Procédures modérées

Vérifier sur la souris l'effet d'une lumière dirigée vers le crâne sur des lésions de type Alzheimer permettrait, écrit le porteur, d'"entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine". 100 souris, dont 60 femelles génétiquement modifiées pour développer ces lésions, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Pendant onze à douze mois, elles reçoivent chaque jour trente minutes de lumière dans leur cage, à une heure qui varie selon les groupes, subissent trois prises de sang éveillées sous la mâchoire, puis un à deux mois de tests : labyrinthe radial à huit bras, labyrinthe de Barnes, Rotarod et open field. Sous une dose létale d'anesthésique, leur sang et leur liquide céphalo-rachidien sont prélevés avant une perfusion par le cœur. Le porteur affirme qu'"un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question".

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) comporte plusieurs dysfonctionnements cellulaires tels que l’hyper-phosphorylation ou l’agrégation de petites protéines. Ces protéines sont normalement éliminées par la cellule mais en conditions pathologiques, elles sont présentes en excès et peuvent être très toxiques. Le but du projet est d’observer à quelle période de la journée, la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne a un effet curatif sur un modèle murin de la MA. Plusieurs études ont déjà pu observer que la photobiomodulation procure un bénéfice thérapeutique sur d’autres maladies neurodégénératives telle que la maladie de Parkinson mais aucun article ne montre in vivo à quel moment elle est la plus bénéfique. C’est pour cela que le présent projet permettra d’obtenir des réponses sur l’évolution comportemental et anatomique de la maladie dans un modèle de souris. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons constituent un modèle de choix pour la maladie d’Alzheimer. Elles développent la MA de type symptomatique à partir de 12 mois même si certaines protéines en excès sont présentes dès le 3ème mois. Cette étude permettra également d’entreprendre une voie thérapeutique non-invasive pour la médecine humaine. Pour respecter les 3Rs, ce projet comporte une procédure pilote afin de déterminer les paramètres techniques de la photobiomodulation et l’entraînement au bon geste de prélèvements du sang et du liquide céphalo rachidien sur un nombre réduit d’animaux, le raffinement avec l'utilisation d'analgésique et le suivi des animaux par l'expérimentateur. Chaque souris sera préalablement anesthésiée avant sa mise à mort pour éviter toute douleur. Pour être en accord avec la réglementation, l'expérimentateur mettra en œuvre des actions précoces et adaptées en cas d’atteinte d’un point limite et ceci afin de respecter le bien-être animal. Les différentes étapes du projet sur le modèle murin seront l’application de la photobiomodulation sur des souris âgées de 3 mois (phase 1), la réalisation de tests comportementaux (phase 2) permettant d’étudier les bénéfices symptomatiques et la mise à mort des animaux pour des analyses biochimiques et histologiques (phase 3).

Bénéfices attendus

Les bénéfices seront de mieux comprendre l’effet de la photobiomodulation (PBM) extra-crânienne dans un contexte pathologique et définir la meilleure période pour photobiostimuler le cerveau. En effet, la vérification des bienfaits sur les stigmates de la maladie d’Alzheimer dans un modèle murin permettrait d’entreprendre un projet pré-clinique sur singe de manière plus sereine. Il s’agirait également d’une stratégie non-invasive qui pourrait être rapidement adoptée pour un traitement chez l’être humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à : -la photobiomodulation durant 11/12 mois pendant 30 minutes chaque jours (à des périodes différentes de la journée selon les groupes) tout en restant dans leur cage d’hébergement (aucune manipulation) -3 prélèvements sanguins sur animaux vigiles en sub-mandibulaire (à 3 mois, 7 mois, 12 mois, durée de 5 minutes maximum par souris) -des tests comportementaux à l’âge de 11/13 mois (tests mesurant les déficits cognitifs et étalés sur 1 à 2 mois par souris, 15 jours le 8-arm radial, 8 jours Barnes maze, 2 jours Rotarod, et 2 jours pour l’OF avec une moyenne de 15/20 minutes par jour, par souris et par test) -1 prélèvement sanguin et 1 prélèvement du liquide céphalo-rachidien sous anesthésie réalisée avec des doses létales, l’animal étant ensuite perfusé en intra-cardiaque afin d’effectuer des analyses immunohistochimiques et biochimiques. L’ensemble de cette procédure dure 1H30 maximum.

Impact sur les animaux

Pour la phase 1, un faible stress pourrait être attendu avec la présence de la photobiomodulation mais cela sera vite dissipé par l’habituation à la lumière des animaux au fil des semaines. Par ailleurs, les prélèvements sanguins pourront également induire un stress mais nous aurons recours à l’isoflurane pour anesthésier l’animal si le stress est trop important. La phase 2 pourrait également induire un stress chez les animaux car les tests comportementaux demandent un minimum de stress pour stimuler l’animal à effectuer le test comportemental. Des points limites seront déterminés afin de pouvoir exclure les animaux incapables d’effectuer les tests comportementaux. Enfin la phase 3 consiste à mettre à mort l’animal par perfusion intracardiaque donc chaque animal recevra une dose létale d’anesthésique afin que chaque souris ne ressente rien lors de cette procédure.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux subiront une mise à mort afin de pouvoir analyser biochimiquement et anatomiquement les modifications du développement de la pathologie exercée par la photobiomodulation.

Remplacement

Pour obtenir des résultats les plus cohérents sur l’influence du rythme circadien pour l’application de la photobiomodulation (PBM), un modèle animal est indispensable et représente le seul moyen de répondre à cette question. A ce jour il n’est pas possible de remplacer l’utilisation des animaux par une autre alternative. En effet, un modèle intégré Alzheimer permettra d’obtenir toutes les informations sur la période de la journée la plus bénéfique pour la PBM et de déterminer l’ensemble des modifications subcellulaires générées par la PBM. L’avantage incontestable des souris génétiquement modifiées, modèle de la maladie d’Alzheimer (MA), que nous avons choisi, est la dynamique évolutive de la pathologie, ressemblant au développement de la MA chez l’humain. D’un point de vue comportemental, les souris présentent des déficits de mémoire, d’apathie et d'anxiété. Survenant en amont de l’apparition des plaques, des modifications du rythme circadien et une perte de protéines synaptiques ont été décelées. Par imagerie, on distingue aussi une altération de l’assimilation du glucose dans les aires cérébrales identiques à celles impactées chez l’être humain.

Réduction

En prenant connaissance des bases de données sur les tests comportementaux, en prenant en compte des connaissances du modèle transgénique par le concepteur du projet, en prenant en compte des conditions de photobiomodulation et en prenant en compte des paramètres statistiques sur le logiciel G*Power (f=0.25, pouvoir statistique=0.7, p value

Raffinement

Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux durant la procédure expérimentale, des points limites ont été déterminés pour agir en fonction de la douleur ou du mal être ressenti. La phase 1 n’a à priori aucune incidence sur le bien-être de l’animal mais une surveillance accrue sera faite les premières semaines afin d’évaluer les éventuels effets indésirables que pourrait être produit par la photobiomodulation. Par ailleurs, l’expérience pilote permettra de mieux anticiper les mesures à prendre pour diminuer au maximum les répercussions de cette procédure. En ce qui concerne la phase 2, les tests comportementaux procurent différents niveaux de stress. Avant de commencer la procédure, l’expérimentateur ira chaque jour pendant une semaine pour habituer l’animal à être manipulé. Pour finir, en ce qui concerne la phase 3, les souris recevront une dose létale d’anesthésique permettant de diminuer à zéro la douleur infligée lors de la perfusion intracardiaque et du prélèvement du liquide céphalo-rachidien.

Choix des espèces

Pour analyser l’efficacité de la photobiomodulation (PBM) extracrânienne aux différentes périodes de la journée, pour vérifier la pénétrance de la PBM à travers la boite crânienne et pour observer toutes les conséquences subcellulaires dans un contexte Alzheimer, la souris génétiquement modifiée modèle de la maladie d’Alzheimer correspond à l’espèce la plus pertinente pour tester cette hypothèse.

2 700 souris, soit 1 200 adultes et 1 500 souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les adultes reçoivent une vingtaine d'injections, sont maintenus tête fixée jusqu'à une heure et équipés d'électrodes cérébrales, avant une perfusion cardiaque terminale, pour étudier le rôle de l'ocytocine dans les comportements maternels. Le porteur indique que les souriceaux sont brièvement séparés de leur mère, parfois sédatés, puis tués car ils ne peuvent être gardés sans elle. Il affirme que l'étude d'animaux vigiles en comportement rend l'in vitro et l'in silico impossibles.

Objectifs

L’ocytocine (OXT) est un neuropeptide synthétisé par les neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN), principalement connu pour son rôle dans la lactation et l’accouchement suite à sa libération dans la circulation sanguine. Cependant, des études récentes mettent en évidence les effets de l’OXT sur le système nerveux central, notamment sur les comportements sociaux et maternels. Chez les rongeurs, l’olfaction joue un rôle central pour les interactions entre individus et en particulier entre adultes et leurs progénitures. Dans le système olfactif, le cortex piriforme (PIR) est un des premiers et principal relais en aval du bulbe olfactif. Il présente chez la souris une densité exceptionnelle de récepteurs à l’OXT par rapport à d’autres régions cérébrales, notamment chez les femelles, avec une densité accrue chez les mères par rapport à des femelles vierges. Aux vues de cette forte expression chez les mères, nous avons fait l’hypothèse que l’OXT dans le PIR est nécessaire à la mise en place de comportements maternels chez des souris femelles. Afin de tester cette hypothèse, nous souhaitons réaliser des expériences en présence de souriceaux âgés de 1 à 10 jours, et manipuler la transmission oxytocinergique dans le PIR pour tester le rôle de l’OXT au niveau comportemental ainsi qu’au niveau des réponses neuronales.

Bénéfices attendus

Chez les Mammifères, la mise en place des comportements maternels est essentielle pour la survie des petits et de l’espèce en général. Chez l’Homme, il est notamment connu que le lien entre mère et enfant est facilité par la neurohormone nommée oxytocine, libérée dans la circulation sanguine de la mère lors de l’accouchement. Nous savons également que les odeurs jouent un rôle important et bénéfique dans le lien entre mère et enfant, un lien qui peut être affecté dans certaines situations, notamment lors de certains accouchements par césarienne (les taux d’oxytocine libérés sont alors plus limités). Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cerveau s’adapte lorsqu’il s’agit de mettre en place des comportements maternels et le rôle des odeurs dans ce processus. A terme, il pourrait permettre de mettre en place des stratégies pour faciliter l’établissement de ces comportements chez l’Homme dans des situations problématiques liées à la maternité. Cette perspective est d’autant plus réaliste que l’administration d’ocytocine par voie intranasale est déjà réalisée chez des enfants autistes pour améliorer leurs relations sociales.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence de souriceaux. Elles seront soumises à des injections et à des phases de contentions pendant les périodes d'habituation et d'expérimentation (environ 20 injections par souris, moins de 3min par injection/jour). Afin de pouvoir présenter les odeurs aux souris de manière précise et juste devant leur nez, nous devrons maintenir certaines souris au sein du dispositif comportemental qui permet de délivrer les odeurs. Ce maintien sera réalisé à l'aide d'une petite fixation métallique attachée à leur crâne au préalable. La durée de contentention par maintien de la tête en position fixe n'excédera pas 1h et sera réalisée après une habituation progressive. A la fin de l'expérimentation, les souris seront soumises à une perfusion afin de préserver les tissus cérébraux et d'effectuer des contrôles histologiques (durée de la procédure inférieure à 20min, réalisée sous traitement anesthésique et analgésique).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet seront mises en présence de souriceaux (ou d’odeurs de souriceaux) et nous observerons leur comportement pour quantifier leur capacité à en prendre soin. Les souriceaux pourront être brièvement séparés de leur mère le temps de réaliser ces tests, ce qui correspond à un stress modéré car réduit dans la durée. Pour limiter ce stress, nous prévoyons aussi de sédater ou anesthésier les souriceaux, ce qui nécessite d’injecter des substances médicamenteuses via des injections sous-cutanées réalisées à l’aide d’aiguilles très fines. Afin de pouvoir tester le rôle de l’ocytocine dans ces comportements, nous utiliserons des méthodes qui permettent de cibler les neurones capables de libérer de l’ocytocine ou bien les neurones qui répondent à l’ocytocine lorsqu’elle a été libérée. Pour cela, nous devrons faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés au préalable (injections réalisées dans un autre établissement) et des injections d’agents pharmacologiques seront nécessaires. Ces injections représentent potentiellement une légère nuisance pour les animaux car elles nécessitent de les maintenir immobiles pendant la durée de l’injection (contention). Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. Les souris pourront être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée.

Devenir

Les 1200 souris adultes pourront être mises à mort par perfusion intracardiaque réalisée sous anesthésie générale avec traitement antidouleur adapté. La préservation du tissu nécessite que cette procédure de perfusion soit réalisée et permet ainsi de réaliser des contrôles histologiques en fin d’expérimentation. Cette procédure, en utilisant la voie circulatoire sanguine, favorise la pénétration du fixateur dans les tissus de manière homogène et suffisamment rapide pour empêcher la détérioration du tissu cérébral en condition d'anoxie (normalement engendrée par l'arrêt cardiaque). Les 1500 souriceaux seront aussi euthanasiés à la fin des procédures car ils ne peuvent être gardés en absence de leur mère.

Remplacement

La souris fait partie de la famille des Vertébrés, comme l’Homme, et elle est capable de fonctions cognitives relativement complexes : elle représente donc un modèle d’étude particulièrement intéressant pour comprendre le fonctionnement du cerveau humain. Nous étudierons les circuits neuronaux des souris alors que ces dernières effectueront des comportements maternels : il nous faudra donc travailler avec des animaux vigiles. Par conséquent, il nous sera impossible de conduire cette étude in vitro. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent malheureusement pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre total d’animaux requis pour ce projet est de 2700 (1200 souris adultes et 1500 souriceaux) sur 5 ans. Nous prévoyons de minimiser ce nombre en utilisant les mêmes souris dans des tests comportementaux différents, avec ou sans intervention sur le système ocytocinergique. Pour chaque condition testée, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire pour pouvoir tirer des conclusions valables sur le plan statistique et tenant compte des aléas liés à ces approches expérimentales complexes. Ce nombre sera réduit davantage grâce à nos études pilotes qui permettront une optimisation des paramètres de nos expériences et raffiner notre approche statistique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux procédures qu’ils vont rencontrer (notamment aux contentions et injections). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. L’effet positif de l’oxytocine sur les comportements sociaux a notamment été montré aussi bien chez la souris que chez l’Homme. Les odeurs jouent un rôle important dans le lien mère-progéniture, aussi bien chez l'Homme que chez la Souris. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation. Des souriceaux entre P1 et P10 seront utilisés comme stimuli au cours des expérimentations car elles visent à comprendre les bases neurobiologiques des comportements maternels.

320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie du crâne créant un défaut osseux sous anesthésie, puis un suivi par imagerie avant mise à mort échelonnée jusqu'à 60 jours, pour étudier le rôle d'une molécule de l'inflammation dans la cicatrisation osseuse. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, hémorragie et rarement une hypertension intracrânienne constituant un point limite. Il affirme que les modèles in vitro et ex vivo ne reproduisent pas la complexité cellulaire ni l'apport vasculaire, rendant le recours à un modèle in vivo nécessaire.

Objectifs

L’objectif de notre projet est de caractériser le rôle d’une molécule clé de l’inflammation (interleukine 33) dans la réparation osseuse. En effet l’interleukine 33 est une cytokine (protéine soluble jouant un rôle de signal) jouant un rôle important dans le maintien de l'éauilibre des tissus et dans la défense contre les infections parasitaires. Le dérèglement de cette cytokine est impliqué dans de nombreux phénomènes allergiques et inflammatoires chroniques. Cette molécule est plus présente dans l’os ostéoporotique et joue un rôle protecteur chez la femme ménopausée1. En revanche son rôle dans la cicatrisation osseuse après une fracture ou une chirurgie orthopédique reste inconnu. Cette étude scientifique nous permettra de mieux comprendre son rôle dans la réparation osseuse pour pouvoir moduler ses effets lors de la phase inflammatoire de la cicatrisation osseuse et pour, in fine, améliorer la réparation osseuse. Enfin, nous voulons connaitre l’influence de l’âge sur l’expression de cette molécule pour pouvoir améliorer la prise en charge clinique de la cicatrisation osseuse chez les patients âgés et affiner la prise en charge pour une médecine plus personnalisée.

Bénéfices attendus

Ce projet s’inscrit dans le contexte des recherches en immuno-ostéologie. En effet, ces expérimentations permettront, dans un premier de temps, de mieux comprendre l’influence de l’âge sur le profil inflammatoire après des résections osseuses de différentes tailles. Par ailleurs, ces études vont permettre d’améliorer nos connaissances sur l’influence d’IL33 dans ce processus de cicatrisation osseuse. Enfin, les bénéfices à long terme d’un tel projet sont l’amélioration de la prise en charge des patients jeune et âgés souffrants de pertes osseuses importantes et une meilleure prise en charge de la cicatrisation osseuse chez les patients jeunes et âgés.

Procédures

Tous les animaux (320 souris) seront soumis à J0 à une chirurgie de la calvaria (procédure 1), conduite sous anesthésie générale de 30-45 minutes. Une analgésie pré- et post-opératoire (3 jours) sera fournie. Les animaux seront mis à mort à J2, J9, J14, J30 et J60 post-opératoires. La moitié des souris mises à mort à J60 (32 souris) sera également soumise à une analyse en bioluminescence de l’inflammation (procédure 2) à J2, J9, J14, conduite sous anesthésié gazeuse de 30 minutes. Il s’agit d’une procédure indolore. L’autre moitié des souris mises à mort à J60 (32 souris) sera soumise à une analyse au microscanner de la formation osseuse à J2, J9, J14, J30 et J60, conduite sous anesthésié gazeuse de 30 minutes. Il s’agit d’une procédure indolore.

Impact sur les animaux

La chirurgie sur calvaria de souris peut entrainer des effets indésirables tels que : douleur, hémorragie, stress, ou un comportement anormal causé par une hypertension intracrânienne. Ces effets indésirables seront potentiellement observés en per-opératoire ou post-opératoire immédiat (jusqu’à 3 jours). L’hypertension intracrânienne est une complication rare et constitue un point limite. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire immédiat peut-être également observé occasionnellement. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire), qui constitue également un point limite de l’étude car pouvant être l’origine de faux positifs dans notre étude (un des critères d’étude étant l’inflammation locale). Les anesthésies nécessaires à l’imagerie non invasive en micro-CT et en BLI vont également entrainer du stress au moment de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil.

Devenir

Suite à la chirurgie sur la calvaria tous les animaux seront gardés en vie. Les animaux seront mis à mort aux temps terminaux de l’étude : J2 (64 souris), J9 (64 souris), J14 (64 souris) J30 (64 souris) J60 (64 souris). Suite à l’analyse en bioluminescence (procédure 2, 32 souris) à J2, J9 J14, ou en microscanner (procédure 3, 32 souris) à J2, J9 J14, J30 les animaux seront réveillés et gardés en vie. A J60, les animaux seront mis à mort juste après l’examen (sans réveil).

Remplacement

La cicatrisation osseuse est un processus séquentiel complexe impliquant l’interaction de nombreuses populations cellulaires différentes : cellules osseuses, cellules vasculaires, cellules du système immunitaire et cellules des tissus environnant tels que le périoste ou le tissu musculaire. Les modèles in silico actuels ne peuvent pas reproduire cette complexité cellulaire et moléculaire, d’autant plus que tous les processus intervenants dans la réparation osseuse ne sont pas encore connus. Les modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions matrice-cellules ou cellules-cellules, mais n’incluent que 2 ou 3 interactions (ostéoblastes/macrophages par exemple). Les modèles ex vivo (explants osseux) sont les plus proches de la situation physiologique et permettent d’étudier la physiologie osseuse sur quelques jours. Ces modèles, cependant, sont dénoués de système vasculaire. Or la formation d’un hématome au tout début de la cicatrisation osseuse joue un rôle essentiel dans celle-ci. Pour toutes ses raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier le rôle d’IL33 dans la cicatrisation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Compte tenu des écarts constatés pour les différents paramètres de la réparation osseuse étudiés par notre équipe, le nombre minimum d'animaux nécessaire afin d'avoir un test statistique significatif (puissance de test 90%, seuil de signification < 0,05) est de 6 /groupe /temps / type d’analyse, mais le nombre d'animaux inclus dans les expérimentations sera de 8/groupe /temps / type d’analyse, afin de conserver une puissance statistique malgré la perte inopinée de certains animaux. Afin de réduire le nombre d’animaux, l’os de calvaria prélevé lors de la chirurgie à J0 sera utilisé comme contrôle T0. De plus, la réparation osseuse et l’inflammation seront étudiées par différentes techniques (biologiques, imagerie multimodale) au sein du même animal, permettant de maximiser la contribution scientifique de l'animal mis à mort. Afin de réduire le nombre de procédure subies par les animaux, seuls les animaux mis à mort à J60 seront soumis l’imagerie non invasive en micro-CT J2, J9, J14, J30 et J60 et en BLI à J2, J9, J14. Les variables quantitatives seront testées pour leur normalité (test de Kolmogorov-Smirnov). Si les variables suivent une loi normale, elles seront analysées par des modèles de régression linéaire générale basés sur l’analyse de variance et les effets significatifs testés par un test post-hoc (LSD-Fisher). Sinon, un test non-paramétrique de Kruskal-Wallis sera utilisé pour une comparaison globale entre les groupes et un test de Mann-Whitney pour une comparaison de groupes deux par deux.

Raffinement

L’état général de l’animal et du site chirurgical seront évalués grâce à un tableau scoré. Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. Suite à la procédure chirurgicale des points surveillés et scorés (feuille de score) sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques cette procédure permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. Des soins et une médication analgésique appropriés post-opératoires seront mis en place pour s’assurer de l’absence de douleurs ou d’inconfort. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si les points limites sont atteints, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort. Un environnement enrichi sera fourni avec briques de bois (usure des dents), papier et dôme cartonné afin de contribuer au fouissement des animaux. Les souris initialement hébergées ensemble (3 ou 4 souris/cage) le resteront du début à la fin du protocole. La température sera maintenue et contrôlée entre 20 et 22°C et le rythme veille/sommeil sera de 12h/12h. Eau et nourriture seront fournies ad libitum. Les animaux seront également observés visuellement quotidiennement par les zootechniciens.

Choix des espèces

Souris C57/BL6 : Modèle de défaut de calvaria de référence dans la littérature internationale, fiable, reproductible, peu couteux ; souche la plus décrite dans la réparation osseuse et l’analyse de l’inflammation 1 Souris adultes de 8 semaines (jeunes) : âge optimal pour analyser la réparation osseuse ; à ce stade aucune influence de la croissance sur le crâne. Souris adultes 18 mois (âgées) : âge optimal pour analyser l’effet du vieillissement sur la réparation osseuse.

420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un mélanome à métastases pulmonaires, elles reçoivent des injections intraveineuses, des inoculations intranasales d'un parasite et des prises de sang, pour identifier les cellules immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale. Le porteur indique que la tumeur pulmonaire peut provoquer des difficultés respiratoires et que la mort survient rapidement après l'apparition des symptômes, la mise à mort étant planifiée juste avant. Il reconnaît qu'une approche in vitro a été développée en amont mais affirme qu'elle ne reproduit pas un modèle de régulation complexe.

Objectifs

Les premiers résultats publiés montrent que l’injection intratumorale de tachyzoïtes de Neospora caninum et de N. caninum modifiés pour sécréter de l’IL15 permet le contrôle du développement d’une tumeur sous-cutanée solide EG-7 par action oncolytique, induction d’une forte réponse immunitaire et reprogrammation de l’environnement tumoral. De même, l’efficacité de N. caninum dans un modèle murin de mélanome à métastases pulmonaires (B16F10) a été démontrée par voie sous-cutanée, intraveineuse et intranasale avec une très bonne protection antitumorale induite par voie intraveineuse et intranasale. Le modèle de mélanome à métastases pulmonaires est à la fois un modèle plus relevant d’un point de vue clinique humaine puisqu’il s’agit d’un cancer contre lequel nous avons besoin de développer de nouvelles approches thérapeutiques efficaces, mais aussi un modèle nous permettant d’étudier la réponse antitumorale induite par N. caninum dans un modèle métastatique. La réponse antitumorale induite par N. caninum dans ce modèle a été caractérisée, il nous faut maintenant déterminer si les populations cellulaires qui sont recrutées dans les poumons des souris traitées sont indispensables à la réponse antitumorale et de confirmer ainsi leur rôle. Le rôle des populations cellulaires présentes dans les poumons sera étudié par déplétion locale de ces dernières (n=420souris).

Bénéfices attendus

Grâce à ce projet nous pourrons identifier les cellules immunitaires dont le rôle est primordial dans la réponse antitumorale induite par N. caninum. En effet, si nous observons un développement tumoral après traitement par N. caninum chez les souris ayant une population cellulaire déplétée, nous pourrons conclure que le rôle de cette population cellulaire est primordial dans la réponse antitumorale. En plus de déterminer quelles populations cellulaires sont impliquées dans la réponse antitumorale, nous pourrons aussi déterminer dans quelle mesure elles sont impliquées.

Procédures

Lot témoin non traité : 1 injection intraveineuse (1 minute), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots déplétés 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 1 à 5 (n=20) : 1 injection intraveineuse (1 minute), 2 inoculations intranasales (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes). Lots contrôles 6 à 10 (n=20) : 2 injections intraveineuses (1 minute), 1 inoculation intranasale (10 secondes), 4 prises de sang (30 secondes).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur au niveau pulmonaire peut induire chez la souris une souffrance due à une difficulté respiratoire. Les effets indésirables pouvant apparaitre sont : - Signes cliniques modérés : Agitation/Agressivité, Hypomobilité/hyporéactivité, stéréotypies, Poil piqué, Coloration anormale de la peau, Flacidité musculaire généralisée, Gonflement abdominal, Zone ano-génitale souillée, Perte de poids inférieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Diminution/absence de prise de nourriture. - Signes cliniques : Akinésie, Tremblements généralisés, Convulsions, Persistance du pli cutané, Voussure du dos/dos cambré, Difficultés respiratoires, Perte de poids supérieure à 15% (en tenant compte de la masse tumorale), Absence de prise de nourriture> à 2 jours. L’apparition des symptômes précède de peu l’apparition des points limites et la mort de l’animal, qui surviennent rapidement (généralement en deux à trois jours). Dès l’apparition des symptômes sur l’une des souris du lot contrôle, l’ensemble des animaux des animaux sera mis à mort pour éviter toute souffrance inutile. Si les points limites cités précédemment sont atteints, les animaux seront mis à mort sans délai. D’après notre expérience, le développement de la tumeur sans traitement devrait conduire à l’apparition des symptômes cités précédemment vers J30 et conduira à la mise à mort des animaux sans délai. Ce délai d’apparition des symptômes est pris en compte lors du développement du protocole expérimental et la mise à mort des animaux est planifiée pour être réalisée quelques jours avant l’apparition des premiers symptômes pour éviter toute souffrance aux animaux.

Devenir

Afin de pouvoir étudier la réponse immunitaire induite par N. caninum lors du traitement des nodules pulmonaires et de déterminer l’impact de l’absence d’une population cellulaire spécifique sur cette réponse immunitaire, nous devons mettre à mort les animaux pour collecter les poumons et étudier la réponse locale dans cet organe. Il n’existe à ce jour aucune méthode nous permettant de nous affranchir de la mise à mort des animaux.

Remplacement

Une approche in vitro a été développée en amont afin de valider notre hypothèse de travail et l’utilisation des composés sur des cellules immunitaires impliquées dans le contrôle de la tumeur mais cela ne reproduit pas un modèle de régulation complexe permettant la validation de notre stratégie.

Réduction

Le nombre d’animaux est calculé au plus juste à l’aide d’outils statistiques (disponibles sur Anastats.fr) garantissant une puissance de test de 80% minimum en s’appuyant sur les données de la littérature. L’étude statistique des résultats sera réalisée avec le test non paramétrique Kruskall-Wallis pour l’étude des réponses immunitaires humorale (titre en anticorps) et cellulaire (dosage de cytokines) ainsi que pour l’étude du développement tumoral.

Raffinement

Les souris sont hébergées en accord avec les normes réglementaires, en animalerie A2 à raison de 5 souris maximum par cage sur des portoirs ventilés et dans un environnement enrichi (objets en cellulose pour faire un nid ou à ronger). Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux sera réalisé avec une surveillance systématique des points limites.

Choix des espèces

Les souches de souris immunocompétentes sont adaptées à la greffe de cellules tumorales syngéniques présentant le même fond génétique que la souche de souris utilisée. Dans le cadre de précédentes études chez la souris, l’utilisation de protozoaires en tant que thérapie antitumorale a montré des résultats probants. Adulte. Il n’y pas la nécessité d’utiliser des animaux plus jeunes ou gestants.

4 790 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des vecteurs viraux sont injectés dans leur cerveau par stéréotaxie, sur des embryons via une laparotomie de la mère, sur des nouveau-nés ou sur des adultes, avant des tests comportementaux non précisés puis la mise à mort par exsanguination. Le porteur indique que les chirurgies peuvent provoquer une douleur modérée et que les nouveau-nés atteignant un point limite sont mis à mort par décapitation avant quinze jours. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne rend compte de la complexité du tissu et que l'étude ne peut être menée qu'in vivo.

Objectifs

Depuis la découverte de la barrière hémato-encéphalique par Paul Erhlich à la fin du XIXe siècle, le cerveau a été considéré comme virtuellement séparé des autres organes et de la circulation sanguine. Pourtant, cette dernière décennie a vu l'émergence du concept selon lequel la fonction cérébrale est façonnée par divers facteurs biologiques, tels que le microbiote intestinal, les cellules et signaux immunitaires systémiques ou encore le cycle jour/nuit. Parallèlement, les zones barrières du cerveau, comme les méninges et les plexus choroïdes, ont été identifiées comme des interfaces de dialogue croisé actif entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières inertes. Les plexus choroïdes constituent la barrière sang-fluide céphalorachidien, l'une des frontières séparant le cerveau de la périphérie. Ils sont situés dans chacun des quatre ventricules du cerveau et sont adjacents à des zones impliquées dans la neurogenèse. D'un point de vue structurel, les plexus choroïdes sont composés d'un réseau de capillaires sanguins fenêtrés entourés d'une monocouche de cellules épithéliales et peuplés entre les deux par une grande variété de cellules immunitaires. Les principaux rôles physiologiques des plexus choroïdes sont la production de liquide céphalorachidien, qui débarrasse le cerveau des déchets métaboliques et des agrégats de protéines, ainsi que la production et le passage contrôlé du sang au cerveau de diverses molécules de signalisation, notamment des hormones et des facteurs neurotrophiques. Les molécules sécrétées par les plexus choroïdes façonnent l'activité du cerveau, par exemple en modulant la neurogenèse et la fonction des cellules immunitaires microgliales localisées dans le cerveau, ce qui rend les plexus choroïdes cruciaux pour l'homéostasie du cerveau. Des travaux antérieurs et d’autres travaux préliminaires ont montré que le niveau d’expression de certains gènes exprimés par l’épithélium des plexus choroïdes varient en fonction de l’âge et notamment au cours du vieillissement, et en réponse aux variations environnementales telles que celles du microbiote et du cycle circadien. Notre but est de mieux comprendre comment ces facteurs influent sur la biologie des plexus choroïdes et la fonction du cerveau.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra l’identification des facteurs produits par les plexus choroïdes et potentiellement impliqués dans la modulation de l’activité neuronale en fonction de l’âge, depuis la naissance et au cours du vieillissement, en fonction des facteurs environnementaux que représentent les variations de la composition du microbiote et celles du cycle circadien. Cette étude devrait permettre une meilleure compréhension de la biologie de cette interface barrière que constitue les plexus choroïdes et qui reste encore très peu étudiée et d’identifier de nouveaux mécanismes via lesquels les plexus choroïdes modulent la fonction du cerveau. A terme, ce projet pourrait permettre la mise au point d’immunothérapie afin de mieux lutter notamment contre les maladies dégénératives associées au vieillissement.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie : - soit une laparotomie sur femelle gestante (durée de la procédure : 45 min à 1h), - soit une injection de vecteurs viraux dans le cerveau par stéréotaxie (durée de la procédure : incluse dans la durée de la laparotomie quand réalisée sur embryons, 5 à 10 min sur nouveau-nés, 30 min à 1h sur adulte). 12 jours (dans le cas des nouveau-nés injectés à la période embryonnaire) à 12 semaines (adultes) après chirurgie, les animaux seront mis à mort par exsanguination sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux adultes auront été avant mise à mort (4 à 8 semaines après chirurgie) impliqués dans des tests de comportement non invasifs.

Impact sur les animaux

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par une injection de buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur. De la lidocaïne sera appliquée sur les zones à inciser. De l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie. Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Devenir

Les animaux ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les géniteurs qui n’auront pas subi de chirurgie (procédures 1 et 2) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 après 6 mois de reproduction. Les femelles gestantes qui auront subi une laparotomie (procédure 1) seront mis à mort par exposition croissante en CO2 au moment de la séparation avec les nouveau-nés P6 ou P21. La mise à mort des souris auxquelles auront été injectés les vecteurs viraux (procédure 2) aura lieu par perfusion de PBS (exsanguination) sous anesthésie générale profonde et analgésie afin de prélever les tissus nettoyés du sang et à analyser post-mortem. Si un animal atteint les points limites définis, il sera mis à mort par exposition croissante en CO2 (jeunes de plus de 15 jours et adultes) ou par décapitation (nouveau-nés de moins de 15 jours).

Remplacement

Notre but est d’étudier comment les cellules situées au niveau des plexus choroïdes, agissent sur le cerveau, en condition physiologique, au cours du développement, du vieillissement et en réponse aux variations de composition du microbiote et du cycle circadien. Les plexus choroïdes sont un tissu composé d’un endothélium fenêtré, de cellules épithéliales, de cellules de type neuronal, de cellules mésenchymateuses et de cellules immunitaires. Les cellules immunitaires du système périphérique pourraient induire l’expression de facteurs produits par les cellules des plexus choroïdes qui pourraient eux-mêmes moduler l’activité neuronale du cerveau. Il n’existe aucun modèle in vitro ou ex vivo rendant compte de la complexité́ d’un organisme ou d’un tissu avec ses composantes endothéliale, épithéliale, neuronale, mésenchymateuse et immunitaire. De plus, nous étudions la physiologie des plexus choroïdes en fonction de l’âge et des variations des facteurs environnementaux tels que le microbiote et le cycle circadien, ce qui ne peut être étudié qu’in vivo.

Réduction

Nous souhaitons étudier les gènes des plexus choroïdes et du cerveau qui auront montré par une précédente approche transcriptomique des différences d’expression considérables en fonction des paramètres comparés. Les quantités d’animaux utilisées pour mener à bien notre projet sont établies en tenant compte de notre précédente expérience et de tests statistiques (test ANOVA, source SHADE). Les 4 plexus choroïdes d’un animal doivent être groupés pour pouvoir réaliser une analyse moléculaire ou transcriptomique sur ces petits tissus. Seuls 10 microlitres de liquide céphalo-rachidien peuvent être prélevés à partir du cerveau d’une souris, ce qui ne permet qu’un seul type d’analyse. Les analyses moléculaires du liquide céphalo-rachidien, des plexus choroïdes et des zones d’intérêt du cerveau pourront cependant être réalisées sur les mêmes animaux qui auront au préalable été impliqués dans des tests de comportement (adultes). Nous prévoyons pour chaque groupe, 4 animaux par analyse. Le sexe des animaux pouvant influer sur les phénotypes observés, des mâles et femelles seront inclus (ratio 1/1). Des triplicatas d’expérience seront réalisés pour permettre l’obtention de résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 3 groupes comparés (P6, P21 et adultes) : les effectifs proposés (36 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.07 (effets considérables à extrêmes). - 2 groupes comparés (adultes jeunes et âgés) : les effectifs proposés (24 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.65 (effets très forts à considérables). - 6 groupes comparés (4h cycle fixe et 2h cycle perturbé) : les effectifs proposés (72 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.85 (effets très forts à considérables). - 4 groupes comparés (P21 et adultes, conventionnels et axéniques) : les effectifs proposés (48 individus) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.97 (effets considérables à extrêmes). Ces résultats nous permettront d’identifier les différences majeures dans la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau en fonction de l’âge, du microbiote et du cycle circadien, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Les procédures décrites visent à réduire autant que possible le mal-être animal. Toutes les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et sur tapis chauffant sur lesquels ils seront maintenus pendant et quelques heures après leur réveil. Les chirurgies sur adultes peuvent entraîner une douleur modérée au cours de la cicatrisation qui sera prévenue par des administrations d’analgésiques (buprénorphine, 30 min avant chirurgie, 6h après, puis toutes les 12h pendant 48h en cas de douleur ; lidocaïne appliquée sur les zones à inciser ; de l’acétaminophène sera également ajouté après chirurgie dans l’eau de boisson pendant la cicatrisation soit 2-3 jours pour une stéréotaxie et 4-5 jours pour une laparotomie). Les signes de douleur plus importante qui pourraient provenir de complications seront surveillés en observant les signes suivants : prostration, altération de la qualité́ du poil (hirsute, terne) ou apathie. Si l’animal présente deux de ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les chirurgies sur embryons seront indirectement surveillées via le suivi des femelles gestantes : toute perte de sang vaginale qui pourrait attester de la mort d’un ou plusieurs embryon(s) sera surveillée et nous appliquerons les points limites définis précédemment. Les stéréotaxies sur nouveau-nés pourront entrainer une douleur légère qui sera prévenue par application de lidocaïne au niveau du site d’injection. Après chirurgie, l’acceptation des nouveau-nés par leur mère sera surveillée au travers des signes suivants synonymes d’abandon : isolement du reste de la portée, bleuissement de la peau associé à une hypothermie et absence visible de lait dans l’estomac. Si le nouveau-né présente ces trois signes (point limite), il sera mis à mort. Les animaux en élevage et ceux qui auront récupérés de leur chirurgie seront régulièrement surveillés et nous suivrons les signes et points limites précédemment définis. Nous éviterons que les animaux soient isolés dans leur cage et nous ajouterons un abri dans la cage des portées, femelles gestantes et géniteurs en plus du papier/coton présent dans toutes les cages. La procédure 2 s’achève par l’injection par voie-intrapéritonéale de l’anesthésique et analgésique qui pourra générer un peu de stress à l’animal mais peu ou pas de douleur.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives et notamment des maladies dégénératives car de nombreuses lignées sont disponibles, invalidées pour de nombreux gènes d'intérêt et/ou génétiquement manipulable après injection de vecteurs viraux. Elle est facile à élever et ses grandes capacités de reproductions facilitent les études sur embryons et nouveau-nés. Il est aisé d’en manipuler le microbiote. La souris permet également l’analyse des capacités cognitives au cours d’expériences comportementales. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Le phénotype induit par les vecteurs viraux n’est analysable qu’au minimum 10 jours après injection. Afin d’étudier comment la biologie des plexus choroïdes et sa fonction sur le cerveau évoluent avec l’âge, nous injecterons les vecteurs viraux à des souris embryonnaires afin d’en étudier les effets chez les souris : (i) âgées de 6 jours, stade important avec la mise en place du système immunitaire et de nombreuses variations métaboliques en réponse à l’allaitement maternel, (ii) âgées de 21 jours qui correspond à la période du sevrage avec d’importantes variations métaboliques et du microbiote qui devient mature, (iii) adultes, âgées de 7 à 12 semaines, qui seront notre point de référence physiologique. De la même manière, nous étudierons les effets du microbiote en injectant les vecteurs viraux à des souris âgées de 3-4 jours afin d’en étudier les effets lorsqu’elles auront 21 jours ou qu’elles seront adultes et les effets du vieillissement en injectant les vecteurs viraux à des souris adultes jeunes de 7 à 12 semaines et âgées de 10 à 20 mois.

280 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une perte osseuse est créée chirurgicalement dans leur mâchoire, puis la régénération est suivie au microscanner pendant deux mois avant la mise à mort pour analyse histologique, afin de tester des biomatériaux de comblement. Le porteur indique que la chirurgie maxillo-faciale provoque une douleur modérée et une gêne à la mastication les premiers jours. Il affirme que les produits destinés à l'humain doivent "nécessairement" être testés sur l'animal et qu'aucune approche in vitro ne répond à la réglementation sur les dispositifs implantables.

Objectifs

Les pertes de substances osseuses représentent un challenge en chirurgie orale et une problématique de santé. Ces pertes osseuses au niveau de la mâchoire peuvent avoir différentes origines : traumatismes dû à un accident, tumeurs bénignes ou malignes, infection, .... En clinique, l'utilisation de greffe pour réparer la zone est très répandue mais présente certains inconvénients (chirurgie lourde, problème de compatibilité et d'intégration du greffon...). Ainsi, le développement de biomatériaux en régénération osseuse est indispensable pour pallier à ces limitations et optimiser la prise en charge des patients. Pour évaluer le potentiel ostéogénique des biomatériaux étudiés et envisager à terme de les utiliser chez l'homme, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal. Dans notre projet le modèle proposé est le rat, qui est une espèce pertinente et reconnue dans le cadre de la validation des biométériaux implantables à visée humaine. Le suivi de la régénération osseuse sera réalisé par de l'imagerie par un micro-scanner, cette technologie est composée d'un système d'acquisition et d'un logiciel dédié, qui effectue des analyses de densité radiologique point par point pour reconstituer des images du site d'intérêt extrêmement précises. Cette technologie permet un suivi performant du site d'intérêt et est indolore pour l'animal. Ainsi l'objectif du projet est de tester le pouvoir ostéogénique de biomatériaux implantés spécifiques de ce type de reconstruction au niveau de la face en vue de futur essai clinique chez l'Homme.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait le développement de nouveaux dispositifs médicaux (matériaux de comblement ou membranes pour la régénération osseuse guidée) dans le domaine de l'ingénierie tissulaire osseuse au vue d'être utilisé en clinique.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie au niveau de la mâchoire (création d'un défaut). Cette intervention dure environ 30 min par animal. Suite à l'opération, le suivi par micro scanner de la régénération osseuse pour chaque rat sera réalisé à des intervalles de temps espacés de 2 semaines. L'acquisition du microscanner dure environ 15 min. Il est envisagé de réaliser 5 fois cette acquisition sur chaque rat (suivi longitudinal sur 2 mois, avec une acquisition à: T0, 2, 4, 6 et 8 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une intervention chirurgicale maxillo-faciale. Cette chirurgie engendrera une douleur modérée pour les animaux et une éventuelle difficulté lors de la mastication pour s'alimenter lors des premiers jours post-opératoires. Une surveillance sera établie afin de pallier à ces inconvénientset et toutes les mesures sont mises en place pour prendre en charge le bien-être des animaux tout au long du projet.

Devenir

Suite à la chirurgie, les animaux seront suivis par microscanner sur 2 mois (examen d'imagerie non invasive). Après le dernier temps d'acquisition (2 mois après la chirurgie), les animaux seront euthanasiés par les expérimentateurs formés à ce geste, afin de pouvoir réaliser des analyses histologiques sur ces animaux et poursuivre les examens post-mortem permettant de valider le pouvoir ostéogénique du biomatériau étudié.

Remplacement

Les produits destinés à être implantés chez l'Homme doivent nécessairement être testés chez l'animal avant les essais cliniques. Il n'existe pas de méthode basée sur une approche in vitro permettant d'évaluer ces matériaux pour répondre à l'objectif du projet et à la réglementation en vigueur dans le cadre de l'évaluation des dispositifs médicaux implantables chez l'Homme.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux utilisé, un suivi longitudinal par analyse au micro scanner sera réalisé. L'intérêt est qu'il est ainsi possible d'obtenir des informations sur l'aspect cinétique du processus, sans avoir à sacrifier des animaux à différents temps. Il est ainsi possible de s'assurer que le processus se déroule correctement, et de décider de sacrifier les animaux en fonction de ces observations.

Raffinement

Pour réduire l’angoisse des animaux, une période d’adaptation d’une semaine au sein de l'animalerie sera respectée avant le début des expérimentations. Les mesures de raffinement sont mises en place tout au long du projet, notamment lors de la phase de la chirurgie : les animaux recevront au préalable une couverture analgésique (anti-douleur), ils seront ensuite endormis, sous anesthésie générale durant toute l'opération. Après la chirurgie, chaque rat se réveille dans une cage à part sur tapis chauffant. Après le réveil complet, le rat reviendra dans sa cage et il sera suivi individuellement pendant quelques jours afin de s'assurer que l'opération s'est bien passé et que l'animal récupère correctement. Les critères d'évaluation et de suivi sont définis et adaptés au projet. Suite à cette surveillance, les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec un raffinement des conditions d’hébergement adapté à leur espèce : enrichissement de l’environnement d’hébergement (litière en copeaux, jouets, bâton à ronger...).

Choix des espèces

Le rat est une espèce adaptée à la première étape de validation chez l'animal de matériaux destinés au traitement des pertes osseuses chez l'homme. De par sa taille, il permet de réaliser des lésions circulaires de diamètre suffisant dans l'os alvéolaire de la mâchoire. Le rat permet ainsi de valider la biocompatibilité, la stabilité dans le temps et l'efficacité thérapeutique du produit. En cas de résultats satisfaisant et supérieur à ce qui est obtenu avec les produits de référence actuellement sur le marché, le processus de validation pourra se poursuivre, afin à terme leur utilisation chez les patients. Des rats Sprague-Dawley adultes de 10 semaines, d'un poids d'environ 400 g seront utilisés. En effet les animaux utilisés doivent avoir achevé leur développement et leur croissance au niveau osseux pour répondre à l'objectif de l'étude.

1 100 rongeurs, soit 500 souris, 500 rats et 100 cochons d'Inde, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils servent à entraîner des expérimentateurs aux gestes d'administration de substances et de prélèvement sanguin, lors de séances de deux à trois heures répétées selon l'habileté de chaque stagiaire. Le porteur reconnaît que des gestes mal maîtrisés par des personnes novices peuvent produire une contention prolongée, du stress et des gestes plus douloureux. Il affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer l'animal pour cette formation et qu'un même animal sert à apprendre plusieurs gestes avant d'être tué.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de former les expérimentateurs aux gestes techniques pour l’administration de composés et le prélèvement sanguin chez le rongeur.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de former les nouveaux arrivants dans notre société et de s’assurer qu’ils maîtrisent parfaitement les gestes d’administration de composés et de prélèvements sanguins avant de les laisser travailler en autonomie.

Procédures

Les animaux subiront des administrations d’eau de boisson pour les administrations per os et de liquide physiologique pour toutes les autres voies d’administration. Des prélèvements sanguins seront également réalisés sur tous les animaux en fonction des gestes techniques à apprendre. La durée de cette formation donc des gestes techniques appliqués sur les animaux dépendra de l’habilité de chaque collaborateur. Il semble cohérent de prévoir des séances d’entraînement de 2 à 3 heures environ par jour où tous les gestes à apprendre peuvent être combinés.

Impact sur les animaux

Ce projet est réalisé pour valider ou former de nouveaux collaborateurs aux gestes techniques d’administration de substances et de prélèvements sanguins. Ces personnes pouvant être novices, il est possible que certains gestes techniques encore mal maitrisés produisent une légère nuisance aux animaux (contention un peu longue par rapport à une personne plus habituée, stress de l’expérimentateur ressenti par l’animal, geste un peu plus douloureux car en apprentissage…). Cependant, dans un premier temps, les gestes à apprendre seront réalisés avec un formateur afin de limiter tout stress à l’animal.

Devenir

A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Aucune méthode substitutive ne permet actuellement de remplacer l’animal pour réaliser la formation de la réalisation des gestes techniques d’administration ou de prélèvement sanguins en reproduisant toutes les réactions physiologiques de l’animal lors des contentions, des administrations, des prélèvements et lors des anesthésies.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de réduire le stress de l’animal ainsi que la douleur. En effet, la personne sera formée par un autre collaborateur expert dans tous les gestes à apprendre afin de lui enseigner les bonnes techniques de contention, les bons gestes techniques afin de réduire au maximum le stress chez l’animal. De plus, le formateur adaptera la formation en fonction de chaque collaborateur (besoin de plus de temps si besoin pour apprendre la contention, le rapport à l’animal…). Sachant qu’un même animal pourra être utilisé pour apprendre différents gestes techniques, ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient. Toutes les procédures nécessitant une anesthésie des animaux seront réalisées avec des plaques chauffantes thermorégulées afin de maintenir la température corporelle des animaux et d’éviter toute hypothermie.

Choix des espèces

Les rats et les souris sont les animaux les plus utilisés dans notre société pour réaliser des études in vivo. Cependant nous utilisons également des cobayes et une formation à la contention et à la réalisation des gestes techniques peut être nécessaire selon chaque expérimentateur (trice). Nos projets d’études utilisant des animaux adultes, il sera préférable d’apprendre les gestes techniques sur des animaux adultes (de 6 à 8 semaines minimum).

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Âgées d'une semaine à vingt-quatre mois, elles subissent des prélèvements de sang deux fois par mois et des injections intrapéritonéales, pour étudier le vieillissement des vaisseaux sanguins. Le porteur présente les manipulations lors des prises de sang et des injections comme les seuls effets indésirables. Les rubriques réduction et raffinement reprennent mot pour mot le texte de la rubrique remplacement, sans mesure propre à chacune, avant mise à mort de toutes les souris pour analyser leurs tissus.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons 1/ caractériser l’endothélium vasculaire vieillissant 2/ explorer le rôle de médiateurs lipidiques sur le vieillissement vasculaire. Le vieillissement de la population est un enjeu majeur du XXIe siècle. Il s’accompagne d’une augmentation de la fréquence de maladies telles que le cancer et les maladies cardiovasculaires. Ces dernières sont la principale cause de mortalité dans le monde, majoritairement causé par un dysfonctionnement du système vasculaire (vaisseau sanguin et lymphatique) et du système d’hémostase (thrombose, coagulation et fibrinolyse). Cette étude sera menée selon plusieurs axes : Axe 1. Evaluation du vieillissement vasculaire Dans cet axe, une étude pilote sera menée pour la mise au point des immunomarquages de sénescence et de caractérisation. Pour ce faire, un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites jeune (1 semaine à 1mois) et un groupe de 5 souris wt (C57BL6) dites âgées (12 ou 24 mois) seront utilisées (n=10).

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’apporter de la connaissance sur le vieillissement vasculaire ainsi que l’impact de la physiologie plaquettaire et de l’endothélium, inconnu à ce jour et peu réalisable sur les humains à la vue de la diversité du système vasculaire. En effet, il est irréalisable d’obtenir sur le même individu des biopsies endothéliales (veines, artères et capillaires), à cause des méthodes invasives et des conséquences délétères (hémorragies). Par ailleurs, le second axe permettra de déterminer un composé diminuant ou stoppant le vieillissement vasculaire. Ces travaux serviront à l’ensemble de la population en général et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets. éral et pourront servir de tremplin pour de nouvelle thérapie innovante, des brevets.

Procédures

Prélèvements sanguins sur animeaux vigiles, 2 fois par mois. La durée de la prise de sang est de maximum 2minutes Les injections en intraperitoneale durent maximum 1minute.

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des prises de sang et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent.

Devenir

Au cour de l'étude, les souris feront l'objet d'un suivi quotidien et de prise de sang bi mensuel. Al fin de l'etude, tous les animaux seront mis à mort afin de faire une etude des tissus murins.

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Réduction

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Raffinement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de médiateurs lipidiques nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant translation à l'homme. Nous sommes actuellement en train d’évaluer in vitro la sénescence sur différents endothélium primaire humain ainsi que leurs récepteurs aux médiateurs lipidiques. Cette approche in vitro participe également à réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique du vieillissement. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 1 semaine à 24 mois. Les souriceaux a une semaine de vie presentent un arbre vasculaire incomplet au niveau des retines et permet d'avoir un temps de reference "jeune". Les vaisseaux sanguins cerebrales sont matures chez les souriceaux de 1 semaine. Pour notre étude, nous avons besoin de souris jeunes (1 semaine à 1mois) et souris vieillissante de 3 à 24mois. Ces dernieres ont un stade de developpement complet.

2 700 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une stimulation magnétique du cerveau après une hypoxie. Selon les procédures, elles subissent une privation d'oxygène de quarante minutes à six semaines, quatorze jours de stimulation magnétique et des tests comportementaux, sous sédation profonde. Le porteur décrit des inconforts transitoires liés à l'hypoxie, à la stimulation et aux injections, et affirme que le cervelet ne peut être étudié hors d'un système nerveux entier. La plupart des souris sont mises à mort pour prélever le cerveau, tandis que 180 femelles ayant servi de mères sont renvoyées à l'élevage pour être réutilisées.

Objectifs

Notre projet testera les effets neurologiques de la stimulation cérébrale non invasive pour améliorer les déficits fonctionnels. Ces connaissances permettront d'optimiser des protocoles de stimulation et trouver des traitements potentiels. Nous analyserons les effets de différents patrons de stimulation magnétique répétée à faible intensité (LIrTMS), qui modifient la plasticité neuronale et améliorent le comportement chez les animaux pathologiques. Les fonctions cérébrales seront évaluées avec des tests de comportement, et les modifications structurales et fonctionnelles chez les mêmes animaux pour minimiser le nombre d’animaux utilisé. Ce traitement peut changer la signalisation cellulaire, modifier des réseaux neuronaux, et provoquer une réparation post-lésionnelle dans le cerveau.

Bénéfices attendus

Nous cherchons des protocoles pour traiter une pathologie commune chez l’Homme, l’hypoxie cérébrale. Nous étudierons le cervelet parce qu’il est particulièrement sensible à l’hypoxie; sa structure, sa fonction et son développement sont très bien décrits; son dommage lors du développement est associé avec les maladies neurodéveloppementales; et il est touché par le vieillissement.

Procédures

4 interventions au maximum. Procédure 1 : 40 minutes d’hypoxie ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 12 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 2 : hypoxie 6h/jour x 10 jours ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 30 minutes/jour, un maximum de 14 jours ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes Procédure 3 : hébergement en cages hypoxie pendant 6 semaines, hypoxie intermittente 6h/jour ; 10 minutes/jour x 14 jours simulation magnétique ; tests de comportement un maximum de 60 minutes dans 1 journée ; analgésie et sédation profonde 1 fois, 15 minutes

Impact sur les animaux

Les interventions individuellement induisent une douleur en deca de la douleur engendrée par une simple injection faite selon le bon pratique vétérinaire. La succession de ces interventions nous emmène à demander l’autorisation du projet avec degré de gravité modérée. Les effets indésirables possible sont : inconfort transitoire en début d’hypoxie ; inconfort lors de la stimulation; inconfort lors des tests de comportement ; inconfort lors de l’injection d’anesthésiants et analgésiants. La surveillance quotidienne permet de s’assurer du bien être des animaux et lorsqu’un point limite (comme décrit) est atteint, les responsables du projet sont avertis et prennent une décision sur le devenir de l’animal, en lien avec la structure du bien être animal, et le vétérinaire référent.

Devenir

Nos études sont designés pour obtenir un maximum d'information biologique et comportemental d'un nombre minimum de souris. La plupart des souris sujet à l'hypoxie et la stimulation non invasive est testé en comportement puis perfusé, et les cerveaux des autres sont prélévé pour les études moléculaires. 180 souris femelles, les mères des portées des nouveaux-nés impliqués, seront remis dans l’animalerie, pour qu’elles soient re-utilisées pour l’élevage et diminuer donc le nombre total d’animaux.

Remplacement

Comme toute structure du système nerveux central, les connexions complexes entre les neurones ne peuvent pas être entièrement remplacé par des méthodes de culture ni des modèles mathématiques. Les déficits de comportement dus à une mutation associée avec les troubles autistique, ou à la suite d'une hypoxie perinatale, et l'amélioration de ces déficits ne peuvent être étudiés hors contexte de l'ensemble du système nerveux et donc avec des animaux vivants.

Réduction

2700 animaux total seront impliqués dans cette étude de 4 années. Nous avons calculé le nombre d'animaux nécessaire pour les trois procédures, pour diminuer le nombre d'animaux utilisé. Les tests de comportement nécessitent normalement 10 animaux par groupe, et les études d'expression génique nécessitent 5 animaux par groupe.Un calcul de puissance a été fait pour déterminer ces nombres d'animaux.

Raffinement

Avant le début des interventions, nous habituons les animaux au contact humain en pratiquant du « handling » quotidien pendant une semaine ; ceci diminue leur peur et leur angoisse. Pendant la stimulation non invasive (LIrTMS) les animaux ne montrent aucun signe d’angoisse. Les animaux sont hébergés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (6 par cage maximum) et l’isolement est évité au maximum. Le milieu est enrichi avec au choix : lanières de papier Kraft, maisons en carton, tunnel en carton ou carré de coton compacté. Les points limites sont définis pour chaque procédure, en cas de dérèglement physiologique ou souffrance de l’animal. Tout acte invasive est fait uniquement après administration des médicaments analgésique ou anésthetiques adaptés.

Choix des espèces

La souris est très utilisée pour des expériences sur le système nerveux car cette espèce partage un nombre de propriétés biologiques avec l'Homme. Sa petite taille et l'existence des lignées de souris transgénique facilitent les aspects pratiques de l'expérimentation. Il existe de protocoles standardisés du comportement, ce qui permet de mieux comparer les résultats obtenus par différentes équipes de recherche. La majorité des animaux seront utilisés pendant les premier mois de développement postnatal, les âges clés pendant le développement du cerveau. Les ages ont été choisi pour être équivalentes au 1) le 3ème trimestre de gestation chez l’Homme ; 2) jeune adulte ; ou 3) adulte agé.

3 045 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une protéine contre l'anorexie liée aux chimiothérapies ou au stress. Selon les groupes, elles subissent une microcoupure hebdomadaire de la queue, jusqu'à six injections intraveineuses, une contention de deux heures par jour pendant deux fois quinze jours, un jeûne de 48 heures ou l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique. Le porteur présente la perte de poids comme le principal effet indésirable et qualifie le stress lié à la contention et au jeûne de transitoire. Toutes les souris sont mises à mort pour prélever leurs organes.

Objectifs

Il a été récemment découvert qu’une protéine libérée par les cellules et les organes est impliquée dans un réflexe primitif de la faim, stimulant le comportement alimentaire par des mécanismes périphériques. Cette protéine agit comme un stimulateur lipogénique et un stimulateur de l'appétit efficace chez la souris. De plus, il a été montré que son injection chez la souris entraine une inhibition du processus autophagique. Une étude bio-informatique à montrer l’existence de plusieurs isoformes exprimées de façon différentielle dans l’organisme de la souris. Cette protéine apparaît comme un candidat d'intérêt dans la lutte contre l’anorexie du fait de son expression ubiquitaire, de ses liens avec la régulation centrale de l'appétit et de son rôle dans le métabolisme des lipides. L’objectif de ce projet est donc d’étudier et de déterminer si la présence de cette protéine (en fonction de son mode d’administration) peut empêcher : (i) l’anorexie (perte ou la forte diminution de l'appétit) associée aux traitements avec des agents chimiothérapeutiques ; (ii) ou l’anorexie associée à un stress psychologique/physique important.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique une nouvelle stratégie thérapeutique pour palier à l’anorexie induite par les chimiothérapies ou par un stress mental trop important dans l'espèce humaine. Ceci pourrait avoir des retombées thérapeutiques dans ces cas par la suite.

Procédures

Sur tous les animaux, une microcoupure de 1mm de l’extrémité de la queue sur animal vigile au début de l’expérience sera réalisée pour analyse sur le sang (durée: quelques secondes), puis une fois par semaine pendant 46 jours. Pour certains animaux, au maximum 6 injections i.v. par souris (20 secondes) ou une injection intravasculaire hydrodynamique par souris (6-8 secondes). Pour d'autres animaux : 1 contention de 2h par jour pendant deux fois 15 jours dans un cylindre acrylique permettant la respiration. Pour d'autres animaux: Une période de jeûne de 48h et 1 injection intranpéritonéale (20 secondes). Pour une des procédures, les souris subiront une chirurgie légère par implantation de pompe osmotique sous anesthésie générale avec analgésie (durée 15 minutes).

Impact sur les animaux

L’ effet indésirable principal prévu pour les animaux est la perte de poids. Les animaux seront transitoirement stressés lors des périodes de contentions de 2 heures ou les périodes de jeûne.

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, l’appétit, l’absorption des aliments et le comportement des individus par rapport à la nutrition vu sa complexité.

Réduction

Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Une analyse statistique a été effectuée afin de calculer le nombre d'animaux nécessaires. Les tests statistiques utilisés seront des tests « LogRank » pour la survie, et des tests « Anova » pour la perte ou la récupération de poids.

Raffinement

Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie et analgésie des animaux pour toutes les procédures expérimentales (locale ou générale selon les cas), utilisation de cages préchauffées et de lampes chauffantes...). La mise en place d’une grille de suivi stricte des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. Du fait du but des recherches prévues, les animaux seront au stade adulte, étant des bons modèles pour les maladies à étudier. Selon les procédures, les animaux seront utilisés entre 7 et 8 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie de quinze minutes pour implanter des cellules cancéreuses dans le foie, puis un suivi de dix semaines pendant lequel se développe une atteinte cardiaque, avant euthanasie. Le porteur indique une douleur post-opératoire et un possible œdème abdominal lié à la maladie cardiaque induite. Il juge le recours à un "organisme entier" vivant "indispensable" pour étudier l'effet d'une tumeur du foie sur les valves du cœur, et met à mort toutes les souris pour analyser leur cœur.

Objectifs

Au cours de ce projet, nous nous intéresserons aux tumeurs neuroendocrines du foie qui constituent une famille de cancers caractérisée par la production d’hormones dont la sérotonine. L'exposition des valves du cœur à la sérotonine est à l'origine d'une maladie cardiaque dite cardiopathie carcinoïde. Il s'agit d'une maladie rare associée à une mortalité élevée chez l'Homme. La sérotonine produite par la tumeur va entrainer des modifications majeures de la structure des valves du cœur. A ce jour, il n’existe aucun traitement médicamenteux efficace pour traiter cette maladie cardiaque. Les connaissances sur la maladie demeurent limitées. L’objectif de ce projet est de créer un modèle de souris reproduisant la maladie telle qu’elle se manifeste chez l’Homme. Ainsi, nous souhaiterions obtenir un modèle de tumeur du foie produisant de la sérotonine et entrainant des changements de la structure des valves cardiaques chez la souris. Un tel modèle nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de la maladie

Bénéfices attendus

La création d’un tel modèle reproduisant précisément la cardiopathie carcinoïde telle qu'elle se manifeste chez l'Homme, permettra d’évaluer l’effet de l’administration de divers traitement médicamenteux chez la souris avant de les introduire chez l’Homme. Il n'existe en effet à ce jour aucun traitement médicamenteux de la maladie. Un tel modèle permettra par ailleurs une meilleure compréhension des mécanismes de la maladie.

Procédures

Les souris subiront une unique intervention chirurgicale d’une durée de 15 minutes au niveau du foie pour implanter des cellules cancéreuses sous anesthésie générale. Après un suivi de 10 semaines, les animaux seront euthanasiés afin d’étudier l’atteinte cardiaque apparue dans l’intervalle.

Impact sur les animaux

Stress lié à l'intervention chirurgicale, au déplacement des cages vers la salle d'intervention. Douleur post-opératoire. L'apparition d'une atteinte cardiaque carcinoïde pourrait s'accompagner d'oedèmes. Il s'agit d'une accumulation d'eau au niveau de l'abdomen de la souris.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la procédure afin de prévenir la souffrance liée à la propagation du cancer, et de pouvoir analyser le coeur des souris. Cette analyse permettra de chercher des signes en faveur de l'apparition de la maladie cardiaque carcinoïde.

Remplacement

L'utilisation d'un animal pour ce projet est indispensable car il est nécessaire de recourir à un organisme entier vivant. En effet, nous souhaitons étudier l’effet sur les valves du cœur d’une tumeur du foie. Le recours à un organisme vivant entier est indispensable pour pouvoir étudier un tel effet. Nous étudions parallèlement des échantillons de valves obtenues chez des patients malades ayant une cardiopathie carcinoïde, opérés. Cette approche permet seulement d'observer les anomalies de la valve mais ne permet pas d'évaluer l'efficacité de traitements médicamenteux.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique

Raffinement

Une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant l'intervention. Les animaux seront observés quotidiennement. En plus du suivi quotidien visuel, un suivi clinique sera mis en place. Ainsi une grille de suivi sera utilisée mentionnant précisément les points limites à surveiller. Les points limites seront donc évalués à l'aide d'une grille de score au moins une fois par semaine. Les animaux sont hébergés sans isolement, avec enrichissement dans chaque cage. La douleur post-opératoire sera systématiquement prise en charge par l'administration d'un traitement antalgique au début de l'intervention. En cas de d'apparition de signe de douleur lors du suivi, un traitement antalgique sera immédiatement administré. Une surveillance quotidienne des points de suture sera réalisée. En cas d'atteinte des points limites, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Nous disposons de lignées de cellules cancéreuses de souris et les protocoles pour modifier ces cellules sont simples et reproductibles. Pour toutes ces raisons, la souris est le modèle expérimental le plus adapté. Les rares études épidémiologiques chez l'Homme indiquent une prévalence accrue des atteintes cardiaques chez l'adulte jeune. Les enfants et les sujets âgés sont moins atteints par la maladie. Nous utiliserons par conséquent des souris âgées de 8 à 12 semaines en début de procédure pour se rapprocher au maximum de la condition de la maladie chez l’Homme.