Procédures modérées

40 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré modéré. Trente-trois subissent une autogreffe de l'utérus puis une seconde opération sans réveil quatre jours plus tard, les sept autres servant de témoins avec la même chirurgie. Le porteur décrit les risques de cette chirurgie longue, hypothermie, douleurs et hémorragie interne, et un hébergement seul de quatre jours en post-opératoire. Le projet cherche des marqueurs sanguins de rejet du greffon utérin, le porteur qualifiant le modèle ovin de "meilleur modèle animal" et le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

Deux études préliminaires ont permis de démontrer la faisabilité, puis la maitrise de la greffe utérine chez la brebis. La mise en évidence de marqueurs sanguins reflétant un défaut de fonctionnalité de l’utérus, et en particulier un état inflammatoire important, permettrait de modifier les modalités de surveillance et de mettre en place une stratégie préventive et thérapeutique pendant la chirurgie et en post opératoire afin d’optimiser la réussite de la transplantation. A ce jour, la surveillance repose sur les biopsies répétées du col de l’utérus sources d’inconfort, d’hémorragie et d’infections. L’identification de marqueurs sanguins permettrait de remplacer cette méthode invasive. De plus, cette approche pourrait permettre de mettre en évidence des marqueurs ayant un intérêt similaire dans des situations de greffe d’autres organes. Nous nous proposons de comparer l'impact de deux solutés de préservation d’organe sur la survie du greffon à court terme dans un modèle d'auto-transplantation chez la brebis. Cet objectif sera évalué au travers de 4 paramètres: 1) Évaluation de l'expression de marqueurs de l'inflammation et d’absence de circulation sanguine dans la muqueuse de l’utérus à J4 de la transplantation, par l'analyse de l'expression de 90 gènes connus impliqués dans l'inflammation, 2) Comparaison de l'expression des protéines exprimées dans la muqueuse utérine à J4 de la transplantation entre les deux solutés testés 3) Par une approche immunologiques utilisant des anticorps, analyse de la localisation de protéines dans la muqueuse utérine du groupe contrôle et des deux groupes expérimentaux, 4) Évaluation de la corrélation entre les paramètres précédents, l'analyse histologique et l'état clinique du greffon en fonction du soluté de préservation d'organe utilisé.

Bénéfices attendus

Le succès des premières greffes utérines chez l'l’humain suggère une demande potentiellement croissante pour une telle intervention. On estime globalement que 4000 à 5000 femmes en France pourraient être candidates à une greffe utérine dans l'avenir. L'équipe de recherche collabore dans ce travail avec l'équipe de l'hôpital travaillant sur un essai pilote évaluant la faisabilité, l'efficacité et la sécurité de la greffe utérine à partir de donneurs vivants apparentés pour 10 patientes avec une malformation congénitale caractérisée par l’absence d’utérus et d’une partie du vagin (syndrome de Rokistanski). La première greffe utérine en France a été réalisée en Mars 2019 et a abouti à une naissance vivante par césarienne en février 2021. En transplantation utérine humaine, le diagnostic de rejet du greffon est réalisé sur des analyses de tissus à partir de prélèvements répétés du col de l’utérus qui contribuent à générer des microtraumatismes tissulaires. Identifier des marqueurs non invasifs indiquant la bonne circulation du sang et l’absence d’inflammation pendant et après transplantation de l'utérus permettrait de limiter les interventions traumatisantes et de mettre en place une stratégie thérapeutique pour assurer la réussite de la transplantation.

Procédures

33 brebis subiront une procédure chirurgicale d'autogreffe et seront réopérées sans réveil 4 jours plus tard. 7 brebis témoins subiront une procédure chirurgiale similaire mais sans greffe pour servir de témoins et seront réopérées sans réveil 4 jours plus tard.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont liés à une chirurgie longue : risques d'hypothermie, douleurs, difficultés à se lever et se déplacer, diminution du transit digestif et de l'appétit. Les effets indésirables comprennent aussi les risques inhérents à toute chirurgie abdominale : risque d’infection, risque de plaie digestive, risque de plaie vasculaire ou de rupture des sutures vasculaires avec hémorragie interne. En postopératoire, les brebis sont hébergées seules dans un box dédié et sous surveillance humaine. Cet hébergement, de 4 jours, est nécessaire pour le suivi d’ingestion alimentaire et le suivi de la reprise du transit digestif. Mais aussi pour éviter l’arrachage du cathéter et une blessure au niveau de la suture par une congénère.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés par injection de pentobarbital en IV sous anesthésie générale. L’utérus sera prélevé afin d'évaluer l'expression de marqueurs de l'inflammation et corréler ceux-ci aux analyses histologiques du greffon en fonction du soluté de préservation d'organe utilisé.

Remplacement

Ce projet vise à évaluer de manière non invasive des marqueurs inflammatoires et de mauvaise circulation sanguine lors d'une greffe utérine. L'utilisation d'un modèle animal est indispensable car il n'existe aucun modèle alternatif permettant de reproduire les réactions complexes d'inflammation suite à une greffe d’organe entier.

Réduction

Les chirurgies de greffe utérine sont réalisées en autotransplantation, ce qui évite de recourir à un animal donneur. Le nombre d'animaux nécessaire est donc divisé par deux.

Raffinement

Pour limiter le risque d’hypothermie, les brebis seront installées sur un tapis chauffant pendant toute la chirurgie. La température corporelle, la fréquence cardiaque et la saturation pulsée en oxygène (SpO2) de la brebis seront également monitorées durant la chirurgie. Un cathéter sera posé pour administrer en continu une solution physiologique pour maintenir une bonne hydratation de l’animal. Cette voie, permettra également l’injection régulière d’analgésiques pendant l’opération. Ce cathéter sera conservé pendant les 4 jours post opératoire pour éviter de piquer l'animal plusieurs fois lors de prélèvements sanguins ou de l'administration d'analgésiques. En début de post opératoire, la température corporelle de la brebis sera contrôlée et maintenue grâce à des lampes chauffantes. Durant les 4 jours de post opératoire, les brebis seront sous surveillance permanente. La gestion de la douleur sera suivie par scoring des mimiques faciales basé sur des critères décrits dans la littérature. Si le score de la douleur est supérieur à cinq, cela justifie la mise en place d’une analgésie adaptée Le suivi des constantes physiologiques sera réalisé plusieurs fois par jour (température corporelle, fréquences cardiaque et respiratoire, glycémie),. Une analyse sanguine quotidienne (hématologie, biochimie et gaz du sang) permettra d’adapter les traitements. Le confort des cages de post opératoire sera renforcé par l’ajout de tapis, qui permettent de maintenir l’animal dans un environnement sain et facilitent les premières levées de l’animal et ses déplacements. Après la première phase de post opératoire, deux cages seront jumelées afin de permettre à l’animal d’avoir plus d’espace d’exercice. De plus, des enrichissements lui seront proposés (brosse, ballon, râtelier à foin, ambiance musicale). Afin de favoriser la reprise de l’appétit de l’animal, une alimentation variée lui sera proposée régulièrement (eau, foin, granulés, herbe, salade) en fonction de ses goûts et sera contrôlée par des pesées systématiques des quantités distribuées et consommées. Si le niveau d'inconfort/de douleurs ainsi que l'altération de l'état général de l'animal est constaté malgré les traitements analgésiques, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L'avantage de la brebis dans la recherche sur la transplantation, comparativement aux autres espèces qui ont été testées, est que le bassin est plus large et que l'anatomie de la vascularisation ressemble aux vaisseaux pelviens humains. Le modèle ovin a été défini dans la littérature internationale comme le meilleur modèle animal pour la recherche sur la greffe utérine. Utilisation d'adultes à maturité sexuelle, ayant mis bas deux fois. Ce modèle permet d'avoir un utérus qui a deja fait preuve de sa fonctionnalité et des vaisseaux de calibre optimal, car une brebis ayant eu plus de deux gestations ) pourrait présenter des veines de trop gros calibres (varices).

1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie, une privation alimentaire contrôlée avec isolement, et un conditionnement par trois chocs électriques d'une seconde. Elles sont tuées entre cinq et quatre-vingt-dix minutes après ce conditionnement pour des analyses du cerveau. Le projet cherche à distinguer le vieillissement normal de la mémoire de la maladie d'Alzheimer, en comparant des souris jeunes et des souris de vingt à vingt-deux mois.

Objectifs

La réalisation du présent projet intervient dans le cadre d’un besoin sociétal croissant concernant la prise en charge des individus vieillissants. En effet, le vieillissement de la population de nos sociétés occidentales est en train de devenir un problème de santé publique. Le nombre de personnes atteintes de formes pathologiques de vieillissement, comme la Maladie d’Alzheimer, est en croissance constante et se traduit par une augmentation parallèle des dépenses de santé. Cependant, un des problèmes majeur des études s’intéressant au vieillissement est qu’une grande majorité de ces dernières s’attachent à étudier les mécanismes altérés dans des cas pathologiques, dont le plus répandu est la Maladie d’Alzheimer. De ce fait, de nombreux aspects du vieillissement normal (qui semblent plus subtils) et les altérations qui en découlent restent méconnues et/ou peu caractérisées, ce qui pose le problème de la distinction entre les modifications dues à la senescence ou à la pathologie. Ainsi, il convient de distinguer les altérations de la mémoire relevant du vieillissement normal de celles relevant du vieillissement pathologique afin de développer des approches thérapeutiques plus adaptées en fonction du type de vieillissement. L'objectif de ce projet est d’améliorer la caractérisation des déficits de mémorisation liés au vieillissement normal, afin de le distinguer plus clairement de la maladie d’Alzheimer, forme de vieillissement pathologique la plus répandue.

Bénéfices attendus

L'objectif de ce projet est d’améliorer la caractérisation des déficits de mémorisation liés vieillissement normal, afin de le distinguer plus clairement du vieillissement pathologique. Cette distinction plus fine permettrait de développer des approches thérapeutiques plus adaptées en fonction du type de vieillissement considéré.

Procédures

Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui dure environ 45 min. Les animaux sont soumis à une procédure comportementale (1 seule fois) où il recevront 3 chocs électriques (0.3 mA, de 1 seconde).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables chez les animaux sont liés à : - une chirurgie - une privation alimentaire - un isolement pour contrôler de manière fine la quantité de nourriture de chaque animal - un très court effet nociceptif dû à la procédure de conditionnement. Néanmoins, afin de réaliser nos études neurobiologiques, les animaux sont mis à mort rapidement (90 min ou 5 min) à la suite de ce conditionnement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation d’analyses.

Remplacement

L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine. 3) Le modèle comportemental a été établi chez la souris et l’ensemble des appareils comportementaux que nous utiliserons sont dimensionnés pour cette espèce.

Réduction

Concernant la réduction, l’effectif se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suites aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux. Nous avons aussi effectué au préalable des analyses ex vivo afin d’améliorer au mieux la sensibilité de chaque technique immunohistochimique.

Raffinement

Pour les procédures avec restriction alimentaire, les animaux sont isolés une semaine avant le début de la restriction, afin de contrôler le rationnement alimentaire de chaque animal. Ces animaux sont surveillés et pesés quotidiennement à partir du moment où les animaux sont en restriction alimentaire et la quantité quotidienne de nourriture sera adaptée en fonction de leur poids. Leur perte de poids (95 à 88 % de leur poids de base) est ainsi progressive et contrôlée. Si la perte de poids dépasse les 12%, alors on augmente la ration alimentaire. Si l’animal continue à perdre du poids, alors on rajoute de la nourriture en poudre. Si malgré ces mesures conservatoires, l’animal ne reprend pas son poids initial, ceci est considéré comme un point limite et l’animal est sacrifié. Lors de l’isolement, un tube en carton est rajouté dans la cage pour augmenter l’enrichissement. De plus, on vérifie tous les jours que les cages avec des animaux seuls sont collées les unes aux autres pour augmenter les interactions olfactives et visuelles. Outre le poids, d’autres indices seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures et des points limites précis et adaptés ont été définis. En cas de présence d’individus agressifs avec leurs congénères, l’individu agressif est isolé. Les animaux présentant des lésions cutanées reçoivent une pulvérisation d’un spray antiseptique sur la zone concernée, ainsi qu’une injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien pour atténuer la douleur. Au cours des procédures expérimentales, si un des points limites est atteint, l’animal reçoit une injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien pour atténuer la douleur. Si nous n’observons pas d’amélioration, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. En cas d’absence d’amélioration après traitement, il sera mis à mort par dislocation cervicale. Si après 24h l’état de l’animal s’est amélioré, avec une reprise de poids, celui-ci est conservé dans l’étude.

Choix des espèces

La souris: -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris: pour une comparaison des résultats, l’étude des mécanismes neurobiologiques responsables du passage d’une mémoire normale à une mémoire traumatique implique l’utilisation de cette espèce -permet des approches invasives (approches pharmacologiques etc.) permettant d’étudier l’effet de molécules sur le système nerveux central et les phénomènes de mémorisation via l’étude comportementale -offre la possibilité d’être manipulée génétiquement par injection de virus ce qui permettra l’analyse des modifications neuromorphologiques. Tous les animaux utilisés seront adultes. Cependant, il y aura deux conditions d’âge. Il y aura tout d’abord des animaux jeunes adultes (âgés de 3 à 4 mois) qui serviront de groupe contrôle pendant le test, les animaux jeunes ne devant pas présenter de déficit de mémorisation. Ensuite, il y aura des animaux âgés (20 à 22 mois) qui, selon les données antérieures, présentent un déficit de mémorisation dans la tâche comportementale utilisée.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de tamoxifène pendant cinq à quinze jours, dont le porteur reconnaît le risque de perforation de l'œsophage ou de passage dans les poumons, subissent un test d'effort sur tapis roulant une heure par jour et un séjour de sept jours en cage métabolique isolée. À la fin, les 650 sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet étudie le rôle de deux facteurs de transcription dans la croissance musculaire, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne peut reproduire ce processus.

Objectifs

Le muscle squelettique est un tissu hautement spécialisé capable de se régénérer et de s’adapter à son environnement. La mécanotransduction se définit par la façon dont la cellule intègre le signal mécanique et le transforme en signal biochimique lui permettant de réagir, de s’adapter et même de modifier l’expression de ses gènes. Nous nous intéressons à 2 facteurs de transcription qui ont récemment été identifiés pour jouer un rôle clef dans la mécanotransduction dans divers tissus dont le muscle squelettique. De récentes données, montrent que ces 2 facteurs sont importants pour maintenir le bon fonctionnement du muscle squelettique adulte et la taille des organes car leur dérégulation peut conduire à un phénotype musculaire retrouvées dans différentes pathologies musculaires telles que les dystrophies musculaires. Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels spécifiquement dans le muscle.

Bénéfices attendus

A terme ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à des désordres de croissance, de régénération et de respiration mitochondriale dans le muscle. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans d’autres pathologies musculaires et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Des souris seront soumises à des injections par gavage quotidiennement durant 5-15 jours pour induire l'inactivation de gènes spécifiques et seront ensuite mises à mort pour examen des tissus. Des souris seront soumises à un test d'effort musculaire à l'aide d'un tapis de course informatisé pendant 1H sur une période de 5 jours consécutifs pour évaluer les fonctions métaboliques dans le tissu musculaire. Des souris seront placées en cage métaboliques pendant 7 jours.

Impact sur les animaux

Certaines souris pourraient dévéloppées des problèmes de locomotion. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’oesophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. La mise en cages métaboliques des animaux pendant 7 jours peut générer un stress lié à l’isolement.

Devenir

A l'issue des Procédures, l'ensemble des 650 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

La croissance et régénération musculaire est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle cellulaire ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations hormonales. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes concernés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.

Réduction

L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. De plus, l’expérience du laboratoire montre qu’un groupe de 50 animaux est suffisant pour le test statistique choisi. Des groupes de 50 animaux seront donc utilisés. De plus, nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour avoir une puissance statistique (n= 650).

Raffinement

Le raffinement des conditions d’hébergement, d’élevage et de soins sera respecté par l’emploi de points limites précoces entraînant la mise à mort des animaux. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton et de « maisons » en carton. Les animaux sont observés tous les jours par le personnel qualifié pour assurer leur bien-être. Pendant les procédures, les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites tous les jours. Par ailleurs, toute procédure douloureuse ressentie par les souris entrainant une douleur, une souffrance ou une angoisse entrainera la mise à mort de l'animal. Le traitement au tamoxifen est donné sous forme de gavage quotidien qui sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des gavages sera réduit au minimum possible. Selon les seuils atteints, l’interruption de la procédure et la mise à mort anticipée de l’animal sera possible.

Choix des espèces

Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes de la signalisation hippo jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons également de nombreux outils (anticorps, vecteurs, méthodes) adaptés à la souris ; 4) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. L’âge des animaux choisis pour l’induction au tamoxifen sera de 1 à 3 mois. Il est nécessaire que l’organogenèse soit terminée. L’âge de mise à mort sera choisi en fonction de l’âge de la survenue du phénotype musculaire attendus vers 1,5-4 mois.

360 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans le cadre de travaux pratiques d'un cursus universitaire. Elles reçoivent deux à quatre injections intrapéritonéales et servent à des tests comportementaux, dont une échelle des grimaces, en étant manipulées par des étudiants que le porteur décrit lui-même comme non formés. À la différence de la plupart des projets, elles sont proposées à l'adoption à l'issue plutôt que tuées. Le porteur reconnaît qu'un remplacement total n'est pas possible pour l'apprentissage des gestes sur animal vivant mais prévoit des vidéos en complément.

Objectifs

Au cours de cette formation, les étudiants doivent ainsi être sensibilisés à l'expérimentation animale voire plus. En effet comme mentionné dans le programme national de cette formation, "les étudiants pourront être accompagnés, au cours de leur formation, dans la préparation de tout ou partie du certificat d'expérimentation animale, niveau applicateur." Ce projet comptabilisant 3 expérimentations différentes permettra aux étudiants, en complément des autres enseignements théoriques et pratiques, d'aborder plusieurs notions liées à l'expérimentation animale à savoir la réglementation, l'éthique, le bien-être, les gestes expérimentaux basiques avec des rongeurs de laboratoire (contention, injection, etc). Plus spécifiquement, au travers de ces 3 expérimentations, les étudiants : i) appréhenderont ce qu'est le métier de technicien animalier par le suivi et le soin aux animaux, ii) apprendront à manipuler et à réaliser des injections aux souris et iii) à étudier les comportements des souris en activité normale mais aussi dans le cadre d'une étude de l'effet de substances actives pharmacologiquement aux moyens de tests comportementaux, d'échelle des grimaces, etc.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra aux étudiants d'acquérir la compétence " Mener des études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé" exigées dans le cadre de cette formation. L'acquisition de cette compétence nécessite pour l'étudiant de maitriser un certain nombre d'apprentissages critiques (AC) qui sont, pour cette compétence, : i) Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques. Cet AC sera abordé via les expérimentations n°2 et 3 ; ii) Acquérir les gestes expérimentaux basiques sur l'animal de laboratoire. Cet AC sera abordé via les 3 expérimentations de ce projet. Le contenu de ce projet répond ainsi à ces apprentissages critiques et entre donc dans le processus d'acquisition de cette compétence en complément des autres enseignements théoriques et pratiques de la Ressource "Physiologie et Expérimentation animale" et de la SAé associée. Pour résumé, au travers des enseignements théoriques et pratiques (entre autres par ce projet), les étudiants auront ainsi une vision d'ensemble sur ce qu'implique l'expérimentation animale (réglementation en vigueur, éthique, bien-être, gestes de base, dispositif expérimental, pharmacologie...).

Procédures

Les animaux utilisés dans cette procédure ne seront pas soumis à ce type d'interventions. Ces animaux seront soumis uniquement à 2 (voire 4 injections pour les souris participant 2 fois à la expérimentation n°3) en intrapéritonéale.

Impact sur les animaux

Durant ce projet, les animaux seront confrontés à différentes nuisances : 1) le maniement par des personnes non formées et inconnues (ce dernier point sera amoindri au cours du temps car les souris seront toujours suivis par les mêmes étudiants. Nous essaierons également en TP qu'ils aient les mêmes souris que pendant le suivi; 2) l'utilisation dans 3 expérimentations différentes mais cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés 3) injections de substances thérapeutiques à dose active mais ces substances ont une durée de vie courte dans l'organisme donc les effets s'estomptent quelques heures après l'injection.

Devenir

Pour le bien-être animal, l'adoption est à privilégier dans notre cas, d'autant plus que les étudiants les ayant suivies 3 semaines y sont attachés. Il est à noter que lors des adoptions, un sachet de granulés ainsi qu'un peu de litière de leur cage d'origine sont donnés aux adoptants pour l'acclimatation de l'animal dans son nouvel environnement et des recommandations telles que l'introduction progressive de la nouvelle alimentation sont données. Pour finir, les étudiants comme les associations permettant la réhabilitation des animaux de laboratoire, reçoivent le certificat sanitaire de notre vétérinaire référent et l'autorisation triennale de la DDPP.

Remplacement

Il est difficile d'acquérir des compétences en expérimentation animale sans l'utilisation de l'animal in vivo c'est pourquoi un remplacement total n'est pas possible mais un remplacement partiel l'est. En complément de ces expérimentations in vivo et dans un objectif de remplacement, des vidéos seront mises à disposition des étudiants pour qu'ils puissent en plus des enseignements théoriques et pratiques, préparer au mieux leurs interventions / expérimentations avec les animaux.

Réduction

Le nombre de souris utilisé est réduit au minimum. Chaque année, 72 souris seront utilisées et seront subdivisées en 2*36 souris réparties dans 8 cages (voire 9 cages selon la corpulence des souris "vieilles") : 36 souris jeunes versus 36 souris 'vieilles'. D'autre part, nous avons choisi de faire travailler les étudiants par groupe de 3 ou 4 étudiants réduisant ainsi le nombre de groupe d'étudiants à 4 par TP. Ces 8 cages seront ainsi suivis par 12 groupes d'étudiants différents impliquant que 4 cages seront suivies par 2 groupes en TP différents. D'autre part, ces 72 souris serviront à 3 expérimentations. Les résultats des différents groupes de TP seront poolés et exploités lors de TPs de statistique. Ceci permettra de comparer les groupes de souris "jeunes" versus "vieilles". Ils pourront ainsi voir la variabilité des données selon le nombre d'animaux par lot utilisé.

Raffinement

Durant tout leur séjour au sein de notre établissement, les souris auront à disposition et sans restriction de la nourriture et de l'eau. Elles seront également visités tous les jours soit par la personne habilité pour cela au sein de l'établissement soit par les étudiants dans le cadre de l'expérimentation n°1. Selon l'âge et la corpulence des souris "vieilles", elles pourront être répartie non pas dans 4 cages mais dans 5 cages (4 cages de 7 souris + 1 cage de 8 souris). Au cours de ces visites, les animaux seront observés pour détecter tout comportement de souffrance, d'anxiété, etc... De plus, notre établissement a acquis des objets d'enrichissement tels que des tubes/ tunnel, ruban de carton. De la même façon les étudiants au cours de leur suivi pourront eux mêmes apporter des objets d'enrichissement.

Choix des espèces

La souris a été choisie comme modèle d'étude pour ce projet pour plusieurs raisons : 1- c'est l'un des modèles les plus utilisés en recherches bio-médicales et pharmacologiques (75%) 2- c'est un modèle (globalement) représentatif de la physiologie humaine (proximité phylogénétique entre les espèces). 3- leur comportement face à la manipulation, aux injections de molécules est bien documenté et des dispositifs expérimentaux sont disponibles pour le mesurer. 4- c'est une espèce facile à maintenir en captivité Les animaux utilisés auront au moins 2 mois. Il s'agira donc d'adultes car ils possèdent, théoriquement à ce stade, toutes les capacités exploratrices, psychiques et locomotrices. Cependant comme évoqué précédemment, nous aurons 2 groupes d'âge : souris "jeunes" environ 2 mois et souris "vieilles" d'au moins 4 mois et ayant eu déjà au moins 1 gestation (souris de réforme). Ce choix permettra aux étudiants d'observer le comportement de souris d'âge et de vécu différents.

612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées dans leur poumon par chirurgie, puis elles reçoivent des agents d'imagerie radioactifs et subissent jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie ainsi que des prélèvements sanguins et des traitements anticancéreux. À la fin, toutes sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet cherche à valider par imagerie TEP cinq biomarqueurs prédictifs de l'efficacité de thérapies, le porteur renvoyant le bénéfice pour les patients au transfert clinique ultérieur.

Objectifs

Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) représentent environ 75 à 80 % des cancers bronchiques. Des progrès significatifs dans la compréhension des dérèglements moléculaires sous-jacents aux CBNPC ont ouvert de nouvelles opportunités de thérapies ciblées et plus personnalisées. Celles-ci nécessitent d’utiliser des indicateurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique, quantifiables au cours du temps, ce que l’on appelle des biomarqueurs (ce peut être un gène, une protéine, un mécanisme cellulaire…). Ces biomarqueurs prédictifs permettront de cibler au mieux le choix thérapeutique en fonction des patients et de leur pathologie. L’une des méthodes employées pour évaluer un biomarqueur d’une tumeur consiste à effectuer des prélèvements de tissus tumoraux (biopsie) et/ou sanguins et à y quantifier le biomarqueur. La méthode est invasive et complique la prise en charge du patient. De plus, les prélèvements effectués ne sont pas nécessairement représentatifs ni de l’intégralité du volume tumoral, ni de l’évolution au cours du temps de la tumeur. L’imagerie moléculaire, notamment l’imagerie hautement quantitative par tomographie par émissions de positon (TEP) permet une visualisation corps entier, au cours du temps de ces biomarqueurs d’intérêt. L’objectif du projet est d’évaluer par imagerie TEP couplée avec l’imagerie IRM ou optique cinq nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité de thérapies ciblées antitumorales, particulièrement les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (tels que des immunothérapies associés à des chimiothérapies et/ou à de la radiothérapie interne ou externe). Cette évaluation se fera en utilisant des modèles de cancers pulmonaires chez la souris. Les biomarqueurs évalués seront soit tumoraux soit liés au système immunitaire qui joue un rôle clé dans l’efficacité de ces thérapies ciblées. L’évaluation de ces nouveaux biomarqueurs en y associant des ligands spécifiques aux biomarqueurs d’intérêt en imagerie TEP permettra d’apporter des preuves suffisantes de l’importance de ce couple biomarqueur et imagerie TEP pour un transfert chez l’humain. Les résultats de ce projet devraient permettre de valider cette approche pour ensuite transférer au niveau clinique la méthodologie.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider de nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique d’un traitement donné, essentiels pour améliorer la prise en charge des patients. Malgré des résultats prometteurs des différents axes thérapeutiques, que ce soit l’immunothérapie, la radiothérapie et les thérapies ciblées (i.e. ciblant spécifiquement certaines protéines, afin de bloquer des mécanismes tumoraux), seulement une partie de la population bénéficie de l’efficacité de ces thérapies : de multiples facteurs liés à la tumeur elle-même (son sous-type) et au patient (le stade de sa maladie, son système immunitaire, des facteurs génétiques…) font que le pronostic d’efficacité ne sera pas le même pour deux patients. Pour soigner le plus grand nombre, il faudrait pouvoir répartir les patients en sous-groupes homogènes pour lesquels on pourrait prédire quelle thérapie est la plus adaptée. Cette meilleure stratification des patients est largement facilitée par l’utilisation de biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique. Actuellement, la quantification des biomarqueurs prédictifs repose principalement sur des techniques invasives et locales, telles que l’immunohistochimie sur des biopsies de patient. L’imagerie TEP est une technique corps entier, très faiblement invasive, dynamique et hautement quantitative. L’objectif du projet est de valider ainsi des couples biomarqueurs et radioligands à base d’anticorps ou de peptides pour de l’imagerie TEP afin de prédire l’efficacité thérapeutique, offrant ainsi un outil décisionnel complémentaire aux biopsies à l’oncologue pour mieux personnaliser le traitement.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : La mise en place du modèle tumoral (30 minutes d’intervention, une seule injection par animaux) : des cellules tumorales seront injectées dans le poumon pour la formation de tumeurs dans l’environnement primaire de la lignée cellulaire. L’injection d’agents d’imagerie radioactifs (imagerie par tomographie par émission de positon), fluorescents (imagerie optique) et/ou IRM pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre d’injection total par souris : maximum 3). Une anesthésie lors des différentes sessions imageries (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 8 sessions d’imagerie à des dates différentes pour un suivi dynamique du traceur dans le cas de l’imagerie par tomographie). Un prélèvement sanguin sur animaux sous anesthésie (maximum 5 minutes, 2 fois maximum par session d’imagerie à des jours différents).

Impact sur les animaux

La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur. Un suivi régulier des animaux sera réalisé. Les effets indésirables prévus sur les animaux : • L’injection des radioligands en intra veineux peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse (isoflurane 1,5% à 2,5%). Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. • Le geste chirurgical induira une douleur au niveau du thorax. L’acte chirurgical durera 20min. Les traitements (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie et thérapie ciblée) peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de dose thérapeutique décrite et validée dans la littérature.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Ceci permettra de prélever les organes afin de pouvoir effectuer les analyses ex-vivo sur ceux-ci.

Remplacement

Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont testées sur des cultures cellulaires et des organoïdes afin de déterminer leur pertinence et pour certains biomarqueurs, leur surexpression au niveau des tumeurs. Les tests in vitro préliminaires mis en place permettront de définir au préalable la stratégie appliquée in vivo afin de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons pour l’évaluation sur le modèle murin. Cependant, le microenvironnement tumoral est difficilement reproductible in vitro. Afin de valider les biomarqueurs et la stratégie associée par imagerie, les tumeurs doivent être implantées dans l’organe cible, ici le poumon.

Réduction

L’imagerie permet des études longitudinales en pharmacocinétique et par conséquent ne nécessite pas l’utilisation d’animaux à chaque temps, réduisant drastiquement le nombre de groupe d’animaux nécessaires pour des études classiques en pharmacologie. Chaque donnée d’imagerie individuellement ou globalement permettra après analyses de définir la distribution des agents thérapeutiques de manière longitudinale en gardant la puissance statistique de l’étude.

Raffinement

Toutes les interventions invasives, à savoir les injections systémiques, seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse complétée par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Un suivi régulier et des points limites permettront d’éviter toute souffrance animale. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi.

Choix des espèces

Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux biomarqueurs prédictifs selon quatre axes thérapeutiques prometteurs (les immunothérapies, la radiothérapie, la chimiothérapie couplé à l’immunothérapie et les thérapies ciblées). La souris est l’animal de choix pour la mise en place de modèle tumoraux, ayant une taille adaptée pour la manipulation et l’imagerie corps entiers. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Les souris utilisées dans ce projet auront atteint un stade jeune adulte (5 semaines) à adulte ( 8 semaines). Cette tranche d’âge permet d’être représentative des cancers pulmonaires chez les patients majoritairement à l’âge adulte.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale de 40 minutes dont le résumé ne décrit pas le geste, passent le lendemain six heures en hypoxie hypobare ou à l'air et à la pression normaux, puis sont opérées une seconde fois sans réveil, 24 heures après la première chirurgie, pour prélever leur caillot et leur sang. Quatre doses d'antidouleur encadrent la première opération, qui peut entraîner des douleurs dans les heures suivant le réveil. Le dispositif doit reproduire l'exposition des passagers d'un vol long-courrier, et le porteur écrit que cette approche "permettrait" d'identifier les acteurs cellulaires de la thrombose et de révéler "à terme" des cibles thérapeutiques pour les personnels de bord et les grands voyageurs.

Objectifs

Evaluation en préclinique des effets de l’hypoxie sur la thrombose veineuse profonde. L'’intérêt est d'’identifier les acteurs cellulaires et protéiques impliqués dans la formation du thrombus après une exposition à un environnement hypoxique hypobare similaire à un vol d’avion long-courrier (minimum de 4 heures)

Bénéfices attendus

Ce projet d’expérimentation permet de reproduire in vivo la formation d’un thrombus sous l’effet d’une hypoxie hypobare et donc de simuler au mieux les conditions environnementales auxquelles sont exposées les passagers d’un vol long-courrier. Cette approche permettrait d’identifier les acteurs cellulaires par lesquels l'hypoxie joue son rôle pro-thrombotique et donc de révéler à terme de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant être spécifiques pour les personnels de bord et les « grands voyageurs ».

Procédures

Les animaux sont dans un premier temps soumis à une chirurgie abdominale avec réveil. 24 heures après ces mêmes animaux sont soumis à une deuxième chirurgie qui cette fois est sans réveil permettant le prélèvement du thrombus et du sang. Les deux chirurgies ainsi que les prélèvements ne sont réalisés qu'une seule fois par animal.

Impact sur les animaux

Cette procédure est une procédure avec réveil et nécessite une chirurgie abdominale qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les chirurgies ont une durée de 40 minutes et l'exposition à l'hypoxie hypobare ou normoxie normobare dure 6 heures.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure après prélèvement sanguin et prélèvement de caillot sanguin.

Remplacement

A ce jour l’étude in vitro des neutrophiles, des plaquettes et des cellules endothéliales ne permet pas à elle seule de reproduire l’intégralité du vaisseau sanguin. De plus, l'induction de l'hypoxie à l'échelle cellulaire ne reproduit pas la complexité des pathologies thrombotiques veineuses auxquelles sont exposés les passagers d’un avion.

Réduction

Dans le cas où une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant l’utilisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d’expérimentations supplémentaires. L’analyse du thrombus et des composés sanguins sera réalisée dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Reduction).

Raffinement

Les animaux seront utilisés 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Afin de limiter le stress, les animaux seront transférés 24h avant la chirurgie dans la cage qui les hébergera tout le long de la procédure. Ceci aura pour but de les habituer à leur nouvel habitat et de les acclimater à la prise d'eau gélifiée. Au cours de la chirurgie, les animaux suivants attendront dans une pièce d’hébergement afin de ne pas être perturbé par la chirurgie en cours. Les animaux seront opérés sur un tapis chauffant (37°C) afin de maintenir leur température pendant la chirurgie. Pour améliorer les conditions de réveil, les animaux seront placés sur une bouillotte dans la cage pour les maintenir au chaud. Une surveillance accrue sera réalisée après la chirurgie toute la journée ainsi que pendant l'exposition à l'hypoxie hypobare pour le groupe concerné pour évaluer le bien-être des animaux et détecter rapidement tout signe de souffrance. Une première dose d'anti-douleur sera administrée aux animaux 30 minutes avant la chirurgie et une deuxième dès la fin de la chirurgie. Une troisième dose est injectée à la fin de la journée afin de limiter les douleurs durant la nuit. Le lendemain matin, soit 12 heures après, une dernière injection d'anti-douleur est réalisée avant de placer les souris en normoxie normobare ou en hypoxie hypobare. En cas de signes de souffrances chez un animal une nouvelle injection d'anti-douleurs lui sera administré.

Choix des espèces

Le modèle murin est un excellent modèle de thrombose à la fois artérielle et veineux et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux seront utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel.

Des babouins sont immunisés contre trois candidats médicaments développés par un partenaire, pour obtenir de leur sang des anticorps qui serviront de contrôle positif dans les tests réglementaires de ce partenaire, chez le singe comme chez l'humain. 6 babouins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, deux au plus par groupe. Chacun reçoit deux injections intradermiques du candidat médicament, à J0 et J21, et subit deux prises de sang, à J0 et J31, chaque fois sous anesthésie légère, hébergé pendant le protocole dans une cage individuelle accolée à celles de ses congénères. Le porteur qualifie cette immunisation de "vaccination non invasive". Les babouins peuvent venir d'un protocole précédent, et ils sont gardés en vie à l'issue pour intégrer un autre protocole de niveau léger ou modéré, après avis du vétérinaire.

Objectifs

Notre partenaire, développe des candidats médicaments , dont l’objectif thérapeutique est soit dans le traitement de cancer soit dans des indications en auto-immunité. Trois candidats médicaments (CM) sont actuellement en développement et sont prévus d’être introduits en clinique dans les 2 ans. Dans le cadre du développement de tests permettant la détection et la mesure des anticorps dirigés contre les candidats médicaments (anti-CM-1, anti-CM-2 et anti-CM-3), produits chez le primate et chez l’homme, tests utilisés respectivement lors d’études précliniques réglementaires effectuées chez le primate et dans le cadre des études cliniques réalisée chez l’homme, notre partenaire désire générer des anticorps polyclonaux de primate qui seront utilisés comme contrôle positif dans ce test. Ces anticorps peuvent être obtenus par vaccination non invasive de primates, suivie d’une prise de sang limitée au volume éthiquement acceptable, à partir duquel seront purifiés les anticorps.

Bénéfices attendus

Les anticorps produits chez le primate dans ce protocole seront purifiés et serviront de contrôle positif dans le tests d'anticorps anti-candidat médicament, utilisés respectivement lors d’études précliniques réglementaires effectuées chez le primate et dans le cadre des études cliniques réalisée chez l’homme.

Procédures

Injection du candidat médicament (30 min) à J0 et à J21 sur animaux sous anesthésie légère, et prélèvement de sang en petit volume (30 min) à J0, et à J31, sur animaux sous anesthésie légère.

Impact sur les animaux

Les animaux reçoivent deux injections intradermiques lors de l’immunisation, qui peut induire une légère inflammation cutanée, et donc une légère douleur (type vaccin). Nous n'attendons pas d'effet indédirable suite aux 2 prélèvements sanguins espacés d'un mois (petits volumes).

Devenir

Les animaux issus de cette procédure peu invasive, de sévérité modérée, seront gardés en vie, et pourront intégrer un autre protocole de classe légère ou modérée en fonction de la compatibilité des objectifs scientifiques et uniquement après avis du vétérinaire référent.

Remplacement

Il n'existe pas de remplacement possible pour ces expérimentations qui répondent cependant aux exigences de réduction et de raffinement. L'alternative non animale serait d’utiliser des anticorps humains anti-candidat médicament (anti-CM) comme contrôles positifs dans les tests d’immunogénicité. Cependant, ces molécules ne sont pas disponibles. Il est nécessaire d’obtenir des anticorps anti-CM comme contrôles positifs dans les tests d’immunogénicité, qui puissent être reconnus par des anticorps secondaires anti-humains. Or des anticorps de ce type ne peuvent pas être obtenus in vitro, car ils ne seraient pas reconnus par les anticorps secondaires anti-humains. Bien que l’utilisation de tels anticorps anti-CM déjà disponibles ait été envisagée, elle ne permettait pas la détection d’anticorps anti-CM humains. Cela aurait invalidé le test, qui présente un caractère réglementaire. Ainsi l'immunisation d’animaux dont les anticorps peuvent être reconnues par des anticorps humaines doit être utilisée à cette étape du développement.

Réduction

Le nombre maximum de 2 animaux par groupe est suffisant pour la production et la purification d’une quantité suffisante d’anticorps polyclonaux. Cependant si l'immunisation d'une seul animal satisfait à la quantité et à la qualité des anticorps produits, le second animal ne sera pas utilisé. Aucun test statistique n’est nécessaire. D’autre part, de façon à réduire le nombre d’animaux utilisés et dans la mesure du possible, les primates inclus dans cette procédure expérimentale, pourront être réutilisés d’un protocole précédent après avis favorable du vétérinaire.

Raffinement

De façon à diminuer le stress, la souffrance et la douleur, toutes les procédures seront réalisées chez ces animaux sous anesthésie et un traitement analgésique leur sera donné de façon adaptée en cas de réactions secondaires suite à l’immunisation. La fréquence d'observation des animaux est doublée lors des immunisations, passant de 3 à 6 fois par jours, et consiste en des examens cliniques de l’animal vigile, permettant une prise en charge individuelle et adaptée. Les animaux seront hébergés avant protocole expérimental en volière, de façon à préserver leur de mode vie en communauté. Au cours du protocole expérimental les individus traités seront hébergés dans des cages séparées, mais jointives permettant la vision et la communication entre congénères. Un enrichissement alimentaire (fruits et/ou légumes) est donné quotidiennement, un enrichissement par jeux (différentes activités) est donné en rotation dans les cages selon un programme hebdomadaire. Enfin, un aménagement (perchoirs, cordes…) des cages permet un enrichissement de l’espace.

Choix des espèces

Les PNH, particulièrement les babouins, représentent l’espèce animale de choix pour la génération d’anticorps de référence pouvant servir de contrôles positifs pour doser les anticorps anti-anticorps thérapeutique générés à la fois chez le singe (macaque) et chez l’homme. Il s’agit d’animaux jeunes adultes (4 à 15Kg) dont le système immunitaire est mature.

360 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit vers la naissance une électroporation du cerveau sous anesthésie, puis est tué entre deux et quinze jours plus tard pour prélèvement du cerveau. Le projet étudie les mécanismes de production des cils dans les cellules du cerveau. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'effet nuisible de cette technique et juge les cultures cellulaires insuffisantes pour reproduire ce contrôle in vivo.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la production des centrioles et des cils dans les cellules multiciliées épendymaires dans le cerveau des souris au stade postnatal. Dans ce contexte nous étudierons la fonction de protéines que nous avons préalablement sélectionnés à partir d’expériences réalisées in vitro en culture cellulaire. Des animaux de phénotype sauvage (CD1) seront utilisés pour étudier l’impact de la surexpression ou de l’inhibition de cette protéine en utilisant la technique d’électroporation in vivo de cerveaux postnataux.

Bénéfices attendus

Notre projet est d'une grande pertinence pour le domaine des cellules multiciliées (MCC) : - Un des grands défis dans ce domaine de recherche concerne le contrôle du nombre final de cils dans les MCC individuelles, qui est la clé de l'émergence de leur fonction physiologique. La réponse à cette question ne sera possible que lorsque les mécanismes de production et d'élimination des centrioles seront bien compris. Ce projet fera la lumière sur ces processus de ouvrant de nouvelles voies pour aborder la façon dont le nombre de centrioles est contrôlé. - La multiplication des centrioles dans les MCC et la duplication des centrioles au cours du cycle cellulaire font intervenir des principes de régulation communs. Ainsi, le domaine plus large de la biologie des centrioles bénéficiera à l'avenir d'études sur les MCC comme celle proposée ici. Notre projet est également pertinent pour la santé humaine : - Les maladies respiratoires chroniques, tuent plus de 4 millions de personnes chaque année. Malgré la mortalité associée à ces maladies, une compréhension de la pathogenèse reste incomplète. Nos résultats fourniront des informations importantes sur les mécanismes qui sous-tendent ces pathologies. - La compréhension des règles qui contrôlent le nombre de centrioles dans les MCCs pourrait également être tout à fait pertinente dans le domaine du cancer ou une multiplication aberrante de centrioles est parfois observé.

Procédures

Les nouveaux-nés P0-P1 anesthésiés seront soumis à une procédure d’électroporation in vivo du cerveau afin de modifier l’état génétique des précuseurs des cellules multiciliées. Cette procédure dure 1 à 2 min et sera réalisée une fois par animal sur 360 animaux.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 15 jours après. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’année et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur la santé et le bien-être des animaux. L’électropration que nous utilisons dans ce projet induit la diminution de l’ARN cible seulement dans quelques cellules du cerveau après la naissance, ce qui n’entraine aucun effet dommageable sur l’animal.

Devenir

A la fin de la procédure (P5 ou P15), les animaux seront euthanasiés pour prélèvement du cerveau et analyse des paramètres des cellules multiciliées par immunofluorescence.

Remplacement

Les modèles de lignées cellulaires de cellules multiciliées (Cellules epitheliales de trachée humaine, culture primaire de cellules épendymaires de souris, culture primaire de cellules de trachée de souris) ne récapitulent pas le contrôle sticte de production des centrioles multiples observé in vivo. Notamment le nombre de centrioles généré par les cultures de cellules ependymaires sont deux à trois plus élevé que le nombre de centriole observés in vivo. Ainsi, la production des centrioles multiples est contrôlée par des facteurs intrinsèques mais également par des facteurs extrinsèques. Ce contrôle cellulaire non autonome lié à l’environnement cellulaire ne permet pas d’utiliser des systèmes de culture cellulaire in vitro pour étudier ce processus en contexte physiologique. Il est donc nécessaire d’effectuer des approches fonctionnelles in vivo chez la souris. Avant le début des analyses fonctionnelles in vivo, la présence de nos candidats dans les structures cellulaires relevantes pour le processus de production des centrioles multiples a été évaluée par des approches biochimiques sur des lignées cellulaires.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules multiciliées dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette approche par électroporation in vivo est utilisée depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires est estimé afin d’atteindre une différence significative (p

Raffinement

Les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 6 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Pendant l’expérimentation, les souris sont traitées par des soins pré-opératoires (pommade lidocaïne) et la phase de réveil post-anesthésie se fait en condition de température optimale. Après l’expérimentation, les souris sont hébergées au calme dans une salle post- opératoire dédiée avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Ils font l’objet d’une surveillance quotidienne par les opérateurs pour vérifier la récupération dans les jours qui suivent l’application de la procédure. En cas de souffrance détectée (grille d’évaluation en Annexe 1), des antalgiques sont administrés (buprenorphine 0,1mg/kg, voie intra-péritonéale). Si les signes de souffrance persistent les animaux seront euthanasiés. Tout au long de l’expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété, agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, noter les observations faites et les actions entreprises.

Choix des espèces

La souris est le modèle mammifère utilisé par la communauté́ scientifique pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation des cellules multiciliées et qui sont conservés chez l’homme. De plus il permet des manipulations génétiques, soit par l’utilisation d’animaux transgéniques soit par modification ciblée de l’information génique des précurseurs des cellules multiciliées in vivo dans le cerveau. Les animaux seront utilisés au stade post-natal P0/P1 car Les précurseurs des cellules multiciliées ne sont accéssibles qu’aux stades P0-P1. Les animaux seront analysés à différents temps après électroporation de P5 à P15 correspondant aux différentes étapes de maturation des cellules multiciliées.