Procédures modérées

576 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un composé par gavage oral répété pendant 13 à 19 jours, 180 d'entre eux subissant en plus une perfusion intracardiaque sous anesthésie sans réveil, et tous sont tués pour analyser leur cerveau et leurs tissus. Le porteur mesure les capacités d'apprentissage par le test de la piscine de Morris et justifie le rat par l'absence de modèle spontané de trisomie 21 et sa proximité génétique avec l'espèce humaine. Le bénéfice annoncé, déplacer de quelques points le quotient intellectuel des patients, reste un objectif lointain avant tout passage en clinique.

Objectifs

Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement crânio-facial et le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent des anomalies crânio-faciales ainsi qu’une une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observée dans la T21. Des collaborateurs proposent des composés ayant la propriété d’améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons tester l’un de ces composés sur nos modèles rats de la trisomie 21. Ce composé est synthétisé et testé pour l’ADME pharmacologique (administration, distribution, métabolisation et excrétion) par nos collaborateurs. Divers dérivés de ce composé ont été préalablement testés au sein de notre laboratoire sur des modèles souris de la T21, permettant ainsi une amélioration des fonctions cognitives de ce modèle sans aucun effet toxique observé. Sachant que le métabolisme des souris et des rats sont différents, ici nous souhaitons optimiser le traitement sur le modèle rat. Dans ce projet, le composé testé sera administré par notre équipe à des rats modèles de la T21 et à des rats contrôles dans le but de s’assurer qu’ils n’ont pas d’effet toxique. Les rats feront l’objet d’une étude comportementale afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives. Le composé sera testé à différents temps et différentes doses afin d’identifier la durée et la dose minimales nécessaires pour obtenir un rétablissement des fonctions cognitives des rats trisomiques.

Bénéfices attendus

Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la Trisomie 21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la trisomie 21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. De plus, dans le cadre de cette étude, réussir à reproduire sur le modèle rat, les résultats obtenus sur les modèles souris de la Trisomie 21, nous permettra une généralisation des résultats avant le passage en phase clinique du candidat-médicament.

Procédures

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera réalisé sur un total de 576 rats. Ce gavage sera effectué sur un même rat soit 19 fois (étude sur 19 jours), soit 13 fois (étude sur 13 jours). La réalisation du gavage prend 1 à 2min pour un rat par jour. De plus, au cours de ce projet nous réaliserons une perfusion par voie intracardiaque sur 180 rats des 576. La procédure qui est sans réveil sera réalisée une seule fois par rat et elle dure 30min par rat. Pour cela il nous faudra anesthésier l’animal via une administration d’anesthésiant par voie intrapéritonéale. Ce geste nécessaire pour réaliser l’exsanguination de l’animal sous anesthésie générale profonde est réalisé en 1 à 2min par rat.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, un gavage oral répété sera réalisé sur un total de 576 rats. Ce gavage sera effectué sur un même rat soit 19 fois (étude sur 19 jours), soit 13 fois (étude sur 13 jours). La réalisation du gavage prend 1 à 2min pour un rat par jour. Ce geste technique peut entraîner un stress non négligeable, une irritation de l’œsophage et un risque de fausse route existe. De plus, au cours de ce projet nous réaliserons une perfusion par voie intracardiaque sur 180 rats des 576. La procédure qui est sans réveil sera réalisée une seule fois par rat et elle dure 30min par rat. Pour cela il nous faudra anesthésier l’animal via une administration d'anesthésiant par voie intrapéritonéale qui réalisé en 1 à 2min par rat. L’anesthésie de l’animal via l’introduction d’une aiguille par voie intrapéritonéale peut entraîner un stress à l’animal.

Devenir

A l’issu de la procédure expérimentale : Gavage oral d’inhibiteurs de Dyrk1A dans des rats modèles de la trisomie 21, l’ensemble des 576 rats seront mis à mort. 180 rats sont mis à mort afin de réaliser des analyses histologiques sur le cerveau des animaux, et les 396 autres rats seront euthanasiés selon les bonnes pratiques de laboratoires, les tissus prélevés sur ces derniers seront utilisés pour des analyses moléculaires.

Remplacement

Le rat est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’Homme. A ce jour, l’anatomie, la physiologie et la génétique de cette espèce sont bien connues. Son génome aisément manipulable permet de multiples applications telles que la création de modèles de pathologies humaines. De plus, la nécessité d’utiliser des animaux transgéniques est liée à l’absence de tout modèle spontané de trisomie 21 dans une espèce mammifère autre que l’Homme. De plus, l’intérêt d’utiliser le rat est de pouvoir comparer les résultats obtenus à ceux de la souris. En effet, comme on le sait, il peut exister des différences inter-espèces et il est donc important de comparer les résultats entre deux organismes-modèles. Si des résultats similaires sont obtenus entre les deux espèces, cela permettra une généralisation de ces résultats.

Réduction

Pour ces tests, des rats mâles et femelles seront utilisés à partir de 10-12 semaines, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons le composé sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. De plus, le traitement sera aussi effectué sur des animaux contrôles dans le but de vérifier qu’il n’y ait pas d’effet toxique. La variabilité inter-individu observée dans les études comportementales nécessite de tester 12 à 16 animaux par groupe pour avoir un résultat significatif avec une puissance statistique suffisante. C’est pourquoi nos expériences sont construites sur des groupes de 16 mâles et 16 femelles au maximum par condition. Il nous faudra donc un total de 576 rats dans ce projet (16 rats x 6 groupes x 2 sexes x 3 conditions = 576 rats).

Raffinement

Préalablement aux études des analyses de pré-tox ont été réalisé par nos collaborateurs, pour s’assurer que les molécules n’ont pas d’impact majeur sur les animaux après administration. L’administration des composés sera réalisée par gavage oral durant 19 et 13 jours continus comme expliqué précédemment. Au cours du traitement nous procéderons aux études du comportement : le test de la piscine de Morris. Durant toute l’étude, les animaux feront l’objet d’un contrôle journalier pour vérifier leur bien-être. Les animaux présentant des signes de douleurs seront évalués suivant l’échelle de l’expression faciale et seront exclus des tests puis soignés ou euthanasiés selon la situation et l’avis du vétérinaire. Concernant la procédure de perfusion intracardiaque, elle est effectuée sous anesthésie générale pour éviter tout stress et limiter la douleur de l'animal.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requière l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. N’existant pas de modèle spontané de la trisomie 21, le rat avec la souris, sont les seules espèces physiologiquement et génétiquement proches de l’Homme dans lesquelles nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que ces modèles permettent d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes lors de l’optimisation de composé pharmacologique. En outre, le génome du rat étant aisément manipulable, permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du syndrome de Down. De plus, l’intérêt d’utiliser le rat est de pouvoir comparer les résultats obtenus à ceux de la souris. En effet, sachant qu’il existe des différences inter-espèces il est intéressant de comparer les résultats entre les modèles souris et rats afin de généraliser les résultats si ces derniers sont similaires. Enfin, le rat ayant des capacités d’apprentissage plus performantes que la souris, il est un meilleur modèle pour l’étude des déficiences cognitives associées à la trisomie 21. Les rats seront étudiés à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 10-12 semaines, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes d’apprentissage et de mémorisation sont présents.

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules de mélanome pour développer une tumeur et des métastases, puis sont tuées par ponction cardiaque sous anesthésie pour prélever tumeur et organes. Le porteur indique que la tumeur peut atteindre 1 500 mm3, seuil déclenchant l'arrêt de l'expérience. Il affirme que la formation de métastases ne peut être modélisée qu'in vivo et conclut que l'étude sur animal est inévitable.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans le cadre d’un programme de recherche CPER FEDER destiné à étudier le rôle des cellules stromales mésenchymateuses et à identifier l’expression des micro-ARN (miARN) lors du développement de tumeurs métastatiques. Les métastases sont une cause majeure de décès chez les patients atteints de tumeurs malignes. Les miARN sont des petits ARN régulateurs de l'expression génique. Une modification de l’expression de ces miARN peut contribuer au développement tumoral et à la dissémination métastatique par dérégulation de l’expression de gènes impliqués dans des processus clés du cancer. Le système du complément a démontré des rôles dans la régulation de la croissance tumorale, bien que ceux-ci puissent différer selon les types de tumeurs. C3a a une fonction prépondérante de médiateur dans les phénomènes inflammatoires au sein des tissus. Le ciblage spécifique du système du complément peut être d'une grande importance et valeur dans le futur traitement des tumeurs. Nous utiliserons le modèle de tumeurs induites par l’administration sous cutané de cellules B16-F10 chez les souris C57BL/6. Ce modèle permet le développement de tumeurs primaires et de métastases dites « spontanées », ce qui correspond étroitement à celles développées par les humains. Les procédures expérimentales utilisées dans ce projet sont de classe modérée et seront réalisées dans les conditions les moins stressantes possibles pour les animaux. Dans un souci permanent du bien-être animal et afin de minimiser l’emploi des animaux de laboratoire, l’évaluation de l’expression des miARN dans un contexte cancéreux sera réalisée en priorité dans des modèles in vitro. Ce projet engagera des souris dans un nombre estimé à 45 individus pour la durée que couvrira ce projet. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque lot de chaque procédure est réduit, il correspond au seuil minimal qui puisse nous permettre d’apprécier, avec nos moyens techniques et en fonction de la variabilité inter-individus, les effets désirés. Par ailleurs, l’hébergement des animaux pendant la phase d’acclimatation et pendant l’expérimentation sera faite avec enrichissement du milieu afin d’améliorer leur bien-être. A terme, nos travaux permettront d’identifier les miARN impliqués dans l’angiogenèse et annonciateurs de formation tumorale et de dissémination métastatique. Ainsi les cancers pourraient être pris en charge à un stade précoce.

Bénéfices attendus

A terme, les résultats de ce projet permettront l’identification des miARN annonciateurs de développement tumorale et ainsi permettre une prise en charge plus précoce des patients atteint de cancer, ainsi que de comprendre le mécanisme et l'implication du système du complément dans la tumorigenèse.

Procédures

Induction de tumeurs métastatiques par injection de cellules B16-F10 ou B16-F10/C3a par voie sous cutanée une seule fois à J1. - Prélèvement sanguin (1mL) par ponction cardiaque après anesthésie volatile des souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances sur les animaux sont des douleurs légères suite aux injections IP des cellules tumorales et le développement de tumeurs métastatiques.

Devenir

Après l'injection sous cutanée, les souris seront maintenues en vie jusqu'à la fin de l'étude. Les indivisus seront mis à mort à la fin de l'étude par ponction cardiaque précédée d’une anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d'une dislocation cervicale. Les organes prélevés seront scindés en 5 : 1/5 protéine (analyse par western blot), 1/5 ARN, 1/5 miARN (quantification, qRTPCR), 1/5 isopentane, 1/5 paraffine (analyse immunohistologique). La tumeur sera récupérée.

Remplacement

Remplacement: Nos études in vitro avec les cellules stromales mésenchymateuses pulmonaire et un modèle de cellules cancéreuses apportent quelques résultats sur les miARN impliqués dans cette pathologie. Néanmoins, ce modèle cellulaire ne suffit pas a modéliser le processus de développement tumoral dans son ensemble. La formation de métastases est un processus complexe et ne peut être modélisé que in vivo. L’étude in-vivo est inévitable pour comprendre le rôle des cellules stromales mésenchymateuses dans le développement de tumeurs métastatiques, identifier des miARN susceptibles d’intervenir dans cette pathogenèse et étudier la capacité du c3a à moduler l’expression de ces miARN et à induire une régression du développement tumoral.

Réduction

Réduction du nombre : Pour chaque condition testée, nous utiliserons un nombre minimal de souris pour avoir des résultats statistiquement exploitables. Nous utiliserons pour l’étude statistique le test one way ANOVA suivi d’un un test de Bonferroni pour comparer les trois groupes d’animaux entre eux, ainsi qu'un t-test suivi d'un test de Student.

Raffinement

Raffinement : La ponction cardiaque sera réalisée sous anesthésie volatile (isoflurane). Le prélèvement des organes se fera après la mise à mort des animaux. L’évaluation de la qualité de l’anesthésie se fera en vérifiant les 4 étapes suivantes : -l’absence de douleur et/ou de réponse réflexe en exerçant une pression au niveau des doigts de l’animal -L’immobilisation de l’animal -La relaxation musculaire -L’état d’inconscience en vérifiant les mouvements respiratoires. Les souris seront observées 3 fois par jour pendant les 10 premiers jours, puis 1 fois par jour pour le reste de l’expérimentation, dans le but de déceler le plus rapidement possible des signes cliniques critiques dus à l’expérimentation (prostration, température trop élevée, perte de poids, …). Ceci sera basé sur une grille de scoring définie. Chaque situation d’animal montrant des signes d’inconfort ou de souffrance liés ou non à l’expérience sera rapporté au vétérinaire responsable de l’animalerie pour que l’animal soit pris en charge de manière individuelle afin d’améliorer son bien-être. Si l'état ne s'améliore pas au-delà de 24h, il sera euthanasié par ponction cardiaque sous anesthésie volatile isoflurane (1,5 à 2%), suivie d’une dislocation cervicale, puis ses différents organes seront prélevés.. De plus, si la taille de la tumeur arrive à 1500mm3 avant J30, l’expérimentation s’arrêtera dès lors, afin d’éviter des expérimentations en durée « non-nécessaires » sur les animaux. La durée de l’étude principale sera de ce fait réduite d’autant. La mesure des tumeurs se fera mécaniquement à l’aide d’un pied à coulisse Caliper. Pour respecter le principe des 3R, un nombre réduit d’animaux a été choisi.

Choix des espèces

Les C57BL/6 sont des souris robustes, et sont déjà utilisées pour la formation de tumeurs métastatiques induites par les cellules B16-F10. Souris adultes de 6 à 8 semaines

120 truites arc-en-ciel vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poisson subit sous anesthésie une micro-lésion musculaire à l'aiguille, avec ou sans injection de cellules souches, avant d'être tué à l'un des temps de prélèvement pour analyser le muscle. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'infection ni de mortalité et décrit une lésion sans douleur ni gêne pour la nage. Il vise à orienter les "pratiques zootechniques" de la filière truite, pour laquelle il juge le recours à l'animal vivant "incontournable".

Objectifs

La croissance musculaire nécessite l'activation et la différenciation des cellules souches musculaires aussi appelées cellules satellites. Chez les poissons, les cellules satellites maintiennent des capacités de prolifération et d'autorenouvellement qui permettent la formation continues de fibres musculaires pendant la croissance exponentielle du muscle. Néanmoins, la croissance musculaire hyperplasique diminue avec l'âge et les mécanismes cellulaires sous-jacents ne sont pas encore connus. Nous avons mis en place un protocole d'extraction de cellules souches de muscle de truite et de transplantation de cellules souches musculaires. Nos premiers résultats montrent que les capacités des cellules souches et de leur niche diminuent dès le poids de 500g. Notre objectif est de déterminer si les capacités de régénération sont également très inférieurs chez les poissons d'un poids de 1kg comparé à un muscle de truite jeune (10g).

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de montrer que les capacités de régénération musculaire et donc aussi de formation de nouvelles fibres (hyperplasie) sont fortement altérées chez les poissons de 1kg en comparaison d'un poisson de 10g. Cette connaissance devrait permettre d'orienter les pratiques zootechniques afin de maitriser plus finement la croissance musculaire et les caractéristiques du muscle de truite.

Procédures

Les animaux vont subir sous anesthésie une micro-lésion intramusculaire (blessure réalisée avec une aiguille ) avec (ou pas) injection d’un petit volume de cellules. Pour chaque prélèvement à J3, J7, J15, J30 et J60 les poissons sont euthanasiés selon la méthode §3.3.3.

Impact sur les animaux

Par le passé, nous avons déjà réalisé des expériences de transplantation et de lésion musculaire, et nous n'avons jamais observé d'infection (cutanée, interne) ou de mortalité. La zone lésée étant très petite (piqure d'aiguille), cela ne gène absolument pas la nage des poissons. Par ailleurs, l'injection de cellules souches musculaires dans le muscle ne provoque aucune douleur spécifique ni de nécrose ou infection.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasiés puisque des prélèvements de muscle sont indispensables au projet.

Remplacement

L'objectif scientifique du projet étant de déterminer si les capacités de régénération musculaire sont altérées avec l'âge chez la truite, le recours à des animaux vivants est incontournable.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés, nous allons utilisés les mêmes animaux pour la régénération et la transplantation. En effet, un coté du poisson sera utilisé pour la transplantation et l'autre coté pour la régénération. Le nombre de point de la cinétique (6) est réduit tout en permettant une bonne caractérisation des premières étapes de régénération ainsi que la régénération complète. Ainsi nous utiliserons 60 animaux de 10g et 60 animaux d'1kg ce qui permettra de prélever que 10 animaux par point de cinétique.

Raffinement

Les animaux seront élevés dans les conditions optimales pour l’espèce (photopériode, qualité d’eau, densité, nourriture, enrichissement). Pendant la procédure, les animaux seront anesthésiés, leur manipulation sera réduite au maximum et une surveillance du comportement des animaux sera effectuée. Les paramètres physico-chimiques de l’eau (température, O2, NH4+) seront également régulièrement contrôlés. Au cours de l'expérimentation nous réaliserons une évaluation quantitative de points limites incluant la nage, la prise alimentaire, la prostration, l'état sanitaire qui permettront d'arréter l'expérimentation si nécessaire.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est une espèce robuste dont l’élevage et la reproduction sont bien maîtrisés en pisciculture. L’espèce est grégaire et supporte des densités d’élevage importantes. Il s’agit d’une espèce d’intérêt agronomique puisqu’elle représente 95% de la production française piscicole en eau douce. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). De plus, nous disposons d'une lignée de truites transgéniques mlc2-GFP qui expriment la GFP dans les cellules souches musculaires. Nous allons utiliser des poissons receveurs de 10g et 1kg. Une expérience préliminaire, nous a montré que les capacités myogéniques des cellules souches et de la niche diminuait rapidement dès 100g et atteignait un minimum autour de 500g. Ainsi pour maximiser nos chances d'observer une différence de capacité de régénération, nous allons utiliser des animaux de 10g (~3 mois) et de 1kg (~1,5 an).

651 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines puis des traitements administrés cinq jours par semaine pendant quatre semaines, avec prélèvements sanguins et imagerie, avant d'être tuées pour prélever rate et os. Le porteur indique que le développement de la leucémie et la toxicité des composés peuvent provoquer perte de poids et apathie. Il affirme que les modèles animaux sont "indispensables" pour évaluer les traitements au stade préclinique, le contexte tumoral ne se reproduisant pas selon lui in vitro.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde (LAM) est une maladie complexe, avec de nombreux sous-types porteurs de combinaisons d’altérations particulières. Cette maladie est caractérisée par un blocage de développement et l’envahissement de la moelle osseuse par des cellules immatures. De nombreux progrès ont récemment été apportés dans la caractérisation des altérations des LAM. Ces études ont permis une meilleure classification des patients. Cependant, la prise en charge des patients à la récidive de la maladie reste problématique ce qui explique les taux de mortalité. Environ 25-30% des patients atteints de LAM ont une altération du récepteur FLT3 qui est associée à des fréquences de rechutes élevées et à un pronostic défavorable. FLT3 est une cible thérapeutique avérée pour laquelle des traitements efficaces et sélectifs sont disponibles. Cependant, des résistances apparaissent très rapidement après ce type de traitement. A la rechute, le traitement initial devient en général inefficace pour cibler les cellules leucémiques. Les résistances sont les causes majeures de l’échec thérapeutique. Il y a donc un besoin urgent de traitements alternatifs pour prendre en charge les patients. L'objectif de notre projet est donc d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. La majorité de nos expériences sont réalisées sur des modèles simplifiés de cellules en culture. Cependant, les modèles animaux sont indispensables pour évaluer les traitements prometteurs pour les études au stade préclinique.

Bénéfices attendus

Notre projet fait appel au repositionnement de médicaments existants pour le traitement des LAM et à des modèles précliniques de LAM. D’autre part, nous interagissons régulièrement avec des cliniciens. En cas de succès, le projet a un fort potentiel de valorisation et de transfert vers la clinique.

Procédures

Une transplantation de cellules cancéreuses (1 minute/souris) sera réalisée une fois au début de l’expérimentation. Les animaux seront soumis à des traitements qui seront administrés au niveau de différents sites d’injection 5 jours consécutifs maximum par semaine pendant 4 semaines. L’intervention durera maximum 1 minute par souris. Des prélèvements sanguins (5 minutes/souris) seront effectués 1 fois toutes les 2 semaines (4 fois maximum) pour suivre l’évolution de la maladie dans le sang. Lorsque les cellules cancéreuses sont bioluminescentes, nous pourrons suivre également l’évolution de la maladie sans geste invasif grâce à une caméra pouvant quantifier la lumière émise par les cellules, localiser le signal donc les cellules cancéreuses au niveau des organes et mesurer son intensité (1 lecture/semaine sous anesthésie volatile). Cette manipulation prendra 10 minutes par souris. Les souris feront l’objet d’un suivi quotidien avec une pesée 5 fois/semaine pour estimer au mieux leur état physiologique global. Ce suivi prendra maximum 1 minute par souris.

Impact sur les animaux

Des effets indésirables dus à la toxicité des composés à la plus forte concentration sont potentiellement à prévoir avec une perte de poids des souris possible. Après greffe des cellules leucémiques, le développement de la pathologie peut entrainer des diminutions de la motricité, un défaut d’entretien du pelage et une perte de poids. Les traitements quotidiens, selon les composés testés, peuvent provoquer une apathie des animaux avec une perte de poids.

Devenir

Tous les animaux à l'issue de chaque procédure seront euthanasiés. Lors de greffe de cellules cancéreuses, après la mise à mort des souris, la rate et les fémurs/tibias seront prélevés, puis dissociés pour énumérer les cellules cancéreuses afin d'évaluer l'effet des traitements. Un stockage de cellules leucémiques issues de ces organes sera aussi effectué afin de réaliser des expérimentations pour évaluer la fréquence de cellules initiatrices de la leucémie et pour analyser in vitro différents marqueurs exprimés par les cellules en réponse aux traitements.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de développement chez l’homme en l’absence de données précliniques. La régulation de l’hématopoïèse normale et pathologique implique des mécanismes de communication cellulaire entre de nombreux facteurs microenvironnementaux (extrinsèques) et propres aux cellules hématopoïétiques (intrinsèques): ainsi, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma et du contexte cytokinien, sont cruciaux dans la réponse thérapeutique et ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.

Réduction

Pour chacune des procédures, nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant de caractériser l'efficacité des molécules testées. Nous ferons en sorte que le groupe contrôle, qui recevra le véhicule de solubilisation du/des composé(s), soit commun à plusieurs combinaisons ce qui nous permettra de réduire le nombre de souris. Afin de réduire le nombre d'animaux génétiquement modifiés issus de nos propres élevages, des animaux des deux sexes seront utilisés. Le sexe sera choisi en fonction du nombre d'animaux nécessaires et disponibles par cohorte.

Raffinement

Hébergement en confinement adapté à la stabulation de lignées murines immunodéprimées (cages individuellement ventilées). La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et coton pour nidification), et maintien des animaux en groupes de 3-5 afin d’éviter le stress de l’isolement. De même, les expérimentations seront débutées au plus tôt 7 jours après réception des souris au sein de la zone d’expérimentation pour permettre leur acclimatation. Les greffes de cellules seront réalisées sous anesthésie gazeuse. De plus, dans un souci de raffinement et de réduction, le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques de la charge leucémique circulante après prélèvement sanguin et par imagerie optique par bioluminescence (quand cela est possible) sous anesthésie gazeuse. Durant toute la durée d’un protocole, l’ensemble des animaux est observé quotidiennement et le bien-être est évalué à l'aide d'une grille de scores. La durée des protocoles sera fonction de l’atteinte des points limites ou de l’obtention de résultats validés statistiquement.

Choix des espèces

La xénogreffe désigne la transplantation d'un greffon d’un individu d’une espèce donnée chez un individu hôte d’une espèce différente. Ainsi, un contexte immunitaire permissif est essentiel pour favoriser la prise de greffe de cellules leucémiques humaines et éviter la réaction de l’hôte vis-à-vis du greffon. Dans ce contexte, la lignée de souris NOD.Cg-Prkdc scid/J (NSG) est un des modèles les plus couramment utilisé et très bien documenté dans la littérature dans le cadre d’études précliniques réalisées à partir de xénogreffes de cellules leucémiques humaines. Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules leucémiques, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.

70 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous reçoivent une injection intracérébrale de cellules tumorales par craniotomie, et trente d'entre eux subissent une seconde chirurgie pour implanter un dispositif d'administration et une pompe osmotique. Le porteur teste une voie d'administration locale de médicament contre le glioblastome, et non une molécule, ce qu'il présente comme réalisable seulement in vivo. Il fixe comme point limite une taille de tumeur qu'il décrit comme n'induisant pas encore de souffrance perceptible.

Objectifs

Bien que l'incidence du glioblastome soit faible (~6/100000) la médiane de survie post-diagnostic est de l'ordre de 15 mois malgrè un traitement agréssif associant une chirurgie et une chimio/radiothérapie. Parmi les améliorations thérapeutiques possibles, l'utilisation d'une infusion focale à flux fixe (CED) est une option. Toutefois, ce type d'infusion est limité dans le temps et possible qu'au moment de l'exèrese. L'objectif de ce projet de recherche est d'évaluer l'apport d'un nouveau dispositif médical permettant de délivrer localement un médicament par une infusion multifocale à flux fixe et ceci sans contrainte de temps.

Bénéfices attendus

Le bénéfice à cours terme est de proposer une approche thérapeutique innovante et modulable pour le glioblastome dont la médiane de survie reste très courte.

Procédures

Parmi les 70 animaux inclus dans cette étude, 70 recevront une injection intracerébrale de cellules tumorales. Ils subiront donc une chirurgie sous anesthèsie générale de 15-20 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 0.5mm de diamètre. Parmi les 70, 30 subiront une seconde chirurgie 8 jours après la première. Les gestes seront identiques à ceux réalisés précédement. 30 subiront une seconde chirurgie, 8 jours après la première, sous anesthèsie générale de 60 minutes, une incision cutanée, une craniotomie de 4mm de diamètre au niveau de la plaque pariètale, suivi par la pose du dispositif et un décollement cutané au niveau interscapulaire afin de poser une pompe osmotique. Les 10 derniers ne subiront pas de chirurgie complementaires. Tous les animaux seront suivi par IRM afin d'évaluer l'impact des thérapies mises en oeuvre sur la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont relatives aux chirurgies incluses dans le protocole. En effet, une première chirurgie consistera à injecter les cellules tumorales au travers d'un orifice de diamètre inférieur à 1mm dans le crâne du rat après incision cutanée. Cette chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post opératoire de buprénorphine (0,1mg/kg 0,1mg/mL Buprécare) et injection locale de lidocaine (16,2mg/mL, 100uL). La seconde chirurgie sera réalisée une semaine après la première, également sous anesthésie générale (isoflurane) avec injection sous cutanée pré-opératoire et post-opératoire de buprénorphine et injection locale de lidocaine. Cette chirurgie s’accompagnant d’une craniotomie de 4mm de diamètre et d’une tunnelisation pour la pose de la pompe osmotique, des doses supplémentaires de buprénorphine seront dispensées 6h et 18h post chirurgie. Enfin, après chaque chirurgie, les animaux seront isolés pour 24h afin d’éviter qu’ils ne se rongent mutuellement les sutures.

Devenir

En fin de procédure 1 (inoculation de cellules tumorales) tous les animaux seront conservés car impliqués dans la procédure 2. En fin de procédure 2 (evaluation du nouveau dispositif) tous les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Il existe de nombreux tests de toxicité de molécules sur des modèles cellulaires. Ces tests ont été réalisés et nous on permis de selectionner 2 molécules avec un potentiel thérapeutiques certains sur la lignée de glioblastome testée. Dans notre cas, nous ne cherchons pas à tester une nouvelle molécule mais une voie d'administration innovante et ceci ne peux être réalisé qu'in vivo.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum tout en maintenant une puissance statistique suffisante. en effet, une simulation en utilisant G-power montre que pour nos groupes (non traités, traités PBS avec le nouveau dispositif, traités par la molécule 1 avec le nouveau dispositif, traité en CED par la molécule 1 et traité par du PBS par CED) contenant un nombre d'individus équivalent et égal à 10, un gain de survie moyen de 2 jours pour la thérapie CED et au minimum 3 fois supérieur pour le nouveau dipositif peux être mis en evidence avec un risque alpha de 0.05 et beta 0.95.

Raffinement

Outre les conditions d'hébergement assurées par la structure (cycle jour/nuit, température, papier pour constitution de nid...) les animaux seront maintenus en normothermie pendant toutes les procédures chirurgicales. Ces procédures seront réalisées sous anesthèsie isoflurane et une injection locale au niveau de la zone d'inscision de lidocaine. Une analgésie pre et post operatoire par de la buprenorphine et également associée. De plus, le suivi réguliers par IRM de la croissance tumorale, là aussi en normothermie assurée par une couverture chauffante asservie à la temperature réctale, et le suivi lors de ces examens du rythme respiratoire, la production de données sériées permet de limiter le nombre d'individus nécessaire pour tester notre hypothèse de travail. De plus, le suivi de la masse tumorale permet d'arreter le protocole expérimental avant tous signes cliniques de souffrance de l'animal. En effet, notre expérience de ce type de modèle nous permet de fixer comme point limite une taille de tumeur de 100µL, taille qui n'induit pas de modifications comportementales traduisant une souffrance.

Choix des espèces

Les tumeurs 9L sont des tumeurs initialement produites chez le rat fisher et ne se developpent que chez cette souche immunocompétente. Les animaux utilisés seront des animaux adultes de 7-8 semaines au moment de la première chirurgie. A cet age, il est possible de poser le dispositif sur le crane de l'animal en ne touchant qu'une seule plaque pariètale. De plus, le dispositif faisant environ 3mm de hauteur, il est possible de suturer sans crèer de tension importante. Enfin, avec cette taille de rat, la pompe osmotique (environ 1cm de long et 0.4cm diametre) alimentant le dispositif une tubulure souple en polyurethane peut être placée entre les omoplates sans entraver la mobilité de la tête.

150 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection cérébrale de vecteurs viraux sous anesthésie, reçoivent du tétrahydrocannabinol, passent des tests de comportement moteur et sont isolées une semaine, avant d'être tuées pour vérification histologique. Le porteur étudie le rôle du récepteur CB1, cible des molécules du cannabis, dans le contrôle moteur et les maladies neurodégénératives. Il affirme que les simulations numériques ne sont pas fiables et que le recours à l'animal "demeure nécessaire".

Objectifs

Le « système moteur » est principalement composé par le groupe de noyaux appelé « les ganglions de la base ». Ce système fortement conservé chez les mammifères, y compris l’homme, est un système complexe des connexions entre différents noyaux fortement régulé par plusieurs mécanismes agissant en différentes étapes, et toujours ces mécanismes sont à clarifier complètement. Le système des ganglions de la base est aussi la principale cible des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. Pour nous, un possible candidat qui pourrait être important dans le control des ganglions de la base est le système endocannabinoide. Dans le cerveau, l’action du principal composé psychoactif du cannabis passe par un ensemble de molécules, appelées collectivement « système endocannabinoïde ». Ce système contrôle de très nombreuses fonctions du corps humain. Il est notamment impliqué dans le contrôle moteur et la coordination. Avec ce projet (que est un complement de un projet deja en cours) nous voulons comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes agissent sur les fonctions motrices, et leurs implications possibles dans les maladies neurodégénératives affectant ces fonctions.

Bénéfices attendus

Le récepteur CB1 est la cible endogène des molécules psycho-actives du cannabis. Au niveau endogène, ce récepteur est activé par des molécules lipidiques (endocannabinoïdes) qui jouent un rôle crucial dans les mécanismes de protection et régénération neuronales. De plus, l’administration de drogues dérivées du cannabis a été suggérée comme un outil thérapeutique pour plusieurs maladies du système nerveux centrale et des ganglions de la base. Ce projet nous aidera à mieux comprendre le mécanisme physiologique par lequel les cannabinoïdes régulent l'activité de ce circuit neuronal en visant donc au development d’outils thérapeutiques pour les troubles moteurs associé aux maladies neurodegeneratives.

Procédures

Nous allons utiliser des souris génétiquement modifiées. Sur certaines souris, nous allons injecté des vecteur viraux pour reduire la signalisation du recepteur CB1 dans des regions specifiques du cerveau. Cette procédure chirurgicale se fera sous anesthésie générale, avec un traitement analgesique pour prévenir la douleur (durée total de 30 minutes). L'intervention aura une durée de 30 minutes. Dans la période postopératoire (intevention de 3 jours), une injection sous-cutanée de Buprénorphine sera administrée 6 heures apres la premiere injection et répétée une fois par jour pedant 3 jours. Trois semaines apres chirurgie, les souris seront en isolement une semaine avant injection et seront injecteé avec differentes drogues: Tetrahydrocannabinol et leur vehicule (Durée total de 45 minutes). Apres traitments, les souris seront soumis a des tests de comportement moteur (Durée de 5minutes ). Apres le comportement, les souris seront mis a mort selone les modalité decrites.

Impact sur les animaux

Il n’y a pas de risque majeur lié à l’acte chirurgical et la douleur associée est traitée par une anesthésie approprié et des analgésiques. Il n’y a pas de signe perceptible des douleur après l'opération, durant la récuperation et lieés au procedures de injection et comportement. Néanmoins, il y a des points limites bien décrit dans les procédures. Le taux d’apparition des signes d’infection de la plaie suite à la chirurgie est très faible.

Devenir

Les souris issue de la procedure de chirurgie seront en suite traité avec des drogues suivi par des tests comportamentales. En suite les animaux seront mis a mort pour fin experimentation et verification hystologique des injectiones virales.

Remplacement

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale.

Réduction

Les animaux utilisés dans chacun des groupes expérimentaux n'excèderont pas 15 animaux, c'est à dire le nombre minimal d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine et aussi décrit dans la literature scientifique sur le sujet. Au regard du faible nombre d'individu par groupes expérimentaux, les analyses statistiques basées sur des tests non paramétriques seront privilégiées par rapport aux tests paramétriques. De cette facon, les nombres prévus permettent de garantir une bonne interprétation des résultats. Néanmoins, si l’expérience nous montre que les échantillons peuvent être réduits, ils le seront en conséquence.

Raffinement

Un protocole de surveillance et un suivi quotidien et rigoureux seront mis en place par l’experimentateur et le personnel zootechnicien. En cas de blessure légère, un protocole de soins et désinfection sera mis en place (antiseptique topique et antiinflammatoire systémique) jusqu’à la guérison. En cas d’atteinte du point limite terminal, l’animal sera mis à mort. Pour les traitments pharmacologiques, les injections IP sont bien maitrisées dans le laboratoire et ils n’induisent pas de mal-être chez l’animal. En plus les produits utilisés (et leur doses) sont bien tolérés chez les animaux. Les souris seront néanmoins bien observées suite aux injections, par un personnel qualifié ainsi que par l’expérimentateur, et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. Pour certaines experiences de comportement moteur, les souris seront isolées pedant 7 jours avant injection. Toutes les mesures pour reduire l'impact de ce type d'hébergement seront mise en place (congénères à proximité et enrichissement approprié). Les animaux seront hébergés dans des cages collectives avant et après manipulation, sauf pour certaines experience de comportement moteur que prevoi une semaine d'isolement. Les souris seront hébergés avec un milieu enrichi (matériel de nidification en coton et 2 tunnels par cage), dans des conditions optimales de température, humidité et lumière pour les souris. Les souris seront observées quotidiennement par un personnel qualifié ainsi que par des expérimentateurs, formés selon la règlementation en vigueur et ce, afin que des mesures d’analgésie et de bien-être soient prises immédiatement si nécessaire. La mise en place des points limites repose sur une évaluation de l'état général et comportemental des animaux comme expliqué dans la procédure. Toutes les procédures chirurgicales, pré- et post-opératoire, prévoit aussi l’utilisation d’analgésique pour la prise en charge de la douleur. Elles seront effectuées par des experimentateurs formés à la chirurgie chez les rongeurs, selon la règlementation en vigueur.

Choix des espèces

A ce jour, l'étendue des connaissances concernant l'organisation des circuits neuronaux conservés chez les mammifères y compris l’homme et surtout leur plasticité ne permet pas la conception et la mise en place de simulations numériques fiables qui pourraient permettre d'étudier les changements qui se mettent en place. De plus, l’usage des invertébrés qui ont un système nerveux complètement différent serait inapproprié. Dans ce contexte il demeure nécessaire d'avoir recours à l'expérimentation animale. La souris représente le modèle idéal pour ces trois raisons : 1) Possibilité d’étudier des mutants pour une protéine donnée (ici le récepteur CB1), 2) Pour une reproductibilité et comparaison avec les résultats obtenus dans le laboratoire auparavant et la communauté scientifique plus large. 3) Les infrastructures sont équipées pour être destinées à l’étude des rongeurs. L'age des animaux sera de 8-12 semaines car les protocoles que nous avons établis seront développés à l'âge adulte des souris en évitant les problèmes de développement et la variabilité associée. Cela nous permettra également de comparer avec d'autres études sur le terrain.

48 porcs vont être utilisés puis engraissés et abattus de façon classique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont anesthésiés à trois reprises pour un scanner de la composition corporelle et élevés en loge individuelle pendant la croissance. Le projet évalue un critère de formulation d'aliments visant à réduire le coût et l'impact environnemental de l'élevage porcin. Le porteur affirme que cette évaluation "nécessite" d'être réalisée sur l'espèce porcine et inscrit ses objectifs dans le "bien-être des animaux non-humains" et les attentes sociétales.

Objectifs

L'objectif du projet est de comparer la réponse des porcs en croissance alimentés avec des aliments se différenciant par le choix des matières premières (céréales, tourteaux) et la modulation apportée par des traitements technologiques sur leurs caractéristiques nutritionnelles et d'évaluer l'applicabilité d’un nouveau critère de formulation intégrant ces modifications nutritionnelles. Les aliments pour porcs sont préparés en mélangeant des matières premières qui apportent les nutriments nécessaires à la couverture des besoins des animaux en énergie (part la plus onéreuse de l'aliment), en acides aminés (suffisamment pour la production de viande mais sans excès pour des raison économiques et environnementales) et en minéraux (suffisamment pour la solidité osseuse mais sans excès pour des raison économiques et environnementales). Des connaissances scientifiques récentes ont été produites sur leur utilisation digestive et métabolique selon les process appliqués lors de la production des matières premières ou de l’aliment. Elles permettent de proposer un critère de formulation synthétique intégrant ces effets, qu’il est nécessaire d’évaluer en conditions pratiques. Cela contribuera aux efforts déployés par la filière pour améliorer l'efficacité d'utilisation des ressources par les porcs à la fois pour réduire la part de l’alimentation dans le coût de production et pour répondre aux attentes sociétales pour un moindre impact environnemental et un meilleur bien-être des animaux.

Bénéfices attendus

Une bonne connaissance des valeurs nutritionnelles des aliments pour animaux est essentielle pour optimiser l’efficacité alimentaire et ainsi réduire les coûts de production associés à l’alimentation, économiser les ressources, réduire l'impact sur l'environnement par une réduction des apports de nutriments en excès. La formulation des aliments repose encore le plus souvent sur des valeurs nutritionnelles déterminées à partir de matières premières présentées sous forme de farine. Or des traitements technologiques peuvent être appliqués aux aliments (par exemple lors de la granulation) ou sur directement sur les matières premières (par exemple lors de l'extrusion ou l'expansion) qui sont susceptibles de modifier leur utilisation par les animaux. Une fois les modifications induites caractérisées (étape en amont de ce projet), les connaissances scientifiques acquises seront intégrées dans un critère synthétique permettant d'intégrer lors de la formulation les effets des traitements technologiques appliqués lors de la fabrication de l'aliment ou la préparation des matières premières sur la valeur nutritionnelle de la formule. Les résultats du projet contribueront à la transposition de ce critère de façon opérationnelle dans les services de formulation des usines d'aliment ou directement chez les éleveurs qui fabriquent leur aliment à la ferme.

Procédures

Aucun prélèvement n'est réalisé sur les animaux. Les porcs sont anesthésiés par un protocole classique d'anesthésie vétérinaire : injection (aiguille 40 x 1.2 mm) intramusculaire de xylazine (Rompun® à 10 ml/100 kg) et de kétamine (Imalgène® à 20 ml/100 kg pour les porcs de poids supérieur à 35 kg et 25 ml/100 kg pour ceux de poids inférieur à 35kg). L'acquisition d'images scanner prend environ 10 mn. L'anesthésie doit donc durer suffisamment longtemps pour permettre un transport de l'animal endormi jusqu'au scanner, la prise de mesure et le transport retour à la case de réveil, soit une vingtaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les phases les plus critiques pour les animaux correspondent à l'élevage en loge individuelle pendant la phase de croissance et à l'anesthésie et la contention mises en oeuvre pendant les trois mesures de la composition corporelle individuelle. L’élevage en loges individuelles permet d’attribuer à chaque animal une aire de vie qui comprend une zone d’alimentation, d’abreuvement, de repos et de déjection. Elle ne leur permet pas de se mélanger avec leurs congénères mais leur permet de se voir au travers des cloisons ajourées, de se sentir, de s'entendre, et aux porcs de deux cases voisines de se toucher. Les procédures d’anesthésie et le suivi constant des animaux au réveil permettent de limiter au maximum le stress autour de la mesure de la composition corporelle par tomographie. L'anesthésie permet d'obtenir des animaux endormis et détendus pour des images de bonne qualité. La contention des animaux endormis pendant le déplacement aller-retour entre la loge et le scanner ainsi que pendant la prise d’image est réalisée avec un matelas à dépression identique à celui utilisé par les pompiers pour le transport de personnes. Les porcs sont ajeûnés avant l’anesthésie afin d'éviter les remontées gastriques dans l'œsophage et la trachée et éviter d'obstruer les voies respiratoires jusqu’au réveil, et sont surveillés après l’anesthésie jusqu’à reprise de la consommation normale d’aliment et d’eau.

Devenir

Les animaux sont tous gardés en vie à la fin des procédures. Ils seront engraissés en groupe pendant 1 mois après la période expérimentale et leur abattage interviendra de façon classique pour ces animaux de rente, à la fin de la période d'engraissement.

Remplacement

L'évaluation de l'applicabilité d'un nouveau critère de formulation pour améliorer l'efficience alimentaire des porcs selon la technologie appliquée lors de la préparation des matières premières et la fabrication des aliments pour porcins nécessite d’être réalisée sur l’espèce porcine et sur animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux mis en essai (12 par lot) est limité au strict nécessaire pour être en mesure de mettre en relation précisément l'ingestion de nutriments et les dépôts tissulaires associés pendant l'engraissement. Cet effectif permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour mettre en évidence un écart de 2 points de pourcentage de teneur en gras et en muscle dans l'animal. L'élevage en loge individuelle permet de limiter le nombre d'animaux à anesthésier pour le même nombre d'unités expérimentales (12/lot) et une mise en relation plus précise entre les nutriments ingérés et les tissus déposés que si ces mesures étaient réalisées sur des porcs élevés en case (donc plus d'animaux) sans possibilité de quantifier leur ingestion alimentaire individuelle (moins de précision). Les données seront soumises à une analyse statistique qui intègre le lot et la répétition en effets principaux, et le porc en unité expérimentale.

Raffinement

Contrairement aux mesures faites après l'abattage, la tomographie est une technique non invasive qui permet de caractériser la composition corporelle en réduisant le nombre d'animaux, chacun étant suivi à 3 stades de croissance. Les aliments sont formulés pour couvrir les besoins nutritionnels des porcs. Ils sont distribués à volonté et les porcs disposent d'une distribution d'eau également à volonté. La température ambiante est régulée par un système de ventilation qui permet de maintenir les animaux dans leur zone de confort thermique.

Choix des espèces

L'évaluation de l'applicabilité d'un nouveau critère de formulation pour améliorer l'efficience alimentaire des porcs selon la technologie appliquées lors de la préparation des matières premières et la fabrication des aliments pour porcins nécessite d’être réalisée sur l’espèce porcine. Les porcs seront suivis depuis leur entrée en engraissement vers 68-70 jours d'âge jusqu'à environ 150 jours d'âge (vers 115 kg de poids vif). La comparaison de la croissance des animaux se fera pendant cette période.