Procédures modérées

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein ou du poumon, puis un traitement par gavage pendant trois à six semaines, pour comparer un dosage adaptatif des anticancéreux au dosage maximal habituel. Le porteur indique que la greffe provoque une douleur modérée sous anesthésie et que la tumeur sera limitée à 2 000 mm3, toutes les souris étant tuées pour analyser les cellules tumorales. Il affirme avoir déjà travaillé sur cellules en culture et par modélisation mathématique, mais juge le passage à l'animal nécessaire pour reproduire la formation des tumeurs.

Objectifs

Le cancer du sein est la première cause de mortalité des femmes par cancer en France, avec plus de 12.000 décès par an. Chez l’homme, le cancer du poumon est le plus mortel avec > 22.000 décès / an. L’échec thérapeutique dans les deux cancers est causé par le développement d’une résistance cellulaire aux drogues. L'approche conventionnelle d'administration d'anti-cancéreux consiste à donner les Doses Maximales de drogues Tolérées par les patients (MTD). Toutefois, en raison du grand nombre de cellules cancéreuses et de leur hétérogenéité, cela conduit inévitablement à une sélection de cellules qui sont adaptées pour résister aux traitements, et qui sont responsables des rechutes. Cette sélection des cellules résistantes par les thérapies est un problème d’écologie, et les écologistes ont conclu que le meilleur moyen de limiter les effets néfastes des éléments nuisibles est de les contrôler plutôt que de tenter de les éradiquer. Transposé au cancer, cela consisterait à appliquer des régimes adaptatifs de drogues où l'on diminue la dose si la charge tumorale diminue. Cela permettrait de maintenir une compétition cellulaire entre cellules sensibles aux traitements et cellules résistantes, tout en limitant les effets secondaires des drogues. Bien que cette "Thérapie Adaptative" (AT) connait déjà des succès dans la clinique, les paramètres essentiels pour l’implémenter, et les mécanismes cellulaires et moléculaires en jeu, restent inconnues. Nous avons récemment montré par une combinaison de modélisation mathématique et d'expériences à partir de cellules cancéreuses en culture, que la compétition entre cellules sensibles et résistantes est réelle et détermine l’efficacité de l’AT. Dans nos expériences, des régimes avec des faibles doses de drogues contrôlaient mieux la croissance des cellules cancéreuses dans le temps que des doses plus élevées, tout en évitant l'apparition de cellules résistantes. Ces expériences sont publiées dans une revue internationale. Comme il s'agit d'utilisation exclusive de cellules en culture, notre stratégie est conforme à la première règle des 3R (remplacement). Cependant, il est important de maintenant procéder aux expériences chez l’animal pour mieux reproduire la tumorigénèse, afin de mieux comprendre comment implémenter l’AT chez l’homme. Le but de ce projet est de tester les avantages et mécanismes de l'AT in vivo chez la souris dans des modèles cliniquement relevants de cancers du sein et du poumon.

Bénéfices attendus

La réussite de ce projet serait d'une importance majeure, car il permettrait d'envisager des essais cliniques avec des drogues déjà autorisées mais jusqu'à présent inefficaces pour lutter contre la résistance. Les avantages de l'AT seraient un gain de temps de survie des patients et la diminution des effets secondaires. L’AT est potentiellement applicable à n'importe quel cancer et n'importe quelle drogue.

Procédures

Greffes de cellules cancéreuses une fois, et traîtement avec des inhibiteurs de kinases par gavage orale une fois par jour pendant 3 à 6 semaines.

Impact sur les animaux

La greffe des cellules tumorales chez la souris engendrait une douleur modérée mais sera réalisée sur souris anaesthésiées. La croissance des tumeurs sera limitée à une taille maximale de 2000mm3, ce qui n'engendre pas de douleur. L'application des drogues par le gavage des animaux implique une nuisance transitoire mas pas de souffrance sévère ni durable. Les drogues utilisées n'ont pas d'effets secondaires chez la souris aux doses utilisées.

Devenir

L'intégralité des animaux sera mise à mort pour éviter de dévélopper des souffrances et pour permettre l'analyse des cellules cancéreuses des tumeurs.

Remplacement

Nous avons déjà analysé in vitro des paramètres relevants des cellules de cancer mammaire (4T1) et du poumon (PC9) sensibles ou résistants aux drogues, et avons également réalisé la modélisation mathématique de ces données. L'ensemble de ces études nous a permis d'identifier et préselectionner les conditions d'intérêt. Mais il n'existe pas d'approches, autre que l'expérimentation in vivo chez l'animal, pour évaluer l'efficacité des différents régimes de drogues sur la diminution de la progression tumorale et de la résistance.

Réduction

Nous avons conçu les expériences pour utiliser le minimum d'animaux permettant de tirer des conclusions statistiquement robustes. Dans chaque expérience, nous comparerons la progression tumorale dans les souris nude entre deux groupes. Chaque expérience prévoit l'utilisation de 10 souris dans le bras AT et 10 dans le bras MTD, à répéter une fois si les résultats sont prometteurs. Ceci donne lieu à 80% puissance pour détecter un effet de différence de 10% avec une confiance p

Raffinement

Les expériences sont conçues pour éviter la souffrance des animaux, selon la règle 3R (raffinement): par exemple en arrêtant les expériences avant les signes de souffrance et en surveillant quotidiennement les animaux pour les points limites correspondant à des signes de souffrance. Les conditions d'hébergements sont les suivantes: 5 animaux par cages (501 cm2) avec pour litière un mélange de sciure de peuplier et de copeaux de peuplier

Choix des espèces

Les modèles choisis (greffe sous cutanées dans des souris nude) sont cliniquement relevants, ayant conduit à des essais cliniques qui ont permi l'approbation des drogues utilisées chez les patients. 8 semaines : il faut des souris adultes jeunes et du même stade pour les expériences de tumorigénèse afin de réduire la variance et diminuer le nombre d'animaux utilisés.

Tués puis autopsiés à la fin de la procédure, pour évaluer en histopathologie l'impact de la chirurgie et des ponctions, 6 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie d'environ 1 h 30 sous anesthésie, avec intubation, pour poser un cathéter intrathécal au niveau lombaire ou de la cisterna magna, puis des injections et des prélèvements de liquide céphalo-rachidien réalisés éveillé, en siège de contention pendant 15 à 20 minutes, jusqu'à huit prélèvements en 24 heures. Le porteur reconnaît que ces actes "peuvent engendrer des atteintes neurocomportementales et de la douleur" et présente le projet comme la validation d'une technique destinée aux études réglementaires de toxicologie. Il décrit pourtant ces ponctions sur primate éveillé comme réalisées "avec un minimum d'impact sur les animaux", l'absence d'anesthésie faisant partie de son argument.

Objectifs

L’objectif du projet est le développement et la validation du cathétérisme intrathécal (lombaire et cisterna magna) pour l’administration de candidat médicament chez le primate non-humain. Ce modèle permettra de répondre aux exigences réglementaires dans le cadre de l’évaluation de la sécurité des produits pharmaceutiques utilisant des stratégies thérapeutiques innovantes du système nerveux centrale qui seront injectés par voie intrathécale chez l’homme.

Bénéfices attendus

La validation du modèle de cathétérisme intrathécal chez le primate non-humain va permettre le développement d’études de toxicologie reglémentaires qui sont nécessaires pour démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques (notamment pour le développement de thérapie innovante telle que la thérapie génique administrée par voie intrathécale chez l’homme). Le cathétérisme va permettre de réaliser des administrations et/ou prélèvements de LCR (liquide céphalo-rachidien) répétés avec un minimum d’impact sur les animaux (pas d’anesthésie car les animaux seront vigiles et la contention physique minimale). De plus, de part le nombre de prélèvements de LCR possible par animaux (maximum 8 prélèvements en 24h), le modèle de cathétérisme permettra de minimiser le nombre d’animaux par groupe nécessaire à l’évaluation de la sécurité du médicament et de son profil toxicocinétique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une chirurgie de mise en place d’un cathéter intrathécal sous anesthésie volatile (après intubation endotrachéale), avec surveillance anesthésique, fluidothérapie et analgésie périopératoires. La durée estimée de la chirurgie est 1H30 environ. Les administrations intrathécales et les prélèvements de LCR seront réalisés sur animal vigile en utilisant un siège à contention adapté, afin de maintenir de bonnes conditions d’asepsie de la peau en regard du port d’accès. La contention sur siège sera d’environ 15-20 min.La procédure chirurgicale et les administrations/prélèvements de LCR peuvent engendrer des atteintes neurocomportementales et de la douleur chez les animaux. Par conséquent, une analgésie préventive, des grilles d’évaluation et des points limites spécifiques seront mis en place afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux.

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale et les administrations/prélèvements de LCR peuvent engendrer des atteintes neurocomportementales et de la douleur ches les animaux. Par conséquent, une analgésie préventive, des grilles d’évaluation et des points limites spécifiques seront mis en place afin d’anticiper toute douleur ou détresse chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront autopsiés à la fin de la procédure afin d’évaluer l’impact de la procédure chirurgicale et des administrations/prélèvements de LCR d’un point de vue histopathologique. Ceci afin de valider le modèle, dans le contexte des études réglementaires de toxicologie.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas d’alternative non animal permettant d’évaluer la sécurité et la toxicité (notamment systémique et neurocomportementale) des futurs candidats médicaments dans le cadre du développement de thérapie innovante, tel que la thérapie génique. Le macaque cynomolgus est un modèle animal phylogénétiquement proche de l'Homme et avec de grande similitude permettant le développement de candidats-médicaments et/ou de formulations innovantes dans les études de toxicologie. L’utilisation de ce modèle permettra de répondre aux exigences réglementaires permettant de démontrer la sécurité des produits pharmaceutiques en développement avant leur mise sur le marché ou les premiers essais cliniques.

Réduction

Le nombre d’animaux dans ce projet a été défini sur la base du nombre minimum d’animaux requis dans les études reglementaires de toxicologie. 3 animaux par type de procédure chirurgicale (implantation du cathéter en zone lombaire ou cisterna magna) correspondent au nombre minimum avec le meilleur compromis entre pertinence scientifique et puissance statistique dans les études de toxicologie, et est suffisant pour la validation du modèle.

Raffinement

Des points limites basés sur le comportement, l’état clinique et la perte de poids sont décrits dans des procédures interne et présentés dans la section point limites de ce projet (section 4.2). Dans le cadre de développement de la technique chirurgicale, un suivi postopératoire sera réalisé (observation clinique et du site d’implantation de manière quotidienne) et des analgésiques sont administrés en per et postopératoire. L’implantation du cathéter sera réalisée sous anesthésie générale volatile (après intubation endotrachéale) avec surveillance anesthésique et fluidothérapie. En raison du potentiel impact des procédures, une évaluation neurocomportementale sera réalisée à deux occasions après chaque adminisration ou prélèvement de LCR.

Choix des espèces

Le macaque cynomolgus est un modèle animal phylogénétiquement proche de l'Homme et présente une grande similitude avec l'Homme permettant le développement de candidats-médicaments et/ou de formulations innovantes dans les études de toxicologie. Or, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le domaine du système nerveux central (SNC) nécessite l’utilisation de voie d’administration spécifique tel que la voie intrathécale. De nombreuses nouvelles stratégies thérapeutiques actuelles du SNC nécessite une homologie phylogénétique ou transcriptomique importante avec l’Homme afin d’évaluer les propriétés pharmacodynamiques du produit mais également les potentiels effets toxiques. Par conséquent, l’utilisation de modèle alternatif non-rongeur (tel que porc et le chien) est innapropriée. La validation du modèle de cathétérisme intrathécal chez le primate non-humain est donc justifié car il permettra l’évaluation préclinique de nouvelle stratégie thérapeutique pour le SNC. Animaux jeunes adultes/adultes mis à disposition par l’établissement utilisateur et représentatifs du stade de développement des animaux utilisés dans des expérimentations ultérieures.

40 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces rats porteurs de la dystrophie musculaire de Duchenne reçoivent 26 injections sur douze semaines et deux prélèvements de sang au sinus de l'œil sous anesthésie, et passent des mesures de force et de fonction cardiaque, pour tester un composé censé renforcer la membrane des fibres musculaires. Le porteur indique que la maladie provoque spontanément une perte de masse et un comportement de "freezing", une immobilité inhabituelle, et que tous les rats sont tués pour les analyses. Il affirme que cette question ne peut être tranchée que chez l'animal vivant, le rat reproduisant la maladie "beaucoup plus fidèlement" que la souris.

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie génétique rare qui touche un garçon sur 3500 à la naissance. Le pronostic de la DMD est très sombre et les jeunes patients meurent prématurément d'insuffisance cardiorespiratoire, en raison de l'absence de la protéine dystrophine dans les muscles striés. La dystrophine connecte l’intérieur de la fibre musculaire à la matrice moléculaire à l’extérieur de la fibre. En l'absence de dystrophine, les fibres musculaires sont affaiblies et fragiles, au point de rompre lors d’une contraction musculaire qui agit comme un stress mécanique. Cela conduit à des cycles répétitifs de régénération et de dégénérescence des fibres, accompagnés d'une inflammation chronique douloureuse, d’une fibrose et d’une perte permanente des fibres musculaires par épuisement de la capacité régénérative des cellules souches. Dans les muscles squelettiques et cardiaque, la liaison à la matrice se fait essentiellement via une protéine appelée intégrine. En condition DMD, les intégrines sont surexprimées par un mécanisme compensatoire. La présence massive d'intégrines à la surface de la fibre musculaire favorise le relarguage de molécule de l’inflammation, à l’origine d’une boucle vicieuse favorisant la fibrose. La stratégie pharmacologique proposée ici consiste à exploiter la présence des nombreuses molécules d'intégrines à la surface des fibres musculaires DMD. L'objectif du projet est d'activer les molécules d'intégrines par une modification de leur forme induite par la fixation spécifique du composé testé. On sait que l'activation des intégrines promeut leur fixation aux molécules de la matrice extracellulaire. Nous posons l'hypothèse que sur notre modèle de DMD, la fragilité de la membrane cellulaire des fibres musculaires initialement induite par la déficience en dystrophine sera compensée par une stabilité renforcée de la membrane, résultant de sa connexion avec la matrice qui agit comme une gaine externe protectrice, avec pour conséquence de réduire la mort des fibres musculaires et pour conséquence fonctionnelle d'accroître le nombre de fibres musculaires actives et ainsi, la force du muscle.

Bénéfices attendus

Notre laboratoire vise à mieux caractériser les mécanismes de la DMD pour les contrer via des thérapies innovantes que nous testons sur un modèle de rat qui mime fidèlement la sévérité de la maladie de l'enfant. Nous proposons ici de traiter des rats malades avec un composé mimant l'activation d’un mécanisme protecteur de la membrane des fibres musculaires, dont nous espérons qu'il améliorera le fonctionnement de l'ensemble des muscles du rat. Ce composé agit en facilitant la résistance de la membrane protectrice qui entoure les fibres musculaires, réduisant ainsi leur mort qui est toujours accompagnée d’une inflammation douloureuse. Le composé réduit aussi la fibrose du muscle, accélérant la récupération motrice. Nous projetons ainsi d'identifier une piste innovante qui pourrait devenir un traitement utilisable chez l’enfant en complément des outils de thérapie génique en cours de développement.

Procédures

Les animaux vigiles sont injectés deux fois par voie sous-cutanée pour induire l'anesthésie/analgésie préalable au prélèvement sanguin (au démarrage de la procédure puis en fin de procédure). Ils sont injectés par voie sous-cutanée pour recevoir le traitement ou le contrôle 2 fois par semaine pendant 12 semaines. Au total, chaque rat recevra 26 injections, chacune d'une durée maximale de 2 minutes, réalisée par une personne très expérimentée et soucieuse de réduire l'impact négatif pour l'animal. L'injection sera réalisée plutôt au début ou en fin de journée pour éviter de réveiller l'animal. Les animaux seront également prélevés deux fois au sinus rétro-orbitaire pour obtenir du sang permettant d'évaluer le bénéfice espéré de la thérapie (biomarqueurs), sous anesthésie générale et locale. La séquence de prélèvement dure au total 1 heure (jusqu'au réveil). Le prélèvement lui-même dure moins de 30 secondes. La durée d'un enregistrement ECG est de 15 minutes. La durée d'un enregistrement pléthysmographie est de 30 minutes. La durée d'une séquence de grip test est de 20 minutes. La durée d'un enregistrement de force est de 90 minutes, anesthésie comprise. Il n'y a pas de chirurgie prévue.

Impact sur les animaux

Il a été montré que le produit administré à une dose 3 fois supérieure à celle que nous administrerons n’est pas toxique chez le rat. Les rats DMD développent spontanément une dystrophie musculaire caractérisée par une perte significative et progressive de masse corporelle. On assiste par ailleurs à un comportement de "freezing" chez les animaux, caractérisé par une absence de mouvements chez les animaux qui semblent se reposer plus que leurs congénères non atteints. Ce "freezing" survient par exemple lorsqu'on prend un animal dans les mains et qu'on le remet dans sa cage. Nous connaissons bien cette évolution de la maladie et ces comportements parfois atypiques, ce qui nous permet de les repérer immédiatement quand ils surviennent. Cela garantit une surveillance très rigoureuse et rapprochée des animaux. Une zootechnicienne est dédiée à cette surveillance. Par expérience des derniers mois, nous n'avons pas à intervenir sur des animaux avant l'âge de 6 mois. La procédure de ce projet inclut des animaux chez lesquels les nuisances de l'évolution spontanée de la maladie sont très limitées et ne semblent pas, en milieu confiné, poser de problèmes particuliers, facilement gérables.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques, cellulaires et moléculaires nécessaires. Tous les animaux, même morts précocement au cours de la procédure, pourront être inclus pour les analyses prévues.

Remplacement

L'efficacité du composé testé sur l’activation des intégrines a déjà été confirmée in vitro et sur des modèles de souris. Sur ces bases robustes, nous souhaitons avec ce projet répondre à la question qui ne peut être obtenue que chez l'animal vivant avec l'ensemble de ses organes en interrelation constante : l’action du composé permet-elle de protéger suffisamment la membrane de la fibre musculaire pour que la masse des muscles des rats DMD traités augmente, que cela confère un bénéfice fonctionnel quantifiable à l’échelle du cœur et des muscles squelettiques, associée à une diminution également quantifiable du remodelage délétère à l’échelle histologique ?

Réduction

Nous avons accumulé beaucoup d'expérience sur les lots de rats DMD traités avec des candidats médicaments (thérapie génique ou pharmacologique). Pour certaines de ces études, nous sommes en train de rédiger les conclusions et avons déjà réalisé les analyses statistiques. Il apparaît que pour chacun des groupes, traiter 6 rats permet d'obtenir in fine des valeurs en nombre suffisant pour confirmer ou infirmer un effet majeur de la thérapie sur l'évolution fatale de la maladie. Par ailleurs, en raison de ce nombre important de projets qui incluent toujours des animaux sauvages (wildtype, WT) et DMD traités avec un placebo, nous avons accumulé des données nombreuses qui nous permettent de documenter avec fiabilité l'histoire naturelle de la maladie, en comparaison avec les congénères sauvages. Il est donc possible de réduire les cohortes de ces animaux. Au bilan, chacun des groupes a pu être réduit à 6 animaux.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont température et hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la réglementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu'ils peuvent marcher et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à 7 ou 8 ratons par cage à l'âge d'un mois. Puis nous réduisons ce nombre progressivement jusqu'à atteindre 3 rats par cage pour les animaux de plus de 600g. L'isolement n'existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Des points limites ont été établis et seront constamment évalués en observant individuellement les animaux chaque jour, week-ends et jours fériés inclus. Tout dépassement des points limites sera suivi d'une action correctrice et en cas d'absence de bénéfice (maladie irréversible), nous procèderons à la mise à mort compassionnelle de l'animal avant qu'il ne souffre. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel autorisé et compétent pour reconnaître, quantifier et atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux.

Choix des espèces

Le rat est une espèce de mammifère appartenant à la classe des Euarchontoglires qui contient également les primates (donc l'humain). À ce titre, le rat phylogénétiquement proche de nous constitue un modèle apprécié. Les récents outils d'édition du génome ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculosquelettiques. Notre nouveau modèle de rat DMD mime la maladie humaine de manière beaucoup plus fidèle que ne le fait le modèle historique de la souris, tout en conservant les atouts des rongeurs (courte durée de gestation, taille raisonnable, longévité moyenne, effectifs plus importants). Il est un excellent complément au modèle du chien dystrophique. En médecine translationnelle, il s'insère entre les données obtenues in vitro et la validation translationnelle du chien dont la valeur est inestimable en médecine de précision (hétérogénéité génétique, épigénome, système immunitaire, partage des facteurs d'environnement, format). Les muscles des animaux âgés d’un à 6 mois sont affectés par la maladie. Il est donc attendu que les différences entre animaux WT et DMD seront marquées et instructives, et que l'évaluation de l'efficacité du composé testé sera pertinente puisqu'intervenant à un moment où la déviation de la trajectoire fibrotique permettra une moindre myonécrose, facilement quantifiable.

2 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante des électrodes dans le cerveau, puis des stimulations électriques répétées de l'amygdale provoquent des crises d'épilepsie, pour tester des molécules antiépileptiques développées par des industriels du médicament. Le porteur indique que ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids, et que l'hébergement en cage individuelle peut aggraver ce stress. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne reproduit les circuits neuronaux impliqués et que les tests sur l'animal vivant sont "indispensables" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les désordres épileptiques représentent l’une des atteintes cérébrales les plus importantes avec une incidence de 0.6 % de la population mondiale. Malgré le développement de plusieurs antiépileptiques ces 30 dernières années, plus de 30% des patients épileptiques n’ont pas leur épilepsie contrôlée par ces traitements qui provoquent de plus de nombreux effets secondaires. Il est donc critique de développer de nouvelles molécules antiépileptiques afin de traiter les patients résistants aux traitements déjà existants et d’améliorer le contrôle de la maladie et la qualité de vie des patients. Ce projet a pour but de tester, sélectionner et valider de nouvelles molécules développées par les professionnels du médicament dans un modèle de rat mimant une épilepsie chronique focale secondairement généralisée. Cette approche repose sur la stimulation électrique répétée afin de reproduire les principales caractéristiques électrophysiologiques d’une forme d’épilepsie humaine : l’épilepsie du lobe temporal. Des études pharmacologiques ont montré l’utilité de ce modèle reposant sur la méthode de l’embrasement, pour le criblage de molécules grâce à la bonne stabilité du modèle une fois établi . Il apparait donc comme un modèle pertinent pour la sélection et la validation de nouvelles molécules antiépileptiques. Ce projet facilitera le développement de nouvelles molécules antiépileptiques plus efficaces et ayant moins d’effets secondaires pour des patients souffrant d’épilepsies non contrôlées efficacement par les traitements actuels.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à aider les industriels du médicament à identifier, sélectionner et valider de nouvelles molécules antiépileptiques afin de palier au manque d’alternatives thérapeutiques disponibles. L’utilisation du modèle de rat embrasé pourrait également permettre d’identifier des cibles potentiellement impliquées dans la génération et/ou la propagation des crises d’épilepsie. Ce projet ajoute une analyse électrophysiologique (en sus de l’évaluation comportementale classiquement décrite) de l’effet sur ce modèle d’épilepsie des molécules testées en caractérisant notamment : les durées, latences d’apparition et amplitudes des crises, et les variations potentielles de seuil d’excitabilité des réseaux observés. Une attention particulière sera portée sur l’effet sur la généralisation ou non des crises induites par la stimulation. L’utilisation de ce modèle dans ce projet pourrait donc permettre d’identifier le potentiel thérapeutique de nouveaux traitements antiépileptiques ou bien leur capacité à ralentir voire arrêter la phase d’épileptogénèse.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une chirurgie d’implantation d’électrodes corticales et sous-corticales, procédure réalisée sous anesthésie générale. Puis des stimulations électriques amygdaliennes de faible intensité et de courte durée (1s) seront réalisées sur l’animal vigile. Une stimulation quotidienne (5 jours sur 7) sera appliquée pendant la phase d’établissement du modèle (2 à 4 semaines). Lors des tests pharmacologiques en aïgu, une administration sur animal vigile maintenu en contention précèdera la stimulation. Ces administrations seront espacées de 72h minimum et ne pourront pas excéder le nombre de 20. Lors des tests pharmacologiques en administration chronique, les injections peuvent être réalisées jusqu’à trois fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Quatre lots de 25 animaux pourront être implantés avec une pompe osmotique sous anesthésie générale, permettant une administration continue des molécules testées. Lors des protocoles de tests pharmacologiques, 4 stimulations électriques maximum auront lieu dans la même journée, deux fois par semaine maximum. En fin d’étude, selon la demande des clients, les animaux subiront une perfusion intracardiaque sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Ce modèle animal implique l’utilisation de stimulations électriques répétées permettant d’abaisser progressivement le seuil d’excitabilité cérébrale. L’intensité de stimulation est progressivement augmentée jusqu’à générer les premières crises épileptiques détectées sur le signal électroencéphalographique. Une fois cette intensité fixée par animal, elle est maintenue pour l’ensemble des stimulations appliquées par la suite. L’animal va présenter à chaque stimulation un ou plusieurs des signes décrits par l’échelle d’évaluation comportementale (échelle de Racine) : ces effets sont observés sur un cours laps de temps uniquement dans les minutes post-stimulation (maximum 2 minutes). En dehors de cette courte période, les animaux ne présentent pas de crises ni de comportements anormaux observables. L’amygdale basolatérale est impliquée dans les mécanismes de défense et les comportements de fuite chez les rongeurs, il est donc envisageable que la stimulation de cette zone aie un impact émotionnel sur l’animal, même si ce potentiel effet n’est pas décrit dans la littérature sur ce modèle. Au cours de la phase de génération du modèle (~15 jours), ces stimulations quotidiennes peuvent induire un stress accru et une absence de prise de poids. De plus, la nécessité d’hébergement en cage individuelle des animaux (afin de préserver l’intégrité des systèmes d’enregistrement) peut potentiellement exacerber ce stress. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une myorelaxation, une sommnolence ou à l’inverse des myoclonies du fait des mécanismes d’action des molécules testées.

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs de stimulation et d’enregistrement de signaux électroenécephalographiques et la mise en place d’un modèle pathologique. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Ce projet a pour but de démontrer l’efficacité de molécules à la fois sur l’épileptogénèse et sur la génération de crises épileptiques. Actuellement, il n’existe aucune alternative in vitro ou modèle computationnel reproduisant les circuits neuronaux impliqués dans leur globalité et pouvant se substituer à ce modèle. De plus, toute demande de mise sur le marché nécessite de prouver l’innocuité et l’efficacité de la molécule testée, les tests in vivo préalables aux essais cliniques sont dans ce contexte indispensables. L’utilisation d’un organisme vivant est donc nécessaire.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en préservant la validité scientifique des expériences menées. Les protocoles d’études sont basés sur des procédures d’études cliniques en utilisant un plan d’étude croisé permettant de réduire le nombre d’animaux et d’augmenter la puissance statistique puisque chaque animal est son propre contrôle. Un nombre minimum final de 16 animaux pour les protocoles pharmacologiques est nécessaire pour obtenir des résultats fiables.

Raffinement

Le projet implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur avec une stimulation électrique répétée de classe modérée. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et l’état général de l’animal. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soins sont optimisées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durables que pourraient ressentir les animaux. Le poids des animaux est également contrôlé de manière continue et hebdomadaire. Les animaux sont hébergés dans des cages individuelles contenant un enrichissement composé de briquettes en bois, de nichoirs en papier kraft et de bâtonets en nylon dédiés spécifiquement aux rongeurs. Afin de minimiser la détresse sociale liée à l’isolement, les animaux sont régulièrement regroupés dans une grande enceinte avec différents éléments (tunnels, briquettes en bois, objets divers). Cette étape d’enrichissement social est réalisée au moins une fois par semaine sous la supervision d’un membre du laboratoire afin d’éviter tout endomagement des dispositifs d’enregistrement.

Choix des espèces

Les modèles animaux sont indispensables pour avancer la compréhension des épilepsies. De précédentes études ont montré la très bonne sensibilité des rats vis-à-vis des protocoles d’embrasement afin de modéliser l’épilepsie humaine. Les activités neurologiques visibles sur les signaux électroencéphalographiques ont des profils similaires à ceux observés chez les patients souffrant d’épilepsie- : début et fin abruptes, oscillations rapides et régulières. Les tests pharmacologiques montrent les sensibilités aux mêmes drogues : suppression ou réduction des crises avec le valproate, le diazepam et l’éthosuximide. Des rats adultes de 5 à 7 semaines seront utilisés dans ce projet. Les procédures seront réalisées au minimum une semaine après l’arrivée des animaux dans notre établissement. L’implantation des électrodes corticales et profondes impose l’utilisation d’un cerveau mature afin que le positionnement des électrodes soit correct, que les connections neuronales soient bien établies et que les animaux puissent récupérer facilement de la chirurgie.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le cerveau, par chirurgie stéréotaxique, une forme agrégée d'alpha-synucléine qui déclenche une maladie proche de la maladie de Parkinson. Le porteur indique que cette inoculation conduirait de toute façon à la mort par paralysie progressive, et que les souris sont tuées dès l'apparition d'une démarche saccadée et de troubles de l'équilibre, avant la paralysie du train arrière. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne permet aujourd'hui de remplacer l'expérimentation animale pour décrire l'extension de ces lésions.

Objectifs

Le projet vise à caractériser la maladie chez la souris génétiquement modifiée M83 après injection dans le cerveau d’une forme particulière d’alpha-synucléine agrégée, non détéctable par les méthodes de laboratoire jusqu'à présent utilisées. L’alpha-synucléine est la protéine majoritaire dans les lésions des maladies humaines assocciées (maladie de Parkinson et démence à corps de Lewy , atrophie multisystématisée), au sein desquelles elle se présente sous une forme agrégée.

Bénéfices attendus

Le projet vise à mieux connaître les relations entre les structures moléculaires de l’alpha-synucléine agrégée et les maladies associées à cette agrégation, par la description approfondie des lésions et des caractéristiques moléculaires observées chez les souris.

Procédures

Les souris font l’objet d’une inoculation par stéréotaxie dans le cerveau de jeunes souris M83 (6-8 semaines) réalisée sous anesthésie générale et locale chez les 40 animaux prévus dans l’étude. L’intervention chirugicale dure 30 à 45 minutes.

Impact sur les animaux

L’inoculation d’alpha-synucléine agrégée est réalisée afin de mesurer le délai d’apparition des premiers signes cliniques moteurs, premier élément de caractérisation dans ce type d’étude. Ceux-ci se manifestent par une démarche saccadée de l’animal et une perte d’équilibre. La confirmation de ces anomalies de locomotion détermine la décision de mise à mort des animaux, avant la survenue d’une paralysie du train postérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du protocole d’expérimentation. En effet, l’inoculation d’alpha-synucléine altérée chez les souris modifiées génétiquement M83 utilisées dans ce projet conduirait irrémédiablement à leur mort suite à la progression d’une paralysie, et leur mise à mort dès l’apparition des premiers symptômes permet de leur éviter des souffrances ultérieures.

Remplacement

Le projet ne peut être réalisé qu’in vivo, visant à évaluer le délai d’apparition des symptomes moteurs et à décrire l’extension des lésions et les altérations de l’alpha-synucléine. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative permettant de remplacer l’expérimentation animale.

Réduction

Les lots expérimentaux conduits jusqu’au stade clinique sont constitués chacun de 14 souris adultes, mâles et femelles, homozygotes et hémizygotes. Cet effectif permet de disposer du nombre d’animaux nécessaire et suffisant aux travaux de caractérisation fondés sur l’examen de la durée d'incubation de la maladie, de la distribution des lésions dans les différentes régions du cerveau et de la caractérisation biochimique de l’alpha-synucléine pathologique. Un lot de 14 souris permet de disposer d’au moins 6 souris, pour les analyses biochimiques et d’au moins 6 souris pour les analyses des lésions du cerveau, prélevés lorsque la maladie apparaît chez la souris. Les autres prélèvements (yeux, intestin, pancréas, sang) contribuent aux travaux menés au laboratoire sur les marqueurs périphériques de la maladie dans ce modèle transgénique.

Raffinement

Pour les inoculations par voie stéréotaxique, l’anesthésie de la peau est réalisée afin de limiter la douleur du scalp. Ceci est réalisé dans le contexte d’un animal par ailleurs soumis à une anesthésie générale par la xylazine/kétamine dont le temps d’action est estimé à 4-5 h, permettant aussi de limiter la douleur post-opératoire. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi pendant toute la durée de l’expérimentation. Les souris sont suivies quotidiennement et de façon individuelle lorsque la maladie apparaît dans le lot expérimental. La maladie se manifeste d'abord par des signes de démarche saccadée et des troubles de l’équilibre dont la manifestation constitue le stade auquel les animaux sont mis à mort. La connaissance des zootechniciens concernant la symptomatologie et son évolution permet ainsi d’éviter que ces troubles évoluent vers une paralysie du train postérieur qui entraînerait des difficultés d’alimentation et un mal-être chez la souris. Une fiche individuelle de suivi pour chaque souris est renseignée, consignant les signes cliniques observés et justifiant la mise à mort de l’animal.

Choix des espèces

Le projet prévoit des inoculations dans le cerveau chez des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines, permettant l’inoculation stéréotaxique des fibrilles dans le striatum, qui sont ensuite entretenues et surveillées cliniquement jusqu’à l’apparition de la maladie avant son délai d’apparition normale lors du vieillissement spontané de cette lignée, lors de laquelle les souris sont mises à mort sous anesthésie générale par ponction ou perfusion intra-cardiaque sans réveil.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris transgéniques Townes développent une drépanocytose avec anémie et atteintes du foie, des reins et de la rate, et reçoivent des candidats médicaments ainsi que des prélèvements de sang répétés au sinus de l'œil sous anesthésie. Le porteur indique que toutes seront tuées en fin de procédure pour prélever leurs organes. Il affirme que la complexité de la maladie impose d'en faire la preuve dans un "organisme intégré" et que le remplacement total par la culture cellulaire est impossible.

Objectifs

Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose, une forme grave d’hémoglobinopathie à transmission autosomique récessive touchant le gène codant pour l’hémoglobine. La drépanocytose se caractérise par une altération de la forme native du globule rouge suite à la formation de polymères d’hémoglobine S mutée. Elle se manifeste des crises vaso-occlusives récurrentes et douloureuses ainsi que par une anémie hémolytique notamment dues à une inflammation vasculaire et un stress oxydant chroniques. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères et multifocaux subséquents rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. Il est donc nécessaire de continuer de développer des médicaments ciblant mieux les mécanismes d'action de la pathologie. Pour cela nous devons évaluer, sur des modèles physiologiques intégrés, l’impact de nouveaux candidats pharmacologiques pour mieux traiter la drépanocytose. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules sur la physiopathologie de la drépanocytose dans un modèle murin transgénique développant la maladie. Dans ce contexte, nous évaluerons l'impact des molécules à tester sur l'érythropoièse, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'hématocrite, la falciformation des globules rouges, ou encore le dosage de l'hémoglobine. L’utilisation de la souris se fera en accord avec la règle des 3R (réduire, raffiner, remplacer). Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum afin de permettre des analyses statistiques solides. Des points limites destinés à limiter l'inconfort et la douleur des souris seront mis en place dans chaque procédure afin de veiller à leur bien-être. Une étude préliminaire pilote permettra de s’assurer de la faisabilité des mesures des paramètres listés ci-dessus et sera suivie d’études principales dont l’objectif sera d’évaluer l’efficacité de futurs candidats médicaments, seuls ou en combinaison avec l’hydroxyurée. Ce projet de recherche nécessitera au total 380 souris sur 3 ans.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer le traitement des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie, l’hydroxyurée. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression de la drépanocytose.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins au sinus rétro-orbital, sous anesthésie isoflurane 3% et suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Dans l'étude principale, les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration dépendra de la demande du sponsor (détails dans le rubrique Procédure 2). Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, un prélevement en point final de sang sera effectué au sinus rétro-orbital. Puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.

Impact sur les animaux

Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique ainsi qu'une augmentation de l'érythropoïèse. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester, en les comparant et ou les combinant au traitement de référence, l’hydroxyurée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet du composé testé sur la physiopathologie de la drépanocytose.

Remplacement

Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.

Réduction

Nous avons une approche en deux temps pour bien définir les meilleures conditions d’expérimentation. Une expérience préliminaire pilote permettra de valider les paramètres à évaluer avant d'administrer les composés à tester dans l'étude principale et de confirmer la robustesse du modèle, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité du modèle transgénique Townes.

Raffinement

Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement. et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur la physiopathologie de la drépanocytose. La souris a été choisie car le modèle Townes a été développé afin de reproduire au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront 7-8 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un diabète leur est provoqué par injection de streptozotocine, puis elles subissent des prélèvements de sang hebdomadaires à la queue et des explorations auditives sous anesthésie, par otoémissions acoustiques et potentiels évoqués, pour mesurer l'atteinte de l'audition. Le porteur indique qu'une souris perdant plus de 20 % de son poids ou montrant un mal-être sera tuée, et que toutes seront tuées en fin d'étude pour prélever les os de l'oreille. Il affirme que ces tests fonctionnels sur l'audition ne peuvent se faire que sur l'animal vivant et qu'aucune méthode alternative ne peut remplacer ce protocole.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de préciser l’impact du diabète sur la fonction auditive sur un modèle de souris : la souris de souche CBA/J Rj (ayant une fonction auditive stable sur près de 2 ans).

Bénéfices attendus

Le diabète représente aujourd’hui la plus fréquente des maladies chroniques puisqu’elle touche près de 6 % de la population. Le diabète est une maladie métabolique qui se caractérise par un excès du taux de sucre dans le sang (hyperglycémie). Actuellement le patient diagnostiqué et pris en charge dispose de nombreuses propositions thérapeutiques plus souples d’utilisation et l’innovation pharmacologique est au coeur des progrès dans le traitement du diabète. Cependant au fil du temps, un diabète mal surveillé et mal géré peut entrainer des conséquences dont les plus fréquentes et les plus connues sont la cécité et les amputations des extrémités (doigts et orteils) ou des membres. Ces complications semblent être induites par la détérioration et l’obstruction des petits vaisseaux ou la dégénérescence des nerfs. Cette atteinte des nerfs est classiquement appelée neuropathie. Par ailleurs, les données de la littérature concernant la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques (de type 1) sont contradictoires. Selon une récente méta-analyses, la prévalence de la surdité serait évaluée entre 5.17% et 48% chez les patients diabétiques de type 1. Une autre étude clinique ne révèle aucune différence significative de la prévalence de la surdité chez les patients diabétiques de type 1 comparativement aux sujets non diabétiques. Les outils d’exploration audiologiques sont-ils assez sensibles pour détecter l’installation d’une atteinte auditive subtile ? De nombreuses études pré-cliniques ont révélé que des pertes massives de cellules ciliées internes, ou de fibres nerveuses pouvaient être sans conséquence sur les seuils liminaires (seuils de détection, déterminés par l’audiométrie). L’atteinte auditive chez les patients diabétiques pourraient donc être sous-estimées car mal évaluée. Il semble donc indispensable de documenter du point de vue fonctionnel et histologique plus précisément sur des modèles murins cette complication « silencieuse » du diabète.

Procédures

- La glycémie sera déterminée par des "prélèvements capillaires" sanguins (gouttes de sang) suite à une légère piqûre au niveau de la queue de l'animal (utilisation de lecteur de glycémie identique au lecteur clinique humaine avec bandelette de prélèvement stérile à usage unique). Cette procédure dure moins de 5 minutes. Cette procédure de détermination de la glycémie est réalisée de façon hebdomadaire. - Injection intrapéritonéale de streptozotocine (1 fois en moins de 2 minutes). Le test pour évaluer si un diabète a été induit par l'apparition d'une neuropathie périphérique, sera effectuée à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%). Par l'insertion de deux paires d'électrodes distantes (une stimulatrice et une enregistreuse du signal) au niveau de la queue de l'animal, une réponse éléctrophysiologique du nerf caudal sera mesurée afin de montrer une possible neuropathie périphérique liée à l'induction du diabète. Une asepsie sera pratiquée sur la queue des animaux par une application d'alcool 70°. Les explorations auditives sont effectuées à 3 reprises (pour une reproductiblité) sous anesthésie gazeuse d'isoflurane (induction à 4% et maintien de l'anesthésie à 1,5%) . Les deux méthodes utilisées dans ces explorations fonctionnelles sont : -Les otoémissions acoustiques : lorsqu’une stimulation acoustique calibrée est appliquée dans le conduit auditif externe, il est possible de recueillir en retour une réponse physiologique acoustique issue d’une population particulière de la cochlée : les cellules ciliées externes. Cette technique de réalisation simple et rapide (5min par animal) renseigne sur la fonction cochléaire et sur la physiologie des cellules ciliées externes. -Les potentiels évoqués auditifs précoces : il est possible à l’aide d’électrodes intradermiques (3 électrodes placées : au niveau de la mastoïde (électrode active), du vertex et au niveau dorsal) de recueillir la réponse électrophysiologique de la cochlée et des voies nerveuses auditives périphériques. Ainsi à l’aide de stimulations calibrées adéquates il est possible de déterminer des seuils auditifs (corrélat de l’audiogramme clinique, pour les fréquences de 8, 10, 16, 24 et 32kHz) et de déterminer des latences de conduction des voies nerveuses (temps de réalisation 15-20min par animal).

Impact sur les animaux

Si les animaux sont diabétiques, une altération de leur état de santé général peut être visible (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…)).

Devenir

A la fin des explorations fonctionnelles, l’euthanasie de tous les animaux sera réalisée au moyen d’une injection léthale d'euthanasiant chimique en vue de prélèvement des os temporaux pour une étude histologique des cochlées. Les animaux ayant reçu une injection de streptozotocine mais ne développant pas un diabète seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2). Les animaux présentant une altération de leur état de santé général (perte de poids supérieur à 20% du poids corporel initial, une attitude inhabituelle traduisant un mal-être) seront euthanasiés (inhalation gazeuse de CO2).

Remplacement

Ce projet a pour but d'évaluer l'impact du diabète induit sur l'appareil auditif chez deux souches de souris (étude fonctionnelle et histologique). Le modèle de diabète induit par la STZ fait référence dans la communauté scientifique. Du fait d’une grande similitude de la fonction auditive de la souris avec celle de l’homme, cette espèce a depuis longtemps été retenue dans notre équipe de recherche. Pour mieux caractériser l'impact du diabète sur l'audition d'un point de vue fonctionnel, les tests auditifs doivent être réalisés sur des animaux vivants. Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal anesthésié, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements dans de prochains projets.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés au minimum, nous projetons d’employer les mêmes animaux diabétiques (n=20) et témoins (n=10) pour les tests fonctionnels auditifs et pour les analyses histologiques. Cependant, dans un premier temps, nous devons déterminer si une seule injection intra-péritonéale de 150mg/kg de streptozotocine induit un diabète chez la souche de souris CBA/J Rj (10 animaux). Pour cela, la glycémie (prélèvement sanguin caudal -1goutte par dosage – animal vigil légèrement contraint) des animaux traités par STZ sera évaluée quotidiennement sur 6 semaines pour déterminer le statut « diabétique » définitif des animaux (selon la souche). Les animaux seront euthanasiés dès statut «diabétique » confirmé (inhalation de CO2). L’étude statistique sera réalisée à l’aide d’un test de Student en comparant les valeurs obtenues de chaque groupe exposé avec les valeurs du groupe témoin pour chaque test fonctionnel aux différents temps du suivi.

Raffinement

Les animaux seront pesés et observés tous les jours (mobilité dans la cage et/ou immobilité, prostration, prise alimentaire). Le comportement général de l’animal, son apparence, la présence d’eau et de nourriture dans chaque cage seront surveillés quotidiennement (7j/7). Si besoin, les souris diabétiques recevront une injection sous-cutanée (s.c.) d’insuline (dissoute dans du sérum physiologique, 0,6UI/souris) tous les deux jours, afin de leur assurer un statut clinique satisfaisant et de limiter l’inconfort dû au diabète. Les explorations fonctionnelles seront effectuées sous anesthésie gazeuse. L’animal sera euthanasié s’il présente un des symptômes suivants : -une perte de poids supérieure à 20% du poids initial, -une attitude inhabituelle traduisant un mal-être (prostration, agressivité, pilo érection,…), -l’apparition d’une altération de l’état de santé général (tumeur, excroissance, prolapsus…). En référence au document « points limites » (The reporting of clinical signs in laboratory animals), tout comportement de léchage excessif, d’autotomie, de prostration ou de vocalisation conduira à l’euthanasie rapide des animaux par inhalation gazeuse de CO2. Les animaux seront habitués à la zone d’expérimentation et aux expérimentateurs la semaine suivant leurs arrivées avant la réalisation des tests et des injections. C’est une procédure habituelle avant toute expérmentation.

Choix des espèces

La souris de souche CBA/J Rj est connue pour posséder une fonction auditive stable sur près de 2 ans. Les animaux utilisés sont âgés de 6 semaines à l'initiation des expérimentations (réception à l'âge de 5 semaines, 1 semaine d'habituation aux conditions d'hébergement). L'appareil auditif de la souris est mature à l'âge de 30 jours.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des greffes de tumeurs murines ou humaines, sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine MIF dans la réponse à l'immunothérapie anticancéreuse. Le porteur indique que la croissance tumorale sera limitée à 300 mm2 pour les tumeurs solides et que les animaux seront tués lorsque les points limites seront atteints, celles qui n'y parviennent pas étant considérées comme "protégées" et tuées elles aussi. Il justifie le recours à la souris par l'impossibilité de reproduire fidèlement l'environnement tumoral et par l'accès aux modèles transgéniques et humanisés.

Objectifs

L’immunothérapie anticancéreuse est une approche dont le succès en clinique a récemment été validé avec l’approbation de stratégies d’immunothérapie visant à traiter des cancers avancés. Ces immunothérapies sont basées sur l’inhibition des points de contrôle immunitaires qui permet d’activer le système immunitaire et sur le transfert adoptif des cellules immunitaires du patient qui ont été modifiées pour reconnaitre la tumeur. Ce projet est dans la continuité de nos études précédentes au cours desquelles nous avons montré que l’une protéine du système immunitaire, appelée MIF, peut contrôler les réponses anticancéreuses de type immunitaire du patient. Ce projet comporte deux parties : 1) Évaluation de la qualité du système immunitaire dans un contexte d’immunothérapie bloquant les immuno-checkpoints chez des souris avec une expression plus ou moins forte de MIF. 2) Étude de l’efficacité anticancéreuse des cellules immunitaires humaines activées in vitro et injectées dans des souris porteuses de tumeurs humaines. Les résultats obtenus devraient donner des informations pour améliorer les immunothérapies en cancer.

Bénéfices attendus

La recherche qui est proposée dans ce projet a par objet d’améliorer les thérapies anticancéreuses de type immunothérapie en ciblant l’effet bénéfique de MIF dans l’activité des cellules T . Nos résultats ont démontré que la cytokine pro-inflammatoire MIF est essentielle pour la réponse à l’immunothérapie anti-PD-1 et l’immunothérapie par transfert adoptif en cancer. Nous avons aussi montré que cette réponse est potentiellement dépendante de l’expression élevée de MIF et que la basse expression de MIF pourrait avoir un effet délétère. Nous avons des agents thérapeutiques qui peuvent reverser l’effet d’une basse expression de MIF et potentiellement reverser l’effet délétère. Les résultats qui découleront de ce projet et permettront d'accroitre nos connaissances sur les immunothérapies en cancer et d’améliorer leur efficacité.

Procédures

Aucun prélèvement sera fait et non plus de procédures chirurgicales. Toutes les procédures seront réalisées lorsque les points limites seront atteints comme décris dans les procédures.

Impact sur les animaux

Les souris seront soit injectées avec des tumeurs murines (MC38,B16) dans les cas des souris 5CATT et 7CATT ou avec des tumeurs humaines (NALM6, Raji ou A549 ) pour les souris NSG. L’injection des tumeurs se fera sous anesthésie à l’isoflurane et la croissance tumorale ne dépassera jamais les 300 mm2 pour les tumeurs solides et plus de 25% des cellules tumorales dans le sang (~3 semaines) dans le cas des tumeurs sanguines.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, lorsque les points limites seront atteints, tous les animaux seront mis à mort. Lorsque l’effet thérapeutique est étudié, les animaux qui n’auront pas atteint le point limite seront considérés protégés et seront mis à mort également par anesthésie à l’isoflurane et dislocation cervicale.

Remplacement

Nous avons réalisé des expériences in vitro (remplacement) au préalable qui nous ont permis de déterminer l’importance de MIF dans notre modèle et le potentiel dans l’immunothérapie en cancer. Pour valider nos résultats nous devons passer dans un modèle de souris pour étudier notre hypothèse dans l’environnement tumorale

Réduction

Les groupes expérimentaux sont constitués de n=6 individus/condition et l’expérience sera réalisée 2 fois ce qui donnera une force statistique fiable. Le fait que ces animaux soient génétiquement les mêmes, permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Le test statistique utilisé sera celui de Wilcoxon univarié en raison de la taille des groupes. L’utilisation des souris de manière indépendante nous permettant d’avoir une réelle puissance statistique. Les expériences ne seront réalisées que deux fois et les rates, et les tumeurs seront analysées sur les mêmes animaux ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux de l’étude.

Raffinement

Les souris chez lesquelles les tumeurs solides et sanguines sont implantées seront examinées tous les jours pour limiter leur inconfort (taille de la tumeur gênant la mobilité, isolation du groupe, absence de toilettage). De plus les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence des éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés à la cage. Également des points limites spécifiques seront appliqués. Ces mesures assureront le raffinement de l’étude

Choix des espèces

Il est impossible de nos jours de reproduire avec fidélité l’environnement tumoral et sa réponse à l’immunothérapie. Pour prouver les mécanismes immunitaires impliqués dans la maladie et tester l’efficacité de l’approche thérapeutique pour améliorer la maladie, nous devons recourir à l’utilisation d’un modèle animal et l’utilisation de la souris nous permet d’avoir accès à des modèles transgéniques et des modèles humanisés. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature

590 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau sous anesthésie pour bloquer localement l'expression d'un gène ou implanter une canule, puis des séances d'imagerie fonctionnelle, une partie ayant les vibrisses d'un côté coupées pendant deux semaines. Le porteur indique que le blocage de ces gènes peut provoquer des troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs, et que la privation des vibrisses induit de l'anxiété et une altération de la mémoire à court terme. Il présente ce travail comme un moyen de mieux comprendre des maladies rares comme les syndromes de Rett, d'Angelman ou de l'X fragile, les souris étant tuées pour prélever leur cerveau.

Objectifs

Les pathologies du système nerveux central ne sont que faiblement couvertes par les molécules thérapeutiques actuelles et l’efficacité des traitements est parfois limitée. Ce constat est d’autant plus flagrant en ce qui concerne les maladies neurologiques rares, qui sont des pathologies très sévères et handicapantes et particulièrement mal comprises. Mieux comprendre les symptômes observés dans ces pathologies constituerait une étape importante afin de guider le développement de nouveaux traitements, adaptés au fort besoin médical chez ces patients. Dans ce contexte, nous nous focalisons ici sur des pathologies orphelines neurologiques liées à la perte de fonction d’un gène, en particulier le syndrome de Rett, le syndrome d’Angelman, le syndrome de l’X fragile et la maladie de Niemann-Pick de type C. Ces maladies se développent dès l’enfance et provoquent des symptômes très invalidants (des troubles cognitifs, moteurs, sensoriels ou épileptiques notamment). Les traitements existants sont extrêmement limités actuellement et ne couvrent que peu de symptômes. Notre objectif est d’étudier par différentes techniques de neuroimagerie l’impact du blocage de l’expression des gènes responsables de ces maladies de manière locale dans le cerveau chez la souris. Cette étude permettra à la fois de répondre à des questions cruciales concernant le rôle respectif des gènes d’intérêt dans ces maladies, et de disposer de modèles animaux ainsi que de biomarqueurs d’imagerie permettant l’évaluation de futurs candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Les besoins thérapeutiques liés aux maladies du systeme nerveux central ne sont que partiellement couverts par les médicaments actuels, en particulier les maladies orphelines génétiques pour lesquelles les rôles des gènes impliqués sont encore mal connus, et les mécanismes cérébraux conduisant aux symptômes sont peu établis. Notre stratégie consiste à étudier quelles sont les altérations de l’activité cérébrale qui sous-tendent les symptômes de ces pathologies. Les bénéfices attendus sont donc une meilleure compréhension de ces pathologies orphelines, et permettront de guider le développement de candidat-médicaments futurs grâce à l’identification des paramètres qui sont altérés de manière significative en imagerie.

Procédures

La quasi-totalité des animaux utilisés dans l’étude auront une unique intervention de chirurgie stéréotaxique, toujours sous anesthésie générale et analgésie d’une durée d’1h30 environ pour permettre : - L’injection stéréotaxique d’un vecteur permettant le blocage de l’expression d’un gène - Et/ou l’implantation stéréotaxique d’une canule pour l’imagerie par photométrie à fibre A la suite de cette intervention de chirurgie stéréotaxique des souris seront utilisées pour un unique examen d’imagerie fonctionnelle ultrasonore qui est non-invasif mais réalisé sous anesthésie générale (durée d’une heure). D’autres souris seront utilisées pour un total de deux examens d’imagerie fonctionnelle ultrasonore, toujours sous anesthésie générale, séparés par deux semaines. Pendant ces deux semaines, ces souris seront anesthésiées tous les deux jours pendant 5 minutes par isoflurane ; des souris auront les vibrisses coupées du côté gauche pendant cette anesthésie. Enfin, les souris implantées avec canule seront utilisées pour un unique examen d’imagerie photométrique, avec pour la plupart un examen de tomographie par émission de positons réalisé dans la foulée. La photométrie et la captation du radiotraceur se font chez la souris éveillée et libre de ses mouvements, puis l’imagerie par tomographie se fait chez la souris anesthésiée (pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le blocage de l’expression des gènes en question sera susceptible de provoquer des symptômes neurologiques (troubles sensoriels, moteurs ou cognitifs) chez les animaux. Néanmoins, comme ce blocage n’aura lieu que dans une petite zone (contrairement aux patients) nous prévoyons des troubles légers survenant quelques jours après l’injection, similairement à de précédentes études utilisant des approches similaires (par exemple des atteintes transitoires des réflexes, ou encore des troubles de la mémoire et des interactions sociales dans des modèles rongeurs du syndrome de Rett avec déficience localisée du gène). Concernant la privation des vibrisses d’un côté pour une des procédures, il est rapporté qu’une privation chronique des vibrisses droites et gauches produit des symptômes légers d’anxiété et d’altération de la mémoire à court terme. Des symptômes similaires pourraient survenir durant les 2 semaines de privation que nous envisageons. Les chirurgies telles que l’injection stéréotaxique des vecteurs ou l’implantation de la fibre peuvent causer une douleur, elles seront donc réalisées dans un état d’anesthésie générale, et sous analgésie.

Devenir

De part la nécessité de prélever les cerveaux pour des analyses post-mortem, tous les animaux à la fin des procédures seront mis-à-mort.

Remplacement

La complexité des pathologies étudiées ne peut pas être reproduite exclusivement par des modèles in vitro, dont l’utilisation est préalable à cette étude (l’efficacité des séquences shRNA est notamment évaluée au préalable sur des cultures cellulaires). Pour comprendre l’impact du blocage de l’expression des gènes d’intérêt dans le cerveau en conditions réalistes, il nous faut travailler chez l’animal vivant, afin de pouvoir établir des parallèles avec les maladies observées chez les patients et évaluer des processus physiologiques pertinents tels que la connectivité fonctionnelle entre aires cérébrales, ou encore la sensibilité à des stimulations sensorielles extérieures. De plus, ces travaux permettront d’établir des modèles animaux et des biomarqueurs in vivo pour l’évaluation de futurs candidats-médicaments, dont l’efficacité devra être vérifiée chez l’animal avant passage à l’humain.

Réduction

Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique et nous prévoyons 2 animaux supplémentaires en cas d’échec éventuel de la chirurgie. Puis les données expérimentales générées seront traitées à l’aide de tests statistiques selon les paramètres évalués. La validation du déficit local d’expression des gènes d’intérêt sera systématiquement effectuée au démarrage de l’étude pour vérifier l’impact des vecteurs sur les gènes d’intérêt avant toute utilisation des animaux en imagerie. Les mêmes animaux effectueront les examens d’imagerie comme la photométrie et la Tomographie par Emission de Positons de manière à réduire le nombre d’animaux final.

Raffinement

L’injection stéréotaxique sera réalisée sous anesthésie générale et locale, et analgésie générale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce a une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés au modèle. En cas de signes de détresse, la procédure serait interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. L’environnement sera enrichi avec morceaux de bois, boites ou cylindres et nourriture en pâtée après la chirurgie.

Choix des espèces

La souris est l’espèce pour laquelle l’impact comportemental d’une inactivation des gènes d’intérêt est connu, parfois en lien avec des régions particulières du cerveau, ce qui nous apporte des informations précieuses sur les régions à cibler dans notre approche locale, et permettra une comparaison des données de la littérature avec nos propres résultats. A l’inverse, nos résultats seront intéressants pour la communauté scientifique car ils apporteront des informations spatiales et temporelles plus précises sur le rôle des gènes d’intérêt. De plus, la souris est une espèce idéale pour l’utilisation de notre dispositif d’imagerie cérébrale ultrasonore, car l’épaisseur restreinte du crâne permet un passage des ultrasons et une qualité d’imagerie suffisante dans des conditions non invasives. Des études précliniques ont montré que l’inactivation tardive de certains gènes chez la souris adulte produit un décours de la pathologie similaire à une inactivation embryonnaire. Pour d’autres gènes, plusieurs arguments suggèrent également une importance du maintien à l’âge adulte de ces gènes notamment pour le maintien de la plasticité synaptique. Cette question est cruciale sur le plan clinique étant donné que le diagnostic de ces pathologies survient habituellement tardivement par rapport au stade de développement du cerveau. Il est donc important de savoir si corriger le déficit d’expression du gène après une maturation avancée du cerveau peut suffire à améliorer la qualité de vie des patients. C’est pourquoi nous souhaitons utiliser des souris adultes afin de mieux caractériser le rôle de ces gènes d’intérêt à ce stade. Notre approche par injection locale de vecteurs est particulièrement adaptée à cette problématique puisqu’elle permet de contrôler à la fois la localisation et le moment où le gène devient déficitaire.