Procédures modérées

288 souris, 144 mâles et 144 femelles, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Une myosite est déclenchée par des injections sous anesthésie, puis les souris reçoivent un gavage quotidien pendant sept jours et subissent un test de force musculaire au grip test, avant d'être tuées pour prélever muscles et organes, afin de tester des molécules candidates contre les myopathies inflammatoires. Le porteur indique que l'induction fait perdre environ 30 % de force musculaire sans, selon lui, provoquer de souffrance décrite dans la littérature. Il affirme que ce modèle murin est "indispensable" et qu'aucun système cellulaire ne reproduit les interactions en jeu dans la maladie.

Objectifs

Les myopathies inflammatoires (MI) sont des maladies caractérisées par l’inflammation du muscle squelettique qui conduit à une faiblesse musculaire et une capacité réduite d'exercice, ainsi qu’une baisse de la qualité de vie et une mortalité accrue. Les glucocorticoïdes (GC) sont le traitement de première intention car ils améliorent la sévérité des symptômes, cependant, un traitement chronique provoque des effets indésirables. Même si des médicaments sont disponibles, ils ont une efficacité partielle, un fort taux de rechute et de nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d'améliorer la prise en charge des patients atteints de MI. Nous avons démontré chez la souris atteinte de myosite que la prednisone, permet de récupérer la force musculaire après 7 jours de traitement. Cet effet thérapeutique passe par l’activation de la voie b adrénergique dans les cellules inflammatoires. De ce fait, l’activation de cette voie pourrait récapituler les effets thérapeutiques de la prednisone en l’absence de ses effets indésirables. Cette stratégie thérapeutique a été testée dans un modèle murin de Myasthénie grave et un essai clinique est actuellement en cours chez l’homme. Nous avons mis en évidence que les fibres musculaires des patients atteints de dermatomyosite (DM), un sous-type de myosite, présentent une augmentation de l’activité du protéasome. De plus, les inhibiteurs du protéasome ont montré une efficacité in vitro, parmi les inhibiteurs du protéasome déjà utilisés pour le traitement d’autres pathologies auto-immunes et du cancer, Ixazomib et KZR-616 sont les mieux tolérés

Bénéfices attendus

Les myopathies inflammatoires (MI) sont caractérisées par l’inflammation du muscle squelettique qui conduit à une faiblesse musculaire et capacité réduite d'exercice, et qui est associées à une baisse de la qualité de vie et à une mortalité accrue par rapport à la population générale et aux patients atteints d’autres maladies chroniques. Les glucocorticoïdes (GC) sont le traitement de première intention dans cette maladie car ils améliorent la sévérité des symptômes, cependant, un traitement chronique provoque des évènements indésirables et les médicaments qui ciblent l’infiltrat inflammatoire ont une efficacité partielle, un fort taux de rechute et nombreux effets secondaires. Il est donc nécessaire d'améliorer la prise en charge des patients atteints de MI. Nous avons précédemment démontré que la fibre musculaire est un acteur à l’origine des MI ainsi qu’une cible thérapeutique des GC et potentiellement d’autres médicaments. Ces données obtenues par des études in vitro, in vivo et chez l’homme ont ouvert des nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de MI. Notamment, l’activation de la voie b adrénergique et l’inhibition du protéasome dans la fibre musculaire permettront spécifiquement de cibler les mécanismes à l’origine de la maladie. Cela permettra d’améliorer le pronostic d’un groupe de maladies handicapantes et associées à une surmortalité.

Procédures

La myosite expérimentale (ME) sera réalisée, sur chaque souris, par l’injection sous-cutanée au niveau des hanches et les pattes arrière bilatéralement (4 sites d’injections, 3 secondes/injection) d’un polypeptide de la protéine C rapide du muscle squelettique associée à l’injection par voie intra-péritonéale (une seule injection durant 3 secondes) de toxine pertussis. Toutes les injections seront faites sous anesthésie à l’isoflurane le même jour et une seule fois sera suffisante pour induire la maladie. Le délai entre les différentes injections sera compris entre 3 et 10 secondes. Seront générées 288 souris ME (144 males, 144 femelles) afin de permettre l’évaluation des nouvelles molécules pour les deux sexes. Quatorze jours après l’induction de la ME, les souris seront traitées pendant 7 jours par gavage de 100µL quotidien par les molécules candidates, Ces molécules seront administrées dans l’eau de boisson par gavage. Le même volume d’eau de boisson sera administré par gavage aux souris ME non traitées. Pendant cette procédure la souris sera vigile. Les médicaments seront administrés par gavage afin de garantir l’administration de la même quantité dans tous les souris. Chaque gavage induit une contention de 15 secondes par souris, le gavage dure 5 secondes et sera répété pendant les 7 jours de traitement. Au jour 21, 100µL de sang sera prélevé au niveau de la veine faciale (10 secondes maximum), puis les animaux seront mis à mort lors de la même contention et les prélèvements suivants seront alors réalisés : - muscles quadriceps, tibialis antérieur, gastrocnémien : afin d’étudier l’efficacité du traitement ; - foie, rate, cœur : afin d’étudier la tolérance du traitement dans le cas où il y aura des signes de toxicité au bilan dans le sang. La force musculaire sera mesurée au jour 0, 14 et 21 après l’immunisation, en utilisant un test de résistance de la préhension (Grip test). Lors de la mise en place de l’expérimentation, les souris seront différenciées par un marquage au feutre au niveau de la queue afin d’éviter toutes contentions inutiles, la durée du grip-test est de 10 secondes par souris (3 prises de mesures).

Impact sur les animaux

La myosite expérimentale (ME) sera induite sur chaque souris, sous anesthésie à l’isoflurane, par l’injection sous-cutanée au niveau des hanches et les pattes arrière bilatéralement (4 sites d’injections, 3 secondes/injection) d’un polypeptide de la protéine C rapide du muscle squelettique associée à l’injection par voie intra-péritonéale (une seule injection durant 3 secondes) de toxine pertussis. Toutes les injections seront faites le même jour et une seule fois. Le délai entre les différentes injections sera compris entre 3 et 10 secondes. L'Induction de la Myosite entraine une perte de force musculaire entre 14 et 21 jours après l’induction. Quatorze jours après l’induction de la ME, les souris seront traitées pendant 7 jours par gavage de 100µL quotidien par les molécules candidates, Ces molécules seront administrées dans l’eau de boisson par gavage. Le même volume d’eau de boisson sera administré par gavage aux souris ME non traitées. Pendant cette procédure la souris sera vigile.

Devenir

La myosite expérimentale (ME) est induite le jour 0. 14 jours après l'induction de la ME, le traitement est administré pendant 7 jours par gavage dans l’eau de boisson. 21 jours après l'induction de la maladie, les animaux sont mis à mort afin d’étudier l’efficacité des molécules candidates thérapeutiques et leur tolérance par le prélèvement des muscles, du foie, du cœur et de la rate.

Remplacement

Le modèle murin de myosite décrit dans ce projet n’est pas remplaçable et reste indispensable afin d’évaluer la tolérance et l’efficacité des molécules ayant possiblement un effet thérapeutique dans les myosites. En effet, il n’est pas possible actuellement de modéliser au moyen d’un système cellulaire les interactions dynamiques et complexes entre les cellules musculaires, inflammatoires et l'environnement au cours des myopathies inflammatoires. De plus, chez l’homme, il n’est pas éthiquement possible de ne pas traiter les patients avec des glucocorticoïdes malgré leurs effets iatrogènes connus et de tester des autres molécules candidates en l’absence d’études sur des modèles animaux.

Réduction

Pour répondre à la question scientifique posée, le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. L’hétérogénéité des résultats des expériences antérieures demande une cohorte de 12 souris (6 mâles, 6 femelles) pour obtenir des résultats statistiquement significatifs De ce fait, 12 souris seront nécessaires pour les analyses histologiques, 12 pour étudier l’expression des gènes et des protéines, 12 souris pour étudier l’activité mitochondriale, 12 souris pour la cytométrie en flux, au total 48 souris. Vu qu’on compare 6 conditions, au total il faut 288 souris. Ce nombre d'animaux nous permettra d'obtenir des conclusions significatives. Les expériences sur les animaux seront stoppées lorsque le niveau de signification statistique est atteint pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisées. Sur la base de notre bibliographie, la question scientifique à laquelle répondra ce protocole n’a jamais été étudiée.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages adaptées agrémentées de nid, en groupes sociaux. Pour minimiser le stress des souris, toutes les injections pour induire la maladie seront faites par des seringues insuliniques et dans le cadre de la même anesthésie. Dans notre projet précédent, nous avons montré que l’induction de la myosite, même en fin d’anesthésie, ne provoque pas de douleur ni de nécrose dans les sites des injections. Cependant, si les souris présentent des rougeurs au niveau des sites d'injection, ou des détresses respiratoires liées à l'anesthésie, ces dernières seront sorties de l'étude. A partir de l’induction de la myosite inflammatoire, une perte de force étant attendue, de la nourriture en gel sera mise à disposition dans la cage afin d’assurer l’alimentation des souris. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien adapté. Le poids, le comportement général, la posture, l’état du pelage, les blessures potentielles seront suivies pendant toute la vie des animaux. En cas de doute, un suivi de poids pourra être mis en place et toute baisse de poids sera notifiée au responsable de projet et au vétérinaire. Nous avons montré que l’induction de la myosite (ME) diminue la force musculaire des souris de 30%, mais n’affecte pas leurs capacités à se nourrir. Cependant, après l’induction de la maladie, de la nourriture gel sera placée tous les jours dans la cage pour assurer leur alimentation même dans des conditions de faible mobilité. La prednisone n’induit pas de signe de souffrance, au contraire, ce traitement ainsi que les molécules candidates, devraient réduire la sévérité des symptômes de la ME. La mise à mort sera faite par des méthodes appropriées et par personnes compétentes pour limiter la souffrance des animaux.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animal la plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants car la composition en termes de type de fibre des muscles squelettiques chez la souris mime celle humaine. De façon concordante, la myosite chez la souris mime la maladie humaine pour la présence d’une diminution de force musculaire, d’inflammation et variabilité de taille des fibres au niveau histologique. Des souris adultes seront utilisées. L’âge adulte selon les répondants varie entre 6 et 20 semaines. L'âge auquel les modèles animaux sont couramment utilisés est de 8 à 12 semaines. De ce fait, l’âge des souris sera de 8 semaines car pour les modèles de maladies auto-immunes la puberté est préférable afin d’avoir un système immunitaire compétent. En effet, la plupart des modèles expérimentaux de myosite présents dans la littérature ont été décrits chez la souris adulte et dans ces modèles, aucune souffrance animale n'a jamais été décrite.

34 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Ils sont vaccinés puis infectés par le SARS-CoV-2 par voie intranasale, avant des écouvillonnages et lavages nasaux répétés sous anesthésie, pour évaluer des composés antiviraux d'une société qui a validé et financé le projet. Le porteur indique que l'infection provoque fièvre, perte de poids et tremblements sans être létale dans ce modèle, puis que tous les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il décrit tantôt un objectif de traitements antiviraux, tantôt de "vaccins", et affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'étudier la transmission du virus.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité de composés antiviraux dans un modèle de transmission du virus du SARS-CoV-2 entre individus. Les traitements antiviraux utilisés ont montré des résultats intéressants lors d’études in-vitro ou lors d’études précliniques sur d’autres types de virus, encourageant la réalisation d’études d’efficacité en préclinique sur le virus SARS-CoV-2. Ce projet a ainsi fait l'objet d'une évaluation par le comité scientifique de la société fabriquant les traitements et a été approuvé par celui-ci. Ce projet permettra de mettre sur le marché un/des traitement(s) antiviral(aux) contre la COVID 19.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre sur le marché des vaccins contre la COVID 19.

Procédures

Pour limiter au maximum le stress des animaux, l’intégralité des actes décrits ci-dessous seront réalisés sur animaux anesthésiés. Les animaux des groupes tests seront, avant d’être mis en contact avec les animaux infectés au SARS-CoV-2, vaccinés par instillation intranasale à raison d’une administration par animal. Le virus du SARS-CoV-2 étant un virus aéroporté, l’infection des animaux du groupe infecté se fera également par instillation intranasale en dose unique. Enfin, des prélèvements réguliers, d’écouvillonnages oropharyngés et des lavages nasaux, à raison au maximum d’une fois par jour tous les deux jours seront réalisés et ce pendant les 7 jours suivants le contact entre les animaux infectés et non-infectés. Une même anesthésie permettra d'effectuer les 2 prélèvements à la suite évitant ainsi les anesthésies multiples pour un même jour (chaque intervention (infection et prélèvement) ne nécessitant qu'une minute par animal).

Impact sur les animaux

Les animaux vont être infectés au virus du SARS-CoV-2 entrainant l’apparition de signes cliniques des animaux reflétant la réalité clinique (principalement fièvre, perte de poids, pilo-érection et tremblements). Toutefois, il est connu dans la littérature scientifique mais aussi d’après les observations des précédentes études réalisées dans notre établissement utilisant le modèle hamster que, contrairement au modèle murin, l’infection au SARS-CoV-2 dans ce modèle n’est pas léthale. A titre indicatif, nous avons observé qu'une infection induit dans le modèle hamster des pertes de poids de l’ordre 5% avec un retour à la normale (poids avant infection) dans les 5 à 7 jours post-infection. Les animaux vont être manipulés régulièrement pour différents actes (administration des vaccins, pesées, scoring clinique, prélèvements, etc). Ces actes pouvant stresser les animaux et leur infliger des douleurs aussi pour palier à ce cela des mesures de raffinements ont été prévues : les animaux seront manipulés quotidiennement afin de les habituer à la contention et des anesthésies seront systématiquement réalisées pour tous actes invasifs.

Devenir

L’ensemble des animaux utilisés pour ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque étude pour pouvoir réaliser des prélèvements d’organes en vue d’analyses anatomopathologiques ou de charges virales.

Remplacement

La transmission d’un virus aéroporté comme le SARS-CoV-2 résulte de plusieurs facteurs tels que la durée et l’intensité d’exposition aux particules infectieuses, la stabilité du virus dans les gouttelettes d’aérosols et de l’infection suivante dans le nouvel hôte. Aussi, il n’existe actuellement aucune méthode alternative permettant d’étudier la transmission d’un virus d’un organisme à l’autre et d’évaluer l’efficacité d’un traitement sur un organisme vivant sans l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Cette étude a fait l’objet d’une réflexion étayée par des connaissances statistiques et des données de la littérature scientifique afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Toutefois, pour obtenir des résultats statistiquement exploitables permettant de conclure sur une réelle efficacité des traitements testés, des groupes de 6 animaux seront utilisés. Des études internes menées par la société fabriquant les traitements ont déjà utilisé le ratio de 1 pour 3 dans un modèle de furet pour la grippe avant de déterminer la réplication du virus pour chaque animal sentinelle après le co-hébergement. L’utilisation de ce ratio permettra de mieux simuler une situation naturelle pour laquelle un individu infecté est capable d’infecter un plus grand nombre d’individus non-infectés lors de contacts directs. De plus, en préférant ce ratio de 1 pour 3 à un ratio de 1 pour 1, nous diminuons considérablement le nombre total d’animal à inclure dans l’étude limitant ainsi le nombre et la souffrance des animaux donneurs indexés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés avec un enrichissement approprié à leur besoin et suivant leur âge (exemple : les hamsters de plus petite taille disposeront de plus de litière en fond de cage pour pouvoir accéder plus facilement à l’abreuvement et à la nourriture). Les animaux seront suivis quotidiennement pendant toute la durée de l'étude grâce à une grille d'évaluation appropriée. En cas d'atteinte de points limites préalablement définis sans possible amélioration de l'état de santé des animaux, ils seront euthanasiés pour arrêter toute souffrance excessive. Pour éviter tout stress aux animaux, ils seront systématiquement anesthésiés lors de la réalisation d'actes techniques invasifs. Durant la phase de co-hébergement en surnombre, les animaux seront suivis 2 fois par jour. Les animaux ne seront pas manipulés lors de cette seconde visite mais simplement observés pour éviter de stresser les animaux. Chaque groupe social sera placé avec le minimum d’éléments lui permettant de reproduire son nid, ses briquettes de bois à ronger et un peu de litière provenant de sa cage d’origine afin que les animaux puissent garder leurs repères. En cas de détection de signes d’agressivité des animaux entre eux, des enrichissements supplémentaires seront ajoutés dans les cages. Si les signes d’agressivité persistent, l’animal dominant sera alors isolé du reste du groupe.

Choix des espèces

L’efficacité des composés antiviraux sera évaluée sur la souche de hamster Golden Syrian, qui a été décrit comme un excellent modèle pour une infection au SARS-CoV-2. Contrairement aux modèles murins transgéniques, les hamsters Golden Syrian expriment naturellement un récepteur d’entrée du virus du SARS-CoV-2. Cette expression leur permet d’être infectés à la COVID-19 conduisant au développement de signes cliniques plus proches de ceux observés chez l’Homme. D'après les données de la littérature scientifique, les hamsters utilisés dans le cadre des études SARS-CoV-2 sont généralement âgés de 4 à 10 semaines. Des animaux jeunes adultes (âgés de 7 semaines au moment de l'infection) seront utilisés pour l'étude. Cet âge représente un état physiologique stable pour le hamster, ce qui est adapté aux besoins de l'étude.

74 animaux non-humains, 64 cochons et 10 chiens, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Ils subissent sous anesthésie l'implantation d'un dispositif dans l'estomac puis jusqu'à cinq prises de sang sur trois mois, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de mettre au point une alternative à la chirurgie de l'obésité développée par une entreprise. Le porteur indique que la chirurgie provoque douleur et perte d'appétit et que le dispositif peut entraîner une inflammation digestive ou une obstruction. Il affirme que la complexité du système digestif rend l'usage d'un "organisme complet et vivant" "indispensable" pour valider le produit avant sa pose chez l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer une solution innovante afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie de réduction de volume de l'estomac, tout en évitant les complications associées. Notre dispositif est aussi une alternative aux ballons intra-gastriques qui sont actuellement utilisés. Plusieurs essais sur des cadavres humains et animaux ont déjà été menés pour mettre au point le dispositif ainsi que son déploiement et son ancrage dans le tube digestif. Désormais, nous devons passer à une phase animale pour démontrer l'inocuité sur le moyen terme de notre dispositif, et pour prouver qu'il reste en place, malgré les conditions chimiques et le péristaltisme digestif. Nos études sont menées en parrallèle entre le laboratoire in vivo et les ateliers de mise au point et d'ingenierie médicale. Suite à chaque essai in vivo, les améliorations sont apportées au prototype. Dès que le prototype sera considéré satisfaisant, il sera mis en place chez l'humain pour des essais cliniques.

Bénéfices attendus

L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de graisse représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes dans le monde, décédant de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après la World Health Organization, près de 39% des adultes dans le monde, représentant près de 1.9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Bien que l’efficacité de la chirurgie bariatrique, qui réduit le volume de l'estomac, ne soit plus à démontrer, seul 1% des patients éligibles décident de se faire opérer à cause du risque de complications sévères et des modifications anatomiques irréversibles. Et pour les solutions moins invasives, comme les ballons gastriques, elles sont aujourd’hui associées à une perte de poids limitée et temporaire. Ce projet est nécessaire pour le développement d’une solution qui sera posée, chez l'humain, par voie endoscopique afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie tout en minimisant les complications associées. En effet, il permettra de vérifier la sécurité et potentiellement l'éfficacité des dispositifs développés par l’entreprise.

Procédures

Les animaux subiront, principalement, une chirurgie, sous anesthésie générale, pour la mise en place du dispositif directement dans l'estomac. Puis, après leur réveil, ils recevront les soins post-opératoires pour une reprise d'alimentation normale. Des prises de sang sont prévues avant la chirurgie, pour évaluer les paramètres basaux des animaux, puis après la chirurgie, pour suivre l'évolution de ces paramètres et vérifier si le dispositif engendre des dérèglements. Un maximum de 5 prises de sang de 10 ml est prévu pendant les 3 mois du protocole. Elles ont lieu sous anesthésie pour les porcs et sur animal vigile pour les chiens. D'autre part, dans la période post-opératoire, les porcs et chiens devront être hébergés seuls pour une durée de 3 jours, mais dans des boxes confortables, et permettant à chaque porc et chien de voir, sentir et toucher ses confrères voisins quand ils le souhaitent.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables les plus prévisibles sont ceux que la chirurgie va provoquer : douleur, perte d'appétit, inconfort, suite à la chirurgie abdominale. D'autres effets indésirables pourraient intervenir si le dispositif n'est pas bien toléré. Il peut s'agir d'inflammations du tube digestif, ou d'autres phénomènes vasculaires localisés au niveau du site d'implantation. Si le dispositif ne reste pas en place, il peut aussi provoquer une obstruction digestive. Nous attendons très peu d'effets indésirables des prélèvements sanguins, dont le volume est réduit au regard du poids des porcs et des chiens.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement d'organes pour des analyses macroscopiques et histologiques.

Remplacement

Ce projet vise à confirmer l’adéquation du dispositif en cours de développement avec le système digestif. Avant d’initier ce projet, des essais sur sujets anatomiques humains et animaux ont été effectués afin de confirmer les dimensions des prototypes en cours de développement. De plus, des essais in vitro ont été réalisés en laboratoire afin de simuler le déploiement du dispositif ainsi que son comportement lors de contraintes mécaniques simulant le péristaltisme. Néanmoins, la complexité et l’adaptabilité du système digestif limitent notre capacité à simuler l’environnement exact. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ses conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable notamment pour le suivi post implantation. Notre stratégie prévoit d’utiliser un maximum de 64 porcs et 10 chiens pour la totalité du projet comprenant une étude pilote, une preuve de concept et enfin une étude de validation de l’innocuité du dispositif. Nous fonctionnons pas à pas, et le projet sera arrêté si chaque phase ne permet pas d’obtenir les résultats escomptés.

Réduction

Avant d’effectuer les études de preuve de concept, une première phase avec une étude pilote sera effectuée en utilisant un nombre réduit d’animal afin de valider que le dispositif s'ancre et se déploie correctement. Pour tester le dispositif candidat. Le nombre d'animaux utilisés a été réduit au minimum et a été calculé pour obtenir une puissance statistique suffisante. Mais surtout, notre approche est progressive : nous réalisons des études successives, en améliorant le dispositif à chaque fois. Dès que nous estimons qu'il est au point, l'étude de preuve de concept s'arrête et nous réalisons une seule étude de tolérance. Le nombre d'animaux présenté ici est donc un nombre maximum d'animaux, qui peut être réduit si nous développons un dispositif satisfaisant rapidement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. : ils disposent de vastes boxes, d'une taille supérieure à celle requise par la législation. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier formés aux soins et à la manipulation de ces espèces. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés. En cas de perte de poids importante se rapprochant des 20%, les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique.

Choix des espèces

Nous prévoyons d’utiliser les modèles porcin et canin car tous deux possèdent une anatomie et une physiologie du système gastro-intestinal très proches de celle de l’homme. Les deux modèles seront utilisés de manière complémentaire, le modèle chien principalement pour des dispositifs transpyloriques grâce à l’absence de torus pylorique et le modèle porc principalement pour des dispositifs avec « chaussette » de 60cm car nettement moins sujet aux intussucepions. Ainsi en fonction du dispositif testé, le modèle animal qui sera choisi sera celui qui, par son anatomie et sa physiologie, sera le plus approprié pour obtenir les données les plus robustes. Pour les porcs le critère de sélection principal sera le poids (environ 50-100kg) afin d’avoir des correspondances anatomiques similaires à celles observées en clinique. Cela correspondra à des animaux adolescents/adultes. Pour les chiens, nous prendront des chiens adultes qui ont auront terminé leur croissance.

193 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une neurochirurgie pour induire dans l'hypothalamus l'expression d'une protéine, et 16 femelles reçoivent en plus un frottis vaginal quotidien pendant cinq semaines, afin d'étudier l'effet de l'hormone IGF1 sur le contrôle cérébral de l'ovulation. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer des hémorragies et une baisse de température, et que les animaux atteignant les points limites sont mis à mort. Il affirme que la reproduction, fonction intégrée, ne peut s'observer que sur un "organisme vivant", ce qui justifierait selon lui le recours au rat.

Objectifs

L'ovulation dépend de l'intégration de facteurs hormonaux, métaboliques, et environnementaux par le cerveau et plus particulièrement par les neurones hypothalamiques à kisspeptine (KP) qui vont orchestrer la sécrétion de la gonadolibérine ou GnRH permettant le pic de l'hormone lutéinisante (LH) à l'origine de l'ovulation. L'objectif est de développer et de mettre en oeuvre une technique permettant d'induire la synthèse d'une proteine dans une région cible du cerveau sur une période de temps étendue (supérieure à 3 semaines) afin d'étudier l'influence de cette proteine sur le contrôle central de l'ovulation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de deux ordres: le premier consiste en une meilleure compréhension des effets de l' Insulin Growth Factor 1 (IGF1), hormone périphérique, sur le fonctionnement dans le noyau arqué des neurones à KP et plus généralement sur la synchronisation du moment de l'ovulation par l'hypothalamus; le second est la mise au point d'une technique innovante, ne nécessitant pas la mise en oeuvre de bâtiments ayant un niveau de biosécurité élevé, pour induire une proteine dans une région délimitée du cerveau et à un âge déterminé de l'animal ce qui permettra de mieux comprendre sa fonction. Cette technique si elle est validée pourra être déployée chez des espèces animales (telles les espèces de rente) chez lesquelles les outils de génie génétique sont peu disponibles.

Procédures

Tous les animaux (n=193) seront soumis à une neurochirurgie d'une durée moyenne de 15 minutes par animal. Pour ce faire, les animaux seront anesthésiés et leur température corporelle sera maintenue grâce à un tapis chauffant. Parmi ces 193 animaux, 16 femelles auront un suivi de cyclicité par frottis vaginal réalisé pendant cinq semaines à raison d'un frottis quotidien (les femelles vigiles sont maintenues le temps du frottis).

Impact sur les animaux

Effets directs: Toute neurochirurgie peut entrainer des diminutions de la température corporelle et des hémorragies. L'incision de la peau du crâne peut induire une douleur localisée. Effets indirects: Mobilité et hygiène du pelage éventuellement réduites suite à la neurochirurgie, l'induction de la synthèse d'IGF1 pourrait avoir des effets sur le poids de l'animal (perte ou gain). Les effets directs sont de courte durée (

Devenir

Le projet porte sur le cerveau et sur l'analyse anatomique et fonctionnelle d'un traitement in situ constitué par un transfectant et un plasmide. De ce fait, il est nécessaire d'euthanasier tous les rats de ce projet en fin d'expérimentation afin de confirmer la zone d'injection, de mesurer son étendue et de caractériser d'éventuelles lésions tissulaires.

Remplacement

La fonction de reproduction étant une fonction intégrée sous contrôle de l'hypothalamus, elle ne peut s'observer que sur un organisme vivant. Les expériences s'appuieront néanmoins sur les données de la littérature pour choisir les critères expérimentaux les plus pertinents et réduire le nombre de tests.

Réduction

Le choix du nombre d’individus par lot s'appuie sur les données de la littérature et notre expérience antérieure montrant que des résultats exploitables et statistiquement fiables peuvent être obtenus avec des groupes compris entre 5 et 7 animaux selon les données à exploiter. La réalisation successive des expériences (et non en parallèle) permet de réduire le nombre de lots expérimentaux car chaque critère établi sera réutilisé dans l'expérience suivante. La taille des lots a été déterminée en nous basant sur notre expérience antérieure où selon les données quantifiées, la variabilité inter-animale et le test statistique utilisé il faut au minimum 7 animaux/groupe. Nous avons ajouté 1 animal par lot afin de prévenir tout risque lié à la chirurgie.

Raffinement

Les rats seront hébergés par trois en présence d'objets en carton (boites à oeufs, tube). Une semaine d'habituation à la manipulation par l'expérientateur sera prévue pour chaque lot de chaque série d'expérience. Les rats seront anesthésiés lors des chirurgies et recevront un traitement antalgique consécutivement à la neurochirurgie. Les rats recevront une pommade ophtalmique pour conserver une bonne lubrification de l'oeil pendant la chirurgie. La surveillance post-opératoire s'appuiera sur l'observation quotidienne du comportement, de l'apparence physique et du poids corporel. La molécule étudiée est une hormone endogène qui n'est pas connue pour avoir des effets nocifs sur la santé des animaux, de même l'absence de nocivité du transfectant a été établie. Néanmoins, une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée tout au long de l'expérimentation ainsi qu'un suivi de poids bihebdomaire.

Choix des espèces

C’est une espèce de référence pour l'étude du contrôle central de la reproduction utilisée en routine par de nombreux laboratoires. L'intérêt de cette espèce dans le cadre de notre projet est la durée courte des cycles ovariens (4 jours) et la bonne reproductibilité/fiabilité des coordonnées stéréotaxiques pour les approches de neurochirurgie. Les animaux seront sexuellement matures afin d'avoir un axe gonadotrope activé et, dans le cas des femelles une activité de reproduction régulière facilement observable par la réalisation de frottis vaginaux. De plus, les coordonnées stéréotaxiques de l'atlas de référence s'appliquent pour des animaux dont le poids est proche de 280g.

Une partie des souris de ce projet est privée d'une protéine mitochondriale de la même famille qu'une enzyme responsable d'une maladie aux atteintes neuromusculaires sévères. 36 souris, mâles et femelles, porteuses de cette inactivation ou témoins, vont être utilisées, toutes tuées en fin de protocole pour l'analyse de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous régime normal ou riche en lipides, chacune passe deux tests de tolérance, au glucose et à l'insuline, qui durent environ trois heures dans un tube de contention avec cinq prises de sang à la queue, deux isolements de 48 heures pour la calorimétrie et une échographie sous anesthésie après rasage et crème dépilatoire. Le porteur ne décrit aucun effet de l'inactivation sur les souris elles-mêmes, alors qu'il justifie le choix de l'espèce par sa capacité à "exprimer fortement les syndromes mitochondriaux incluant les atteintes de différents systèmes, l'intolérance à l'effort et les déficits neurologiques".

Objectifs

Dans le cadre de ce projet nous nous intéressons à une famille d’enzymes, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, en utilisant des cellules en culture, une sous-famille unique de ces enzymes dont les membres sont très similaires à l’enzyme responsable de la pathologie mitochondriale a été mise en évidence. Cette sous famille de protéines est également impliquée dans l’activité énergétique de la mitochondrie. Dans des modèles in vitro, un mécanisme pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients a été récemment décrit. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique mitochondrial, nous voulons étudier le rôle d’une protéine appartenant à cette sous famille. Pour cela un modèle de souris avec cette protéine désactivée a été généré. Nous voulons ainsi étudier les effets de la suppression de cette protéine en particulier sur les fonctions physiologiques en condition normale et sous régime riche en lipides. Nos objectifs spécifiques sont donc chez 36 souris : D’analyser les effets cardiaques et métaboliques en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De mesurer les variations de la biochimie du sang en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De réaliser une étude tissulaire en condition normale et en condition de régime riche en lipides.

Bénéfices attendus

La mitochondrie est un élément présent dans les cellules et jouant un rôle central dans plusieurs fonctions. Elles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares et sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, la compréhension des mécanismes régulant ces activités énergétiques mitochondriales représente une étape essentielle vers le développement d’approches thérapeutiques contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une protéine dans la régulation du métabolisme énergétique mitochondriale. Celle-ci fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille. A long terme, notre projet permettra d'identifier les cibles sur lesquelles agir afin d'améliorer les fonctions mitochondriales. Ainsi, une fois que nous aurons détaillé le mode d’action de cette protéine, nous souhaitons identifier des molécules actives sur celle-ci et utiliser ces molécules pour restaurer les fonctions mitochondriales dans des pathologies.

Procédures

Durant ce protocole, une cohorte de 36 animaux suivra une série de tests qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi en lipides sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un seul test de tolérance au glucose par souris, dans lequel l'animal reçoit une injection intrapéritonéale de glucose suivi de 5 prélèvements d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un seul test de sensibilité à l'insuline par souris sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie. Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contention afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 48h, ce qui peut être un stress d'isolement. Ce test sera répété deux fois par souris. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. L’échographie sera réalisée une fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris. Enfin, des prélèvements sanguins seront effectués en fin d’étude pour analyser des paramètres biochimiques. Ces prélèvements, un par souris, se font en quelques minutes.

Impact sur les animaux

Durant le projet, les animaux subiront un prélèvement sanguin, qui dure quelques minutes. Nous étudierons les mécanismes de régulation du glucose et la sensibilité à l'insuline. Dans ce protocole, les animaux recevront une injection d'insuline et de glucose, et subiront des prélèvements de gouttes de sang à intervalle réguliers sur une période de 3 heures, afin de suivre leur glycémie. Pour connaitre leur métabolisme énergétique, ils seront isolés pour une période de 48h. Cet isolement permet de connaitre la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre. L’échographie se déroule quant à elle sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée. Enfin, le régime enrichi en lipides peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hyper-toilettage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation génétique sur les organes.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et d'animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests en conditions de régime riche en lipides et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et moléculaires sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro dans le domaine physiopathologique. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire incluant mâles et femelles porteurs des génotypes KO et wild-type. de plus, les groupes contrôles et expérimentaux ont un fond génétique identique. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, nous avons opter pour une approche intégrative où les animaux sont utilisés pour différents tests et analyses. Tous les types de tissus que nous souhaitons étudiés seront prélevés sur chacun des animaux utilisés. Pris dans son ensemble, le design de notre projet permet d'optimiser au maximum la quantité d’animaux nécessaire à sa réalisation.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Ainsi, durant le prélèvement sanguin, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance accrue et quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux sera mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure, si ces derniers sont atteints nous procéderons à l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle expérimental utilisé dans ce projet et le modèle murin, largement utilisé dans le contexte de modifications génétiques. La souris est un modèle établit et solide concernant l’étude des pathologies mitochondriales. En effet, ce modèle permet d'exprimer fortement les syndromes mitochondriaux incluant les atteintes de différents systèmes, l’intolérance à l’effort et les déficits neurologiques. Les animaux seront utilisés à 8 semaines, soit le début de l’âge adulte.

100 mini-porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée pour analyser un organe et la plupart réutilisés pour d'autres tests ou la formation. Chaque animal reçoit une administration unique d'un candidat médicament, par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou sur la peau, suivie de prélèvements de sang répétés. Le porteur indique que le même animal peut être réutilisé après sept jours pour tester une autre molécule ou une autre voie, et évoque un possible placement en association comme le GRAAL. Il affirme qu'un "organisme vivant entier" est nécessaire et qu'aucune méthode in vitro validée n'existe, la peau du porc ressemblant à celle de l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer le devenir de molécules candidats médicaments après administration unique par différentes voies d’administration, afin de déterminer comment elles sont absorbées, distribuées, métabolisées et éliminées de l’organisme. Les informations apportées permettent de modéliser le comportement de la molécule dans l’organisme et de prévoir les doses et posologies pour son utilisation future. Elles contribuent au choix de la voie d’administration pour les futures études réglementaires de toxicologie dans l’espèce non-rongeur, qui seront soumises aux autorités de santé pour l’enregistrement de nouveaux médicaments.

Bénéfices attendus

Les données obtenues permettront de mieux caractériser des molécules candidats médicaments en vue d’une future administration chez l’homme. Elles contribueront au choix de la voie d’administration pour les études réglementaires de toxicologie nécessaires à l’enregistrement du médicament, et au choix des doses thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Chaque animal recevra une administration unique de la molécule candidat médicament, qui pourra être effectuée par voie intraveineuse (1 minute ou 10 min dans le cas d'une injection lente), orale (environ 2 minutes), sous cutanée (30 secondes) ou topique (5 minutes) selon le mode d’administration prévu dans les études de toxicologie réglementaire et en clinique. Des prélèvements sanguins seront ensuite effectués à différents temps après l’administration pour doser la molécule dans le sang. Ces prélèvements pourront s’effectuer sur animal vigile (5 minutes pour la contention et le prélèvement) ou sur animal anesthésié (temps d’anesthésie approximativement 5 min, prélèvement 1 minute, réveil 1 à 2 minutes). Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire à ce type d’étude, le même animal pourra recevoir une nouvelle administration de la molécule par une autre voie d’administration, ou dans une autre formulation, après une période minimum de 7 jours permettant à l’animal de récupérer et à la molécule d’être éliminée.

Impact sur les animaux

- Les administrations et prélèvement peuvent induire un certain niveau de stress, et potentiellement de douleur, qui seront limités par la maitrise des gestes techniques. - A priori, aucun effet toxique des molécules testées n’est attendu après administration unique en raison des doses utilisées dans les études de pharmacocinétique choisies pour n’entrainer aucune toxicité. Toutefois, l’animal sera observé après l’administration afin de repérer toute réaction cutanée liée à l’application topique, ou tout signe de mal être pouvant être lié au traitement et mettre en place un suivi adapté en accord avec les points limites préétablis. - A priori, aucun effet indésirable n’est attendu sur les animaux après les prélèvements sanguins répétés du fait de l’alternance des sites de prélèvement. Un point de compression d’environ 30 secondes sera effectué après chaque prélèvement pour s’assurer de l’arrêt du saignement. Par ailleurs, une attention particulière sera apportée au niveau des sites de prélèvements afin de repérer tout signe inattendu d’inflammation qui pourrait entrainer une douleur chez l’animal. Des fiches d’observation sont mises en place et permettent de suivre les points limites préalablement établis.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux pourront : - soit être euthanasiés si le protocole nécessite le dosage de la molécule dans un organe cible, ou en cas d’effet indésirable sévère inattendu qui n’aurait pas pu être traité après intervention du vétérinaire - soit être réutilisés dans une autre procédure expérimentale pour tester une autre molécule, ou à des fins de formation et de maintien des compétences aux gestes techniques. Cette réutilisation se fera conformément aux dispositions réglementaires en vigueur et après avis du vétérinaire. - soit être replacés dans des organismes pouvant les accueillir et les réhabiliter (type association GRAAL)

Remplacement

Un organisme vivant entier est nécessaire pour caractériser la distribution d’une molécule candidat médicament jusqu’à son élimination de l’organisme. Il n’existe aucune méthode alternative in vitro validée scientifiquement offrant une alternative fiable à l’expérimentation animale pour répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Les molécules évaluées auront auparavant été testées dans des tests in vitro afin de n’évaluer que des molécules présentant un potentiel thérapeutique élevé et ainsi réduire le nombre de mini porcs utilisés dans ce projet. Des groupes de 8 animaux au maximum seront utilisés pour évaluer chaque molécule (4 males et 4 femelles) dans le cas où le sexe de l’animal pourrait avoir un impact sur la distribution de la molécule, par exemple en raison de son mode d’action. Cependant, 4 animaux seront préférentiellement utilisés pour évaluer chaque molécule, ce qui permet d’obtenir des analyses statistiques robustes et une interprétation scientifique des données. Si les études préliminaires générées dans d’autres modèles ont montré une faible variabilité des paramètres influençant la distribution de la molécule, le nombre d’animaux pourra être limité à 3 par groupe. Afin de réduire le nombre d’animaux, un effort sera porté sur l’utilisation d'un même animal pour tester une autre voie d’administration, une autre formulation, ou un autre candidat médicament après accord du vétérinaire. Dans ce cas, un délai minimum de 7 jours sera appliqué pour que l’animal puisse récupérer, et pour garantir l’élimination de la molécule de l’organisme.

Raffinement

Les conditions d’hébergement et de soins sont conçues de manière à réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages que pourraient ressentir les animaux, en conformité avec les législations françaises et européennes. Par défaut, les animaux sont hébergés en box collectifs sur copeaux de bois. Dans le cas d’administration par voie topique, les animaux sont hébergés en box individuels afin d’éviter le transfert du produit d’un animal à l’autre par contact. Dans ce cas, les box individuels permettent de garder un contact visuel et olfactif avec leurs congénères afin de diminuer le stress. Si cela ne nuit pas à l’expérimentation, un fruit pourra également être donné, comme récompense, et le milieu environnemental pourra être enrichi par l’apport de jouets adaptés au mini porc. De la musique peut également être présente dans les salles d’hébergement. Dès l’arrivée des animaux, une période d’acclimatation d’au moins 15 jours sera appliquée avant toute procédure expérimentale afin qu’ils s’habituent à l’environnement, aux conditions d’hébergement, à la présence humaine et aux interactions avec le personnel. La première semaine, les interactions seront limitées à la présence humaine, y compris dans les box avec possibilité de contact physique avec les animaux (palpation des oreilles, cou, dos, pattes…) et habituation à la pesée. A partir de la deuxième semaine, l’habituation aux différentes situations auxquelles les animaux pourront être soumis dans l’étude pourra commencer. Afin de limiter le stress des animaux au moment de l’étude, les animaux seront habitués à être pris dans les bras, placés dans le hamac qui servira aux prélèvements sanguins… Aucun geste invasif ne sera pratiqué pendant cette période. Afin de s’assurer du bien-être animal, les animaux seront observés quotidiennement et les observations notées dans des grilles d’observation afin de tracer tout signe inattendu. En cas d’altération de l’état d’un animal, la surveillance sera augmentée au minimum à 2 fois par jour. En cas de signes de douleur, il sera soigné en appliquant des protocoles analgésiques pré établis adaptés au mini porc. Des points limites adaptés sont pré établis avec un arbre décisionnel permettant de traiter toute souffrance de l’animal en accord avec le vétérinaire

Choix des espèces

Dans le cadre du développement d’un nouveau médicament, la distribution de l’actif dans l’organisme doit être étudiée dans au moins deux espèces animales mammifères dont une espèce non-rongeur, en vue des études de toxicité réglementaires nécessaires à l’enregistrement. Le mini porc est une des espèces non-rongeur fréquemment utilisée en particulier pour les produits en dermatologie administrés par voie topique, en raison des nombreuses similitudes entre la peau de porc et la peau humaine. La quantité de produit dosée dans le sang chez le mini porc servira au choix des doses testées dans les études de toxicologie réglementaires et/ou les études cliniques chez l’homme. L’espèce mini porc est également sélectionnée pour ce type d'étude, parce qu’elle permet de prélever plusieurs millilitres de sang de manière répétée sur le même animal après administration du produit. Les mini porcs utilisés sont âgés au minimum de 6 semaines à réception (animaux sevrés) et au maximum de 12 mois. D’une manière générale, le poids est un facteur déterminant pour la quantité de médicament administré à l’animal (souvent en faible quantité à ce stade de développement) mais également en termes de manipulation de l’animal. Aussi l’âge maximal est fixé à 12 mois pour limiter les difficultés de contention qui peuvent être préjudiciables au bien-être animal. Pour les produits administrés par voie topique, les animaux seront préférentiellement utilisés à partir de 9 semaines. En effet, c’est à cet âge que l’épaisseur de l’épiderme et du derme approche celle de l’homme adulte. Cette similarité est essentielle pour mimer la pénétration cutanée des produits administrés par voie topique.

63 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous anesthésie, puis douze perfusions intraveineuses d'une heure par un cathéter alors qu'elles sont éveillées, avant un prélèvement de sang cardiaque terminal, pour tester un candidat médicament anticancéreux dans un modèle de cancer de la vessie. Le porteur annonce un effet "vaccinal" contre les récidives, à partir de résultats antérieurs, et vise des données précliniques pour un futur essai chez l'humain. Il indique que le cathéter peut s'obstruer et que la pousse tumorale peut gêner la locomotion.

Objectifs

Le TLR3 est un récepteur impliqué dans l’immunité et est exprimé par les cellules normales mais aussi dans de très nombreuses cellules tumorales. L’activation de ce dernier par certaines molécules entraîne une mort spécifique des cellules cancéreuses (mais pas des cellules normales), ainsi qu’une activation de l’immunité ayant un effet antitumoral. La conjugaison de ces deux mécanismes induit une vaccination à long terme contre la tumeur empêchant ainsi les récidives cancéreuses. Des études précédentes ont démontré l’ensemble des effets cités ci-dessus (guérisons complète de 45% des souris traitées et vaccination à vie des souris guéries contre les récidives dans 66% des cas). Ces résultats ont été obtenus lors d’injections intratumorales d’une toute nouvelle famille de molécules activant le TLR3 (spécifique, utilisable en clinique et bien tolérée). Dans la présente étude, le candidat médicament adapté à une injection dans le système veineux (ici perfusion intraveineuse sur souris vigiles sans contention) va être comparé en doses croissantes sur 63 souris dotées d’un cathéter pour déterminer : (1) l’efficacité antitumorale, (2) la tolérance et (3) les mécanismes d’action (dont l’action sur le système immunitaire). Pour ce faire, le modèle de cancer de la vessie sera utilisé pour que l’activité de ce candidat médicament puisse être directement comparable aux études précédentes et à venir.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à démontrer l’efficacité du candidat médicament par voie d’administration en perfusion intraveineuse et à trouver sa dose efficace pour une action anti-tumorale. L’hypothèse est également que ce candidat médicament permettra d’éviter les récidives avec un effet vaccinal. Il est testé ici sur un modèle de tumeur de la vessie mais il pourrait avoir des actions sur une multitude de cancer.

Procédures

- Anesthésie pour identification, tonte, injection de cellules tumorales dans le flanc …. (5 min) - Douze traitements (injection intraveineuse lente par le cathéter) d’une heure sur souris non anesthésiées. - Une anesthésie pour prélèvement de sang intracardiaque suivi d’une mise à mort (10-15 min).

Impact sur les animaux

Les animaux sont reçus déjà dotées d’un cathéter dans la veine jugulaire avec un injecteur double qui est susceptible de s’obstruer. Les animaux subiront un stress lors des contentions, mesures, entretien des cathéter, anesthésies et greffe tumorale. L’anesthésie terminale en vue du prélèvement sanguin intracardiaque peut entraîner l’arrêt du cœur. La pousse tumorale peut engendrer une gêne dans la locomotion.

Devenir

A la fin de l'unique procédure, tous les animaux seront mis à mort avant prélèvements en point final sans réveil (analyses pharmacocinétiques, biodistribution et biomarqueurs).

Remplacement

Pour cette étude, des souris ayant un système immunitaire complet et dotées d’un cathéter sur la veine jugulaire permettant les injections et les prélèvements seront directement reçues du fournisseur. Ces expériences sur petits animaux ne peuvent pas être REMPLACEES. Seul un modèle in-vivo, possédant un système immunitaire complet, permet l'étude de l'effet vaccinal thérapeutique et anti-récidives contre les tumeurs. Il en va de même pour les facteurs physiologiques pouvant influer sur l’effet de la molécule testée (biodisponibilité, métabolisation, distribution cellulaire, réponse immunitaire...). Aucune donnée bibliographique n’étant disponible sur ces molécules, seules les expérimentations permettront de disposer de ces données et d'étudier l'efficacité du candidat médicament aux différentes étapes de la progression tumorale. Ces expériences s'inscrivent dans le cadre du développement d'une application thérapeutique et fournira des données précliniques précieuses pour la conception d'un essai clinique chez l’Homme.

Réduction

Une précédente preuve de concept a permis de déterminer que le nombre de souris prévu pour cette expérience était adapté. Ainsi, la REDUCTION du nombre d'animaux sans mettre en péril une interprétation statistique des résultats sera respectée, tout en utilisant les méthodes statistiques adaptées. Des études statistiques seront effectuées sur les mesures de croissances tumorales et sur le nombre de tumeurs n’atteignant pas une taille critique.

Raffinement

Le RAFFINEMENT sera respecté par la mise en place d’une définition précise des points limites précoces et prédictifs, sur la base d'une grille de score validée sur ce modèle et sur ce type de traitement. Une surveillance adaptée des animaux 3 fois par semaine permettra d'éviter toute souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 et isolés pendant le temps du traitement dans des cages transparentes et pourront ainsi se voir à travers les parois. Ils auront accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’à de l’enrichissement. Un prélèvement de sang aura lieu à la fin de 2 des 12 traitements sans que l’animal s’en rende compte par le cathéter. Les autres prélèvements seront des prélèvements terminaux pratiqués sous anesthésie et antalgie. Ce modèle se rapproche donc physiologiquement d’une infusion clinique sur l’Homme. Ce dispositif permet aussi de ne pas piquer plusieurs fois dans la même veine, ce qui peut l’abîmer.

Choix des espèces

La souris est un modèle mammifère bien caractérisé pour les études pharmacologiques et immunologiques : (1) En plus d’être un modèle pertinent, la souris est un modèle de petite taille, facile à manipuler et génétiquement bien caractérisé, avec des grilles de comparaison entre la souris et l'homme très bien définis pour les perfusions intraveineuses. (2) La réponse immunitaire chez cette espèce est également très bien définie. Or, seul le modèle animal possédant un système immunitaire complet permet l'étude de l'effet vaccinal contre le cancer. Les expériences s’effectueront sur des souris de 9 à 11 semaines après 7 jours d'acclimatation dans l’EU. A ce stade de développement, la croissance tumorale est plus reproductible et bien tolérée, de plus, le système immunitaire est suffisamment mature pour induire une réponse vaccinale. Les souris utilisées seront toutes des femelles afin de limiter le risque d’agressivité inter-individu par rapport aux mâles. De plus, les études précédentes ont également été effectuées sur des souris femelles, ce qui permettra de comparer les résultats de cette étude.

2 259 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales ou un produit cancérigène suivi d'un agent provoquant une inflammation du côlon, puis sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs organes, afin d'étudier le rôle des lymphocytes T régulateurs dans les cancers. Le porteur indique un risque de prolapsus rectal et une perte de poids, et renvoie ses retombées thérapeutiques éventuelles chez l'humain à un horizon lointain. Il affirme que la complexité du développement tumoral impose l'animal et revendique une expertise de plus de vingt ans pour fixer les effectifs.

Objectifs

Les cancers représentent la première cause de décès en France. L'immunothérapie a permis de faire des avancées spectaculaires dans leur traitement. Des recherches précliniques et cliniques laissent espérer une augmentation du nombre de patients que nous pourront traiter dans le futur. Notre projet s’inscrit dans cette perspective. Il est maintenant clairement établi qu’une population de cellules du système immunitaire qu’on appelle lymphocytes T régulateurs, appelés plus simplement « Treg », a un rôle délétère dans les cancers en inhibant fortement les réponses immunes contre les tumeurs. Certains traitements efficaces en immunothérapie des cancers agiraient par destruction des Treg. L'objectif de ce projet est de mieux comprendre le rôle joué par les Treg dans la physiopathologie des cancers et de proposer de nouvelles approches thérapeutiques. Du fait de la complexité des mécanismes physiopathologiques impliqués dans ces maladies, nous devons avoir recours à l'animal pour mieux comprendre ces mécanismes et tester de nouvelles approches thérapeutiques. Le rôle fondamental du microenvironnement dans le développement tumoral ne peut être reproduit et analysé dans des modèles de culture cellulaire. Il est d'ailleurs important de rappeler ici que toutes les avancées récentes en immunothérapie des cancers proviennent directement de données obtenues d'abord chez la souris. On voit donc l'intérêt de pouvoir tester ces approches chez la souris avant de pouvoir les appliquer à l'homme. Nous allons travailler sur le rôle joué par certaines molécules exprimées par les Treg infiltrant les tumeurs ou impliquées dans la régulation du métabolisme de ces cellules. Pour ce faire, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dans lesquelles l’expression de ces différentes molécules est éliminée dans les seuls Treg. Mieux comprendre le rôle de ces molécules dans les Treg permettra de mieux comprendre la physiopathologie des cancers. De plus, le ciblage de certaines de ces molécules dans les Treg pourrait amener à de nouveaux traitements des cancers. C’est l’objectif général de ce projet.

Bénéfices attendus

Grâce à ce travail, nous espérons avoir une meilleure connaissance de la biologie des Treg en général et plus particulièrement de la physiopathologie des cancers, notamment concernant la régulation de ces maladies par les Treg. A terme, les résultats de ce projet pourraient permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques chez l’homme.

Procédures

Le projet comprend 2 procédures. Pour la première procédure, l’expérience débutera par l’injection de cellules tumorales sous la peau chez des souris anesthésiée et maintenues sur une plaque chauffante. L’injection en elle-même des cellules ne durera pas plus de 30 secondes et l’anesthésie durera moins de 5 minutes par souris. On effectuera ensuite un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal, la taille des tumeurs avec un pied à coulisse et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 90 secondes par souris. Pour la mesure de la taille des tumeurs, on fera une contention par la peau du cou et pour la mesure du poids des souris, on fera une contention par la queue. Certaines de ces souris seront également traitées 10 à 17 jours après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 18 ou 30 jours après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris). Pour la deuxième procédure, le début de l’expérience consistera à injecter un produit carcinogène. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Puis, on donnera dans l’eau de boisson un produit déclenchant une inflammation dans l’intestin qui va favoriser l’apparition d’un cancer du colon sur le long terme. Ce dernier produit sera administré 3 fois (à 1 semaine, 4 semaines et 7 semaines après le début de l’expérience) pendant 1 semaine. On effectuera un suivi quotidien des souris pour mesurer le bienêtre animal et le poids des animaux. Le tout prendra moins de 20 secondes par souris. Certaines de ces souris seront traitées pendant 1 semaine, 6 semaines ou 9 semaines après le début de l’expérience avec une molécule non toxique, le tamoxifène. Le tamoxifène sera administré soit par voie orale sous la forme de croquettes alimentaires complémentées soit injecté par voie intra-péritonéale une fois par jour. Ces injections dureront moins de 20 secondes par souris dont on fera une contention par le cou. Enfin, ces souris, seront euthanasiés 12 semaines après le début de l’expérience par dislocation cervicale (compter 5 à 10 secondes par souris).

Impact sur les animaux

A l'état basal, aucun phénotype dommageable n'a été reporté ou observé au laboratoire pour les différentes lignées utilisées dans ce projet. L’inoculation des 3 lignées tumorales n’entraine pas de douleur systémique spécifique. L'induction du cancer colorectal provoque l'apparition de tumeurs dans le colon distal en 1 à 3 mois avec risque de prolapsus rectaux et une perte de poids inférieure à 10% du poids initial. Le traitement par le tamoxifène entraine une perte de poids modérée (

Devenir

Les souris seront euthanasiées pour pouvoir prélevez de nombreux tissus biologiques (rate, ganglions, tumeurs, colon etc…) sur lesquels on effectuera des analyses cellulaires et immunologiques multiples.

Remplacement

Etant donnée la complexité du développement des cancers, seule l'expérimentation animale permettra une approche intégrée de la compréhension des mécanismes impliqués. Nous utiliserons la souris dans la mesure où c’est un modèle de référence d’étude des cancers et que nous avons développé au laboratoire des modèles de souris génétiquement modifiées uniques qui permettent de répondre aux questions soulevées par ce projet. Dès que possible, on effectuera un remplacement partiel de la souris par des expériences de culture cellulaire et par des analyses bio-informatiques.

Réduction

REGLES GENERALES. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Du fait de la variabilité de maladie interindividuelle entre souris, nous utiliserons 7 souris par groupe pour les analyses de croissance tumorale, d’immunophénotypage par cytométrie de flux et d’analyse histologique. Les groupes seront constitués de 4 souris pour les analyses transcriptomiques. Les expériences seront répétées 3 fois. Nous ne pouvons descendre en dessous de ces valeurs. La taille des effectifs et le nombre de fois où les expériences seront reproduites ont été établis en tenant compte de l’expertise que nous avons développée depuis plus de 20 ans. Nous procéderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. STRATEGIE D’ANALYSES GROUPEES. Dans la plupart des cas, nos études portent sur des analyses multifactorielles. Une approche de réduction du nombre d’animaux utilisés est de réaliser les expériences sur différentes lignées de souris génétiquement modifiées en même temps afin les comparer entre elles et par rapport au même groupe témoin. STRATEGIE D'UTILISATION DE SOURIS GENETIQUEMENT MODIFIEES HOMOZYGOTES. Dès qu'il sera possible de le faire, nous maintiendrons nos souris génétiquement modifiées à l'état homozygote pour les transgènes. De cette façon, toutes les souris seront utilisables pour les expériences. STRATEGIE D’OPTIMISATION DES ANIMAUX EUTHANASIES. Nos études in vivo portent sur l’analyse de différents organes. Ainsi pour chaque animal euthanasié nous prélèverons le maximum d’organes afin de collecter et conserver le plus de données possibles par animal. L’ensemble de ces stratégies permet de réduire le nombre de souris utilisées à un total de 2259 pour l’ensemble du projet.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont optimisées pour réduire douleur, souffrance ou stress. Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum dans des cages de Longueur 36,50 cm, largeur 20,5 cm et hauteur 12,5 cm). Les animaux sont regroupés de façon à éviter les combats et permettre l'installation d'une hiérarchie stable et non conflictuelle. L'isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi pour permettre aux souris de faire un nid avec des lanières de papier Kraft. L’état général des animaux (apparence physique, changement de comportement) sera suivi quotidiennement par le personnel qualifié de l'animalerie et par les expérimentateurs au moins 3 fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mis en œuvre (euthanasie ou arrêt du protocole). Toute observation de souffrance animale (blessure, prostration, poil hérissé, modification majeure du comportement, expression faciale particulière indiquant des signes de souffrance) fera l’objet d’un avis au vétérinaire responsable de l'animalerie et sera suivi de l’application de ses conseils en tant qu’expert. Une discussion sera engagée pour déterminer s'il y a lieu d'administrer un analgésique et si oui lequel. Le choix dépendra de l'intensité et de la durée de la douleur éventuelle. En pratique si on trouvait un animal qui présente des signes de souffrance, soit nous l'euthanasions et le sortons de l'étude soit on lui donne un analgésique. En général, on choisira plutôt de le sortir de l'étude car les analgésiques peuvent interférer avec le système immunitaire. La dentition de chaque souris sera vérifiée régulièrement.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. De nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et Homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. Le modèle d’induction de cancer du colon est un modèle préclinique mimant la pathologie humaine. L’utilisation de souris génétiquement modifiées nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche. Pour l’ensemble des expériences, celles-ci seront initiées chez des jeunes adultes de 6 à 12 semaines d’âge, à un moment où le système immunitaire est mature.