après le début de la procédure, c’est à dire à l’issue des 6 mois de suivi par imagerie médicale et à la fin de la procédure expérimentale. Cette euthanasie est indispensable afin de pouvoir réaliser les analyses histologiques et immunohistochimiques prévues sur l’ensemble des DIV des brebis concernées par l’expérimentation (216 à 252 DIV au total). Ces analyses permettront d’identifier les modifications résultant des injections intradiscales du nouveau médicament évalué par ce projet, tant au niveau cellulaire que moléculaire (informations non disponibles par imagerie médicale).

Remplacement

Ce projet correspondant à une étude préclinique d’évaluation de l’innocuité et de l’efficacité d’un nouveau médicament in vivo, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation de l’animal. Toutefois, nous avons choisi de faire appel à des animaux de production réformés destinés à l’abattoir (élevage laitier) plutôt qu’à des animaux élevés spécifiquement pour l’expérimentation animale. Toutes les étapes de développement des nanocapsules lipidiques renfermant des miARN ont été réalisées in vitro, sans utilisation de l’animal.

Réduction

A l’IRM, le degré d’atteinte d’un DIV atteint de dégénérescence discale est évalué par la détermination du score de Pfirrmann (valeur allant de I à V). Nous souhaitons pouvoir mettre en évidence, entre chacun des 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes avec une concentration croissante en miRNA), une différence de 1 point dans la valeur moyenne du score de Pfirrmann. Pour cela, après analyse statistique, chaque groupe doit être composé de 27 DIV. En injectant des nanocapsules lipidiques dans 3 DIV lombaires d’un même animal (sélection des DIV recevant une injection de nanocapsules lipidiques par randomisation), nous réduisons le nombre total d’individus utilisés : 9 animaux par groupe, soit 36 animaux au total (108 DIV recevant une injection intradiscale, analyse histologique de 216 à 252 DIV au total). De plus, la méthode de suivi choisie (par imagerie médicale et ne faisant appel qu’à une euthanasie terminale) limite également le nombre d’animaux utilisés (par comparaison avec des procédures où des animaux seraient euthanasiés à chaque temps de suivi). Tests statistiques : Nous avons prévu de comparer des moyennes entre chacun des 4 groupes.

Raffinement

Conditions d’hébergement : Les animaux sont stabulés en groupe dans des conditions similaires à leur hébergement en élevage. Ils ont accès librement au foin et à l’eau (ad libitum). L’alimentation est complétée par des granulés spécifiques (Terrena, France) et par des pierres à lécher (apport en minéraux). Les animaux bénéficient d’un suivi individuel quotidien pendant toute la durée de l’expérimentation : examen clinique et évaluation de la douleur/inconfort selon une grille adaptée à l’espèce ovine : intégration dans le troupeau, comportement à l’approche de l’opérateur, appétit et rumination, vigilance, posture (debout, couchée), port de tête à l’arrêt et en déplacement, aspect et posture au niveau du dos et des membres postérieurs, confort global (addition sur une grille de 1 à 10). Prévention de la douleur : De façon générale, la gestion de la douleur per- et post-opératoire suit les règles de l’analgésie multimodale associant l’administration de molécules antalgiques et le recours à l’anesthésie locorégionale. Un examen clinique sera fait quotidiennement par un vétérinaire pour déceler toute complication post-injection.

Choix des espèces

L’espèce ovine est un modèle spontané de dégénérescence discale. Les similitudes avec l’Homme concernent la physiopathologie de cette maladie, les anomalies détectées à l’IRM au niveau des disques intervertébraux (DIV) atteints et l’évolution clinique. Ainsi, la brebis est un modèle classiquement utilisé en médecine régénératrice du DIV. Par ailleurs, la taille des animaux facilite la réalisation des injections (taille relativement proche de celle de l’Homme) et leur hébergement en stabulation est aisé (contrairement aux porcs par exemple). Chez l’Homme comme chez la brebis, la sévérité de l’atteinte des disques intervertébraux lors de dégénérescence discale n’est pas corrélée à l’âge des individus. Nous avons choisi de travailler avec des animaux adultes âgés de 3 à 7 ans (animaux réformés destinés à l’abattoir du fait de problème de production de lait) afin de nous assurer que des lésions de dégénérescence discale seront identifiées à l’IRM chez chacune des 36 brebis de l’étude, sans que d’autres affections liées à l’âge n’interfèrent avec leur santé.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée à la patte, avec injections cinq jours sur sept pendant quatre semaines et suivi par imagerie, pour tester des molécules contre un cancer pédiatrique, le rhabdomyosarcome. Le porteur précise n'utiliser que des femelles, notamment pour limiter les bagarres entre mâles. Il affirme que le modèle animal est le seul à intégrer les facteurs physiologiques en jeu, les retombées cliniques étant renvoyées à un transfert ultérieur.

Objectifs

Dans les cancers pédiatriques, le rhabdomyosarcome (RMS) représente 5% des tumeurs pédiatriques solides. Ces tumeurs malignes d’origine musculaire se développent dans diverses localisations, principalement dans la tête et le cou (40%), la vessie et les organes reproducteurs (20%), les membres (20%) et le tronc (10%). La survie à cinq ans des patients est d'environ 75 %, alors qu'elle est inférieure à 30 % chez les patients dont la maladie s'est propagée à d'autres parties du corps (maladie métastatique). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. Une famille de nouvelles molécules ciblant la production d'énergie a été identifiée dont il faut démontrer qu’elles possèdent les caractéristiques de candidats médicaments anti-tumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale des RMS chez l’enfant et l’adolescent. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité anti-tumorale de ces molécules, c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume des tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (rhabdomyosarcomes) et de confirmer les résultats déjà obtenus en vue d’un transfert technologique vers la clinique.

Procédures

Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe au niveau de la patte avant l'anesthésie. Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée : 5 min maxi) et au niveau de la queue en intra-artérielle (Durée : 20 min maxi) ; 2x avant l’imagerie par l'échographie pour la préparation des animaux (Durée : 5 min maxi par point d’acquisition) ; 2x (lors du constat de la prise de greffe et en point final) pour l'imagerie par échographie (Durée : 10-20 min maxi par point d’acquisition) ; 13x max pour l'imagerie lumineuse (Durée : 8 min maxi par point d’acquisition soit 1x/semaine). Traitement : 5 jours/7 injection des molécules pendant 4 semaines maximum. Évaluation de l’efficacité des composés et prise de greffe par imagerie lumineuse sous anesthésie (1x/semaine) et par mesure au pied à coulisse de l’épaisseur des pattes (1x/semaine) pendant 91 jours maximum.

Impact sur les animaux

Implantation intra-musculaire (IM) : Avant l’implantation IM, l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. Puis, l’implantation IM sous anesthésie entraine une douleur légère. Le suivi de l'évolution du volume tumo va engendrer un stress léger lors de la mesure au pied à coulisse de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Implantation intra-veineuse ou intra-artérielle : L’implantation va entrainer une douleur légère. Développement des tumeurs/dissémination et imagerie : Le suivi dudéveloppement de tumeurs et/ou leur dissémination (métastases) peut engendrer une douleur modérée. Uniquement pour l’imagerie par bioluminescence, les animaux vont devoir recevoir en vigile une injection de luciférine en intra-péritonéale qui va engendrer une douleur légère. Traitements : Les animaux des procédures (3 et 4) reçoivent une injection en intra-péritonéale du traitement standard (Doxorubicine) ou des composés d’intérêt (MS-C2 et MS-C3) qui génèrent une douleur légère au début qui peut évoluer vers une douleur modérée suite à la répétition des injections (5J/7 des composés à tester ou 2J/7 le traitement standard) pendant les 4 semaines de traitement. Les effets secondaires pour le traitement standard et l’administration des composés d’intérêt sont connus et n’entrainent pas de douleur. La toxicité des molécules a été évaluée précédemment in vivo chez la souris et n’a pas montré de souffrance des animaux aux doses que nous allons utiliser. Les molécules MS-C2 et MS-C3 sont resuspendus dans du DMSO (= véhicule) et lors des traitements, seront injectées en présence d’un excipient lipidique (huile raffinée) dédiée et certifiée pour l’usage vétérinaire en injection. La concentration finale de DMSO dans l’excipient est ~1% et aucun signe particulier de souffrance ou d’irritation n’a été relevé chez les souris ayant reçu ce traitement lors des expériences réalisées selon le même protocole. Elles ont permis de déterminer la Dose Maximale Tolérée (DMT) utilisable pour un protocole de traitement incluant une injection intra-péritonéale 5J/7 pendant 4 semaines. Avec le traitement standard, nous allons observer une diminution de la taille des tumeurs donc une diminution potentielle de la douleur mais nous ne savons pas avec les composés d’intérêts.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Des études précédentes sur des cellules cancéreuses et sur des embryons de poulet ont montré qu'une nouvelle famille de molécules était efficace sur la tumeur et les métastases. Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d’intervenir dans les effets de la molécule testée. Aucune donnée bibliographique n’est disponible sur ces molécules à l'heure actuelle.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts et de déterminer les doses maximales tolérées. Dans le but de réduire le nombre d’animaux, deux lignées cellulaires humaines, qui émettent de la lumière seront utilisées afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir à le mettre à mort. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.

Raffinement

Deux lignées cellulaires humaines qui émettent de la lumière seront utilisées afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir recours à sa mise à mort dans un but de raffinement. Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dont le système immunitaire est altéré est nécessaire pour étudier l’efficacité du nouveau traitement sur des cellules de cancers pédiatriques humaines sans rejet de greffe par le système immunitaire. Les rhabdomyosarcomes sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquelles un sexe-ratio Mâle/Femelle légèrement supérieur à 1 a été rapporté, toutefois très variable selon les études, l’âge et la localisation des tumeurs primaires. Les premières expériences de greffes en intra-musculaire au niveau de la patte ont été menées avec des femelles et ont permis l’obtention de tumeurs dans 90% des cas. Uniquement des femelles sera utilisée afin d’être dans les mêmes conditions que le projet précédent et aussi de limiter le risque d’agressivité/bagarre inter-individu par rapport aux mâles dans les cages et être obligé d’écarter des individus ou les mettre à mort suite à des blessures. Les essais chez le mâle seront ultérieurement envisagés en fonction d’effets endocriniens potentiels car actuellement aucune information n'est disponible. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines pour une réalisation optimale de l’expérience. En effet à cet âge, d'après la littérature, la prise de greffe est plus fiable et donne des résultats clairs pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.

700 poulets vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont infectés par voie orale par le parasite Eimeria pour étudier le rôle d'un type de lymphocytes dans l'inflammation intestinale, puis tués pour prélèvement de tissus. Le porteur situe l'enjeu dans les pertes de production de l'aviculture et annonce un bénéfice uniquement scientifique. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour étudier cette infection, et la perte de poids attendue resterait en deçà du point limite.

Objectifs

L’amélioration des performances de croissance en production avicole s’est effectuée grâce à la sélection génétique et à une optimisation de l’alimentation, mais elle a été réalisée au détriment de la santé des animaux associée à une augmentation de l’incidence des maladies infectieuses. La coccidiose, causée par des parasites du genre Eimeria, représentent le premier fléau parasitaire de l’aviculture induisant des pertes de production ayant de graves conséquences économiques dues à de la mortalité mais surtout de la morbidité. L’infection par Eimeria conduit à une inflammation intestinale importante. Cependant, la nature des différents acteurs cellulaires et moléculaires ainsi que les mécanismes précis conduisant à cette inflammation nécessitent d’être mieux connus. Des travaux montrent l’importance de l’interleukine 17 (IL-17) sur l’inflammation et l’apparition de lésions. Dans ce contexte, et comme les lymphocytes T gamma delta sont des cellules majeures impliquées dans la production d’IL-17, nous avons pour objectif d’étudier le rôle fonctionnel de ces cellules dans la physiopathologie de l’infection par Eimeria. Nous testerons plusieurs espèces d’Eimeria indépendamment. Pour ce faire nous utiliserons au maximum 700 poulets au total.

Bénéfices attendus

Dans le cadre de ce projet, le bénéfice attendu est scientifique et nous permettra de mettre évidence le rôle plus ou moins important des lymphocytes T gamma delta sur la physiopathologie de l’infection par Eimeria lors d’une infection primaire.

Procédures

L’objectif de créer une infection expérimentale per os pour étudier le rôle des lymphocytes T gamma delta sur la physiopathologie de l'infection par E. tenella. L’inoculation est de courte durée (20s maximum) et est effectué par du personnel expérimenté. les animaux sont calmes.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à une administration orale du parasite Eimeria à des doses qui ne causent pas de morbidité importante et qui n’induisent pas des signes cliniques proches du point limite. Cependant, une perte de poids pourra être observée chez les animaux sans atteindre le point limite ni des signes cliniques sévères. Dans le cas peu probable que l’état des animaux exempts de lymphocytes T gamma delta infectés soit pire que les animaux contrôles wild type, l’observation des animaux (2 fois par jour) permettra de déterminer si ceux-ci atteignent le point limite (plumes ébouriffée, prostration, yeux mi-clos, refus d’alimentation …). Dans ce cas, les animaux seront euthanasiés avant la fin de l’expérimentation.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvements de tissus biologiques voués à l’étude scientifique.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternatives non animales pour l’étude de la physiopathologie de l’infection, la physiopathologie étant est la résultante, lors de l’infection par E tenella, de l’activation et de l’interaction de différents types cellulaires entre eux et directement ou indirectement avec le parasite ou ses antigènes au sein de la muqueuse intestinale conduisant à l’apparition de signes cliniques (exemple des lésions caecales). Par conséquent, l’étude du rôle des lymphocytes Tγδ dans la physiopathologie de l’infection par Eimeria ne peut être étudié in vitro et nécessite l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot est adapté aux buts de cette expérimentation. Les effectifs sont basés sur le nombre d’oocystes qui est le paramètre le plus variable de cette étude. Ainsi, pour avoir un log de différence d’excrétion d’oocystes entre 2 groupes avec une puissance de 90%, il faut 20 animaux ce qui correspond à 2 réplicats de 10 animaux par groupe. Les effectifs utilisés devraient aboutir à suffisamment d’animaux pour permettre de conclure sur le rôle des lymphocytes Tγδ dans la physiopathologie de l’infection par Eimeria.

Raffinement

Les poulets seront dans des conditions environnementales contrôlées, avec nourriture et boisson à volonté dans un milieu enrichi social et comportemental (petites plaques en inox suspendues ce qui permet aux animaux de piquer dedans). Une visite quotidienne est réalisée dans la salle expérimentale afin de surveiller l’état général des animaux et l’apparition d’éventuelle symptômes liés à la maladie. Même si les doses administrées sont déterminées de manière à éviter toute pathogénicité qui entraverait le développement cette étude, le point limite défini est l’observation d’un état de prostration tel que l’animal ne s’alimente plus. La décision est prise de le mettre à mort. Sur l’ensemble des protocoles de multiplication au cours des 3 dernières années, aucun animal inoculé n’a atteint le point limite nécessitant sa mise à mort.

Choix des espèces

Le poulet est l’espèce hôte chez laquelle se multiplient les parasites Eimeria tenella, acervulina et maxima. Les œufs étant éclos et le génotypage ayant lieu à J1-J3 d’âge, les expérimentations commencent dès la sortie de l’éclosoir. Les infections seront réalisées à 2 semaines d’âge et les prélèvements seront réalisés à 7 jours et 9 jours post infection (19-23 jours d'âge).