Procédures modérées
Evaluation de l’inflammation induite par une souche bactérienne du microbiote intestinal sur des souris obèses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Rendues obèses par un régime gras, elles reçoivent un gavage quotidien, des prélèvements sanguins hebdomadaires et des prélèvements de fèces répétés, avec des risques d'irritation du larynx ou de fausse route liés au gavage et des troubles digestifs, pour tester si une bactérie intestinale réduit l'inflammation liée à l'obésité. Le porteur ne détaille aucun test comportemental. Il affirme qu'"il n'existe pas de méthode alternative", le modèle d'obésité alimentaire chez le rongeur étant présenté comme classique.
Objectifs
La littérature scientifique montre que l’obésité d’origine alimentaire est associée à une diminution de la prévalence d’une bactérie particulière du microbiote intestinal humain. De plus, il a été montré que l’obésité d’origine alimentaire provoque une inflammation systémique de bas grade, ou méta-inflammation. De précédentes études menées par une équipe de recherche ont montré que l’administration par gavage d’une souche particulière de cette bactérie permet de réduire la prise de poids de souris nourries par un régime riche en gras. L’objectif de l’étude est de déterminer si l’administration de cette bactérie permet également de réduire l’inflammation induite par l’obésité d’origine alimentaire chez des souris déjà obèses.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence les potentiels effets anti-inflammatoires de Xla1 sur l’inflammation systémique induite par l’obésité. Dans un premier temps, il permettra de déterminer si la prise de Xla1 modifie l’inflammation systémique d’une souris mince. De plus, il permettra de déterminer si, dans un contexte d’obésité, Xla1 permet de réduire l’inflammation systémique ou locale, notamment au niveau du colon.
Procédures
Les souris seront soumises à un régime normal ou riche en graisse pendant 8 semaines. Une partie des souris sera suivi pendant deux semaines, avec pesée journalière, prise de sang hebdomadaire et prélèvement de fèces 4 fois par semaine. Ces souris seront aussi gavées quotidiennement à partir d’une semaine après réception pendant une semaine. Le reste des souris sera suivi pendant 8 semaines, avec pesée journalière, prise de sang hebdomadaire et prélèvement de fèces 4 fois par semaine. Les souris seront aussi gavées quotidiennement à partir d’une semaine après réception pendant 7 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux nourris avec un régime riche en gras pendant 12 semaines peuvent développer des effets indésirables liés à l’obésité. Notamment, un début de diabète entrainant une polyurie et/ou une polydipsie peuvent être observés. Pour le confort des animaux, la litière pourra être changée plus régulièrement et de l’eau sera à disposition ad libitum. La procédure de gavage peut entrainer des irritations du larynx ou des risques de fausse route pendant l’administration. La prise du traitement par Xla1 ou le véhicule peut entrainer des modifications du confort digestif des animaux, avec possibles diarrhées/constipations ou maux de ventre. Enfin, des saignements peuvent être observés à la suite des prises de sang.
Devenir
150 animaux sont inclus dans la procédure 1. Ces animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale : une partie 2 semaines après réception, une autre 8 semaines après réception.
Remplacement
Il n’existe pas de méthode alternative à ce projet car la prévention de l'obésité d'origine alimentaire (DIO) chez le rongeur est le modèle classique pour étudier l'effet des médicaments anti-obésité. De plus, il est nécessaire d’effectuer ces expériences sur des souris déjà obèses afin d’observer un état inflammatoire induit par l’obésité et ainsi déterminer l’efficacité de Xla1 sur l’inflammation. Des expériences in vitro préliminaires ont conforté les résultats observés mais la confirmation de ces résultats sur un organisme complexe est nécessaire.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires a été déterminé grâce à des expériences préliminaires : ces expériences ont montré que 10 animaux par groupes permettaient de réaliser des tests statistiques robustes (ANOVA) notamment sur le dosage de l’IL-6. De plus, le nombre d’animaux à sacrifier en début d’expérience a été réduit par 2 : les animaux n’ayant subi aucun traitement, la variabilité entre les souris sera réduite et permettra un test statistique robuste malgré un échantillon réduit. L’expérience sera répétée 3 fois pour confirmer les résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en groupe). Notamment, pour leur confort, les animaux obèses seront hébergés par 2 ou 3 maximum, et les animaux minces par 5. Les cages seront agrémentées d’un milieu enrichi avec des tunnels en carton, dômes et bâtonnets permettant la création de nids afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Les prises de sang submandibulaires seront réalisées sur des animaux vigiles. Pour leur confort et réduire le stress, les tentatives de piqûres seront réduites au minimum (deux tentatives maximum). L'inconfort et la souffrance seront limités grâce à l'utilisation d'un tableau de score, permettant l'établissement de points limites et la mise en place de mesures adaptées aux événements rencontrés (ex. injection d'anti-inflammatoire, utilisation de crème cicatrisantes, enrichissement des cages, adaptation de la nourriture).
Choix des espèces
Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Le comportement alimentaire, la balance énergétique et le métabolisme glucidique et lipidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De plus, ces souris possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant d’étudier les effets de l’inflammation induite par l’obésité. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 18 et 20 semaines) car le développement des organes sera terminé. De plus, il est nécessaire que les souris soient au moins nourries 12 semaines avec un régime riche en gras afin de pouvoir observer l’établissement de l’inflammation induite par l’obésité. Chez le fournisseur, après 6 semaines de croissance, les souris seront donc nourries au moins 12 semaines avec un régime riche en gras. Les souris contrôles seront sélectionnées parmi la fratrie des souris obèses et seront nourries à partir de 6 semaines et pendant la même durée que les souris obèses avec une alimentation standard. Toutes les souris seront donc âgées de 18 à 20 semaines lors de leur réception et du début de la procédure.
Formation des techniciens animaliers à certains gestes techniques
- Formation professionnelle
300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de gravité légère à modérée. Ce sont d'anciens reproducteurs réformés, sur lesquels des techniciens s'entraînent à prélever environ 60 mL de sang à l'artère de l'oreille sur animal vigile maintenu en contention, puis un prélèvement intracardiaque sous anesthésie sans réveil qui met fin à l'animal. Le projet ne vise pas la recherche mais la formation aux gestes techniques pour un projet de production de sérum. Le porteur justifie le recours aux lapins par l'impossibilité d'éviter "un minimum de pratiques" après la formation théorique et le tutorat.
Objectifs
Il s’agit d’un renouvellement de projet. Le projet de formation des techniciens animaliers à certains gestes techniques vise à assurer un complément à la formation pratique de base lors de la prise de poste, afin d’assurer le niveau de maîtrise technique requis par la réglementation de la protection animale et par les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Cette formation aux gestes techniques est précédée par une première période de tutorat, avec atteinte progressive d’acquis techniques préalables en matière d’approche, de contention et de réalisation des gestes techniques simples (telles les injections sous-cutanées). Arrivé à un tel stade, la technicité des gestes qui font l’objet du présent projet requiert un minimum de pratique en situation de formation avant de poursuivre et affiner par la pratique en conditions réelle sous tutorat. Le projet inclus des gestes techniques sur lapin dans le cadre du projet autorisé.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d'amener les techniciens à acquérir le niveau de maîtrise requis pour les gestes techniques sur le lapin dans le cadre du projet autorisé. La maîtrise technique permet en effet : - de minimiser le risque de douleurs et de stress sur les phases de prélèvements, donc de contribuer à l'objectif de raffinement - de minimiser le risque de pertes de sérum, donc de contribuer à l'objectif de réduction - de répondre aux exigences de qualification au poste exigées par les bonnes pratiques de fabrication (pharmaceutiques)
Procédures
l s'agit de prélèvements sanguins au niveau de l'artère à l'oreille (volume prélevé d'environ 60 mL) sur des animaux vigiles sur lesquels une contention est assurée pendant toute la durée du prélèvement; ainsi que des prélèvements par voie intra-cardiaques sur des animaux préalablement anesthésiés avec une solution constituée par un mélange de xylazine et de kétamine. (anesthésie sans réveil). La durée totale d'utilisation effective d'un lapin est généralement de 5 minutes avec un une limite de 10 minutes avant l'anesthésie sans réveil.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques sur le lapin dans le cadre du projet autorisé sont des prélèvements sanguins à l'artère au niveau de l'oreille. Aucune complication ou réaction secondaire n’est observée à la suite de ce prélèvement. Outre l'attention apportée aux gestes techniques, une attention toute particulière est également portée sur la durée de la contention qui est une source notable de stress dans l'espèce concernée. La contention de l'animal est assuré par une boîte adaptée pendant toute la phase de prélèvement. Les manipulations et les gestes techniques sont effectués sous le tutorat d'un technicien formé et confirmé. Comme décrit par ailleurs, les animaux sont euthanasiés en fin de séance de formation, et donc non réutilisés. Ceci permet d'éviter toute complication éventuelle plus tardive.
Devenir
L'ensemble des animaux qui intègre ce projet sont utilisés pour la formation du geste technique du prélèvement intra-cardiaque qui se termine toujours par la mort de l'animal.
Remplacement
Toutes les alternatives et étapes préalables au recours à des animaux ont été mises en œuvre : formation préliminaire sous tutorat, démonstrations mais il n’est pas possible d’éviter un minimum de pratiques pour les actes techniques décrits dans le présent projet. Une partie des actes techniques décrits dans la demande de projet précédente ont cependant pu être retirés du présent projet.
Réduction
Le nombre d’animaux requis est fonction du nombre d’actes techniques justifiant le recours à l’animal, qui est en réduction ainsi que du nombre de techniciens en prise de poste, qui est variable au cours du temps et non prévisible de façon précise. Le nombre d’animaux mentionné dans la présente demande d’autorisation représente un maximum, et ajusté au strict minimum nécessaire. Tous les animaux utilisés à des fins de formation à des gestes techniques spécifiques sont des animaux anciens reproducteurs réformés pour cause de limite d'âge. Aucune utilisation d’animaux élevés à des fins d’utilisation scientifiques n’est prévue.
Raffinement
L’étape d’utilisation d’animaux à des fins de formation à des actes techniques justifiant le recours à l’animal, est soumise au succès des étapes préalables de formation théorique et pratique, qui incluent une formation préliminaire sous tutorat. Le tuteur est obligatoirement présent et, outre son rôle de formateur, est garant du respect de l’animal utilisé (des points limites sont établis). Selon la difficulté du geste et le niveau d’habilité de la personne formée, le tuteur décide ou non de débuter la formation sous anesthésie sans réveil (il s’agit exclusivement d’animaux anciens reproducteurs destinés à l’euthanasie). Les points limites définis sont : - Un temps de contention limité à maximum de 10 minutes en boîte à contention. - Un arrêt du geste technique en cas de difficulté de réalisation après 3 échecs successifs sur animal vigile (en particulier les administrations intra-veineuses et les prises de sang). - Un arrêt des actes sous anesthésie après maximum de 10 minutes afin d’éviter tout risque de réveil ou d’analgésie insuffisante. - Un arrêt d’utilisation immédiat, sous décision et responsabilité du tuteur pour toute observation, pour tout autre évènement ou observation incompatible avec le classement en procédure légère (en se référant à l’Annexe VIII de la directive 201/63/EU). Par ailleurs, seuls les animaux anciens reproducteurs en parfait état général seront utilisés à des fins de formation. En outre, les animaux présentant un comportement incompatible avec une utilisation en formation (stress excessif) seront également écartés.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est celle avec laquelle le technicien en formation sera amené à travailler. L'ensemble des animaux utilisé dans le cadre de ce projet sont des anciens reproducteurs réformés.
Evaluation des propriétés anti-tumorales de virus oncolytiques codant pour des protéines thérapeutiques chimériques chez la souris immunocompétente C57BL/6
- Recherche appliquée
- Cancers
338 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis jusqu'à cinq injections de virus oncolytiques, avec des douleurs liées aux injections et à la croissance des tumeurs, la mise à mort intervenant à 20 % de perte de poids. Le projet teste des virus porteurs de protéines chimériques contre le cancer. Le porteur indique disposer de cultures 3D, sphéroïdes et puces microfluidiques, pour une partie de ses expériences, mais juge "l'organisme entier" nécessaire pour évaluer les effets immunitaires.
Objectifs
Les virus oncolytiques sont de nouveaux agents thérapeutiques dont les développements récents participent à l'essor des traitements par immunothérapie. Ces virus présentent 3 modes d’actions principaux, à savoir la capacité à 1) tuer directement les cellules tumorales, 2) induire une réponse immunitaire anti-tumorale et 3) vectoriser des protéines thérapeutiques qui seront uniquement produites dans le microenvironnement tumoral par les cellules cancéreuses infectées. Cette dernière propriété fait actuellement l’objet de nombreuses recherches au niveau international mais des questions importantes demeurent quant aux transgènes thérapeutiques à utiliser et aux conditions dans lesquelles ils doivent être administrés in vivo. Notre projet vise ainsi à étudier, chez la souris immunocompétente, les effets thérapeutiques de virus oncolytiques contenant un nouveau type de transgène codant pour des protéines chimériques qui cibleront plusieurs mécanismes immunitaires au sein du microenvironnement tumoral. Ces protéines chimériques, qui ont été développées dans notre laboratoire, comportent 3 domaines fonctionnels (inhibition des points de contrôle immunitaire, présentation antigénique, co-stimulation) et donnent des résultats très encourageants in vitro. Cependant, l’évaluation de ces différents mécanismes dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.
Bénéfices attendus
Les efforts réalisés pour comprendre la biologie des tumeurs ainsi que l’amélioration continuelle des traitements tels que la chimiothérapie, la radiothérapie, et plus récemment l’immunothérapie ont déjà permis d’augmenter la survie des patients atteints de cancers. Cependant, dans de nombreux cas ces traitements présentent une efficacité limitée. De nouvelles molécules thérapeutiques potentiellement très efficaces nécessitent une vectorisation appropriée pour profiter de leur efficacité tout en limitant les effets secondaires. Il a ainsi été montré qu’une vectorisation appropriée des agents anti-cancéreux permettait de diminuer la morbidité associée au traitement mais aussi d’en améliorer l’efficacité et de limiter l’établissement d’une résistance dans les cellules tumorales. Ce type de stratégie thérapeutique est d’autant plus intéressant dans le cas de cancers très agressifs pour lesquels nous ne disposons pas encore d’options thérapeutiques satisfaisantes. L’utilisation de virus oncolytiques injectés par voie systémique pour vectoriser des molécules au sein même des tumeurs est une approche innovante destinée à répondre à ces problématiques. En créant de nouvelles protéines chimériques très actives et en les combinant au potentiel de vectorisation des virus oncolytiques, nous espérons pouvoir apporter des réponses thérapeutiques à des problèmes actuels en cancérologie.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées de cellules tumorales puis à des injections intraveineuses, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales répétées de traitements. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 5 injections (1 challenge + 4 traitements) par animal.
Impact sur les animaux
Nous avons préalablement pu vérifier que l’injection de virus oncolytiques aux doses prévues n’entraîne pas de morbidité particulière ou de douleur chez les animaux. Concernant la protéine thérapeutique ScFv-OVA-dm41BBL, nous n’avons pour le moment pas de données in vivo. Les données de la littérature sur les différents domaines protéiques qui la composent suggèrent que des effets secondaires auto-immuns pourraient être observés. Une attention particulière sera apportée au suivi de ces effets éventuels (peau, intestin et foie notamment). Chacune des procédures nécessitera la réalisation d'injections intraveineuse, intra-péritonéales et/ou intra-tumorales qui peuvent être à l'origine d'une douleur légère et générer un stress modéré et ponctuel chez les animaux. Dans toutes les procédures, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra aussi générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes, puces microfluidiques) qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. L'approche sur organisme entier nous permet cependant d’évaluer l’effet thérapeutique des virus et de leurs transgènes mais également les effets toxiques potentiels sur divers tissus tels que le compartiment hématopoïétique par exemple. Une telle complexité n’est malheureusement pas encore reproductible in vitro. Dans la mesure où nous souhaitons étudier le ciblage in vivo des cellules tumorales dans un environnement complexe après administration des virus oncolytiques en intraveineux, comme c’est le cas en clinique, ces expériences nécessitent d’être réalisées sur l’animal. Nous avons déjà validé la spécificité de nos virus sur un large panel de lignées cellulaires, en 2D et en 3D. Cependant, ces expériences ne permettent pas de présumer de la biodistribution réelle et des effets systémiques de nos traitements une fois injectés dans un organisme, en particulier les effets immunitaires.
Réduction
Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons (n
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe légère à modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en cas d’absence de réponse au traitement ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, poil ébouriffé, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental
Choix des espèces
L’objectif principal étant d’évaluer les effets immunitaires de nos nouvelles molécules chimériques et de leur vectorisation par des virus oncolytiques, l’utilisation de souris immunocompétentes et de modèles tumoraux syngéniques est essentielle. L’implantation sous-cutanée des cellules tumorales se justifie par le suivi facilité de la croissance tumorale et la comparaison avec les données de la littérature qui utilisent des approches similaires. Nous utiliserons des animaux âgés de 7 à 10 semaines (jeunes adultes). Le stade de développement est justifié par la nécessité d'avoir des animaux adultes ayant un système immunitaire mature.
Impact d’un stress chronique léger sur la fréquence des transferts de gènes au sein du microbiote intestinal
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Elles subissent un protocole de stress chronique léger, confinement et inclinaison de la cage répétés, censé induire une anxiété transitoire, pour mesurer l'effet du stress de l'hôte sur le transfert de gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal. Le porteur décrit des nuisances minimes tout en classant les procédures en gravité modérée, et ne détaille comme test comportemental qu'un open field. Il affirme que le remplacement "n'est pas possible" car les effets du stress dépendraient de processus physiologiques que seuls des modèles in vivo permettraient d'appréhender.
Objectifs
Le microbiote intestinal est un écosystème microbien complexe dont l'équilibre et l'homéostasie sont entretenus par un afflux constant de micro-organismes commensaux. Sa composition est affectée à la fois par des facteurs intrinsèques tels que la génétique de l'hôte, et des facteurs extrinsèques comme les médicaments ou l'alimentation. De récents travaux, ont également montré que le stress de l’hôte, aigu ou chronique, pouvait avoir des effets profonds sur la composition et l'organisation du microbiote intestinal. Ces modulations peuvent être la conséquence soit de l'action directe des médiateurs du stress libérés dans la lumière intestinale sur les bactéries in situ, soit des modifications de la physiologie intestinale induite par le stress. Le microbiote intestinal est par ailleurs un réservoir majeur de gènes de résistance aux antibiotiques (ARG) dont la dissémination pourrait également être influencée lors d’un stress de l’hôte. En effet, le microbiote intestinal représente un milieu extrêmement propice aux transferts de gènes de résistance entre bactéries dû à la grande diversité d’espèces incluant des souches résistantes aux antibiotiques, et un dialogue permanent entre les bactéries. En cas d’un stress de l’hôte, les bactéries constituant le microbiote vont se retrouver au contact de concentrations croissantes de marqueurs de stress (noradrénaline, glucocorticoïdes) provoquant des modifications de croissance et de virulence de certaines espèces. De plus, des données in vitro ont démontré que la noradrénaline stimulait le transfert de gènes entre deux souches bactériennes. Cet effet est inhibé par l’ajout dans le milieu de culture d’inhibiteurs de la noradrénaline. L’ensemble de ces observations suggère que le stress de l’hôte pourrait impacter la fréquence des transferts de gènes dans l’intestin, notamment des ARG, dans un contexte mondial préoccupant quant à l’expansion considérable des bactéries multi-résistantes. A l’heure actuelle, cette observation n’a pas été confirmée in vivo et nous souhaitons explorer cette hypothèse et évaluer la fréquence de transferts de gènes dans un modèle murin de stress léger chronique.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus ici permettront de conclure quant à la nature de l’effet d’un stress chronique vis-à-vis des transferts de gènes au sein du microbiote. Ces résultats seront donc tout à fait novateurs. Ces données permettront d’apporter un éclairage sur le rôle des facteurs liés au stress dans l’adaptation et l’évolution de l’écosystème digestif et notamment la mobilisation des gènes de résistance aux antibiotiques au sein du réservoir intestinal, ouvrant ainsi de nouvelles pistes de réflexion quant à la lutte contre la résistance aux antibiotiques. Dans le cas où une stimulation de ces transferts est observée, nous envisagerons de caractériser ultérieurement les voies impliquées dans ces phénomènes.
Procédures
Le protocole d'induction de stress chronique léger est basé sur l'utilisation de facteurs de stress sociaux et environnementaux. Aucun d'entre eux ne peut être considéré comme inducteur de douleur. Ce protocole de stress est léger car il y a des périodes pendant lesquelles l’animal n’est pas soumis à des stress et d’autre part ou il est exposé plusieurs fois dans la même semaine aux mêmes facteurs stressants (confinement, inclinaison de la cage). L’exposition répétée aux mêmes facteurs de stress donne généralement lieu à une habituation.
Impact sur les animaux
Aucun signe de douleur ou de détresse (telles qu’une position voutée, prostration, toilettage anormal (absent ou excessif) n’a été mis en évidence avec ces séquences comportementales sur 21 jours. Ce protocole de stress chronique entraîne l’apparition de traits d’anxiété mis en évidence en openfield. D’autres études montrent une disparition de l’anxiété et une récupération d’un état normal quelques jours après l’arrêt du protocole de 21 jours. Tous ces éléments indiquent qu'aucun effet indésirable n'est attendu. La seule nuisance attendue est une anxiété, induite par le protocole de stress chronique mais elle est transitoire.
Devenir
N/A
Remplacement
Les données in vitro de la littérature montrent un lien entre des molécules telles que les glucocorticoïdes, induites par le stress chronique, sur le transfert de gènes dans une souche bactérienne précise. Néanmoins, ces expériences ne prennent pas en compte la complexité du microbiote intestinal. De plus, le protocole d’induction du stress chronique léger comprend un ensemble de facteurs sociaux et environnementaux plus proche de la réalité physiologique que les modèles in vitro. Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est donc pas possible dans ce contexte. En effet, les effets du stress chronique léger dépendent d’interactions cellulaires, de processus physiologiques et de l’état de l’être vivant. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé que par l’utilisation de modèles in vivo.
Réduction
L'effectif total des animaux de ce projet a été déterminé par une analyse statistique permettant la réduction maximale du nombre de sujets inclus tout en garantissant une fiabilité forte des résultats qui seront obtenus dans ce projet.
Raffinement
Les cages seront munies d’éléments d’enrichissement (buchettes, sizzlenet), permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera évalué quotidiennement par observation de tout comportement pouvant suggérer la présence de mal être chez les animaux de cette étude.
Choix des espèces
Des études récentes ont validé les effets de la procédure de stress chronique léger de 3 semaines sur des souris C57BL/6J. En effet, celui-ci induit une augmentation des glucocorticoïdes sanguins (marqueur du stress) et un phénotype anxieux (openfield). De plus, les expériences précédentes du laboratoire sur le transfert de gènes d’une bactérie donneuse au microbiote intestinal ont été optimisées sur les souris mâles C57BL/6J de 8 semaines. En particulier, la dose de bactéries donneuse capable d’induire une bonne implantation de la souche en 21 jours a été déterminée dans des souris C57BL/6J non soumises au stress. Pour toutes ces raisons, nous utiliserons le modèle murin C57BL/6J dans cette étude.
Approche intégrée pour l’identification de marqueurs du lupus neuropsychiatrique : analyse comportementale, imagerie cérébrale par IRM et caractérisation histopathologique avec un focus sur la myéline (EU 2/2 – partie IRM)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 760 dans des procédures de gravité sévère. Développant spontanément un lupus, elles présentent des réactions inflammatoires, des lésions des vaisseaux, de la peau, des articulations et des reins, une perte de poids rapide et une dermatite ulcéreuse, et passent trois IRM sous deux heures d'anesthésie chacune. Le projet cherche des marqueurs du lupus neuropsychiatrique en observant la myéline. Le porteur présente l'IRM comme un raffinement et affirme que ces études nécessitent "l'animal entier", un modèle cellulaire ne reproduisant pas l'organisme dans sa globalité.
Objectifs
Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une pathologie autoimmune aux mécanismes complexes dont le diagnostic reste toujours très difficile à poser. Affection inflammatoire chronique, ses symptômes varient beaucoup d’une personne à l’autre avec des atteintes qui peuvent être dermatologiques, rhumatologiques, rénales, cardiaques, mais également cérébrales chez au moins 75% des patients avec l’apparition de troubles des fonctions cognitives et émotionnelles. Cette forme délicate et très invalidante de la maladie constitue le lupus neuropsychiatrique (ou neurolupus) et représente un problème majeur de santé publique du fait des conséquences socio-économiques dramatiques qu’il entraîne (perte d’emploi, coût financier très élevé de la prise en charge, souffrance physique et psychologique des patients et des proches). Actuellement, faute de biomarqueurs et d'études contrôlées, le traitement du neurolupus est basé sur l’administration d’immunosuppresseurs qui entrainent de graves effets secondaires à long terme. De ce fait, la caractérisation précise de biomarqueurs prédictifs d’un dysfonctionnement cognitif et le développement de stratégies thérapeutiques relèvent d’une nécessité de santé publique absolue. La myéline, paramètre négligé jusqu’à présent mais fortement impacté dans certaines pathologies autoimmunes du système nerveux central, fera ici l’objet d’une attention particulière. En effet, la myéline est un élément crucial pour la communication entre les structures cérébrales. Les perturbations de cette dernière induisent des modifications comportementales. Mené sur un modèle murin développant les aspects du LED humain, les objectifs de ce projet seront donc de mieux comprendre les origines et les manifestations comportementales du neurolupus, d’en disséquer les mécanismes (avec un focus sur la myéline comme potentiel biomarqueur prédictif des altérations cognitives), de mettre au point des stratégies thérapeutiques ciblées sur la neuroprotection, et enfin de permettre le transfert d’hypothèses physiopathologiques vers la clinique et vice-versa. Ce projet s’inscrit donc dans le cadre de la recherche fondamentale mais aussi dans celui de la recherche appliquée par l’usage de méthodes IRM et de molécules neuroprotectrices, déjà utilisées en clinique humaine pour le traitement de certaines pathologies neurodégénératives.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont la production de connaissances dans le but d’élaborer des stratégies permettant de traiter efficacement les symptômes cognitifs accompagnant le lupus neuropsychiatrique, et par extension, les symptômes cognitifs observés dans d’autres pathologies inflammatoires autoimmunes affectant le système nerveux central, telles la sclérose en plaques et la neuromyélite optique dans lesquelles la myéline présente des altérations.
Procédures
Les souris auront 3 examens IRM espacés d’au moins une semaine nécessitant 2h d’anesthésie.
Impact sur les animaux
L’IRM est une technique d’imagerie non-invasive et non-irradiante, reconnue pour améliorer le raffinement et la réduction. L’usage d’anesthésie durant l’examen permet d’éliminer les sources de stress et d’inconfort pour l’animal. De ce fait, aucun effet indésirable est prévu. A partir du deuxième temps IRM, les souris alors âgées de 14 jours commenceront à présenter les symptômes du neurolupus tels que : réactions inflammatoires et de lésions de divers tissus/organes (vaisseaux, peau, articulations, reins) ainsi que des troubles comportementaux, symptômes que nous cherchons à contrecarrer par l’administration de nos traitements. Les animaux présentant les signes de souffrances ne seront pas transportés pour l'examen IRM. Ces signes sont les suivants : la perte drastique et rapide de poids, l’augmentation importante des valeurs de protéinurie urinaire, une dermatite ulcéreuse, des modifications de l’état général (piloérection, absence de toilettage, dos vouté, sécrétions nasales et/ou ophtalmiques, difficultés à respirer, gonflement des articulations, présence de ganglions/hyperplasie) et du comportement (prostration, vocalisations, agressivité). Les points limites ont été définis pour détecter le plus précosément possible l’apparition de ces signes.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la dernière IRM.
Remplacement
Les études planifiées dans ce projet ne peuvent en aucun cas être réalisées in vitro car il s’agit d’investiger les mécanismes pathogéniques d’une maladie systématique, le LED, impliquant de nombreux organes en interaction, et d'observer l'efficacité d’un traitement dans le temps. De plus, le développement de nouvelles thérapies requiert des études in vivo permettant d’évaluer les effets de molécules potentiellement thérapeutiques sur la communication entre les organes et l’organisme dans sa globalité. L’avantage de ces modèles est d’intégrer la totalité des effets potentiels d’une substance et de ses métabolites dans un contexte de fonctionnement physiologique, les connexions entre les différents organes étant conservées et les effets de la substance pouvant être appréhendés globalement (ce qui n’est pas le cas dans un modèle cellulaire réductionniste in vitro). Ces études nécessitent donc l’animal entier.
Réduction
Le nombre d’animaux est déterminé avec soin à l’aide d’un logiciel, ajusté et calculé au plus juste pour répondre aux critères d’éthique tout en permettant l’analyse statistique des résultats obtenus et en assurer la reproductibilité.
Raffinement
Les animaux ne seront pas hébergés dans notre EU. Les examens IRM sont non invasifs et réalisés sous anesthésie afin de réduire le stress des souris. La profondeur de l’anesthésie est évaluée par le réflexe de retrait de la patte ou le pincement de la queue, et la fréquence respiratoire et la température corporelle sont suivies en temps réel durant tout l’examen. L’hypothermie due à l’anesthésie sera évitée grâce à un tapis chauffant pendant la durée totale de l’expérimentation. Du gel sera appliqué sur les yeux pour éviter leur dessèchement.
Choix des espèces
Notre choix d’utiliser des souris permet d’avoir un modèle reproduisant la pathologie humaine de manière spontanée. Les souris seront observées à différents stades de la maladie : à 8 semaines avant l'apparition des symptômes; 14 semaines au début de l'expression de la maladie et 20 semaines au moment de l'expression des symptômes.
Suivi et caractérisation par IRM de la radio-nécrose (3/3)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris porteuses de gliomes ou de métastases cérébrales sont suivies jusqu'à une perte de 15 % de leur poids ou jusqu'à l'atteinte d'autres points limites, qui entraînent leur mise à mort immédiate. 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour comparer leurs images IRM à l'analyse de leurs tissus. Elles passent des examens IRM d'une heure au plus sous anesthésie générale, espacés d'au moins trois jours, avec à chaque fois une injection d'agent de contraste, et peuvent présenter titubation, léthargie, tête penchée, tremblements ou crises d'épilepsie. Le projet vise à distinguer par IRM la récidive d'une tumeur cérébrale de la nécrose due à la radiothérapie, mais le résumé ne décrit ni l'implantation des tumeurs, ni l'irradiation, ni le nombre d'examens par souris.
Objectifs
L’Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) est une méthode de choix pour la détection de tumeurs cérébrales. Cependant, les techniques d'IRM conventionnelles ne sont toujours pas capables de distinguer la progression tumorale de la radio-nécrose, car les deux présentent la même apparence sur les images IRM. Seuls des critères d'évaluation qualitatifs non reproductibles et subjectifs des lésions ont été proposés. Des performances modérées ont été rapportés grâce à l’implémentation de techniques d'IRM avancées. Ainsi actuellement, des séries d’examens IRM incluant l’ensemble de ces nouvelles techniques sont nécessaires pour affiner les pronostics sans pour autant atteindre 100% d’exactitude. L’actuel projet de recherche s'appuie lui sur la relaxométrie IRM. Cette technique permet de caractériser la microstructure du tissu et ainsi d'augmenter la spécificité de détection. De plus, pour résoudre le problème spécifique de la différenciation radio-nécrose/progression, ce projet adoptera une approche de pointe pour extraire des informations sur la microstructure du tissu au sein de chaque voxel (pixel en 3D). Ce projet vise à développer des méthodes avancées d’IRM pour permettre l'évaluation in vivo non invasive de la réponse à la radiothérapie de gliomes implantés ou de métastases cérébrales chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces données recueillies avec la nouvelle méthode IRM fourniront un point de départ solide pour 1) évaluer la possibilité d'éviter les biopsies et 2) évaluer plus précocement l'évolution de la maladie. Les résultats de ce projet bénéficieront à long terme aux patients atteints de cancers cérébraux. De nouveaux biomarqueurs permettant de distinguer la récidive tumorale de la nécrose seront développés et mis à disposition via des techniques d'IRM rapides et robustes compatibles avec l'environnement clinique. Cela facilitera le diagnostic et permettra une prescription de traitement adapté. De plus, cela devrait réduire la nécessité d'une biopsie chirurgicale et ainsi limiter les risques pour le patient. Finalement, cette nouvelle technique IRM améliorera le confort des patients (pas d’injection d’agents de contraste, acquisitions rapides, diagnostics plus précis, technique d’imagerie inoffensive).
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection d’agents de contraste IRM sous anesthésie générale à chaque examen IRM. Ces examens seront séparés d’au minimum 3 jours.
Impact sur les animaux
Les modèles tumoraux pourraient induire des effets indésirables sur le comportement de l’animal (titubation, léthargie), sur son apparence (yeux mi-clos, dos vouté), une perte de poids, et des signes neurologiques tels que la tête penchée, tremblements, crises d’épilepsie. La radionécrose tumorale ne devrait pas induire de douleur. En revanche, si une radionécrose du tissu cérébral sain intervient, celle-ci pourrait devenir douloureuse et sera détectée par des modifications du comportement ou de l’apparence physique. De plus, le transport des animaux d’un établissement utilisateur à un autre pourrait induire un stress aux animaux.
Devenir
A la fin du projet, les animaux seront euthanasiés pour comparer les résultats obtenus en IRM avec des études histologiques, et ainsi valider le nouveau protocole IRM.
Remplacement
Notre projet est à visée translationnelle. En effet, nous souhaitons développer des séquences IRM permettant un diagnostic plus précoces et fiables de la radionécrose (grâce à l’obtention d’images avec des résolutions spatiales et temporelles plus élevées, et des informations plus quantitatives). L’imagerie du petit animal vivant est donc un maillon indispensable dans ce processus.
Réduction
Les séquences IRM sont déjà développées et ont déjà été évaluées sur des souris saines. Ainsi, seulement des souris pathologiques (portant soit des gliomes soit des métastases cérébrales) seront imagées. Du fait de la non-invasivité de l’imagerie par IRM, les mêmes animaux seront imagés plusieurs fois avec un minimum de trois jours entre chaque examen. De plus, les structures cérébrales contralatérales au gliome serviront de contrôle interne. Cette démarche permet de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire.
Raffinement
L'utilisation d'anesthésies gazeuses, la présence d'un tapis chauffant permettant de maintenir la température interne des animaux et le contrôle de la respiration permettent d'assurer un réveil rapide des animaux. De plus, du gel ophtalmique sera utilisé pour éviter la secheresse oculaire. Il est à rappeler que l’expérience d’IRM en elle-même ne génère aucun signe de souffrance visible. Lors du positionnement de l’animal dans l’antenne IRM, la tête de l’animal est placée dans un masque surmonté d’un tuyau dans lequel circule de l'air etun anesthésique. Un ordinateur placé à côté de l’expérimentateur permet de contrôler en permanence la respiration de l’animal et d’adapter la dose d’anesthésique afin d’induire l’anesthésie la plus faible possible. Une expérience sur animal a une durée maximum de 1 heure. L’agent de contraste utilisé est un agent quotidiennement employé lors des examens d’IRM sur les patients. Cet agent de contraste n’entraîne pas d’effets secondaires. Les animaux seront injectés avec une dose 5 fois inférieure à la dose clinique. Les souris portant des tumeurs ou métastases cérébrales seront étudiées jusqu’à ce que leurs poids aient diminué de 15% ou que les autres points limites soient atteints. Une grille de scorage a été instaurée pour surveiller la santé et le bien-être des animaux, comprenant des signes au niveau du comportement, de la mobilité, de la perte de poids, et de l’apparition de signes neurologiques. Si des signes de mal-être apparaissent, les animaux seront pris en charge par un analgésique. Des points limites ont aussi été instaurés, induisant une euthanasie immédiate. Les animaux seront observés au réveil pour une recherche de signes cliniques de la douleur.
Choix des espèces
Les souris C57Bl/6N et BalbC sont couramment utilisées dans la littérature, permettant de comparer nos résultats à des études précédentes. De plus, elles possèdent un système immunitaire fonctionnel permettant de mimer la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 8 semaines) car le développement des organes sera terminé.
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Dindes : 1000
Après une à deux administrations d'un vaccin candidat, et jusqu'à dix chez les poules pondeuses, puis cinq à six semaines d'élevage, ou jusqu'à 70 semaines pour les pondeuses, 4 200 poules et 1 000 dindes reçoivent un agent pathogène du coryza infectieux, de la bronchite infectieuse, d'un pneumovirus ou d'un réovirus. Ces 5 200 oiseaux subissent aussi des prises de sang, des écouvillons ou des prélèvements de larmes, et restent suivis 7 à 28 jours après l'infection, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur reconnaît que la maladie peut causer "une contrainte voire une douleur", surtout chez les témoins non vaccinés, pour des vaccins destinés à garantir les "performances zootechniques et économiques" des élevages. Poules et dindes sont toutes tuées en fin d'étude, ou plus tôt si elles atteignent un point limite, en raison des autopsies souvent pratiquées et parce que leur âge ne permet plus de les réutiliser pour tester un vaccin.
Objectifs
Le projet a pour but d’évaluer l’efficacité de substances d’essai immunologiques sur les espèces aviaires (poules et dindes). Pour évaluer l’efficacité des substances d’essai, un agent pathogène responsable d’une maladie est ici administré à des animaux vivants. Pour qu’un médicament soit commercialisé, il faut démontrer que celui-ci apporte un effet bénéfique sur l’animal pour la ou les maladies considérées. Les études sont réalisées sur l’espèce cible du produit développé (ici les volailles) ou sensible à la (aux) souche(s) utilisée(s). Ceci afin de s’approcher au maximum des conditions réelles d’utilisation. Ces différentes études sont exigées par la Pharmacopée Européenne et/ou les règlementations nationales et internationales concernant les vaccins.
Bénéfices attendus
Ces études sont menées selon les exigences, du règlement (UE) 2019/6, de la Pharmacopée Européenne, de guidelines (dont VICH GL44) et d’autres exigences réglementaires spécifiques à chaque pays et en conformité avec la Directive Européenne 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. La finalité de ces études est la mise au point de produits immunologiques ayant un niveau d’efficacité satisfaisant chez les animaux cibles. Ceux-ci sont essentiels en élevage de volaille afin de protéger les animaux contre les maladies infectieuses et garantir les performances zootechniques et économiques, tout en réduisant l’impact des maladies infectieuses sur les populations.
Procédures
#1(Coryza infectieux)Les anx reçoivent en général 2administrations(durée:jusqu’à10 sec), mais ce nombre peut aller jusqu’à10 dans le cas d’études chez la poule pondeuse. Les administrations sont espacées d’au moins 2sem. Des prlvm sanguins, et/ou des écouvillons(durée:jusqu’à10 sec), peuvent être effectués. La durée d’élevage avant épreuve dure généralement de 5à6 sem. Dans le cas exceptionnel des poules pondeuses, cette phase peut durer jusqu’à70 sem. Après l’épreuve, la durée de la procédure est généralement de 14jours, voire 21jours en fonction des études réalisées (si besoin de sérologie ou récupération du sérum par exemple. #2(Bronchite infectieuse)Les anx reçoivent en général 1à2 administrations(durée:jusqu’à10 sec), mais ce nombre peut aller jusqu’à 10 dans le cas d’étude chez la poule pondeuses. Les administrations sont espacées d’au moins 2sem. Des prlvm sanguins, et/ou des écouvillons et/ou des prlvm de larmes (durée:jusqu’à10 sec), peuvent être effectués. La durée d’élevage avant épreuve dure généralement 6sem. Dans le cas exceptionnel des poules pondeuses, cette phase peut durer jusqu’à 70sem. Après l’épreuve, la durée de la procédure est généralement de 7à28 jours (post-épreuve) en fonction des études réalisées. #3(Pneumovirus)Les anx reçoivent en général 1à2 administrations(durée:jusqu’à10 sec), mais ce nombre peut aller jusqu’à 10 lors d’étude chez la poule pondeuse. Les administrations sont espacées d’au moins 2sem. Des prlvm sanguins, et/ou des écouvillons et/ou des prlvm de larmes (durée:jusqu’à10 sec), peuvent être effectués. La durée d’élevage avant épreuve dure généralement de 5à6sem. Dans le cas exceptionnel des poules pondeuses, cette phase peut durer jusqu’à 70sem. Après l’épreuve, la durée de la procédure est généralement de 10 à 14jours (post épreuve) chez l’ensemble des espèces. Cette durée pourra être augmentée jusqu’à 4sem en fonction des critères suivis et des études réalisées. #4(Réovirus)Les anx reçoivent en général 1à2 administrations(durée:jusqu’à10 sec), mais ce nombre peut aller jusqu’à 10 lors d’études chez la poule pondeuse. Les administrations sont espacées d’au moins 2sem. Des prlvm sanguins, et/ou des écouvillons(durée:jusqu’à10 sec), peuvent être effectués. La durée d’élevage avant épreuve est généralement de 5 à 6 semaines. Après l’épreuve, la durée de la procédure est généralement de 10 jours à 14 jours. Cette durée pourra être augmentée jusqu’à 4 semaines en fonction des critères suivis et des études réalisées.
Impact sur les animaux
Le développement de la maladie peut donner lieu à des signes cliniques provoquant une contrainte voire une douleur à l’animal (notamment chez les animaux non-vaccinés = animaux témoins dans les études d’efficacité). C’est pourquoi, afin de limiter une possible dégradation de l’état général des animaux, des points limites généraux et des points limites spécifiques des maladies étudiées ont été définis. L’administration de l’agent pathogène, les prélèvements et la contention des animaux peuvent également générer du stress chez les animaux. Pour limiter le stress engendré par ces actes, les procédures sont réalisées par des opérateurs qualifiés qui assurent une contention adaptée de l’animal. De plus, d’autres mesures (telles que l’alternance des sites d’administration et de prélèvement) peuvent être envisagées lorsque les opérateurs les jugent nécessaires.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés compte-tenu des autopsies souvent nécessaires en fin d’étude. De plus, l’âge des animaux en fin d’étude ne correspond plus à un âge recommandé pour la vaccination, ils ne peuvent donc être réutilisés (la règlementation demandant de tester le(s) vaccin(s) à l’âge minimum recommandé pour la vaccination). Dans des cas exceptionnels, si l’animal atteint des points limites ou un critère d’alarme spécifique à la procédure pendant l’étude, il est euthanasié.
Remplacement
Lorsque cela est possible, une première étape consiste à tester in vitro différents candidats vaccins et substances immunologiques. Ceci permet une première sélection de ces derniers, et de réduire ainsi le nombre d’animaux utilisés. Une série de tests analytiques permet de garantir un certain niveau de sécurité pour les animaux recevant le produit. Un recueil d’informations est également apporté par la bibliographie lorsque cela est possible. Le recours à l’espèce cible est, à l’heure actuelle, une exigence règlementaire. Ce recours est indispensable pour observer le plus fidèlement possible les effets sur les espèces cibles qui pourront bénéficier de ces traitements.
Réduction
Concernant les études règlementaires, le nombre minimal d’animaux à inclure est fixé par les textes réglementaires. En amont, lors des phases recherche, les effectifs sont évalués au plus juste grâce à l’historique des études réalisées par l’entreprise, la connaissance des modèles expérimentaux utilisés, la bibliographie et en utilisant des tests statistiques de puissance. Cette évaluation des effectifs permet de limiter le nombre d’animaux et les études non conclusives.
Raffinement
Pour chaque étude, une période d’acclimatation systématique est prévue dans le but de limiter le stress des animaux et de stabiliser leur état physiologique (sauf cas exceptionnels subordonnés au protocole expérimental).
Choix des espèces
L’évaluation chez l’espèce cible est une exigence règlementaire. Les espèces aviaires sont les espèces cibles des substances d’essai étudiées. Dans la majorité des études, les animaux utilisés ont entre 1 jour et 18 semaines d’âge (en fonction des études et des espèces). Les animaux utilisés dans des études menées chez les poules pondeuses, peuvent avoir jusqu’à 70 semaines d’âge (en fin d’expérimentation). L’âge des animaux au moment de la vaccination dépend des besoins des différents types d’études qui sont à effectuer. Ces besoins dépendent de l’objectif de l’étude, du produit testé et répondent à l’exigence expérimentale d’utilisation du produit en vue de sa mise sur le marché. Dans la majorité des cas, l’âge des animaux correspond au plus jeune âge recommandé pour l’administration du médicament, conformément aux exigences réglementaires.
Étude de traitements anticancéreux dans des modèles de tumeur du nasopharynx
- Recherche appliquée
- Cancers
Privées de la protéine p53, qui freine l'apparition des cancers, une partie des souris développe plus facilement des tumeurs spontanées en vieillissant, d'où leur emploi avant l'âge de 16 semaines. Au total, 2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les autres reçoivent par chirurgie sous anesthésie, sous la peau du dos, un fragment de tumeur du nasopharynx, puis chaque souris est traitée tous les jours pendant deux semaines, éveillée et sous contention, par injection intraveineuse ou gavage, et celles qui sont privées de p53 subissent en plus une prise de sang à la joue sans anesthésie chaque semaine pendant un mois. Après la mise à mort, les tumeurs sont analysées et la moelle osseuse prélevée. Le porteur affirme que "seul un animal vivant, entier, peut permettre d'étudier dans sa globalité l'effet des traitements", pour six composés déjà prescrits à des patients atteints d'autres cancers.
Objectifs
La protéine p53, appelée gardienne du génome, a pour rôle d’empêcher l’émergence et la prolifération de cellules cancéreuses lorsque des évènements favorisant leur apparition surviennent. En effet, dans de nombreux cancers cette protéine est modifié ou absente. Une autre protéine, MDM2, est décrite comme empêchant l’activité protectrice de p53 et jouerait donc un rôle dans l’apparition de cancers. Des composés thérapeutiques visant à empêcher la fonction de régulation de MDM2 sur p53 ont été développés, mais sans réel succès. Ceci signifie que MDM2 pourrait avoir un rôle plus important que ce qui est actuellement connu et agir sur d’autres molécules. Ce projet cherche à définir plus précisément l’implication de MDM2 dans le développement des cancers.
Bénéfices attendus
Les connaissances obtenues grâce à ce projet de recherche seront bénéfiques pour la communauté scientifique à court terme, afin de permettre d’appréhender la complexité du rôle de notre molécule d’intérêt dans la progression tumorale. A moyen terme, si l’un des composés que nous testons sur les cancers nasopharyngés est efficace (composés déjà indiqués pour un autre type de cancer en médecine humaine), cela pourra alors donner lieu à un essai clinique (dont l’objectif est d’évaluer la sécurité et l’efficacité du médicament) pour ce type de pathologie.
Procédures
Pour mener à bien ce projet, nous réaliserons deux types de protocoles expérimentaux utilisant des souris. Dans le premier axe, nous testerons l’effet de composés thérapeutiques déjà validés chez le patient pour certains cancers sur des tumeurs nasopharyngés (cancer où l’action protectrice de la molécule p53 est empêchée par notre molécule d’intérêt) qui auront été greffées sous la peau du dos de souris. Cette implantation se fait par chirurgie (petite incision de la peau) sous anesthésie générale et traitement anti-douleur (durée de la procédure maximum 10 minutes). Un mois plus tard, le traitement (6 composés différents administrés seul soit par voie intraveineuse soit par gavage) débute avec une administration quotidienne pendant 2 semaines. Chaque administration est réalisée sur souris éveillée et après contention et dure moins d’une minute. Dans le second axe, nous utiliserons des souris transgéniques n’exprimant pas la molécule p53. Cela nous permettra de caractériser l’effet des composés thérapeutiques en absence de l’action de notre molécule d’intérêt sur la protéine protectrice du cancer. Pour cela ces souris recevront les traitements comme décrits pour l’autre modèle. Chaque semaine pendant un mois, un prélèvement de sang au niveau de la joue (geste réalisé sans anesthésie et d’une durée de 10 secondes) permettra de suivre l’effet des traitements sur la composition du sang.
Impact sur les animaux
Dans la mise en place du premier axe de recherche, l’implantation chirurgicale du fragment tumoral va impliquer une suture avec un risque de mauvaise cicatrisation. Lorsque le fragment tumoral greffé va croître, sa taille pourra donc entraîner une gêne dans le déplacement des souris et une nécrose pourrait également apparaître. L’administration répétée des composés thérapeutiques (une fois par jour pendant deux semaines) pourrait entrainer une ulcération au site d’injection (pour les administrations dans la veine) et une irritation du tube digestif (dans le cas de l’administration orale avec une sonde de gavage). Enfin les souris transgéniques n’exprimant pas la molécule p53 peuvent développer plus facilement des cancers spontanés en vieillissant (apparition de tumeurs affectant le bien-être de l'animal: difficulté de déplacement, douleur liée à la présence de la tumeur).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Dans le cas du modèle de greffe d’un tissu tumoral sous la peau, cela permettra de faire l’analyse de ce tissu après le traitement avec nos différents composés thérapeutiques. Dans le cas des souris transgéniques n’exprimant pas la molécule pouvant jouer un rôle dans le développement du cancer, nous récupérerons la moelle osseuse après l’euthanasie afin d’en faire une fine caractérisation (effet des thérapies sur les différentes types de cellules présentes).
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans sa globalité l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale (caractérisée par une régression de la tumeur), ainsi que les relations entre les différentes cellules dans un contexte normal ou pathologique. Cela est impossible à reproduire complètement dans des systèmes artificiels n'utilisant pas d'animaux. De plus la distribution des traitements dans l’organisme joue un rôle important dans l’effet thérapeutique d’une molécule et cela est impossible à reproduire sans l’utilisation d’animaux.
Réduction
Nous utilisons le nombre minimal de souris nécessaires à l’obtention de résultats statistiquement interprétables. Des expériences in vitro, n'utilisant pas d'animaux, ont été réalisées au préalable.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement mis en place, les procédures de chirurgie seront réalisées sous anesthésie générale et avec une analgésie adaptée. Nous surveillerons dans les premiers jours la suture (absence d’infection, bonne cicatrisation). Une surveillance quotidienne (visuelle) sera mise en place et complétée par un suivi clinique toutes les 48h. Nous avons établi une grille d’évaluation clinique prenant en compte la croissance de la tumeur et l’état général de la souris nous permettra de mettre en place des actions correctives nécessaires (analgésie, euthanasie). Dans le cas de douleur liée à l’administration répétée des composés thérapeutiques, une analgésie sera administrée. Si aucune amélioration n'est observée dans les 24h, la souris sera euthanasiée. Enfin, les souris seront hébergées en groupe et dans des cages contenant un enrichissement (papier kraft pour faire des nids et buchettes en bois à ronger).
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont la génétique est bien connue ce qui nous permet d’utiliser un modèle transgénique bien établi. De plus, la connaissance de son comportement permet aussi l’évaluation du bien-être de la souris et la souffrance liée à l’expérimentation animale peut être aisément effectuée (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, prostration) permettant ainsi une prise en charge rapide et adaptée. Nous utiliserons des souris adultes (7 semaines au début du projet) car cette maladie touche essentiellement des sujets adultes. Dans le cas des souris transgéniques, nous les utiliserons avant l’âge de 16 semaines afin de ne pas être confrontées à l’apparition de tumeurs spontanées.
Etude de l’efficacité d’un composé anti-obésité en développement chez la souris rendue obèse par une alimentation riche en graisse
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures de gravité légère à modérée. Rendues obèses par un régime à 60 % de graisses, hébergées seules, elles reçoivent chaque jour un composé par voie orale, des pesées quotidiennes, des prélèvements sanguins à la queue et un test de tolérance au glucose après jeûne, pour évaluer un candidat anti-obésité. Le porteur indique viser un dossier d'autorisation de mise sur le marché et affirme qu'"il n'existe aucune méthode de substitution". Il précise que cette étude reprend un essai précédent gâché par une panne de climatisation ayant fait monter l'animalerie à 38 °C et tué une partie des souris.
Objectifs
L'étude décrite dans le présent dossier sera réalisée dans le cadre du développement d'un composé d'intérêt thérapeutique (sous trois doses), destinés à l'amélioration des troubles métaboliques, notamment l'obésité. Cette étude est un avenant à un dossier qui a déjà été accepté. Vers la fin de l'étude, suite à un problème technique au sein de notre animalerie, lié à un dysfonctionnement de la centrale de traitement d'air pendant la nuit, la pièce d'hébergement est montée jusqu'à 38°C. Cet événement est arrivé 2 à 4 jours avant la fin de l'étude selon les bras expérimentaux. Le métabolisme de la souris est très sensible aux changements de température. Ainsi, même si un nombre limité d'animaux sont morts par cette hausse accidentelle de température, le stress engendré si près du jour de prélèvement par l'étude nous a empêché de réaliser une étude statistique robuste. Pour remettre le contexte de l'étude, l'obésité dans le monde a presque triplé depuis 1975, pour atteindre plus 650 millions de personnes obèses en 2016, selon l'OMS. L'obésité est alors considérée comme un fardeau de santé publique, pour lequel une variété de thérapeutiques, de procédures chirurgicales et de dispositifs médicaux sont actuellement à l'étude. Une première étude pilote, réalisée par le laboratoire pharmaceutique client de l'étude, a montré qu'un de ces composés induit une perte de poids corporel associée à une diminution de la prise alimentaire chez des souris obèses. L'objectif de la présente étude sera de confirmer et de compléter ces résultats préliminaires en évaluant l'impact à plus long terme de ce composé sur la prise alimentaire, le poids corporel et la régulation glycémique chez des souris rendues obèses par un régime hyperlipidique (60% de l'énergie issue des graisses) pendant 10 semaines avant démarrage du traitement. Les traitements seront administrés par voie orale pendant les 4 semaines suivantes, pendant lesquelles les animaux seront soumis au même régime enrichi en graisse. Au cours du traitement, les paramètres suivants seront mesurés : poids corporel et prise alimentaire, composition corporelle, glycémie à jeun, tolérance au glucose. Le traitement sera administré à trois doses différentes afin d'obtenir une dose-réponse. Par ailleurs, afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°C).
Bénéfices attendus
Cette étude a pour objectif de constituer un dossier d'autorisation de mise sur le marché pour commercialiser un composé thérapeutique luttant contre l'obésité.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - obésité des animaux de part leur phénotype - un hébergement individuel sur toute l'étude - une administration orale quotidienne à partir de D-11 - une pesée quotidienne de D-18 à D-1 - un prélèvement sanguin à la queue à D-3 et D29 - une prise alimentaire et une pesée trois fois par semaine à partir de D1 - une mise à jeûn de 4h - une analyse de leur composition corporelle à D29 - un test oral de tolérance au glucose (OGTT) à D29 [Mise à jeun pendant 8h, Prélèvements sanguins (1 goutte) 30min avant et à 0, 5, 20 et 60min aprés administration du glucose] De plus, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance.
Impact sur les animaux
La nécessité de mesure individuelle de la prise alimentaire implique l'hébergement individuel des animaux. Afin d'explorer l'implication éventuelle de la thermogenèse dans les effets du composé, les animaux seront hébergés à une température de thermoneutralité (29-32°). Etant donné leur phénotype attendu, les souris seront obèses. Toutefois, la perte de poids induite par leur diabète sévère et/ou par l'administration des composés d'intérêt peut être une source de nuisance. D'autre part, des prélèvements sanguins à D-3 et D29, une administration quotidienne per os à partir de D-11, un test de tolérance au glucose (avec une mise à jeun de 8h), une analyse de la composition corporelle et une mise à jeûn de 4h avant euthanasie sont prévus.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort. Des prélèvements terminaux post mortem sont nécessaires pour une étude complète de ce composé.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe aucune méthode de substitution n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’impact d’un composé sur le poids corporel, la prise alimentaire et les troubles métaboliques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été rationalisé à partir de l'expérience acquise par notre laboratoire sur l'analyse des paramètres d'intérêt. Ainsi, le nombre d'animaux par groupe a été adapté pour chaque série expérimentale en fonction des paramètres d'intérêt de façon à être en mesure de mettre en évidence une différence statistiquement significative sur les paramètres étudiés avec une puissance à 0.80 et une erreur alpha à 0.05. Les paramètres étudiés sont les suivants : poids corporel, gain de poids corporel (en g et %), prise alimentaire, prise alimentaire cumulée, efficacité alimentaire (Gain de poids en g/Prise alimentaire cumulée en g), test de tolérance au glucose (glycémie et aire sous la courbe), glycémie à jeun, insulinémie, HOMA-IR et HOMA-b (résistance à l'insuline et fonction des cellules b du pancréas) et les poids des différents organes. De plus, les résultats obtenus dans la précédente étude nous a permis de réduire le nombre d'animaux au composé le plus prometteur.
Raffinement
Le modèle animal qui sera utilisé est un modèle parfaitement caractérisé dans la littérature et couramment utilisé dans les études précliniques cherchant à mettre en évidence les effets bénéfiques de composés sur la prise alimentaire, le poids corporel et les troubles métaboliques. Le protocole a été planifié de façon à limiter au maximum tout stress et tout inconfort pour les animaux. Les animaux seront hébergés en cages individuelles du fait de la nécessité de mesurer précisemment l'impact du composé sur leur prise alimentaire individuelle. Néanmoins, les animaux conserverons des contacts visuels avec leurs congénères et un enrichissement des cages sera assuré par l'ajout d'igloos et de matériels de nidification. Enfin, un suivi journalier des animaux à l'aide d'une grille de score permettra une action rapide en cas d'atteinte des points limites établis. Afin d'éviter toute angoisse ou souffrance des animaux, lors de l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés (Procédure 1 : Euthasol en surdose/Procédure 2 : mélange de kétamine/xylazine) avant la dislocation cervicale. Les animaux de la procédure 1 seront euthanasiés par surdose d’anesthésique puis par dislocation cervicale. Ceux de la procédure 2 seront ensuite anesthésiés par l'administration d'un mélange de kétamine/Xylazine et euthanasiés par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Le modèle de souris C57BL/6J nourries avec une alimentation enrichie en graisse (60%) est un des modèles de souris le plus classiquement utilisé et le mieux documenté dans le cadre d'études précliniques menées dans le contexte des troubles métaboliques. Le choix du modèle a été validé avec le client par le chef de projet. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte. Le choix de ce stade de développement est guidé par la population humaine ciblée par les composés testés, à savoir une population adulte.
Évaluation du rôle du « Set & Setting » dans les effets pharmacologiques et thérapeutiques de la DMT
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures allant de la gravité légère à sévère, une partie opérée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent un modèle de dépression par corticostérone sur quatre semaines, des chirurgies crâniennes, des injections de DMT, le principe actif de l'ayahuasca, ou de kétamine, et trois tests comportementaux, la suspension par la queue, le labyrinthe en croix surélevé et l'open field. Le protocole prévoit aussi un "Set & Setting" défavorable, préhension par la queue et isolement de 24 heures, pour induire un stress. Le porteur affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour étudier ces comportements complexes en vue d'un futur protocole clinique.
Objectifs
Les principales substances psychédéliques sont l’acide lysergique diéthylamide (LSD), la psilocybine, la mescaline, et la diméthyltryptamine (DMT) le principe actif du breuvage amazonien « ayahuasca ». Ces substances exercent leurs effets biologiques (effets anxiolytiques et/ou antidépresseurs) principalement par une action d’agoniste des récepteurs sérotoninergiques. La DMT présente une courte durée d’action puisque ses effets psychotropes disparaissent 20 à 30 minutes après leur administration par voie parentérale. Le « Set & Setting », c’est-à-dire les dispositions individuelles et environnementales, pourrait jouer un rôle essentiel dans les effets thérapeutiques recherchés. Certains essais cliniques montrent par exemple qu’une maîtrise du contexte d’administration avec notamment une décoration adaptée, de la musique diffusée, un mobilier adéquat, et la présence d’un personnel formé aux séances d’administration permet d’optimiser la réponse thérapeutique. Toutefois, les mécanismes sous-jacents restent à être déterminés. Ce projet vise à évaluer l’influence du « Set & Setting » dans la réponse à la DMT pour le traitement de troubles de type anxio-dépressifs chez la souris.
Bénéfices attendus
Ces études précliniques devraient permettre de mettre en évidence une efficacité de la DMT dans le modèle murin de symptômes anxio-dépressifs causés par l’exposition à la corticostérone. Les variations de « set & setting » devraient montrer une influence sur cette efficacité. Les résultats de ces études précliniques pourraient poser les bases de la mise en place d’un essai clinique. L’objectif final étant de proposer de nouveaux traitements anxiolytiques et/ou antidépresseurs plus efficaces que ceux actuellement disponibles. En effet, leur long délai d’action, le faible taux de réponse et le risque de rechute constituent les principales limites à l’utilisation des traitements conventionnels.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 tests comportementaux de degré de sévérité modérée, qui dureront respectivement 5, 6 et 10 minutes. Pour évaluer l’efficacité des molécules testées, un modèle de dépression sera appliqué pendant 4 semaines à certaines souris. 2 types de chirurgies seront effectuées. Au maximum, les souris recevront une seule chirurgie. Les chirurgies dureront une dizaine de minutes. Un dispositif sera posé sur le crâne de certaines souris et restera en place pendant 1 semaine.
Impact sur les animaux
Les animaux suivant le protocole CORT, pourront présenter des symptômes pseudo-dépressifs tels qu’une perte de plaisir (anhédonie), une diminution de soin corporel (incurie), et/ou un état de résignation. Cependant le régime d'administration choisi produit une symptomatologie relativement subtile dont le seul signe spontané clairement visible est une altération de l'état du pelage. Ces symptômes seront présents au maximum pendant 4 semaines. Les animaux recevant le protocole « Set & Setting » défavorable (préhension par la queue et isolement dans un environnement appauvri pendant 24h) pourront présenter un léger stress. Lors de la réalisation des tests comportementaux (Tail Suspension Test, Elevated Plus Maze, Open Field), les animaux pourront subir un stress léger de quelques minutes, le temps du test. Toutes les procédures invasives ou chirurgicales se réaliseront sous anesthésie. Les animaux subiront la seule douleur liée à la piqûre lors de l’injection du produit d’intérêt. L’injection de DMT ou de kétamine induira un état modifié de conscience pouvant éventuellement entraîner une diminution de l’activité locomotrice et une anxiété légère de quelques minutes.
Devenir
À l’issue des tests comportementaux, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale. Leurs cerveaux seront ensuite prélevés pour des examens de biologie moléculaire. Pour d'autres procédures, les animaux seront mis à mort par une perfusion à débit constant de NaCL précédée d’une injection d’euthasol à forte dose. Cette mise à mort permettra de prélever les cerveaux pour une analyse immunohistochimique ultérieure. Suite aux examens de microdialyse et d'électrophysiologie, pour éviter une souffrance liée à une atteinte irréversible des structures cérébrales, les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale.
Remplacement
L’objectif du projet étant l’étude de comportements complexes, les symptômes de type anxio-dépressif, il est indispensable de travailler sur un modèle animal. Il s’agit de valider des stratégies thérapeutiques dans un modèle préclinique en vue de développer un protocole clinique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante nécessaire aux comparaisons intergroupes : 10 animaux pour les études comportementales répartis ensuite en deux groupes de 5 pour les études électrophysiologiques et neurochimiques (microdialyse intracérébrale).
Raffinement
Pour éviter la souffrance des animaux, nous utiliserons des anesthésiques adaptés pour chaque chirurgie. À l’issue des chirurgies, des soins postopératoires seront dispensés et une plus grande attention sera portée sur les animaux. Si, hors chirurgie, des souffrances sont constatées, nous utiliserons des antalgiques. Lors des procédures impliquant la modélisation de symptômes pseudo-dépressifs, une observation quotidienne sera effectuée. Pour évaluer l’état des animaux, une grille de score sera utilisée. Des critères d’arrêt de souffrance prédéfinis permettront de prendre la décision de mise à mort des animaux si les points limites sont dépassés.
Choix des espèces
Le modèle de corticosterone chronique est bien validé chez la souris. Il permet de reproduire un certain nombre des symtômes dépressif observés chez l'homme et répond aux antidépresseurs utilisés en clinique. Il s’agit d’un modèle de dépression chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines.
Maintien de colonies de puces
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
18 202 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures classées en gravité légère à modérée. Les souriceaux de deux à cinq jours sont placés dans des jarres contenant des puces et se vident de leur sang en quelques minutes, sans anesthésie car elle perturberait les insectes, pour maintenir et infecter des colonies de puces destinées à l'étude de la transmission de la peste. Le porteur décrit cette mise à mort comme une douleur "sévère mais très transitoire", alors que les procédures sont déclarées en gravité seulement légère à modérée. Sur le remplacement, il indique qu'un nourrissage artificiel existe mais exige de la peau de souris et davantage d'animaux, et reconnaît chercher une méthode évitant les animaux vigiles sans certitude d'y parvenir.
Objectifs
La peste est une maladie mortelle transmise par les puces (un insecte hématophage strict) et causée par la bactérie Yersinia pestis. Cette maladie qui sévit toujours à travers le monde a ré-émergé dans des régions où elle avait disparu pendant plusieurs décennies. Ce problème de santé publique international est aggravé par l'émergence de souches multi-résistantes aux antibiotiques, l'absence de vaccin commercialisé et l’émergence de puces résistantes aux insecticides. En somme, notre arsenal anti-peste se réduit et il serait incapable d’éliminer un réservoir majeur de la maladie que sont les puces. Il nous faut donc développer de nouvelles stratégies anti-peste. L’une d’entre d’elles ciblerait la transmission du bacille par les puces. Pour cela, il nous en faut mieux comprendre les mécanismes, car ils sont peu documentés. Dans ces circonstances, l’objectif général de notre projet (d’une durée de 5 ans) est un déchiffrement des mécanismes physiologiques et moléculaires expliquant la dynamique de la transmission peste par les puces. Plus particulièrement, le projet à 6 objectifs scientifiques impliquant des animaux : 1. Caractériser la physiologie et le taux reproduction de différentes souches de puces 2. Mettre au point un protocole permettant d’étudier les capacités vectorielles de différentes souches d’intérêt, afin de réduire au strict minimum le nombre d’animaux nécessaires tout en garantissant les conclusions scientifiques. 3. Comparer les compétences et capacités vectorielles des différentes souches de puces à l’aide du protocole développé au point 3. 4. Elucider les mécanismes expliquant des différences de comportement vis-à-vis d’une infection et du comportement alimentaire de différente souches de puces. 5. Mettre point de nouvelles méthodes d’étude d’infection des puces par Yersinia pestis dont une a pour but d’éviter la souffrance animale. 6. Elucider les mécanismes moléculaires d’infection de la puce par Y. pestis en partie à l’aide d’une nouvelle méthode qui requière beaucoup moins d’animaux que la méthode usuelle.
Bénéfices attendus
Le projet permettra une meilleure compréhension 1) de la physiologie des puces, 2) de la capacité des puces mécanismes moléculaires utilisées par Y. pestis pour une infection transmissible par les puces. Elle permettra également peut être de comprendre pourquoi des puces seraient plus résistantes ou non à une infection par Y. pestis. Dans son ensemble, il permettra d’entrevoir le développement de nouvelles stratégies de lutte anti-peste, en ciblant les puces
Procédures
Aucune intervention n'est prévue sur les animaux
Impact sur les animaux
Dans le cadre des élevages, les souriceaux subissent une souffrance transitoire car ils sont inconscients et exsangues en quelques minutes. Dans le cadre des nourrissages autres que celui de l’élevage, le souriceau ressent au maximum une légère gêne mais aucune douleur sévère est apparente. Ceci est lié au fait que la plupart des piqures de puce sont indolores.
Devenir
Tous les animaux restant en vie seront sacrifiés
Remplacement
Aucun système in vitro ne mime la puce ou s'en rapproche. Il est possible de nourrir des puces à l’aide d’un système artificiel. Ce dernier requiert une peau de souris adulte recouvert par 5 ml de sang hépariné fraichement collecté. Ce système artificiel est utilisé pour infecter ponctuellement des puces, mais il ne permet pas de nourrir l’ensemble des colonies de puces nécessaires au projet. L’utilisation de souriceaux présente l’avantage de nécessiter un nombre plus restreint d’animaux par rapport au nourrissage artificiel (1 souriceau contre 5 souris adultes). De plus, elle réduit la manipulation des insectes et donc, le risque de fuite d’insectes infectés ou non. Cependant, dans ce projet, nous cherchons à mettre en place une méthode qui permettrait de ne plus utiliser des animaux vigils pour étudier les mécanismes utilisés par Y. pestis pour infecter les puces. Mais, il n’est pas certain que nous y arriverons.
Réduction
Pour maintenir les colonies de puces infectées ou saines, il faut les nourrir au moins deux à trois fois par semaine en fonction de la souche considérée. Le nourrissage de puces saines se faisant toute l’année, il faut au minimum 104 à 156 souriceaux par colonie saine par an. Le nombre de colonies saines requis pour le projet est réduit au maximum (15 et 3 en moyenne en fonction de la souche) afin d'assurer la mise en oeuvre du projet. Par ailleurs, pour nos projets visant à mettre au point de nouvelle méthode et élucider les mécanismes d’infection, la colonie qui nécessite le moins d’animaux pour son élevage a été choisi. Pour élucider les mécanismes d’infection, nous faisons en partie appel à une nouvelle méthode d’analyse. Celle-ci identifie un gène de Y. pestis requis pour l’infection de la puce en utilisant nettement moins de souriceau que des méthodes usuelles. Il faut en effet, 6 vs 16 souriceaux par mutant (contrôle inclus). De plus, elle permet de tester des mutants en batterie, réduisant encore plus le nombre d’animaux à utiliser puisque le même groupe contrôle est utilisé pour un nombre plus importants de mutant à tester. Bien éthiquement avantageuse, cette méthode peut identifier des mutants dépourvus de gènes qui ne sont pas impacter dans le processus infectieux per se. C’est pourquoi, les mutants identifiés par cette méthode doivent toujours être confirmés par des méthodes plus anciennes. Avec cette ancienne méthode, le nourrissage des puces infectées doit se faire sur une période variant de 1 à 4 semaines en fonction de la question posée, et pour obtenir des résultats exploitables. De plus, les expériences doivent être également menées au minimum trois fois afin de ne pas compromettre la puissance des tests statistiques. C’est pourquoi, nous ne pouvons pas utiliser moins de 6-9 (2 à 3 nourrissages pendant 1 semaine x 3 expériences) et 24-36 animaux (8-12 nourrissages pendant 4 semaines x 3 expériences) par colonie de puces infectées. Néanmoins, pour la plupart des études menées, les puces qui nécessitent le moins d’animaux pour étudier l’infection ont été choisies. Enfin, il convient de mentionner que l'utilisation de souriceau permet de réduire le nombre d'animaux à utiliser par rapport à un système de nourrissage artificiel (1 souriceau contre 5 souris adultes).
Raffinement
En pratique, pour maintenir les colonies saines, le souriceau âgé de 2 à 5 jours est placé dans une jarre contenant une colonie de puces saines. Cette approche induit une douleur sévère, mais très transitoire ; l’animal est exsangue en quelques minutes. Il n’est pas possible d’utiliser d’anesthésiques ou d'analgésiques car cela affecteraient les colonies puces et donc, empêcheraient la réalisation du projet. Dans le cas de maintien de colonies de puces infectées, un souriceau âgé de 2 à 5 jours est placé dans une capsule (sans contention) pendant une heure. L’animal reçoit quelques piqûres lors de cette manipulation, ce qui ne semble pas induire de douleur sévère. Cependant, si l’animal présente une agitation anormale, une douleur et/ou crie, il sera récupéré et sacrifié immédiatement.
Choix des espèces
Nos souches de puce sont des puces de rongeur; elles se nourrissent sur des souris.
Evaluation du franchissement de la barrière hématoencéphalique à l’aide d’un peptide de pénétration cellulaire
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie l'implantation d'une capsule de mesure de température dans l'abdomen, puis jusqu'à quatre injections dans la veine de la queue, pour évaluer un vecteur censé faire franchir la barrière hématoencéphalique à des candidats médicaments. Le porteur justifie la mise à mort par la présence de ce dispositif abdominal qui ne peut rester en place durablement. Il décrit de nombreux modèles in vitro de cette barrière et affirme que seul l'animal vivant permet d'étudier le passage des vecteurs les plus prometteurs.
Objectifs
Un vecteur innovant a été développé afin de faire franchir la barrière hématoencéphalique à des molécules incapables d’atteindre leur cible cérébrale. Le but de ce projet est d’évaluer in vivo les capacités de ce vecteur fusionné à des molécules prometteuses.
Bénéfices attendus
Actuellement, le franchissement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) est le plus gros frein au développement de nouveaux médicaments à cibles cérébrales. Plus de 90% des molécules évaluées par l’industrie pharmaceutique pour une maladie du système nerveux central (SNC) sont abandonnées en phase clinique faute d’atteindre leur cible. La validation de notre vecteur pour la délivrance de candidats médicaments au travers de la BHE est donc très attendue et permettrait de relancer la recherche de nouveaux médicaments en neurosciences.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’implantation intrapéritonéale d’une capsule permettant le suivi de la température interne. La procédure est réalisée en 5 min environ sous anesthésie générale et la possible douleur post-opératoire est prise en charge par traitement avec un analgésique. Les composés testés seront injectés par voie intraveineuse dans la veine caudale, à raison d’un maximum de 4 injections étalées sur 8 jours.
Impact sur les animaux
La pose de la capsule mesurant la température ne doit pas provoquer de douleur autre que celle de l’intervention chirurgicale. Une médication préopératoire et post-opératoire et des points limites adaptés permettront de prendre en charge efficacement la douleur et le stress. Par ailleurs, une nuisance modérée pourrait survenir en raison des injections intraveineuses caudales successives.
Devenir
La mise à mort des animaux à l’issue de la procédure expérimentale est justifiée par la présence dans la cavité abdominale du dispositif de mesure, qui ne peut être chronique.
Remplacement
De nombreux modèles in vitro de la BHE ont été développés à partir de cellules animales ou humaines. Leur utilisation est limitée par la nécessité d'une isolation fraîche de microvaisseaux cérébraux et par leur durée de vie efficace qui est relativement courte (quelques heures). Les systèmes de co- et tri-cultures avec les autres cellules constituant la BHE permettent généralement d’améliorer les propriétés de barrière de ces modèles mais sont plus difficilement manipulables. Ces modèles nous ont cependant permis de cribler de nombreux vecteurs de franchissement de la BHE mais seuls les modèles in vivo nous permettront l’étude du passage des vecteurs les plus prometteurs en raison de la combinaison de tous les aspects biologiques tels que les barrières physiologiques, les transporteurs et les voies métaboliques.
Réduction
Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. En effet un faible effectif sera utilisé pour évaluer la faisabilité de la méthode lors de l’étude pilote, et l’étude principale ne sera réalisée que si cette première étude est concluante. De plus le dispositif implantable choisi permettant la mesure de la température participe à la réduction du nombre d’animaux utilisés grâce à la collecte de données fiables et continues.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce et le choix du dispositif implantable de mesure de la température préserve la mobilité et les conditions de vie en groupe. Ce dispositif favorise également le bien-être animal en limitant les manipulations, le stress et les contraintes appliquées aux mesures de températures corporelles conventionnelles. Une médication et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance.
Choix des espèces
Les études précédentes de biodistribution des composés utilisés ont été réalisées chez la souris de même que les études sur le passage de la BHE par la neurotensine sur lesquelles nous nous appuyons. Aussi, afin de pouvoir comparer nos futures données, nous restons pour cette étude sur la même espèce animale. Les animaux utilisés seront adultes, âgés au minimum de 8 semaines, pour que le dispositif implanté en intra-péritonéal soit le moins gênant possible.