Procédures modérées

3 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour enregistrer l'activité de leur cortex pendant des tâches visuomotrices. Chaque animal subit deux chirurgies d'implantation d'électrodes d'environ douze heures, une IRM sous anesthésie, une restriction hydrique partielle entraînant une perte de poids, et une contention quotidienne en chaise d'une à trois heures, cinq jours par semaine, pendant quatorze à quarante-huit mois. Le porteur décrit un stress lié à la capture à la canne, au masque de contention et à l'isolement post-opératoire, ainsi qu'un risque de douleur et d'infection autour des électrodes. Le champ structuré du devenir est vide, et le texte indique que les animaux sont mis à mort pour vérifier la position des électrodes, sauf ceux réutilisés dans un autre projet ou, pour les femelles, renvoyés à l'élevage.

Objectifs

Les comportements sensorimoteurs résultent de traitements parallèles dans de multiples aires cérébrales. Le cortex pariétal « associatif » joue un rôle central dans les transformations sensorimotrices, mais les aires longtemps considérées comme purement visuelles peuvent être modulées par un mouvement de la main, et les aires considérées purement motrices peuvent être activées par des stimuli visuels. Cela suggère l’intervention de nombreuses boucles proactives et rétroactives entre les aires pendant ces comportements. Ce projet a pour but d’explorer les dynamiques intra- et inter-aires des réseaux corticaux fronto-pariétaux impliqués dans la planification de l’action et les processus attentionnels nécessaires à la mise en place et l’exécution des comportements sensorimoteurs. Ces dynamiques sont largement influencées par l'état du cerveau et ce projet les comparera au cours de différents états cérébraux allant de l'anesthésie et de l'état de repos à l'attention sélective et aux différents niveaux de prévisibilité. Pour cela, nous utiliserons des techniques d’enregistrements électrophysiologiques intracorticaux (potentiels d’actions des neurones individuels et potentiels de champs locaux). Les données seront recueillies chez des macaques rhésus en utilisant des matrices d’électrodes laminaires chroniques. Deux aires motrices et deux aires pariétales ayant une complémentarité fonctionnelle somatosensorielle et visuelle seront enregistrées simultanément. Ce modèle animal sera utilisé pour l’analogie qu’il partage avec l’homme au niveau de la structuration du réseau fronto-pariétal, de l’organisation laminaire des couches corticales, et de la coordination sensorimotrice et visuelle lors de l’exécution motrice. Les données recueillies seront partagées avec la communauté scientifique, pour permettre de compléter et étendre les connaissances existantes sur l'organisation corticale, au-delà de nos objectifs scientifiques dans ce projet spécifique. Elles pourront notamment permettre d’étendre et d’affiner les modèles computationnels récents pour décrire les réseaux corticaux qui sous-tendent l’attention et la planification du mouvement.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu, à court et moyen terme, est l’élargissement des connaissances sur les réseaux fronto-pariétaux impliqués dans les comportements sensorimoteurs. Le jeu de données récolté sera d’une précision spatiale et temporelle inédite et couvrira différents états cérébraux. Les objectifs sont de : (i) Caractériser les réseaux fronto-pariétaux fonctionnels. Cela comprend la dynamique des réseaux intra-couches corticales, inter-couches corticales et inter-aires, et cela au travers de différents états cognitifs allant de l’anesthésie à l’attention sélective au cours de la réalisation d’une tâche visuomotrice. (ii) Quantifier la contribution des réseaux fronto-pariétaux à la communication neuronale ascendante et descendante. (iii) Caractériser la dynamique des activités neuronales unitaires dans et à travers différentes aires fronto-pariétales et couches corticales. Cela comprend les fréquences et la variabilité d’occurrence des potentiels d’action des neurones supposés excitateurs et inhibiteurs. Ces informations pourront être comparées à celles rapportées pour les aires sensorielles des primates et d'autres espèces de mammifères. (iv) Fournir ces jeux de données à la communauté scientifique pour contraindre/valider/étendre les modèles computationnels existants.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Déplacement au centre IRM pour acquisition d'images, sous anesthésie, 1 fois pour une durée d'environ 4h. - Chirurgies d'implantation de matrices d'électrodes, sous anesthésie, 2 chirurgies pour une durée d'environ 12h chacune. - La prise quotidienne de l'animal en chaise pour entrainement et enregistrements électrophysiologiques, environ 1h30 (jusqu'à 3h), 5 jours par semaine, durant 14 à 48 mois. - La prise de l'animal en chaise pour microstimulations, 20 sessions d'environ 1h30 (jusqu'à 3h). - La prise de l'animal en chaise pour enregistrements électrophysiologiques sous anesthésie gazeuse, 20 sessions (habituation + enregistrement) d'environ 2h (jusqu'à 3h).

Impact sur les animaux

Ce projet utilisera des macaques rhésus qui entreront dans une procédure avec une sévérité classée modérée. La plupart des étapes de la procédure utilisée sera susceptible de créer une nuisance aux animaux. i) Les premières fois où les animaux seront mis en chaise pour leur venu dans le laboratoire pourront causer du stress lié à la prise de l’animal à l’aide d’une canne et à son déplacement depuis sa cage d’hébergement jusqu’à la chaise primate. Cela durera d’une à deux semaines bien qu’une habituation des animaux à la canne soit préalablement réalisée. ii) La restriction des mouvements de la tête des animaux à l’aide d’une masque de contention, nécessaire pour l’enregistrement des mouvements oculaires et électrophysiologiques, sera également source de stress lors des premières mises en place du masque. Pour cela, le masque est constitué de pièces détachables permettant de procéder à une habituation progressive. Nous pouvons tout de même prévoir plusieurs semaines de stress liées à la mise en contention dans le masque. iii) La restriction hydrique partielle liée au besoin expérimental pourra engendrer une perte de poids durant toute la durée de l’expérience. Les animaux seront donc pesés au minimum deux fois par semaine et surveillés quotidiennement afin de prévenir toute perte anormale de poids. iv) Malgré le traitement antidouleur, l’anesthésie et l’intubation de l’animal nécessaires aux procédures d’IRM et de chirurgie d’implantation des matrices d’électrodes pourront créer de la douleur post-opératoire à l’animal durant plusieurs jours. v) Malgré la médication post-chirurgicale et l’inspection/nettoyage quotidien de la zone opérée, l’animal pourrait ressentir de la douleur et développer une infection liée à l’implantation des matrices d’électrodes. vi) Afin de laisser l’animal cicatriser, il devra être isolé durant une semaine du contact physique de ses congénères après l’opération d’implantation des matrices d’électrodes et cela pourrait créer du stress. vii) Durant les enregistrements sous anesthésie partielle mais pendant lesquels l’état d’éveil sera maintenu, un masque délivrant le gaz anesthésique sera fixé à la tête de l’animal et cela pourrait augmenter le niveau de stress de l’animal.

Devenir

Les animaux seront mis à mort. L'objectif de la mis a mort est de prélever le cerveau de l'animal en fin de projet afin de préciser par une analyse post-mortem la localisation et l'état de préservation des zones corticales ayant fait l'objet des enregistrements électrophysiologiques. En particulier, deux scenarios peuvent nécessiter une analyse post-mortem de la localisation et l'état de préservation des zones enregistrées. 1) Les données obtenues chez différents animaux sont très dissimilaire, mettent en question la bonne implantation dans les zones ciblées, ou le bon positionnement des matrices sur une zone corticale permettent une implantation perpendiculaire aux couches corticales. 2) Une mauvaise qualité des signaux électrophysiologiques, ou une forte détérioration des signaux à travers le période d’enregistrement peut suggérer un dommage important du tissue cortical autour des matrices. Cela sera important à considérer pour l’analyse des données, et pour une future utilisation du même dispositif chez d'autres animaux. Si chez certains animaux, après la fin de l'enregistrement des données, on estime qu'il n'est pas nécessaire de procéder à une vérification post-mortem, les animaux seront gardés en vie. Dans ce cas, le connecteur et les câbles pour les matrices seront coupés, laissant les matrices en place. La base de connecteur, sera explantée du crâne et la peau sera fermée et suturée. Apres une récupération complete de leur état de santé et de bien-être général, les animaux gardés en vie peuvent 1) si possible, être inclus dans un autre projet basé sur un dispositif expérimental similaire, permettant d’éviter l’utilisation des autres animaux naïfs. Les animaux réutilisés seront déjà habitués au contexte expérimental (interactions quotidiennes avec l’homme, mise en chaise, travail dans le dispositif expérimental). Sinon, 2) en particulier les femelles peuvent retourner dans un établissement éleveur pour être inclues dans une programme d’élevage.

Remplacement

Le projet implique l'utilisation d'animaux car à ce jour, il n'existe pas d'alternatives expérimentales permettant de répondre aux objectifs. Aucune simulation informatique ou culture cellulaire ne peut remplacer le modèle animal vivant pour l'étude des substrats neuronaux de comportements visuomoteurs complexes. Les techniques électrophysiologiques utilisées dans le projet, permettant une mesure de l'activité de neurones unitaires, bien qu'utilisées en milieu clinique, restent trop invasives pour être utilisées chez l'homme pour des approches expérimentales.

Réduction

Les procédures chirurgicales prévues comportent un certain risque. En outre, la qualité des enregistrements à long terme est difficile à évaluer, car l'implant que nous utiliserons est récent. Nous prévoyons d'inclure un maximum de trois animaux dans cette étude. Si nous obtenons suffisamment de données (neurophysiologiques et séances comportementales) pour une analyse statistique satisfaisante chez deux animaux, nous n'utiliserons pas de troisième animal. Pour chaque animal, l’enregistrement avec plusieurs matrices multi-électrodes permettra de mesurer l’activité de populations neuronales dans plusieurs structures corticales. Le nombre de neurones enregistrés peut varier d’une matrice à l’autre en fonction du succès de la procédure d’implantation. La richesse des enregistrements multi-électrodes offre la possibilité de réaliser de très nombreux types d’analyses portant sur les potentiels d’actions de neurones isolés (modulation de fréquence de décharges ou de synchronisation entre neurones dans différentes périodes de la tâche ou dans différentes structures), sur les populations de neurones (distribution spatiale de l’activité, moyennes de populations), sur les potentiels de champs locaux (LFP) et sur la synchronisation entre LFP et potentiels d’actions. La répétition des séances d’enregistrement sur une durée de 2 à 12 mois a pour objectif d’augmenter le nombre de neurones différents enregistrés dans chaque structure. Cette augmentation permet d’augmenter la puissance statistique de nos analyses, et d'évaluer la stabilité des modulations neuronales et comportementales détectées à travers plusieurs mois. La durée totale des enregistrements pour un animal est étroitement dépendante de la qualité du signal lors des premiers enregistrements et de sa stabilité sur long terme. De fait, elle ne peut être définie à priori.

Raffinement

La cage et volière de l’animal est enrichi de perchoirs, de cordes et de jeux suspendus, pour favoriser les comportements exploratoires de l'animal et aussi le retour à une activité normale en période post-chirurgicale. Après un délai minimal d'une semaine et selon l'état de récupération, l'animal sera sorti en chaise afin de reprendre une routine qui lui est familière. Les méthodes de renforcement positif (training et habituation) seront utilisées afin de réduire le stress des sujets. Le IRM anatomique pre-chirurgicale permet de mieux planifier l’implantation des matrices chroniques, pour bien atteindre les aires corticales ciblées. L'utilisation du masque de contention au lieu d’un plot de tête fixée sur l’os est moins invasive. Les matrices multi-électrodes de nouvelle génération permettent des enregistrements simultanés de neurones dans différentes aires et couches corticales, ce qui implique une réduction d'études et de sujets utilisés, comparé aux recherches effectuées avec des électrodes simples. Le connecteur pour l’implant dans le deuxième hémisphère sera connecté sur la même base de connecteur, déjà fixée sur l’os.

Choix des espèces

L’espèce macaque rhésus est l’espèce de primate non humain utilisée préférentiellement par des laboratoires de recherche étudiant les processus visuomoteurs. Ce choix s’appuie sur la proximité des systèmes visuel (vision diurne binoculaire et trichromatique) et moteur (utilisation du bras pour saisir et manipuler les objets) ainsi que celle de l’anatomie fonctionnelle du cerveau entre les macaques et l’homme. L’utilisation répandue des singes rhésus a permis l’optimisation des procédures d’entraînement ainsi que celle de la gestion de leur alimentation, de leur hébergement et des soins vétérinaires. Les macaques rhésus s’adaptent rapidement aux protocoles de conditionnement comportemental et présentent des performances comportementales très similaires à celles observées chez l’homme. Les animaux seront utilisés au stade de jeune adulte/adulte. A ce stade du développement, les animaux ne sont plus en croissance et leurs besoins physiologiques sont stabilisés. Cela permet un contrôle plus précis des protocoles expérimentaux, que ce soit en termes de volume des récompenses utilisées pour l'apprentissage par renforcement, de contrôle du régime alimentaire dans la cage ou de localisation des structures cérébrales cibles pour les implants chirurgicaux. Par ailleurs, les animaux étant encore jeunes, ils présentent une meilleure tolérance aux procédures expérimentales et une meilleure récupération suite aux procédures nécessitant une anesthésie.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour une formation à l'imagerie du petit animal. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis sert de support aux ateliers d'imagerie par TEP scan, tomodensitométrie, IRM, échographie et imagerie optique que manipulent les participants. Le porteur affirme que les techniques d'imagerie ne causent aucune souffrance et présente la greffe de tumeur comme le seul acte affectant la santé des animaux. Les 50 souris sont mises à mort à l'issue des ateliers.

Objectifs

Dans le domaine de l'exploration non-invasive, de nombreuses modalités d'imagerie ont vu le jour afin de se rapprocher au mieux de ce qui est fait et utilisé chez l'Homme. C'est dans ce contexte, qu'une formation à l'imagerie du petit animal a été créée en 2009. Depuis 6 éditions, elle accueille des participants de tous horizons et permet de s'approprier les modalités d'imagerie de façon théorique (cours) et en conditions réelles d'utilisation par l'intermédiaire de TP/ateliers. Dans le cadre de la session 2022 de l’école et plus particulièrement dans le cadre des 4 ateliers proposés aux participants de l'école par notre unité, 6 modalités d'imagerie seront présentées. Les ateliers proposés aux participants sont : 1/ Imagerie nucléaire (Tomographie par émission de positons (TEP)-FDG et Tomodensitométrie (TDM)); 2/ IRM; 3/ Echographie et 4/ Imagerie optique (bioluminescence et fluorescence). Pour l'ensemble de ces ateliers, nous utiliserons 50 souris SCID beige femelles de 8 à 10 semaines. 10 souris pour la procédure d’imagerie multimodale (TEP/CT, IRM, Echographie, Imagerie optique) réalisée quelques jours avant l’école d’imagerie. 40 souris pour les ateliers de l’école réalisés en présence des participants : - Tomodensitométrie (10 souris) - IRM (10 souris) - Echographie (10 souris) - Imagerie optique (bioluminescence et fluorescence) (10 souris)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ces ateliers sont multiples, il s'agit tout d'abord de présenter les modalités, toutes disponibles dans notre structure, mais surtout de discuter de leurs spécificités respectives, avantages, inconvénients, coût financier, conditions de mise en œuvre et de démontrer l'intérêt de la multimodalité pour combiner les avantages et spécificités de chacune. Nous nous attacherons également à mettre en lumière les développements mis en œuvre par notre unité pour permettre le maintien du statut sanitaire des animaux par l'utilisation de cellule de confinement pour l'imagerie nucléaire et l'IRM ce qui permet d'ouvrir notre service à des animaux provenant de différentes zootechnies de statut sanitaire SPF tout en permettant que les animaux imagés puissent réintégrer ces zootechnies et poursuivre leur exploration selon d'autres procédures expérimentales alors qu'en règle générale, sans confinement, l'imagerie reste souvent terminale (les lots d'imagerie suivis par imagerie sont dédiés à l'imagerie puisqu'ils perdent leur statut sanitaire en quittant leur zone d'hébergement initiale).

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par voie sous cutanée (l'induction des tumeurs sera réalisée en moins de 7 minutes, induction de l'anesthésie comprise). Ces tumeurs étant parfaitement accessibles, nous serons vigilants à intervenir au moindre signe de douleur ou si la taille de la tumeur devait impliquer le sacrifice des animaux. Les autres procédures sont des procédures d'imagerie non invasive n'entrainant aucune douleur pour les animaux. Nous leur éviterons tout stress en les anesthésiant dès le début des sessions d'expérimentation. Durée des anesthésies selon la procédure d’imagerie en question (il y en a 5 au total) : TEP FDG : durée d'anesthésie 45 minutes maximum, TDM : durée d’anesthésie 20 minutes maximum, IRM : durée d'anesthésie 90minutes maximum, échographie : durée d'anesthésie 40 minutes maximum, Bioluminescence / fluorescence : durée d'anesthésie 60 minutes maximum.

Impact sur les animaux

Les modalités d'imagerie mises en œuvre ne causent aucune souffrance aux animaux. L’induction de tumeurs aux animaux affecte en revanche la santé des animaux. Aussi, nous serons vigilants à ce que cela n'entraine aucune douleur, aucune limitation de leur mobilité. Dans le cas contraire, les animaux seraient immédiatement sacrifiés. Le suivi quotidien du bien-être des animaux impliqués dans ce projet nous permettra de nous assurer que la taille des tumeurs n’atteigne pas 10% du poids des animaux.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet auront tous subi une induction de tumeur par injection sous cutanée de cellules tumorales. Ils seront tous mis à mort à l'issue des différentes procédures d'imagerie mises en oeuvre.

Remplacement

L’exploration non invasive par imagerie est une méthode permettant d’assurer un suivi longitudinal en limitant la souffrance animale ainsi que le nombre d’animaux. Ceci sera répété à plusieurs reprises aux participants pendant les cours et pendant les ateliers.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour avoir au moins 2 à 3 souris par session d’ateliers afin de permettre aux participants qui le souhaitent de manipuler les souris en limitant leur stress (nous éviterons la manipulation multiple d’un même animal sur 2 heures d’atelier). Les souris qui n’auraient pas développé de tumeur après induction (procédure expérimentale n°1) pourront néanmoins être utilisées dans le cadre des ateliers ce qui évite de prévoir des animaux supplémentaires. Aucune approche statistique n'a été réalisée.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de volume supérieur ou égal à 10% du poids corporel sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les animaux sont anesthésiés pour chaque procédure et une attention particulière est apportée au maintien de leur température corporelle pendant l'anesthésie. Le recours aux animaux dans le processus de formation est essentiel. L'objectif de la formation est en particulier d'informer les participants quant aux différentes modalités d'imagerie disponibles (dans notre structure et/ou ailleurs) et pouvant remplacer des procédures expérimentales nécessitant la mise en œuvre de nombre plus importants d'animaux (biopsies, biodistribution ex vivo etc.). Il est indispensable de mettre en images au cours des ateliers les potentialités de ces différentes techniques au travers d’exemples concrets et en permettant aux participants de faire eux-mêmes ces observations après avoir reçu des informations théoriques lors des sessions de formations précédents les ateliers. De plus, les modalités d’imagerie présentées par notre structure dans le cadre de l'école sont non invasives et n’entrainent pas de souffrance physique importante.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix dans les pathologies comme le cancer. C'est également un animal facile à manipuler et adapté aux modalités d'imagerie présentes dans notre structure. C’est dans ce contexte que seront utilisées des SCID Beige femelles de 8 à 10 semaines. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (8 à 11 semaines environ) après atteinte de la maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ce stade est également optimal pour le développement de tumeurs (l'induction tumorale sera effectuée à 8 semaines).

720 souris et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour élever et infecter des moustiques Anopheles vecteurs du paludisme. Les lapins sont exposés vingt minutes par semaine pendant six mois aux piqûres d'environ 500 moustiques femelles, les souris à quarante piqûres par semaine pendant deux mois, certaines étant en outre infectées par des parasites Plasmodium. Le porteur présente ces piqûres et les prélèvements de sang associés comme les seuls effets indésirables. Il justifie le gorgement sur animaux vivants par la difficulté de certaines lignées à se nourrir sur membrane, et met à mort lapins et souris à l'issue de chaque cycle.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire régulièrement des moustiques femelles du genre Anopheles pour l’étude des interactions Plasmodium-Anopheles. Selon les questions scientifiques, il s’agira soit de colonies bien établies, soit de nouvelles lignées récemment établies ou à établir à partir de populations sauvages. Trois programmes scientifiques sont en cours. Programme 1 : Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae (souche Yaoundé) conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants. Programme 2 : Analyse fonctionnelle de gènes d’Anopheles arabiensis dont l’expression est régulée par P. falciparum et Plasmodium vivax. Programme 3 : Infection d’Anopheles darlingi par P. vivax pour le cyclage au laboratoire de ce parasite.

Bénéfices attendus

Globalement, le projet contribuera à une meilleure compréhension des interactions Anopheles-Plasmodium avec pour objectif principal la recherche de stratégies nouvelles et innovantes pour lutter contre la transmission du paludisme. Spécifiquement le programme 1 (Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants) doit permettre d’identifier des facteurs de type épigénétique impliqués dans la susceptibilité du moustique Anopheles gambiae, vecteur majeur du paludisme en Afrique sub-saharienne, à P. falciparum et guider vers le choix de nouvelles stratégies de contrôle des populations de ce moustique sans avoir recours à des insecticides. Le programme 2 a pour objectif une meilleure connaissance des gènes du moustique spécifiquement régulés par P. vivax, un parasite négligé mais d’importance croissante en Asie et Amériques et ainsi orienter les programmes de stratégie de blocage de la transmission de ce parasite, tel que des vaccins bloquant la transmission. Le succès du programme 3 (cyclage au laboratoire de P. vivax) ouvrira un pan nouveau de recherches, notamment pour agir sur les formes quiescentes du parasite au niveau du foie, sensibles à une seule famille de molécule (primaquine et tafénoquine), qui présente de nombreux effets indésirables chez les patients déficients en G6PD. Sur le plan transmission de P. vivax, ce programme permettra de compléter les études développées dans le programme 2, facilitant et accélérant la validation des gènes d’intérêt du moustique.

Procédures

Dans la procédure 1, les lapins sont exposés pendant 20 minutes à une cage contenant environ 1000 moustiques (donc seulement 500 sont des femelles), une fois par semaine, pendant 6 mois. Dans la procédure 1, les souris sont exposées pendant 20 minutes aux piqures de moustiques, à raison de 40 anophèles femelles par souris, une fois par semaine, pendant 2 mois. Dans la procédure 3, les souris reçoivent une injection intra péritonéale (quelques secondes), puis subissent un prélèvement d’un micro-volume de sang par une micro incision à l’extrémité de la queue de la souris à l’aide de ciseaux stérilisés (quelques secondes par prélèvement), puis sont exposées aux femelles adultes d’Anopheles, pour un repas de sang sous anesthésie générale (injection intrapéritonéale/ quelques secondes par injection ; repas sanguin pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables sur les animaux peuvent être dus à l’inconfort lié aux piqures par moustiques et la quantité de sang qu’il leur sera prélevé à cette occasion.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure : au bout de 6 mois pour les lapins, au bout de 2 mois pour les souris non infectées par Plasmodium, 3 à 5 jours après l’infection pour les souris infectées par des Plasmodium de rongeurs

Remplacement

Le choix de nourrir les moustiques sur animaux et non par gorgement sur membrane est guidé par la difficulté de lignées à se gorger sur membrane (An. arabiensis, An. darlingi) et l’impact potentiel d’altérer l’effet maternel étudié chez An. gambiae souche yaoundé (programme 1). En effet le comportement et la physiologie du moustique sont très sensibles à l’origine du sang, aux odeurs émises par les animaux et au mode de piqure. Par ailleurs des souris infectées par un Plasmodium de rongeur (P. berghei ou P. yoeli) sont utilisées comme substitut à des infections avec les parasites infectant l’homme (P. falciparum ou P. vivax) difficiles à produire au laboratoire.

Réduction

Le nombre requis d’animaux découle de la longue expérience de l’équipe qui veille à respecter les recommandations 3R. L’utilisation d’un même lapin au-delà de 6 mois résulterait à une production réduite de moustiques incompatible avec les objectifs scientifiques du fait de l’apparition d’un taux trop élevé d’anticorps anti-salive de moustiques ayant pour conséquence une perte de qualité des repas sanguin pour les moustiques et donc une perte en nombre de descendants moustique. Il en va de même pour les souris, auquel s’ajoute l’effet cumulé d’une anesthésie hebdomadaire qui amènerait à avoir recours à des doses d’anesthésiant plus importante et les conséquences possibles sur le bien-être de la souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales d’hébergement répondant aux normes européennes, avec une surveillance de l’état général (observation de la mobilité, du pelage, et de la couleur des oreilles) et du poids. Avant et après chaque repas sanguin des suppléments alimentaires sous forme de gel seront proposés aux animaux.

Choix des espèces

Le choix des lapins et souris pour maintenir ou produire des lignées de moustiques anophèles est guidé par la qualité du sang fourni par les animaux vivants et le fait que certaines lignées ne se gorgent que très faiblement à travers une membrane produisant des progénitures dont la taille est incompatible avec les programmes scientifiques. Le programme 1 interroge une composante épigénétique pour laquelle une modification du mode de gorgement des moustiques (Lapin versus poche de sang) pourrait être dommageable sachant que de nombreux paramètres peuvent être impliqués dans l’expression de signatures épigénétiques. Stade de développement des animaux : souris et lapins adultes jeunes car les animaux vieux sont difficiles à « piquer » et leur poids est trop important et pour les souris hôtes de Plasmodium, pour leur sensibilité aux parasites.

1 402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Exposées à des additifs alimentaires de la vie in utero à l'âge adulte, elles subissent deux tests comportementaux au sevrage et huit à l'âge adulte, dont le porteur ne précise pas la nature. Il affirme que ces tests ne durent que quelques minutes et n'induisent pas de stress majeur, et que l'exposition alimentaire ne peut être étudiée que sur des animaux vivants. Toutes les souris sont mises à mort pour des analyses biochimiques et cellulaires.

Objectifs

Le projet porte sur l’étude de l’impact d’une exposition chronique à des additifs alimentaires sur la mise en place du cerveau et de ses fonctions depuis la vie in utero jusqu’à l’âge adulte, en observant la régulation et les fonctions microgliales ainsi que le développement cérébral et le comportement

Bénéfices attendus

L’ensemble des résultats permettra de mettre en avant l’importance de la période périnatale ou non dans l’exposition aux additifs alimentaires, d'explorer le devenir périnatal des additifs alimentaires, et d’en évaluer les effets sur les fonctions cérébrales des descendants, jusque dans leurs intéractions directes. Ceci permettra de d’accroitre les connaissances scientifiques sur les additifs alimentaires qui sont largement critiqués voir prohibés dans l’alimentation et de valider ou non leur lien avec des altérations comportementales, neurologiques et moléculaires.

Procédures

Tests comportementaux au sevrage (2 tests) et à l’age adulte (8 tests) – quelques minutes par test

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes et n’induisent pas de stress majeur induisant une altération de l’état général des animaux.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de réaliser des analyses biochimiques et cellulaires lors des différents temps d'exposition proposés dans le projet.

Remplacement

L’étude de l’exposition à des additifs alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit au mieux grâce à l’utilisation de tests statistiques montrant la différence entre plusieurs groupes.

Raffinement

Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l'inconfort (manipulation régulière et hébergement en cage collective avec enrichissement, utilisation d'antalgiques) des animaux.

Choix des espèces

La souris est un modèle pertinent et reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier notamment le cerveau et son fonctionnement (test comportementaux et électrophysiologie). Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6. Les souris mâles et femelles reproducteurs seront utilisées à l’âge adulte (8 semaines) afin qu’ils soient capables de procréer et leurs descendants seront utilisés au sevrage ou à l’âge de 3 mois selon les procédures. Cela permettra d’étudier les impacts d’une exposition périnatale suivie d’une exposition post-sevrage sur le développement des fonctions cérébrale, ainsi que son maintien chez l’adulte.

600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections de cellules tumorales dans le flanc sous anesthésie locale, avec des prélèvements de sang, pour tester des molécules censées déclencher une mort des cellules cancéreuses reconnue par le système immunitaire. Le porteur décrit une croissance tumorale sous-cutanée dont il qualifie les nuisances de limitées. Il affirme que des tests in vitro existent mais n'évaluent pas la réponse immunitaire mémoire, juge l'animal vivant entier "indispensable", puis met à mort les souris pour prélever rate, ganglions et tumeur.

Objectifs

Le développement des tumeurs dépend fortement de l’interaction entre les cellules cancéreuses et leur microenvironnement, particulièrement avec les cellules immunitaires présentes comme les lymphocytes cytotoxiques. Ces dernières reconnaissent spécifiquement la tumeur via la présentation d’antigènes, qui sont de petites protéines spécifiques à la tumeur. Après avoir été activatés, les lymphocytes cytotoxiques peuvent détecter et détruire la tumeur. Le profil antigénique de la tumeur est donc un point déterminant dans la réponse anti-cancéreuse. Cependant, la présentation antigénique n’est pas suffisante pour produire une réponse immunitaire efficace ; d’autres paramètres sont requis. Les lymphocytes cytoxiques sont activés les cellules dendritiques, or lors de cet échange, des signaux co-stimulateurs sont requis pour finaliser l'activation. Ce paramètre est décrit comme l’adjuvanticité, et l'absence de ces signaux se traduit par l’échappement de la tumeur au près système immunitaire. Dans un contexte tumoral, l’adjuvanticité est décrite, entre autre, par l’émission de motifs moléculaires associés au danger (DAMPs). Ces DAMPs sont des biomolécules sécrétées lors de mort des cellules cancéreuses et causent une réponse inflammatoire locale. La mort cellulaire immunogène (ICD) est définie par l'induction d'un stress aux cellules cancéreuses, et aboutit à la mort de celles-ci, accompagnée de la libération de nombreux DAMPs. Ces DAMPs sont reconnus par les cellules dendritiques et initient une cascade cellulaire aboutissant à l'activation de réponse immunitaire anti-cancéreuse . Plusieurs études ont décrit certaines chimiothérapies et radiothérapies comme inductrices de mort cellulaire immunogène, ce qui renforce leurs effets thérapeutiques. Jusqu'à présent, peu de molécules ont été caractérisées comme inductrices de l’ICD. Or ces agents pourraient être pertinemment utilisés en thérapie combinatoire en oncologie, avec des immunothérapies par exemple, afin de renforcer la réponse immunitaire anti-cancéreuse, et à terme d’améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer la capacité de molécules à induire une vaccination contre 3 modèles tumoraux différents via une induction de la mort cellulaire immunologique. Cette mort cellulaire permet d’engendrer des populations de lymphocytes T spécifiques contre la tumeur. Ainsi les souris seraient vaccinées contre la tumeur étudiée, ce qui serait un bon modèle préclinique en vue de développer des stratégies identiques ou similaires dans l'espèce humaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux injections durant toute la durée de l’expérience. Ces injections se feront après anesthésie locale sur l’un des deux flancs de l’animal, durée 5-10 minute. Du sang pourra être prélevé au niveau sub-mandibulaire après anesthésie sous anesthésie gazeuse (1 fois par semaine pendant la période entre la 1ère et la 2nde injection de cellules), durée: 2-3 minutes.

Impact sur les animaux

Croissance tumorale sur le flanc des souris, en sous-cutanée. Nuisances limitées liées à la présence de cette tumeur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes (rate, ganglions drainants et tumeur) et d'étudier au mieux la réponse immunitaire mémoire mise en place.

Remplacement

Concernant cette étude, il existe des alternatives non-animales comme des tests elternatifs in vitro. Cependant ces alternatives nous permettent seulement de décrire la capacité de nos molécules à induire la mort cellulaire, or il nous est impossible d’évaluer leur capacité à engendrer une population celulaire spécifique. L'utilisation d’animaux vivants est donc indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier la réponse immunitaire mémoire, et une potentielle vaccination complète contre les tumeurs étudiées. En effet, les relations entre les cellules cancéreuses et les cellules immunitaires s’effectuent via différents organes, nécessitant toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

Les traitements et procédures seront faits après tirage au sort et en aveugle. Afin réduire le nombre d’animaux, seules deux concentrations par molécule seront testées afin d’observer une vaccination in vivo. Ces deux concentrations seront déterminées au préalable via des tests de toxicité in vitro. Les témoins seront regroupés pour éviter la multiplication des groupes témoins lors du test in vivo en faisant toutes ces procédures en parallèle pour chaque modèle tumoral. Les résultats seront analysés par des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Afin de réduire la douleur chez l’animal : - Les injections seront effectuées après anesthésie locale - Le milieu est enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Les prélèvements sanguins seront effectués sous anesthésie gazeuse . - Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. - Des points limite ont été définis a priori et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Les modèles de tumeurs existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implatation chez la souris est indispensable pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale dans sa globalité. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines (travaux sur les cancers de l'adulte).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale quotidienne pendant six semaines, subissent l'ablation chirurgicale d'un rein, puis des prélèvements d'urine en cage à métabolisme et un prélèvement de sang terminal, pour étudier l'atteinte rénale du diabète. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur post-opératoire traitée par analgésiques et que le diabète peut atteindre cœur, reins et rétines. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever et analyser les reins.

Objectifs

Le diabète est la première cause de mise sous dialyse en Europe. L’insuffisance rénale est de sévérité variable au moment de la découverte de la maladie, mais la règle est que la néphropathie diabétique conduit à une altération lente et progressive des unités de filtration du rein, les glomérules. Nous recherchons les stimuli à l’origine des lésions des glomérules induites au cours du diabète. Nous avons identifié récemment un mécanisme de protection des glomérules au cours du diabète, l'autophagie. En recherchant des régulateurs de l'autophagie, nous avons identifié d'autres molécules qui sont impliquées dans une régulation négative de l'autophagie. Nous allons maintenant étudier de façon plus précise le lien entre l'autophagie et ces régulateurs dans le rein, à la fois en contexte normal et en contexte pathologique.

Bénéfices attendus

A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la néphropathie diabétique et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de cette complication sévère du diabète.

Procédures

Une injection intrapéritonéale quotidienne pendant 6 semaines (20 secondes/ jour). Une procédure chirurgicale: uni-néphrectomie (20 minutes). 6 Prélèvements urinaires en cage métabolique sur animal vigile (6 heures d'isolement par semaine). Un prélèvement sanguin terminal sur animal anesthésié (1 minute) .

Impact sur les animaux

Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, douleur au point d'injection, inconfort lié aux cages métaboliques. Effets de la chirurgie: douleurs post-opératoire soulagée par des analgésiques. Effets du modèle pathologique de diabète: potentiellement atteinte des organes cibles (coeur, reins et rétines).

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les organes et analyser les atteintes rénales.

Remplacement

Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte microvasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). En général, les expériences de remplacement ne peuvent pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. C'est pourquoi nous aurons aussi recours au modèle animal, en choisissant la souris comme modèle classique de mammifère, et comme modèle expérimental établi, avec de nombreux outils génétiques disponibles, un temps de génération court et des portées de grande taille.

Réduction

Réduction : le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur le logiciel en ligne https://sealedenvelope.com/power/continuous-superiority/ avec un risque alpha de 5%, une puissance de 80%, une moyenne du groupe contrôle de 22, une moyenne pertinamment différente attendue de 26 dans le groupe traité, une déviation standard de 3 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 15 animaux par groupe requis. 5 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental (pénétrance incomplète de la streptozotocine, mortalité liée à la chirurgie, point limites atteints). Nous optimisons l'utilisation des reins pour les différentes analyses réalisées dessus afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Raffinement : les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux par cage est limité à 3 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane 2%) avec une analgésie péri-opératoire (bubrénorphine 0,1mg/kg sc).

Choix des espèces

La souris est le seul modèle permettant à la fois de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère et d’utiliser la recombinaison homologue ou l’excision allélique dirigée afin de connaître la fonction des produits des gènes in situ et in vivo. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. Souris adultes agées de 8-12 semaines car il faut de jeunes adultes. En effet, l'age est un facteur de risque de fibrose rénale et utiliser des souris trop agées induirait une plus grande variabilité  de nos résultats expérimentaux.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections dans le tarse et sous la peau de la queue, puis une injection hebdomadaire d'un inhibiteur par voie intrapéritonéale pendant quatre semaines, pour étudier le rôle de l'interféron de type 1 dans le vitiligo. Le porteur indique que l'injection dans le tarse peut provoquer de petites plaies gênant le déplacement de l'animal, tout en affirmant n'avoir jamais observé d'effets indésirables. Les souris sont mises à mort par inhalation de CO2 pour prélever la queue.

Objectifs

Le vitiligo est une pathologie de la peau qui provoque l’apparition de taches blanches de taille plus ou moins importante et peut toucher l’ensemble du corps, y compris le visage. Ces macules blanches sont la résultante d’une altération des mélanocytes de l’épiderme qui sont les cellules responsables de la pigmentation cutanée. Environ 1% de la population mondiale souffre de cette pathologie qui affecte significativement la qualité de vie des patients. A ce jour, aucun traitement efficace et spécifique n’est disponible du fait de la complexité de cette pathologie et dont la compréhension et l’identification de nouvelle cibles thérapeutique reste un enjeu majeur. L’origine de cette pathologie reste à ce jour mal définie mais l’implication de plusieurs facteurs (génétiques, environnementaux ou encore une altération du système immunitaire chez les patients) sont identifiés. Ainsi, concernant le dérèglement du système immunitaire, notre équipe a pu mettre en évidence la présence forte et inhabituelle d’une population de cellules particulières, les lymphocytes T, au niveau de la peau et provenant de la circulation sanguine, chez le malade. L’activation de ces lymphocytes T de la peau va entrainer la forte production de molécules inflammatoires qui vont directement cibler le mélanocyte, et in fine, favoriser la progression de la maladie. Afin de comprendre comment cet excès de lymphocytes T est retrouvé, nous avons pu identifier et proposer l’importance d’un autre type cellulaire, également retrouvé en surnombre dans la peau affectée du malade, les cellules dendritiques plasmacytoides (pDC). En effet, ces pDC vont induire de fort taux d’une molécule inflammatoire. Cette forte production d’IFNa va directement agir et stimuler les autres cellules au niveau de la peau permettant le fort recrutement des lymphocytes T de la circulation sanguine dans la peau. L’activation des pDC et l’impact de la production d’IFNa semble ainsi majeur dans la progression de la maladie et pourrait représenter une cible thérapeutique de choix. Ainsi, l’objectif de l’étude proposée est : 1/ Confirmer les études in vitro sur un modèle in vivo de l’impact de l’IFNa sur la dépigmentation de la peau en évaluant l’efficacité du blocage de IFNAR (souris KO IFNAR). 2/ Etudier le rôle des lymphocytes T de la circulation dans le maintien de la maladie en déplétant ces derniers chez la souris.

Bénéfices attendus

Cette maladie ne dispose pas à ce jour de traitement efficace et il paraît important de tester de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Injections au nombre de 2 au niveau du tarse de la souris et 2 en sous cutanée au niveau de la queue, puis une injection de l'inhibiteur de S1P1 par semaine en intra peritoneal pendant 4 semaines. Les interventions sont rapides de l'ordre de 30 seconde maximum par souris. Nous ne mettons pas en tube les souris pour être plus rapide nous effectuons la procédure avec deux expérimentateurs. L’un contentionne la souris pendant que l’autre expérimentateur injecte ainsi nous évitons un stress de la souris et gagnons en terme de temps de manipulation de l’animal.

Impact sur les animaux

L'injection dans le tarse peut éventuellement provoquer de petites plaie au site d'injection ce qui peut restreindre le déplacement de la souris . Nous n'avons cependant jamais observé d'effets indésirables avec ce type d'injection.

Devenir

Mise à mort par inhalation de CO2, on prélévera la queue pour des immunofluorescences et de la cytométrie en flux pour regarder les populations cellulaires

Remplacement

Des tests in vitro sur un modèle d'épiderme 3D ont été effectués montrant l'implication de l'IFNAR sur le détachement des mélanocytes pouvant engendrer une dépigmentation.Il n’existe malheureusement à ce jour aucun système de co-culture in vitro reconstituant l’ensemble des réponses cellulaires impliquées dans la dépigmentation de la peau. Cependant, le modèle de souris nous permet d'avoir des conditions physiologiques intactes primordiales dans l'étude de la dépigmentation lier à un déréglement immunitaire. Le modèle in vivo de souris est donc une étape essentielle pour évaluer 1/l’interféron type 1 dans l’initiation de la dépigmentation associée au vitiligo et 2/l’efficacité de l’inhibition du recrutement des lymphocytes circulants dans la peau dans la repigmentation.

Réduction

Pour réduire à maximum le nombre de nos souris, nous allons dans un premier temps valider la dépigmentation de ces souris puis nous passerons à la procédure 2 de déplétion des lymphocytes T. La procédure est déjà validée sur des souris Wild Type par le laboratoire, nous devons donc nous assurer qu’elle fonctionne également sur les souris de génotype KO IFNAR.

Raffinement

Le poids, le développement d’un érythème au niveau de la zone d’injection et le comportement des animaux seront évalués quotidiennement au cours de la procédure. Les animaux seront hébergés à raison de 5 souris/cage dans un environnement propice à leur bien-être (litière en copeaux de peuplier, tunnels en polycarbonate). Si un impact environnemental est observé (bagarre des mâles entre eux, signes de stéréotypie, prostration, isolement d’un animal...), l’animal sera soigné et mis en isolement. -En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie : l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie. Les critères utilisés sont ceux de Lloyd et al. (Lab Animal 1998). Les critères utilisés sont ceux de Lloyd et al. Dont le score peut atteindre 20. Le score limite que l’on se fixe est de 14. Au-delà l’animal sera euthanasié sans attendre. En tenant compte de ces points limites adaptés et conformément au paragraphe 3 de l’annexe VIII de la directive 2010/63CE, le classement de la procédure 1 et 2 sont modérées.

Choix des espèces

Nous avons choisi les souris sauvages C57BL/6J sur lesquelles le modèle de dépigmentation a déjà été validé par notre équipe, et des souris transgéniques B6(Cg)-Ifnar1tm1.2Ees/J (IFNARKO) qui n’expriment pas la sous-unité 1 du récepteur de l’interféron type 1. Cette souche de souris mutante est utile dans les études sur la pigmentation et dans les pathologies auto-immunes dépendantes de la voie de signalisation JAK-STAT, voie impliquée dans la signalisation des interférons type 1 (notamment interféron alpha et béta). Nous débutons l’expérimentation à 5 semaines pour ce modèle animal ainsi nous évitons un biais en utilisant des souris jeunes dont le système immunitaire n’est pas altéré.

12 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent une administration unique d'un produit test par voie orale ou rectale, puis subissent des prélèvements de sang par ponction jugulaire et intracardiaque et sont placés en cage à métabolisme pour recueillir leurs fèces. À la fin, les 12 rats sont mis à mort pour prélever foie, reins et cerveau. Le porteur affirme qu'aucune méthode ne reproduit la diffusion d'un produit dans le sang au niveau de l'"organisme entier" et juge le recours au rat entier "indispensable", sans qu'aucune analyse statistique n'appuie l'effectif.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les paramètres pharmacocinétiques d'un produit test aprés une simple administration orale ou rectale chez le rat à la dose de 0.5 mg/kg.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer que le produit test peut s'administrer soit en voie orale soit en voie rectale et de pouvoir comparer les paramètres pharmacocinétiques en comparant les deux voies d'administration.

Procédures

Dans ce projet, il est prévu de faire des administrations rectale et orale sur animal vigile. Ces administrations seront de trés courte durée (durée d'une administration moins d'une minute). Puis des prélèvements sanguins seront réalisés dans le but de suivre la concentration dans le sang de la molécule testée. Ils seront réalisés sur animal anesthésié au préalable, par ponction directe aux veines jugulaires ( ou en intracardiaque dans le cas du prélèvement terminal). La durée d'un prélèvement de sang est de l'ordre de la minute également. Les prélèvements de sang se feront avant administration, puis à 30min, 2h, 3h, 4h et 6h aprés l'administration rectale et avant administration, 30 min, 2h, 3h, 4h et 6h aprés l'administration orale. Le volume de prélèvement sanguin sera d'environ 300 μL par prélèvement soit 1.8mL au maximum. Les prélèvements de sang se feront selon les bonnes pratiques de laboratoires et conformément à la réglementation en vigeur. La durée de la phase animale est de 6h aprés les administrations. Les administrations et les prélèvements de sang seront réalisés par un personnel expérimenté et conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux seront placés en cage à métabolisme pour une collecte de féces sur une durée de 6h aprés administrations. Les animaux auront un contact visuel entre eux. D'un point de vue scientifique il est necessaire de collecter les fécès pour doser la quantité de principe actif dans les échantillons.

Impact sur les animaux

Le produit test fait partie de la classe thérapeutique infectiologie. Il n'y a pas d'effets indésirables attendus. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, poils ebouriffés, prostration, site de prélèvement abimés, hématome ou saignement au site d'administration pour la voie rectale...)

Devenir

A la fin de ce projet, les 12 animaux seront euthanasiés aprés le prélèvement sanguin conformément à la réglementation en vigeur et aux bonnes pratiques vétérinaires. Des prélèvements de tissus seront réalisés. Le foie, les reins et le cerveau seront prélevés

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier.

Réduction

12 animaux seront inclus dans ce projet. Ils seront réparti en 2 groupes de 6 animaux. Les animaux du groupe 1 seront administrés par voie orale et les animaux du groupe 2 par voie rectale. Aucune approche statistique n'a été réalisée

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés individuellement en cage à métabolisme pour collecter les fécès durant 6 h aprés administration. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires (observation de l'état de santé général, poils ebouriffés, prostration, site de prélèvement abimés , hématome ou saignement au site d'administration pour la voie rectale...) Le vétérinaire désigné ou suppléants toujours présents sur site pourront intevenir rapidement si besoin. Les points limites ou points d'arrêt anticipés sont: - Dégradation marquée de l'état général (ex : détresse respiratoire, décubitus) - Atteintes ou traumatismes à l'origine de douleurs sévères (ex : convulsions, mouvements ou postures anormaux... - Apparence physique dégradée, absence de toilettage (ex : prostration, poil ébouriffé ou souillé, alopécie extensive...) - Changements majeurs de comportements (ex : automutilation, agitation intense...) - Site de prélèvements sanguins trés abîmés, douleurs au niveau des sites de prélèvements - Hématomes ou saignements au niveau du site d'administration pour la voie rectale La contention des animaux sera faite par du personnel expérimenté pour éviter toute mauvaise manipulation de l'animal. Evaluation quotidienne de l'état de santé général de l'animal pour une détection précoce des signes cliniques anormaux.

Choix des espèces

Le rat, Sprague Dawley est l'espèce utilisée dans ce type d'étude. Cette espèce est bien décrite et caractérisée dans la littérature et son utilisation est conseillée (OECD) pour les essais de produits pharmaceutiques dans le domaine de l'infectiologie. Adultes. Rat d'environ 200-250g