Procédures modérées

972 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie appartient à des lignées privées d'une ou deux copies des gènes CYP24A1, SLC34A1 ou SLC34A3, et les souris subissent avant le sevrage l'amputation de phalanges, une au plus par patte, puis jusqu'à trois isolements de 96 heures en cage métabolique, jusqu'à six anesthésies par injection, quinze administrations orales en un mois et jusqu'à trois prises de sang, avec un suivi jusqu'à 12 mois. Le porteur affirme qu'aucun effet indésirable n'est attendu chez les souris homozygotes, pourtant hypercalcémiques, et prévoit malgré tout des points limites comme l'incapacité à s'alimenter ou un poids inférieur de plus de 15 %. Le bénéfice qu'il met en avant est de "faciliter les études de toxicité préclinique de notre molécule", et il écarte le remplacement en affirmant que la souris est un "organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique".

Objectifs

Ce projet de recherche transversale vise à caractériser l'évolution d'une maladie rare, l'hypercalcémie induite par des excès de vitamine D, et de déterminer l'effet d'un nouveau traitement pour cette maladie sans traitement efficace à ce jour. Pour cela nous caractérisons les souris ayant une inactivation homozygote des gènes dont les variants homozygotes (CYP24A1, ou SLC34A1 ou SLC34A3) ont été identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des excès de vitamine D. De plus, les effets de la perte d'un seul allèle seront déterminés pour la 1ère fois dans cette étude.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus dans ce projet permettront d'améliorer le diagnostic et la prise en charge clinique des patients portants des variants homozygotes. De plus, cela permettra de conclure sur l'effet de l'état hétérozygote de ces gènes, la litterature étant très discordante sur ce point. Enfin, les résultats obtenus chez les souris traitées permettront de faciliter les études de toxicité préclinique de notre molécule, et donc accélérer le developpement de ce candidat médicament.

Procédures

Phalangectomie avant sevrage (10 sec), isolement pendant la mise en cage métabolique (minimum 96h ; maximum 3*96h sur 3 mois) administrations IP pour anesthésie (minimum 1, maximum 6 sur 3 mois, 15 sec par administration), administrations per os (15 sur 1 mois, 15 sec par administration), prélevements sanguins sur animaux anesthésiés (minimum 1, maximum 3 sur 3 mois, 30 sec par prise)

Impact sur les animaux

Les animaux homozygotes sont hypercalcémiques, mais d'après nos expériences précedentes, aucune nuisance ni d'effet indésirable ne sont attendus (e.g. pas de perte de poids, pas de difficulté motrice, pas de signe de souffrance). A ce jour, les souris hétérozygotes n'ont pas été décrites comme hypercalcémiques. Durant la collecte des urines, un stress sera lié à l'isolement dans les cages métaboliques. Aucun effet indésirable n'a été observé précedement chez les souris traitées avec notre molécule.

Devenir

Afin de caractériser l'évolution de la maladie et les effets de notre molécule sur les paramètres biochimiques urinaires et sanguins, l'expression de gènes/protéines et au niveau histologique, tous les animaux seront mis à mort et leurs tissus prélevés et conservés pour des analyses.

Remplacement

L'homéostasie phospho-calcique implique un réseau finement régulé impliquant les glandes parathyroides, l'intestin, les reins et les os. La compléxicité de ce réseau ne permet pas d'étudier les conséquences d'une dysfonction dans des systèmes cellulaires. La souris est un organisme modèle pour l'étude de l'homéostasie calcique, les paramètres biochimiques sanguins et urinaires étant similaires à ceux chez l'Homme.

Réduction

L'expertise du laboratoire dans le phénotypage des souris a permis de déterminer que 12 animaux par groupe (6 males et 6 femelles) est le nombre d'animaux optimale afin d'obtenir des résultats avec une puissance statistique supérieure à 80%. Les tests utilisés seront soit paramétriques soit non paramétriques, dépendant de la normalité des valeurs obtenues. Au maximum, 4 doses seront utilisées. Si la molécule n’est pas efficace à une dose donnée, les doses inférieures ne seront pas testées. Les facteurs comparés seront les paramètres biochimiques urinaires et sanguins et l'expression de gènes/protéines.

Raffinement

Afin de minimiser le stress des souris qui seront isolées en cage métabolique, une phase d’habituation de 3 jours précède le test de 24h à proprement dit. Une partie des souris utilisées dans cette étude étant hypercalcémiques, des modalités de suivi de l’état de santé, des critères d’arrêts ainsi que des points limites seront mis en place (i.e. absence de gain de poids à la puberté, incapacité à s’alimenter, poids inférieurs de plus de 15 %, poils hérissés). Si nécessaire, des analgésiques pourraient être administrés selon les recommendations vétérinaires. L’expertise du laboratoire sur l’étude des voies de signalisation de la vitamine D chez la souris permettra la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées (i.e. points critiques étroitement surveillés). Le nombre d’amputations sera limité à une seule phalange par patte, ne concernera pas le pouce et autant que possible, les pattes postérieures seront privilégiées pour ne pas compromettre la préhension fine que l’animal exerce avec ses pattes antérieures pour manger, se toiletter, interagir et grimper à la grille du couvercle de la cage. Afin de limiter le stress des animaux lors des études longitudinales, ces derniers ne seront placés que 3 fois maximum dans les cages métaboliques, avec une distance de 28 jours entre 2 prélèvements. Lors des prises de sang, un volume équivalent de sérum physiologique sera administré en sous cutanée.

Choix des espèces

L'homéostasie calcique est finement régulée par de nombreuses hormones dont la vitamine D. De nombreuses études réalisées chez la souris ont mis en évidence les mécanismes finement régulés régulant les niveaux de calcium sériques et urinaires, et leur similitude avec les mécanismes chez l'Homme. De plus, les variants identifiés chez les patients atteints d'hypercalcémie secondaire à des exces de vitamine D induisent également cette pathologie chez la souris. Ainsi, le modèle murin est un modèle pertinent pour cette étude. Après le sevrage (4 semaines) et jusqu'à 12 mois, l'objectif étant de déterminer l'évolution de la maladie. Pour le traitement, cette pathologie étant une maladie affectant les enfants dès leur naissance, les souris seront traitées après le sevrage pendant 1 mois.

32 souris vont être infectées par Plasmodium berghei, un parasite du paludisme des rongeurs, et chacune des souris du second lot subit une prise de sang à la queue et une pesée tous les deux jours pendant 30 jours, soit une quinzaine de piqûres. Le jour de leur mise à mort, elles reçoivent une injection intrapéritonéale de bleu Evans qui marque les tissus endommagés, puis sont anesthésiées et tuées par dislocation cervicale, tandis que les 2 souris du premier lot sont vidées de leur sang sous anesthésie dès 7 % de parasitémie, puis décapitées pour récupérer leur cerveau. Le porteur classe ces procédures à un niveau de souffrance modéré, indique que le parasite tue les souris BALB/c au-delà de 80 % de parasitémie et situe les bénéfices attendus dans la "confirmation des résultats in vitro" pour des molécules conçues contre la tuberculose ou des vers parasites. Le second lot compte 35 souris dans la description des procédures et 30 dans la justification de leur mise à mort, et seul ce dernier chiffre s'accorde avec le total de 32.

Objectifs

Ce projet s'inscrit dans un repositionnement médicamenteux. Il vise à déterminer l'efficacité de molécules initialement utilisées pour traiter la tuberculose, des fascioloses ou bien encore des helminthiases, en tant qu'antipaludiques. Lesdites molécules ont préalablement été testées in vitro et sont issues des dernières générations de molécules produites pour les infections précédemment mentionnées. Elles présentent un intérêt chimique car elles n'appartiennent à aucune des familles chimiques antipaludiques déjà utilisées. L’injection au niveau abdominale de bleu evans permet, 1H avant la mort des souris, de marquer les tissus ayant subi des dommages et de les quantifier. Ces tissus sont récupérés après l’euthanasie et soigneusement conservés dans du formamide.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus résident dans la confirmation des résultats in vitro. Une évaluation de la quantité de molécules candidates restantes dans le sang après injection totale est un point important de l'évaluation in vivo pour savoir si ces molécules sont plus ou moins éliminées pendant l'infection. Ce projet permettra de mettre en évidence l'efficacité de nouvelles molécules dans la thérapeutique antipaludique

Procédures

Un premier lot de 2 souris subit un prélèvement veineux à la queue - tous les 3 jours pendant 10 jours et à partir de 7% de parasitémie, une anesthésie et un prélèvement rétro orbitaire seront réalisés - la totalité du sang sera prélevé. Les souris seront euthanasiées (durée 30 minutes) et décapitées pour récupérer les cerveaux intacts. Un autre lot de 35 souris subiront des prélèvements veineux à la queue - tous les 2 jours à compter de J2 (post infection) pendant 30 jours accompagnés de pesée tous les 2 jours à compter de J1 (post infection) pendant 30 jours - Jour de l'euthanasie injection de bleu Evans en ip 50 µL à 50mg/kg, incubation 1h maximum puis anesthésie et dislocation cervicale permettant de collecter le cerveau, le sang et les autres organes. Cocktail kétamine xylasine pour des souris de 18g ; tel que : 100 mg/kg de Kétamine et 10 mg/kg de xylazine.

Impact sur les animaux

Les molécules évaluées sont des molécules qui ont déjà été testées sur des rongeurs ou lagomorphes pour la cytotoxicité et la reprotoxicité et ayant conduit à leur autorisation de mise sur le marché dans le cadre de traitement humain (sutézolide) et vétérinaire (triclabendazole). Les doses utilisées sont en dessous du seuil de toxicité décrits dans la littérature. L'infection par Plasmodium berghei conduit à la mort chez les BALB/c pour des parasitémies supérieures à 80% néanmoins le choix de ce modèle réside également sur le fait que ces souris résistent très bien à des parasitémies élevées en affichant un tableau clinique facile à suivre. Les nuisances correspondent à des contentions, des piqures au niveau de la queue pour prélèvement, des injections intrapéritonéales et l’injection de médicaments candidats pour l’expérience. Dans le modèle de paludisme murin, les souris auront des parasitémies qui à taux elevé (>75%) peuvent entrainer une anémie donc une perte de mobilité et une perte de poids transitoire

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées. L’euthanasie se justifie par le prélèvement de la totalité du sang infecté pour le premier lot de 2 souris - il est également justifié pour le second lot de 30 souris ce qui permet de récupérer rapidement les organes vitaux des souris et le sang pour dosage médicamenteux. Les souris ne peuvent plus être infectée en raison des restes de médicaments et de la prise de poids

Remplacement

Pour ce projet, il n’existe pas de solution viable de remplacement pour le moment. L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques est justifiée par la complexité de la pathologie étudiée, le paludisme. Cette infection parasitaire touche les hématies et l’augmentation de la parasitémie entraine un tableau clinique complexe au niveau des différents organes en raison de l’anémie progressive et l’inflammation croissante liées à l’infection. Ces mécanismes ne peuvent pas être d’étudié dans des systèmes in vitro, ou des bioréacteurs élaborés.

Réduction

La réduction fait partie de notre stratégie d'étude. Elle repose sur une étude bibliographique pour connaitre les dernières études pharmacologiques et antipaludiques en paludisme simple. Le calcul du nombre de sujets dans des groupes de même effectif est donné par une formule mathématique, pour mettre en évidence une différence statistiquement significative entre les deux groupes avec un risque de première espèce alpha égal à 5% et une puissance de 80% Nous prenons 6 souris, tq trois mâles + trois femelles par groupe

Raffinement

Le bien-être des animaux est un point important dans notre projet puisqu’ il est évalué dans notre grille de score. Des abris, des éléments à ronger seront fournis (enrichissement), et la présence de nids réalisés par les souris est vérifiée tout comme leur capacité de fouissement (expression du caractère naturel de l’animal). Les animaux seront hébergés en conditions standard d’animalerie, avec de l’eau et de la nourriture ad libitum. Ils bénéficieront d’une période de stabulation de 5 jours post livraison dans l’animalerie de l’Etablissement utilisateur, puis d’une période de 7 jours pendant laquelle les animaux seront familiarisés quotidiennement à la manipulation par les expérimentateurs. Entre la livraison et l’expérience, les animaux seront placés dans des cages garantissant la surface réglementaire pour chaque souris. Les éventuels signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. La Kétamine (100 mg/Kg) et la Xylazine (10 mg/Kg) avec une injection de 100µL pour 20 grammes de masse corporelle seront utilisés afin de limiter la douleur, notamment pour le retro orbitaire (procédure 1) et les anesthésies avant dislocations cérébrales en fin de procédure 2. De façon générale, Des aiguilles plus fines 29 gauge pourront être utilisées en complément d’une pommade (lidocaine) si les sites d’injection en intrapéritonéal deviennent sensibles pour les souris. En cas de difficulté d'alimentation des croquettes imbibées et des biberons aux tétines plus faciles d'accès peuvent etre également mis en place.

Choix des espèces

Le modèle murin (Mus muculus) est choisi car il est un support idéal pour l'infection par Plasmodium berghei. Il permet l'étude d'un paludisme proche de celui de l'Homme. Il est d'autant plus pertinent car la souche de paludisme murine a un cycle plus rapide que celle infectant l'Homme. Cette caractéristique est très utile dans une étude d'efficacité antipaludique ou pharmacologique pour confronter l'activité antipaludique d'un candidat face un parasite se multipliant rapidement. Nous retenons les souris BALB/C pour cette étude en raison de leur capacité à résister à des parasitémies élevées (entre 60 à 70%) et afficher un tableau clinique facile à suivre. la simplicité et l'efficacité du modèle {BALB/c+Plasmodium berghei} en font un support pertinent pour notre étude d'efficacité antipaludique.

288 souris transgéniques développant une maladie du foie vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien pendant 28 jours, puis un prélèvement sanguin terminal sous anesthésie profonde avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur reconnaît que le gavage sur animal vigile peut provoquer un stress et, rarement, des lésions de l'œsophage. Il vise une "preuve de concept" de l'effet d'un probiotique sur la cholangite sclérosante primitive, dont la transposition à l'homme reste hypothétique, et affirme qu'on ne peut pas recréer in vitro la complexité d'un "organisme entier".

Objectifs

La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie chronique du foie affectant les voies biliaires, souvent associée à une maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI). Plusieurs études ont démontré l’importance du microbiote intestinal dans le développement des MICI et de la CSP. Nous avons identifié une bactérie commensale du microbiote intestinal possédant des propriétés anti-inflammatoires, qui utilisée comme probiotique de nouvelle génération, a un effet bénéfique sur les MICI. Le but de cette étude est d’évaluer l’effet de cette bactérie sur la CSP, en utilisant un modèle murin transgénique qui développe spontanément une pathologie du foie qui mime la CSP. Nous traiterons ces souris en leur administrant le probiotique quotidiennement par voie oral. Nous analyserons leur microbiote intestinal avant et après administration du probiotique afin d’évaluer l’impact de ce traitement sur le microbiote. Nous comparerons le foie des souris traitées par le probiotique au foie des souris traitées par placebo pour évaluer l’effet de la bactérie sur les manifestations de la CSP. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP.

Bénéfices attendus

La cholangite sclérosante primitive (CSP) est une maladie grave exposant au risque de cirrhose et de cholangiocarcinome. Actuellement, le seul traitement efficace de la CSP est la transplantation hépatique. Or ce traitement est réservé aux patients avec une maladie avancée et n’est pas toujours possible en cas de cancer. Il est donc primordial d’étudier d’autres pistes thérapeutiques. Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP et son éventuelle transposition à l'homme dans le cadre du traitement de la CSP.

Procédures

Les animaux seront produits au sein de l’établissement. A 4 semaines, ils seront soumis à un gavage quotidien sur animal vigile (15 secondes/animal) durant 28 jours. A l’issue de la période de traitement (4 semaines), les animaux subiront un prélèvement sanguin terminal unique sous anesthésie profonde (5 minutes) puis seront immédiatement euthanasié sans réveil de l’animal.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris transgénique développe une cholangite sclérosante primitive avec le temps, nous utiliserons ici des animaux jeunes adultes dans lesquels les lésions du foie sont déjà présentes mais à un stade débutant n’entrainant aucun symptôme pour l’animal. Le gavage quotidien sur animal vigile peut être source de stress et d’inconfort pour l’animal. De façon extrêmement rare, il peut induire des lésions traumatiques de l’œsophage. L’administration de la bactérie ne devrait pas entrainer de nuisance en dehors du geste technique (gavage).

Devenir

L’ensemble des animaux (n=288) sera euthanasié à la fin de la période de traitement afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements d’organes et analyser le potentiel effet bénéfique du traitement sur la CSP.

Remplacement

Dans la mise en œuvre de ce projet, un système vivant est nécessaire pour reproduire les interactions foie-intestin mises en jeu dans le développement de la CSP, et l’effet bénéfique potentiel d’un probiotique. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec ces interactions inter-organes et tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. Nous travaillons avec modèle animal (souris transgéniques) reconnu pour cette maladie biliaire afin d’évaluer les effets bénéfiques in vivo d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Un nombre de 12 souris par groupe est prévu afin de pouvoir réaliser des statistiques. Un total de 288 souris sera nécessaire pour la mise en œuvre de ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie si les actes le nécessitent). Dans ce projet, l’administration de la bactérie ne devrait pas entrainer de nuisance en dehors du geste technique (gavage sur animal vigile) mais plutôt un bénéfice pour les animaux avec un ralentissement de la progression de la maladie du foie. De plus, le fait que ce geste soit pratiqué par une personne formée et expérimentée ainsi que l’utilisation de matériel adapté permettent de réduire significativement les nuisances liées au geste technique lui-même.

Choix des espèces

Justification de l’espèce/modèle : Le projet a pour objectif d'évaluer le potentiel bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération dans la CSP. Afin de répondre à cet objectif nous allons utiliser le modèle animal reconnu pour cette maladie biliaire qui est représenté par un modèle de souris invalidé pour un gène qui modifie la composition de la bile (modèle préclinique le mieux validé de CSP). Nous attendons de cette étude la preuve de concept de l’effet bénéfique d’un probiotique de nouvelle génération sur la CSP et son éventuelle transposition à animal/homme dans le cadre du traitement de la CSP. Justification des stades : Dans la grande majorité des études précliniques, les souris transgéniques modélisant la CSP sont traitées entre l’âge de 4 semaines, stade des lésions débutantes, et 8 semaines, stade auquel les lésions atteignent un plateau. Nous suivrons ce schéma validé dans de nombreuses études et débuterons ainsi le traitement chez des souris âgées de 4 semaines lorsque les lésions hépatiques sont débutantes, et ainsi accessibles à un traitement qui permettrait de freiner leur évolution. Justification du sexe : Chez la souris, comme chez l’Homme, la gravité des lésions hépatiques est variable en fonction du sexe. De plus, le même traitement peut avoir une efficacité variable en fonction du sexe. En effet, dans un projet précédent nous avions obtenu des résultats différents chez les souris mâles et les femelles. C’est pourquoi, il est nécessaire d’inclure dans ce projet 50% de souris mâles et 50% de souris femelles.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prélèvements sanguins sur animal vigile, une irradiation destinée à les rendre aplasiques, des greffes de cellules souches, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et une induction de lymphome par des globules rouges de mouton et du tamoxifène, les animaux étant tués dès une perte de poids de 20 % ou un gonflement abdominal. Le projet cherche à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans un cancer du sang humain et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Le porteur affirme que la souris est un modèle "irremplaçable" et qu'"aucun autre système" ne peut s'y substituer.

Objectifs

Le lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL) est un groupe de cancers du sang qui se disséminent dans les organes lymphoïdes. Il est très agressif et la survie du patient atteint de DLBCL se compte en nombre de mois en absence de traitement. Malgré des traitements standards efficaces, environ 30 à 40 % des patients atteints de DLBCL meurent de leur maladie. Ce manque d'efficacité thérapeutique contre le DLBCL a été attribué entre autres par la présence de cellules immunitaires d’origine myéloïde. Ces cellules myéloïdes pourraient participer à la survie et au maintien des cellules tumorales chez des patients atteints de DLBCL, et pourraient aider les cellules tumorales à échapper à la reconnaissance immunitaire, donc pourraient contrecarrer les bénéfices des thérapies administrées aux patients. Jusqu’à présent, toutes les études visant à comprendre le rôle des cellules myéloïdes dans le DLBCL portaient sur des échantillons prélevés sur des patients atteints de DLBCL. Cependant, les accès aux biopsies sont limités : les biopsies ne sont pas fréquentes, et pour celles qui nous parviennent, elles ne contiennent que peu très peu de cellules myéloïdes et tumorales, et ne nous permettent pas de poursuivre des analyses expérimentales poussées. Ainsi, ce projet vise à développer des modèles de DLBCL chez la souris afin de déterminer comment, au cours de la progression tumorale, les cellules myéloïdes alimentent l’expansion des cellules tumorales. Les objectifs de ce projet sont : 1) Analyser les populations de cellules myéloïdes infiltrant les organes atteints par les cellules tumorales ; 2) Déterminer le rôle des populations myéloïdes dans le maintien de la survie des cellules tumorales ; 3) Identifier des cibles thérapeutiques exprimées par les cellules myéloïdes, et les valider expérimentalement. Ce projet en expérimentation animale est critique pour avancer sur notre compréhension du lymphome agressif DLBCL chez l’homme, contre lequel les traitements actuels ne sont pas efficaces à 100%.

Bénéfices attendus

Ce projet en expérimentation animale est essentiel pour plusieurs raisons : - il permet de mieux comprendre comment les cellules myéloïdes favorisent la persistance des cellules tumorales, et la résistance des patients atteints de DLBCL aux thérapies anti tumorales utilisées actuellement en clinique. - il participe à l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques présentes sur ces cellules myéloïdes, qui pourraient être spécifiquement ciblées et/ou neutralisées en clinique pour améliorer les traitements actuellement appliqués, et qui restent sans effet chez des patients DLBCL. - il permet de valider l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements de DLBCL sur des modèles précliniques murins.

Procédures

En ce qui concerne les interventions, aucune intervention chirurgicale n’est prévue dans ce projet. Des prélèvements sanguins via la veine sous maxillaire sont effectués sur animaux vigiles (540 animaux). 560 animaux seront irradiés. Quant aux gestes techniques, le projet comprend des injections intraveineuses et sous-cutanées sur animaux anesthésiés par voie gazeuse (isoflurane et oxygène) (972 animaux), des injections par voie intrapéritonéale (772) sur animaux vigils selon la réglementation en vigueur.

Impact sur les animaux

Dans ce projet d’expérimentation animale, nous réalisons plusieurs gestes techniques nous amenant à : 1) administrer de cellules de lymphome d’origine murine; 2) irradier des animaux pour les rendre aplasiques et pouvoir reconstituer leur système immunitaire avec des cellules souches hématopoïétiques modifiés; 3) effectuer des administrations par voie intraveineuse de cellules immunitaires purifiées; 4) administrer un inhibiteur du développement des cellules myéloïdes par la voie intra-péritonéale, ou administrer des inhibiteurs de la vascularisation des tumeurs par la voie sous-cutanée; 5) induire des lymphomes B par administration de globules rouges de mouton et de tamoxifène. Toutes ces procédures nécessitent de la contention à l’origine d’un stress passager de l’animal (5 minutes). Les procédures impliquant l’administration d’un traitement par voie intrapéritonéale sur animaux vigils entrainent une douleur locale de 2 secondes causée par la piqure de la seringue. Toute autre administration (voie intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvements sanguins) se réalise sur animaux anesthésiés et ne provoque pas d’inconfort le temps de la manipulation. Les injections intraveineuses et les prélèvements sanguins par voie rétro-orbitales entrainent un inconfort passager (5 minutes) de l’oeil qui est soignée par l’application d’un gel oculaire dès la fin de la procédure. L’irradiation n’entraine aucun effet indésirable dès lors que les animaux reçoivent une greffe de cellules souches hématopoïétiques suivie d’un traitement antibiotique continu de 4 semaines. L’immunisation par des globules rouges de mouton et le transfert adoptif n’entraine aucun effet indésirable sur le long terme. L’administration de tamoxifène peut entrainer une perte de poids de 10% le temps du traitement (ici, 9 jours). La croissance tumorale du lymphome peut entrainer une perte de poids dans 10% des cas ou un gonflement abdominal. La mise à mort des animaux concernés sera appliquée dès lors que la perte de poids atteindra 20% du poids total, ou qu’un gonflement abdominal est observé.

Devenir

Les animaux (mus musculus) sont euthanasiés pour effectuer des prélèvements de plusieurs organes, et effectuer des analyses biologiques en laboratoire.

Remplacement

Il nous est à ce jour impossible de recréer grâce à des modèles informatiques ou des modèles de culture cellulaire tous les facteurs physiologiques et environnementaux permettant à une tumeur de se développer, d’être irriguée par le sang, drainée par la lymphe, de modifier son environnement, et d’interagir avec les cellules du système immunitaire. Ainsi aucun autre système ou modèle actuellement disponible ne peut se substituer au modèle murin, modèle animal irremplaçable pour notre projet.

Réduction

Des résultats fiables sont obtenus avec 5 animaux par groupe expérimental, et pour des expériences répétées deux fois. Tous les animaux ont un fond génétique uniforme pour limiter les variations entre les individus et assurer la reproductibilité des résultats. Nous appliquons des analyses statistiques spécifiques à chaque expérience pour déterminer si les différences que nous observons entre nos groupes d’animaux sont exactes et suffisamment fiables pour conclure sur les effets observés, établir de nouvelles hypothèses et avancer dans notre recherche de potentielles molécules candidates pouvant être ciblées dans les lymphomes de type DLBCL.

Raffinement

Les animaux sont gardés en groupes sociaux, avec nids et dômes protecteurs, et suivis quotidiennement. Les analgésiques administrés régulièrement en systémique modifiant les réponses immunitaires étudiées, leur utilisation n’est pas recommandée. La totalité des animaux utilisés dans ce projet et porteurs de cellules tumorales sont mis à mort avant l’apparition de signe de stress ou de souffrance. Cependant, un animal présentant des signes de trouble du comportement et/ou de douleur fera l’objet d’une surveillance accrue, disposera de nourriture humidifiée au fond de la cage pour faciliter la prise alimentaire, et sera mis à mort dès lors qu’il présente simultanément une perte de poids, des troubles du comportement, une déshydratation, et une baisse d’activité. Dans les expériences nécessitant des injections sous-cutanée, intraveineuse et des prélèvements sanguins, les souris sont anesthésiées par voie gazeuse (un mélange oxygène/isoflurane), ou chimiquement.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est proche de celle de l’homme : une étude de la souris nous permet de mieux comprendre le fonctionnement du système immunitaire chez l’homme. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle d’étude le plus simple et le mieux approprié pour 1) Analyser l’impact des mutations génétiques à l’origine des pathologies des lymphomes agressifs de type DLBCL chez les patients, et 2) Visualiser et analyser des cellules myéloïdes qui participent à l’émergence et à la persistance des cellules tumorales dans les tissus tels que la rate, la moelle osseuse et les ganglions grâce à des techniques d’imagerie de pointe (cytométrie, microscopie). Dans ce projet, les animaux utilisés ont atteint l'âge adulte (> 8 semaines d’âge).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit de la lidocaïne et de l'ibuprofène puis est posée sur une plaque chauffée à 55 °C jusqu'à une réaction d'évitement, et reçoit une injection de carraghénane provoquant un œdème, pour tester une libération contrôlée de ces molécules encapsulées. Le porteur reconnaît que les souris témoins, privées d'anesthésique et d'anti-inflammatoire, ressentent une douleur de brûlure plus vive et une gêne à l'oreille. Il affirme que ces systèmes biologiques complexes ne peuvent pas être reproduits in vitro ou in silico.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de concevoir des objets macroscopiques permettant la libération d’une molécule « active » encapsulée dans une matrice de biopolymère mise en forme par un procédé thermomécanique, tel que l’impression 3D, avec une quantité et une vitesse personnalisée à l’utilisateur. L’un des principaux leviers sera la structure poreuse de l’objet qui lui sera attribuée par le procédé. Cette approche ouvre la voie à l’impression -dite 4D- d’objets biopolymères 3D pour une libération de petites molécules en temps contrôlé (4ème dimension), avec des applications possibles dans divers domaines, comme l’ingénierie tissulaire, ou la galénique. En effet, dans le domaine pharmaceutique, la délivrance contrôlée de médicaments constitue un enjeu thérapeutique de première importance. Actuellement, la tendance forte est d’utiliser des polymères naturels pour atteindre ces objectifs

Bénéfices attendus

Les travaux réalisés antérieurement au laboratoire ont montré que des compositions à base de zéine, principale protéine de stockage du maïs, présente un potentiel important, notamment grâce à leur mise en œuvre possible à l’état fondu et aux capacités d’interaction de la zéine avec des molécules d’intérêt thérapeutique. Par ailleurs, les Principes Actifs pharmaceutiques - Liquides Ioniques (PA-LI) sont très prometteurs pour de futurs médicaments, car ils peuvent être facilement dosés et transformés afin d’obtenir des produits pharmaceutiques présentant un franchissement rapide des parois cellulaires et une stabilité importante. L’inclusion d’un PA-LI dans une matrice biopolymère, telle que la zéine plastifiée, permet non seulement de faciliter sa mise en forme, mais aussi d'assurer sa conservation et ensuite sa libération. Parmi eux, le [Lidocaïnium][Ibuprofénate] (LidIbu), présente un triple intérêt : (i) un effet plastifiant sur les biopolymères et deux rôles thérapeutiques, avec (ii) le cation, Lidocaïnium, comme anesthésique local et (iii) l'anion, Ibuprofénate, en tant que composé anti-inflammatoire

Procédures

Pour chacune des souris 2 procédures seront réalisées à deux jours d'intervalle. Pour la première, après injection de la lidocaïne et de l'ibuprofène (soit par gavage soit par voie intrapéritonéale) la souris sera déposée sur un tapis chauffé à 55°C, jusqu'à ce qu'elle manifeste un signe d'évitement à 30min, 60min et 2H. Il y aura donc une injection par souris et puis 3 positionnement sur plaque chauffée à 55°C. Pour la deuxième procédure, après injection de la lidocaïne et de l'ibuprofène (soit par gavage soit par voie intrapéritonéale) la souris est anesthésiée et reçoit une injection de carraghénane avant la mesure de l'oedème à 30 min, 60 min et 2h. Il y aura donc deux injections et une anesthésie sur chaque souris lors de cette procédure.

Impact sur les animaux

Pour les souris contrôles, une douleur plus aigûe de brûlure pourra être ressentie lors du test de la plaque chaude car elles n'auront pas eu l'anti-inflammatoire ni l'anesthésiant. Egalement elle ressentiront une gêne et douleur à l'oreille plus grande que leur congénère lors du test de l'inflammation induite par le carraghénane.

Devenir

Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de la deuxième procédure car elles ne peuvent plus être utilisées pour un autre protocole car elles ont reçu en injection des molécules pharmaceutiques.

Remplacement

Impossible de prendre des mesures de remplacement car on ne peut pas reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes uniquement par des systèmes in vitro ou in silico, notamment la réaction à la douleur lors de tests de molécules pharmaceutiques.

Réduction

Nombre d’animaux réduis au minimum pour être statistiquement relevant c’est-à-dire au moins 10 individus par groupes pour faire des analyses statistiques adaptés.

Raffinement

Seul le personnel expérimenté et qualifié effectuera les expérimentations animales. Ces exigences visent à s’assurer que les procédures nécessaires à l’élevage et à l'expérimentation sont exécutées efficacement, avec les soins appropriés afin de minimiser la souffrance des animaux. Le suivi quotidien des animaux et des signes généraux mais aussi la mise en place lors des procédures expérimentales d'analgésie et d'anesthésie permet de minimiser l'inconfort et la douleur. Le cycle jour/nuit de 12h des animaux sera respecté. Les souris seront stabulées dans les cages d’un portoir ventilé avec un cycle jour/nuit de 12h (température, humidité). Les souris seront hébergées à 4 ou 5 par cage selon les groupes dans un environnement enrichi ( 2 enrichissements) pour limiter l’angoisse et s’adapter à nos expériences

Choix des espèces

Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes et en particulier le système immunitaire uniquement par des systèmes in vitro ou in silico. Ainsi, l'expérimentation animale est un élément vital de ce projet afin de modéliser efficacement la réponse physiologique globale du système. Néanmoins, chaque fois que possible, les études sur les animaux seront remplacées par des systèmes in vitro. Les souris seront au stade de jeunes adultes (6 semaines), âge auquel leur système immunitaire est mature et pleinement fonctionnel

3 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en fer, une greffe sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie et, pour certaines, des injections d'un anticorps d'immunothérapie, les tumeurs étant laissées à croître jusqu'à un point limite de taille. Le porteur met à mort toutes les souris deux à treize semaines après la greffe, quand ce point limite est atteint. Il affirme que la complexité du microenvironnement tumoral ne peut pas être reproduite in vitro, ce qui obligerait à recourir à l'expérimentation animale.

Objectifs

Le développement de tumeurs chez des individus immunocompétents reste un paradoxe. En effet, chez les patients atteints de cancer, on détecte fréquemment des réponses immunologiques spontanées dirigées contre la tumeur mais qui malheureusement ne se traduisent que trop rarement par des réponses cliniques efficaces (destruction de la tumeur/guérison). Le principal frein est l’existence de points de contrôles négatifs du système immunitaire correspondant entre autres à l’expression par certains acteurs de l’immunité de molécules inhibitrices bloquant leurs fonctions. Pour remédier à ce problème, des protocoles “d’immunothérapies” anti-tumorale se sont développés avec succès permettant de réactiver la réponse immunitaire anti-tumorale. Cependant, seule une fraction des patients répond au traitement et développe une réponse anti-tumorale efficace. Nos résultats préliminaires montrent que le fer augmente significativement les réponses des lymphocytes T in vivo et in vitro. Cet effet “adjuvant” se traduit par un fort ralentissement de la croissance de lignées tumorales transplantées chez la souris. Au regard de ces résultats, nous souhaitons poursuivre et approfondir notre étude en associant notamment supplémentation en fer et immunothérapie anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Au terme de ce projet, nous pourrons déterminer si l’association d’une supplémentation en fer aux stratégies d'immunothérapie actuelle pourrait être bénéfique pour la mise en place de réponses immunitaires anti-tumorales efficaces. Chaque traitement, séparément, augmente les réponses immunes anti-tumorales, provoquant un ralentissement voire un arrêt de la croissance tumorale. Nous espérons que les effets de ces 2 traitements, non seulement s’additionnent, mais également qu’une synergie puisse être observée, càd que l’effet anti-tumoral des 2 traitements ensemble soit supérieur à la somme des effets des 2 traitements appliqués séparément. En conclusion, ce projet vise à montrer l’effet bénéfique d’une supplémentation en fer pour la mise en place de réponses anti-tumorales plus efficaces et devrait confirmer le bénéfice de l’associer aux immunothérapies actuelles.

Procédures

-Régimes alimentaire contrôle ou enrichie en fer (de l'âge de 8 semaines jusqu'à la fin de l'expérimentation) -Injection sous-cutanée de cellules tumorales, sous anesthésie générale par isoflurane (10-15min par souris) - Certains animaux seront également injectés à 5 reprises par voie intra-péritonéale avec un anticorps utilisé en immunothérapie anti-cancéreuse (30secondes/injections/souris). Les injections seront toutes espacées de 3 jours.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques utilisées pour ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Le régime enrichi en fer peut induire au cours de la première semaine une perte de poids des animaux n'excédant pas 10%. Cependant, celui-ci n'induit pas de pathologies sur la durée des procédures de ce projet. Le stress et les douleurs pouvant être occasionnés lors des injections sous-cutanées et intra-péritonéales sont à proprement parlé légers. La croissance tumorale peut occasionner encore une fois un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux.

Devenir

Toutes les souris seront mise à mort 2 à 13 semaines après l’injection sous-cutanée en fonction de la vitesse de croissance des différentes lignées tumorales car le point limite de taille de la tumeur sera atteint.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Des expériences préliminaires ont été réalisées in vitro pour évaluer nos hypothèses. Ces expériences nous ont permis, par exemple, de confirmer que le fer permet l'activation, la prolifération et la différenciation de certaines cellules du système immunitaire, cruciales pour la mise en place de réponses anti-tumorales.

Réduction

Des lots d’un nombre adapté d’animaux seront utilisés en anticipant la validité statistique des données obtenues. Les tumeurs transplantées sont très majoritairement de type “mâle”. Nous utiliserons donc des souris mâles pour notre étude. De plus, les expériences de la première procédure nous permettrons de réduire le nombre d'animaux utilisés lors de la seconde.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de maisons en cartons. Nous nous efforçons de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux au cours de chaque procédure grâce à l’utilisation d’anesthésie générale sous isoflurane lors des injections sous-cutanées et grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. En effet, il est important de maintenir les animaux immobiles pour pouvoir les raser et procéder aux injections sous-cutanées sans risque de les blesser. Nous avons défini des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie. A partir du 4eme jour suivant l’injection de cellules tumorales les animaux seront suivi 4 à 5 jours par semaine par le responsable du projet pour notamment mesurer la croissance des tumeurs. Les souris seront également pesées une fois par semaine. Tout état anormal sera communiqué au responsable de projet et les mesures pour remédier à la souffrance seront mises en oeuvre (mise à mort et analyse des animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral car de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques, déficientes pour l'expression de tel ou tel gène, nous permet d'étudier le rôle de différentes voies de signalisation dans le développement tumoral. Ces modèles expérimentaux sont également des outils précieux pour étudier les mécanismes d'action d'agents pharmacologiques comme le fer in vivo et pour envisager leur validation dans des études précliniques chez l'Homme. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 20 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral et l’effet du fer sur celui-ci.

300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat reçoit huit injections d'antigène, dont certaines avec l'adjuvant complet de Freund pouvant provoquer ulcérations, fièvre et inconfort, et subit quatre prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux servant au contrôle de protéines-médicaments. Le porteur euthanasie tous les rats en fin de protocole, chaque antigène empêchant selon lui leur réutilisation. Il affirme que l'immunisation d'un animal vivant reste "indispensable", aucune méthode in vitro n'étant selon lui aussi efficace.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps. Lorsque la réponse est suffisamment élevée, une purification des anticorps est réalisée à partir de ce prélèvement.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de rats développés interviendront notamment dans les étapes d’obtention des protéines d’intérêt, qui constituent des médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

Huit injections : 4 prélèvements de 2 mL (volume de sang prélevé fonction du poids de l’animal) de sang seront réalisés. L’ensemble des prélèvements sera réalisé au niveau de la veine sublinguale ou au niveau de la veine caudale sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Les injections en sous-cutanée et plus particulièrement celles couplées à l’adjuvant complet de Freund peuvent provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). L’anesthésie gazeuse, a un très faible impact sur l’animal, l’individu récupérant quasiment instantanément ses facultés après retrait du masque anesthésiant. Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 12,5% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (10 rats par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant, notamment dans le contrôle et la qualification de protéines médicaments. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et sacrifiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire (PO418 : Evaluation et suivi du bien-être animal). L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 4 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), physiologiques (respiration, fréquence cardiaque,…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, présence de masses anormales, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec 4 niveaux : normal, observer attentivement, souffrance : mise en œuvre immédiate d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement) de RUSSELL et BURCH, constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Idéalement, les points limites doivent être tels qu’ils permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance.

Choix des espèces

Les rats présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Les rats sont intéressants pour l’obtention d’IgG spécifiques pour les protéines de souris et pour la génération d’IgE. L’immunisation du rat nécessite des quantités d’antigène moindre, de plus cet animal est facile à manipuler et à élever en laboratoire. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les rats sont reçus à l’âge de six semaines et entreront en protocole après une semaine de quarantaine.

3 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer des lésions précancéreuses de la prostate, elles reçoivent des injections de tamoxifène et des prélèvements de sang répétés, les tumeurs pouvant grossir jusqu'à un point limite fixé à 2 000 mm³ ou une perte de poids de plus de 20 %. Le porteur met à mort les animaux à différents temps pour prélever la prostate et d'autres organes. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique et la complexité de la formation des lésions, ce qui rendrait l'expérimentation in vivo nécessaire.

Objectifs

Le cancer de la prostate ( CaP) est le cancer viscéral masculin le plus fréquent et responsable de 350 000 décès en 2020. Les méthodes de diagnostic actuelles ne permettent pas d’identifier de façon précoce et fiable les patients qui développeront des formes agressives et métastatiques. De plus, les traitements existants ne sont pas efficaces contre les formes agressives et sont à l’origine des nombreux effets indésirables. Une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires à l’origine de l’agressivité des tumeurs est donc requise afin de d’améliorer les outils diagnostiques et de développer des approches thérapeutiques plus efficaces. Une stratégie privilégiée pour l’étude du cancer est l’utilisation des modèles animaux qui miment la maladie humaine. Les modèles murins du cancer de la prostate, développés au laboratoire, répliquent les mutations du gène le plus fréquemment muté dans les tumeurs humaines. Cela permet la génération de lésions précancéreuses aux caractéristiques très proches de celles observées chez l'homme. L'objectif de ce protocole est le suivi et caractérisation des lésions précancéreuses de la prostate. Suite à l'invalidation du ou des gènes, des lésions, nommées néoplasies intraépithéliales prostatiques (PIN), se développent. L'évolution des PIN sera suivie pendant un délai suffisant à l'apparition des formes agressives. En conclusion, cette étude permettra de caractériser les mécanismes d'apparition des formes agressives du cancer de la prostate afin d’identifier des nouvelles cibles thérapeutiques et des outils diagnostiques.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de cartographier l’évolution des lésions précancéreuses et l’implication des gènes étudiés dans cette évolution. Les prélèvements de fluides (urines et sang) nous aideront à mettre en évidence des biomarqueurs du cancer de la prostate permettant un diagnostic précoce de la maladie.

Procédures

Chaque animal utilisé dans cette étude sera soumis à 5 injections intrapéritonéales du tamoxifène réalisés au courant d’une semaine, une fois que cet animal aura atteint l’âge adulte (8 à 12 semaines après naissance). Ce geste ne nécessite pas d’anesthésie. Ensuite, afin de réaliser les études des biomarqueurs circulants, 100 µL du sang sera prélevé sur 20 animaux à chaque point de la cinétique ( 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 12 et 15 mois après injections du tamoxifène), un animal pourra être sujet à 3 prélèvements sanguins maximum au courant de sa vie, ces prélèvements seront espacés d’au moins 28 jours. Une injection en intra péritonéale prend 10 secondes de manipulation (contention+ injection) par souris. Le prélèvement sanguin prend 30 secondes de manipulation (contention+prélèvement+ injection) par souris. Un sous groupe subira sous anethesie générale à l'isofluorane, une injection en retro-orbitale suivi du sacrifice. (maximum 5 minutes sous anethesie gazeuse)

Impact sur les animaux

Suite à l'injection du tamoxifène, une infection peut se développer au niveau de l'abdomen de la souris dans les journées suivantes l'injection. Lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, ces PIN pourront évoluer vers les tumeurs de taille importante dans les points de cinétique les plus tardifs établis. Ces tumeurs pourront conduire à une douleur abdominale chez l'animal qui sera manifestée par une posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, perte de poids etc. La taille de tumeur sera donc un point limite clé(2000 mm3). Suite à la prise de sang, les souris pourront être déshydratées, cette déshydratation sera régulièrement vérifiée par le pincement de peau sur le dos de la souris. De plus, une infection peut se développer sur le lieu de prélèvement, manifestée par une rougeur et un gonflement.

Devenir

Les animaux seront sacrifiés à différents points de cinétique afin de récupérer la prostate et différents organes en vue de la caractérisation.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

L’effectif demandé a été calculé afin d’obtenir les groupes des souris mutantes à différents points cinétiques de taille suffisante pour réaliser les tests statistiques de sorte à pouvoir tirer des conclusions pertinentes de nos expériences. Pour un type de souris donné et un point cinétique donné, 20 souris seront utilisées. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les premières cohortes de souris seront divisées en sous-groupes pour étudier les différents stades de progression tumorale (stades précoces, intermédiaires et tardifs). Cette première étape permettra de déterminer les points cinétiques les plus intéressants pour réaliser les expériences. Le nombre d’expériences sur les points ne faisant pas partie de points clés pourra être réduit ce qui conduira à une réduction de nombre d’animaux utilisés. De plus, les cinétiques pourront potentiellement être raccourcies après cette première estimation, ce qui permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux. En revanche, sur les points clés, des expériences supplémentaires pourront être réalisées, toujours dans la limite de 3200 souris maximum.

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Après injection, les souris seront observées pour détecter les éventuels signes de douleur ou de souffrance, à savoir la posture inhabituelle, le dos vouté, le poil hérissé, les grimaces, les vocalisations. Si ces signes persistent dans la journée suivant l'injection, les souris seront sorties de l'étude. De plus, lorsque les souris transgéniques développeront les PIN, à partir de 4 semaines après injection, elles seront observées par l'expérimentateurs et le personnel de l'animalerie d'hébergement chaque semaine afin de contrôler la taille de la prostate par palpation et l’apparence générale de la souris. Les points limites de l’expérience seront le volume de la prostate et le poids de la souris. Si le volume de la prostate est supérieur à 2000 mm3, les souris seront mises à mort et disséquées pour analyse histologique. Si la perte de poids est supérieure à 20% et/ou si la souris présente des signes de souffrance ou de détresse (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif, léthargie), la souris sera retirée de l’expérience et sacrifiée. Après chaque prélèvement sanguin, un volume équivalent au prélèvement de sérum physiologique sera injecté en sous-cutanée. De plus, le lieu de l'injection sera surveillé dans les journées suivantes afin de détecter des signes d'une éventuelle inflammation (rougeur, gonflement).

Choix des espèces

La souris a été choisie comme animal modèle car l’expression des protéines jouant un rôle dans les développements du cancer de la prostate est similaire à celle de l’humain. Cela nous permet d’induire les mutations dans des gènes Pten et Trp53 le plus fréquemment mutés dans les cancers de la prostate humain pour générer nos modèles. De plus, l’évolution des lésions précancéreuses dans notre modèle murin réplique de manière fidèle le développement du cancer de la prostate chez l’homme. Le système immunitaire murin est bien décrit dans la littérature et est proche de celui de l’humain, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. L’ensemble de ces facteurs nous permettra d’étudier l’évolution des lésions de CaP afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les souris mâles seront utilisées de 8 semaines à 2 ans après naissance puisque le projet s’intéresse à l’organisme adulte. Les animaux utilisés seront adultes, les injections de tamoxifène se feront sur des jeunes adultes à partir de 8 semaines après naissance.

130 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 100 d'entre elles tuées à l'issue et 30 remises en élevage pour la reproduction. Chaque souris reçoit une injection d'un produit convulsivant dans la veine de la queue et subit une crise, pour préciser la position d'un gène soupçonné d'être impliqué dans l'épilepsie. Le porteur décrit le stress de la contention et de la crise ainsi que la douleur possible d'une mauvaise pose de l'aiguille. Il affirme qu'aucun remplacement n'est possible, seul le test sur l'animal révélant selon lui la sensibilité aux convulsions.

Objectifs

Une étude réalisée par nos soins a permis de révéler que la partie distale du chromosome 4 de la souris est impliquée dans le contrôle des convulsions liées à l’épilepsie. Ce travail a permis de réaliser qu’il existe probablement un gène, nommé Bis1, dans la partie terminale du chromosome 4 comme impliqué dans les convulsions, sans être pour autant capable de l’identifier ni même connaitre sa position. Dans le but de préciser sa localisation, nous avons développé par croisements élaborés, des souris qui permettront, après tests de convulsions, de renseigner sur cette position aujourd’hui inconnue. Le projet présenté ici recouvre l’ensemble des expériences qui seront menées pour informer sur la position de ce gène. A terme, il est envisagé de rechercher chez l’homme, s’il existe un gène équivalent dans la région homologue à la région chromosomique de la souris.

Bénéfices attendus

Plusieurs études chez l’animal ont montré qu’il existe un gène impliqué dans l’épilepsie dans une région particulière du chromosome 4 de la souris. Il reste maintenant à identifier quel est ce gène. Les stratégies d’identification d’un gène nécessitent que la région chromosomique où on soupçonne la présence du gène soit relativement restreinte. Dans ce but, nous avons créé des lignées de souris particulières qui permettront de réduire la taille de ce fragment chromosomique après que les lignées seront testées pour leur capacité à manifester des crises.

Procédures

Contention et infusion dans la veine de la queue, 1 fois par souris sur d’une durée maximale de 5 min.

Impact sur les animaux

La contention de l’animal ainsi que la crise convulsivante peuvent entraîner un stress. La pose de l’aiguille peut entraîner une douleur.

Devenir

En fin de procédure une partie des animaux sera remise en croisement dans le système d’élevage (30/130) et l'autre (100/130) sera mise à mort ne pouvant pas être réutilisée pour une autre procédure car les effets d’une deuxième injection aurait un effet contraire, protecteur contre les crises d’épilepsie.

Remplacement

Seule une approche empirique et expérimentale en testant l’animal, permettra d’identifier quelles lignées présentent une sensibilité à la convulsion. Il n’y a donc pas de remplacement possible.

Réduction

Par expérience, nous savons que des tailles de groupe de 12 souris permettent d’estimer si ce groupe diffère d’un groupe de référence ou pas. Nous testerons donc 12 souris pour chacune des 4 lignées appelées à permettre un positionnement plus précis du gène. Nous testerons 20 souris pour chacune des 3 lignées de référence auxquelles les 4 lignées précédemment mentionnées seront comparées. Effectivement, une meilleure estimation de la capacité à présenter des crises chez les lignées de référence est nécessaire pour obtenir la puissance statistique requise pour atteindre les objectifs de l’étude. La statistique réalisée reposera sur l’emploi du t de Student.

Raffinement

Dans notre situation, seule de la douleur pourrait être induite durant le test par une mauvaise pose de l’aiguille à ailettes dans la veine de la queue de la souris. Deux techniques expérimentales seront engagées pour minimiser le risque de mauvaise pose de l'aiguille à ailette. D’une part, la veine de la queue sera dilatée par immersion de la queue durant 2 min dans un bain à 45°C. D’autre part, nous utiliserons un illuminateur de queue permettant de mieux visualiser la veine de la queue. L’expérimentation sera arrêtée après 2 tentatives de pose infructueuse de l’aiguille à ailettes. On s’attachera par une observation visuelle attentive, à vérifier qu’aucune boursouflure de la queue n’apparaisse durant le test. Auquel cas, le test serait arrêté et l’animal exclu et mis à mort. Lorsque la pose de l’aiguille à ailettes sera réalisée, le volume disponible pour la mobilité de la souris dans le tube de contention sera augmenté pour favoriser le confort de l’animal. Enfin les expériences seront réalisées par des expérimentalistes aguerris à la technique de l’infusion par la veine de la queue chez la souris. Une surveillance quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel et des critères d'arrêt ont été définis en cas d'atteinte des points limites.

Choix des espèces

L’espèce souris est l’espèce retenue pour la raison unique que ce travail prolonge un travail initial réalisé sur la souris. La souris et le rat sont les deux espèces majoritairement retenues pour l’étude des épilepsies et des convulsions car elles représentent un compromis optimal lorsqu’on prend en compte l’homologie avec l’homme, le coût de l’élevage, les aspects éthiques incitant à employer des espèces dites « inférieures », la rapidité de reproduction. L’intérêt supérieur de la souris sur le zebra fish réside dans la faculté de la souris à supporter la consanguinité. Les souris seront testées à l’âge de 11±1 semaines lorsque les souris, mâles comme femelles, auront acquis leur pleine sensibilité au convulsivant utilisé. Fortuitement, cet âge correspond aussi à un stade de développement corporel favorisant le taux de réussite de l’infusion par la veine de la queue.

12 rats vont être utilisés, tous tués sans réveil, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après un jeûne de 24 heures, chaque rat subit une chirurgie de pose de trois cathéters dans une veine, une artère et la veine mésentérique, puis reçoit du malate radiomarqué au carbone 14 pendant près de trois heures d'anesthésie avant la mise à mort, pour mesurer la production de sucre par l'intestin. Le porteur indique des risques d'hypoglycémie, de saignements, de détresse respiratoire et d'hypothermie. Il affirme que cette mesure n'est pas réalisable sur des cellules ou des organoïdes en culture et que seul le rat convient à la technique.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique qui est un facteur de risque majeur du développement de nombreuses complications. Dans ce contexte, la production intestinale de glucose (PIG) (qui correspond à la capacité qu’à l’intestin de produire du sucre (glucose) en dehors des périodes de repas), est une fonction qui exerce des effets anti-obésité et anti-diabète. De plus, les régimes riches en protéines et en fibres, sont responsables d’effets bénéfiques impliquant la PIG. De plus, les fibres alimentaires peuvent être digérées par l’intestin et les bactéries intestinales en différentes molécules, susceptibles d’activer la PIG. De ce fait, dans un projet précédent, nous avons émis l’hypothèse que d’autres molécules issues de la digestion des aliments pourraient induire la PIG. Les résultats issus de ce projet ont permis d’identifier le malate comme un activateur de la PIG (molécule qui active la production de glucose par l’intestin). En effet, l’apport de 5% de malate à une alimentation riche en gras et en sucres de souris contrôles pendant 4 semaines, limite la prise de poids alors que la prise alimentaire reste inchangée. De plus, nous observons également des effets bénéfiques protecteurs du malate sur la glycémie (taux de sucre dans le sang) et l’accumulation de graisses dans le foie (stéatose hépatique). De façon intéressante, l’ensemble de ces effets bénéfiques ont déjà été décrits lors d’une activation génétique de la PIG chez la souris. Enfin, alors que le niveau d’expression des protéines clés dans la production de glucose est augmentée, ces effets ne prennent pas place chez des souris où la PIG est non fonctionnelle. Montrant ainsi le rôle crucial de la PIG dans l’obtention des effets bénéfiques du malate. Néanmoins, ces travaux ne nous permettent pas de comprendre comment le malate active la PIG, et donc la production de glucose (sucre) par l’intestin. Ainsi, l’objectif de ce projet est donc de déterminer si le malate agit en tant que substrat de la PIG (s’il est directement transformé en glucose). Plus précisément, nous souhaitons déterminer si les carbones du malate sont intégrés dans le glucose produit par l’intestin. Grâce à ces résultats, le malate pourra alors être envisagé comme une nouvelle cible de traitement de l’obésité et ses complications.

Bénéfices attendus

Les résultats issus de ce projet nous permettrons de compléter nos travaux sur les capacités de molécules à activer la PIG et ses effets bénéfiques. En effet, nos travaux issus d’un projet précédent ont permis de montrer que le malate exerce des effets bénéfiques sur l’obésité, le diabète (trop de sucre dans le sang) et la stéatose hépatique (trop de graisses dans le foie). De façon intéressante, ces effets bénéfiques ne prennent pas place chez des ayant une PIG non fonctionnelle. Néanmoins ces travaux n’ont pas permis de montrer précisément les mécanismes impliqués. Plus précisément, nous ne savons pas si le malate est directement transformé en glucose (sucre) par l’intestin. Ce projet, qui viendra finaliser notre projet précédent, nous permettra de comprendre les mécanismes mis en jeu dans l’activation de la PIG par le malate. Ainsi, grâce à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, l’activation de la PIG par le malate pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.

Procédures

Les rats seront soumis à une mise à jeun pendant 24h, puis recevront un traitement antidouleur adapté 30 minutes avant le début de la chirurgie. Ensuite ils seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) afin de mesurer l’incorporation du malate [qui a été modifié pour contenir du carbone 14 (C14), qui est une forme radioactive du carbone], dans le glucose (sucre produit par l’intestin). Lors de la privation de nourriture de 24h, les rats conserveront un accès à l’eau, leur enrichissement et l’hébergement en groupe. Les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, le foie, les reins et l’intestin vont produire du glucose et maintenir un taux de sucre dans le sang stable. La mise à jeun est effectuée à 9h du matin, soit 3h après la fin de la phase nocturne, qui est la phase pendant laquelle les animaux consomment 80% de leur ration quotidienne. La mesure de l’incorporation du malate radiomarqué (C14) dans le glucose produit par l’intestin de rats nécessite une chirurgie d’environ 45 min afin d’insérer 2 cathéters dans une veine (jugulaire) et une artère (carotide). Ensuite, le malate C14 est perfusé en veine pendant 90 minutes, puis un cathéter est introduit dans la veine mésentérique supérieure (point de convergence du sang provenant des différentes veines de l’intestin) afin de collecter simultanément du sang provenant de l’intestin et de la circulation sanguine générale. Au total, le temps d’anesthésie par rat est d’environ 2h45 à 3h. A la fin de la procédure, les rats sont mis à mort par injection intraveineuse d’une dose létale d’un euthanasiant chimique (sans réveil de l’animal).

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite une mise à jeun (privation de nourriture, mais pas de l’eau de boisson) des rats pendant 24h avant la chirurgie et la perfusion de malate radiomarqué (C14) pour la mesure de la production de sucre par l’intestin. Pendant cette phase de privation de nourriture, les rats peuvent avoir des épisodes d’hypoglycémie (taux de sucre trop bas), une modification de leur comportement (absence de déplacement dans la cage, absence de toilettage, grimaces). Néanmoins, les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, l’activation de la production de sucre par le foie, les reins et l’intestin, va permettre de maintenir un niveau de sucre dans le sang suffisant (glycémie). De plus, la participation de l’intestin et du rein au maintien de la glycémie augmente lorsque la privation alimentaire se prolonge. A l’issu de ces 24h de privation alimentaire, les animaux recevront un traitement anti-douleur adapté à la chirurgie et seront anesthésiés (anesthésie gazeuse). Lors de la pose des cathéters, il est possible de provoquer des saignements. De plus, l’anesthésie est susceptible de provoquer une détresse respiratoire ou une hypothermie. Des moyens seront mis en place afin de prévenir ces nuisances.

Devenir

Dans ce projet, la procédure comporte une chirurgie et une injection de traceurs radioactifs (malate C14). La chirurgie doit permettre l’implantation de 3 cathéters (en veine jugulaire, en artère carotide et en veine mésentérique supérieure). Il n’est pas possible, ni nécessaire de réveiller les rats ayant subi l’implantation de 3 cathéters et l’injection de composés radioactifs. D’autre part, à l’issu de la procédure (tout de suite après la mise à mort des rats), le contenu intestinal sera prélevé. Ces prélèvements nous permettrons de déterminer si une partie du glucose-C14 produit par l’intestin (qui est issu du malate-C14) a pu être libéré dans la lumière intestinale (et non dans la circulation sanguine).

Remplacement

La PIG exerce un contrôle sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. La mesure de l’incorporation des carbones radioactifs du malate (C14) dans le sucre (glucose) produit par l’intestin dépend de plusieurs paramètres, dont le déstockage du glucose, la production de glucose par le rein, et la consommation de glucose par l’ensemble des tissus de l’organisme. Ainsi, cette mesure nécessite de reproduire les conditions physiologiques d’un jeûne de 24h (nécessaire à l’activation de la PIG) et une circulation sanguine préservée. En effet, la mesure de la production de glucose à partir du malate nécessite des prélèvements de sang simultanés dans l’artère carotide et la veine porte. Cette mesure n’est donc pas réalisable avec des cellules ou des organoïdes d’intestin en culture (groupement de cellules en culture qui modélise un tissu et donc les interactions entre cellules).

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux dont nous avons besoin, nous avons calculé le nombre de rats au plus juste à partir de notre connaissance de la technique utilisée, soit au maximum 12 rats. Néanmoins, pour limiter au maximum le nombre de rats nécessaires, l’étude sera menée avec une première cohorte de 6 rats, et en fonction des résultats obtenus, nous augmenteront l’effectif pour atteindre 12 rats au maximum. Ainsi, cette étude nécessitera au minimum 6, et au maximum 12 rats. D’autre part, le principe de réduction a été appliqué dès la conception de ce projet. En effet, nous avions choisi de réaliser ce projet en plusieurs étapes (les 2 premières faisant partie d’un projet précédent, actuellement terminé): - Etape 1 : Afin de déterminer si les molécules d’intérêt (dont le malate) exercent des effets bénéfiques chez des souris sauvages/contrôles, nous les avons ajoutés à l’alimentation des souris. - Etape 2 : Seulement pour les molécules ayant montré des effets bénéfiques chez les souris sauvages, nous avons cherché à déterminer si ces effets étaient médiés par la PIG. Pour cela, les métabolites ont été ajoutés à l’alimentation de souris chez lesquelles la PIG est non fonctionnelle . L’absence d’effets, traduisait alors de l’importance de la PIG dans ces effets bénéfiques. - Etape 3 : Lors des étapes 1 et 2, nous avons montré que le malate est capable d’induire des effets bénéfiques via la PIG. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre les mécanismes impliqués. Plus précisément, nous souhaitons déterminer si le malate est transformé en glucose par l’intestin. Grâce à cette stratégie, l’étude de molécules qui paraissaient intéressants au départ, mais qui n’ont pas induits d’effets bénéfiques lors de l’étape 1, a été abandonné et a donc limité le recours à l’animal lors des étapes 2 et/ou 3. D’autre part, à l’issu de la procédure (tout de suite après la mise à mort des rats), le contenu intestinal sera prélevé. Ces prélèvements nous permettrons de déterminer si une partie du glucose-C14 (radioactif) produit par l’intestin (issu du malate-C14) a pu être libéré dans la lumière intestinale (et non dans la circulation sanguine). Dans ce cas, nos travaux montreraient pour la première fois que la PIG est capable de fournir du sucre/glucose aux bactéries du microbiote intestinal. Enfin, il n’est malheureusement pas possible de constituer une banque de tissus radioactifs pour une utilisation ultérieure.

Raffinement

Les rats seront commandés à l’âge de 5 semaines et une phase d’acclimatation de 2 semaines sera respectée avant le début de la procédure. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisés et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les rats seront hébergés par groupe de 2, dans des cages adaptées et avec un enrichissement adapté dans la cage. Lors de la mise à jeun (pour 24h), les rats conserveront un accès à l’eau, leur enrichissement et l’hébergement en groupe. La surveillance des animaux et de leur comportement permettra de déceler toute souffrance de façon précoce. Néanmoins, les nuisances causées par la mise à jeun chez le rat sont limitées car très rapidement, l’activation de la production de sucre par le foie, les reins et l’intestin, va permettre de maintenir un niveau de sucre dans le sang suffisant (glycémie). De plus, la participation de l’intestin et du rein au maintien de la glycémie augmente lorsque la privation alimentaire se prolonge. Concernant la mesure de la production de glucose à partir du malate C14, les animaux recevront une analgésie adaptée 30minutes avant la chirurgie. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Au cours de l’opération, nous surveillerons les paramètres cardio-respiratoires et la température de l’animal (maintenue stable par une couverture chauffante thermorégulée). Les chirurgies seront réalisées par des personnes qualifiées, et l‘intérieur des cathéters seront recouverts d’un anticoagulant pour éviter la formation d’un caillot sanguin. Les cathéters utilisés sont en matériaux biocompatibles et de diamètre adapté. A la fin de l’anesthésie ou en cas d’arrêt de la procédure pour souffrance (ils ne seront pas réveillés à l’issu de la procédure), les rats seront mis à mort par injection par injection d’une dose léthale d’un euthanasiant chimique.

Choix des espèces

Le rat, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de sa taille, il s’agit d’un animal où la chirurgie est facile et adaptée à la pose de cathéters. De plus, la mesure de l’incorporation du malate radioactif C14 dans le sucre produit par l’intestin est une technique qui n’est fiable que chez le rat. En effet, contrairement à la souris, le rat est peu sensible à la perturbation des flux de glucose qui peut intervenir lors du prélèvement de sang en simultané dans 2 cathéters. Sachant que la perturbation des flux de glucose est susceptible de moduler la fiabilité de la mesure. Les rats (mâles) seront commandés à l’âge de 5 semaines (environ 200-220g) et la procédure sera réalisée 2 semaines plus tard, soit à l’âge de 7 semaines (environ 300g). Les rats adultes sont sevrés et ont donc une alimentation indépendante, ce qui justifie leur utilisation comme modèle en nutrition humaine.